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Chromobacterium violaceumis one of millions of species of free-living microorganisms that populate the soil and water in the extant areas of tropical biodiversity around the world. Its complete genome sequence reveals (i) extensive alternative pathways for energy generation, (ii) ≈500 ORFs for transport-related proteins, (iii) complex and extensive systems for stress adaptation and motility, and (iv) widespread utilization of quorum sensing for control of inducible systems, all of which underpin the versatility and adaptability of the organism. The genome also contains extensive but incomplete arrays of ORFs coding for proteins associated with mammalian pathogenicity, possibly involved in the occasional but often fatal cases of humanC. violaceuminfection. There is, in addition, a series of previously unknown but important enzymes and secondary metabolites including paraquat-inducible proteins, drug and heavy-metal-resistance proteins, multiple chitinases, and proteins for the detoxification of xenobiotics that may have biotechnological applications.

Background: Human infection by the pork tapeworm Taenia solium affects more than 50 million people worldwide, particularly in underdeveloped and developing countries. Cysticercosis which arises from larval encystation can be life threatening and difficult to treat. Here, we investigate for the first time the transcriptome of the clinically relevant cysticerci larval form. Results: Using Expressed Sequence Tags (ESTs) produced by the ORESTES method, a total of 1,520 high quality ESTs were generated from 20 ORESTES cDNA mini-libraries and its analysis revealed fragments of genes with promising applications including 51 ESTs matching antigens previously described in other species, as well as 113 sequences representing proteins with potential extracellular localization, with obvious applications for immune-diagnosis or vaccine development. Conclusion: The set of sequences described here will contribute to deciphering the expression profile of this important parasite and will be informative for the genome assembly and annotation, as well as for studies of intra- and inter-specific sequence variability. Genes of interest for developing new diagnostic and therapeutic tools are described and discussed.

We report the first case of digestive tract pathology (megaesophagus) determined by Trypanosoma cruzi infection in Santa Catarina State, southern Brazil. A 63-year- old female had presumptive clinical diagnosis of Chagas' disease, which was confirmed by imaging (endoscopy and esophagogram) and immunological methods. Further molecular diagnosis was carried out with esophagus and blood samples collected during corrective surgery. Polymerase chain reaction tested positive for Trypanosoma cruzi in both esophagus and buffy coat samples. Relatamos neste artigo o primeiro caso de megaesôfago determinado por infecção pelo Trypanosoma cruzi no Estado de Santa Catarina, região sul do Brasil. Uma paciente de 63 anos de idade com diagnóstico clínico presuntivo de doença de Chagas, apresentou exames de imagem (endoscopia e esofagograma) e imunológicos positivos. Além disso, foi realizado diagnóstico molecular com amostras de esôfago e sangue coletadas durante a cirurgia corretiva. A reação em cadeia da polimerase apresentou-se positiva para Trypanosoma cruzi nas amostras de esôfago e no creme leucocitário.

The aim of this work was to verify the colonization of Panstrongylus megistus on artificial ecotopes in Florianópolis, in the Santa Catarina Island, South Brazil. For this purpose 443 houses of the Lagoa district and 779 house annexes (524 chicken-houses, 46 corrals and 209 storage-houses) in 9 different places were examined from 1985 to 1992. These ecotopes, which include ceilings and basements, were checked after application of dislodging liquid (Pirisa 5%). Colonization by P. megistus was verified in two houses, three chicken-houses and one storage-house of the Lagoa district, where eggs, nymphs and adults were collected. To verify local reports of P. megistus occurrence, another two houses and one school were investigated. The colonization at all of these places was confirmed. In the 9 artificial ecotopes examined, 559 eggs, 305 nymphs and 24 adults were collected. The infection rate of P. megistus by Trypanosoma cruzi was 55.3% (182/ 329). A similar infection rate of 56.5% (78/138) was obtained in adults of P. megistus from sylvatic ecotopes and in adults captured in the houses by the inhabitants between 1983 to 1991. Precipitin tests revealed blood from just one source in 94.0% of the insects (170/181). Human blood was found in 80.6% (25/31) of the adults and in 5.8% (1/17) of the nymphs captured in the houses. These results suggest the need to ally serious epidemiologic vigilance to the effort of the inhabitants in order to avoid the risk of domiciliation of P. megistus in the houses. Objetivando verificar a colonização de Panstrongylus megistus em ecótopos artificiais em Florianópolis foram examinados, de 1985 a 1992, 779 anexos peridomiciliares (524 galinheiros, 46 currais e 209 ranchos) em 9 localidades e 443 domicílios no distrito de Lagoa, todos na Ilha de Santa Catarina. Todo o ecótopo, incluindo forro e porão das casas, era examinado após aplicação de líquido insentífugo (Pirisa a 5%). A pesquisa nos anexos peri-domiciliares revelou 3 galinheiros e um rancho positivo no distrito de Lagoa, onde foram também encontrados 2 domicílios colonizados pelo P. megistus, com a captura de ovos, ninfas e adultos em todos os ecótopos. Pesquisas dirigidas foram realizadas em dois outros domicílios e em uma escola, nos quais os moradores haviam detectado anteriormente exemplares de P. megistus e, em todos os 3, foi confirmada a colonização pelo triatomíneo. Nos 9 ecótopos artificiais foram coletados 559 ovos, 305 ninfas e 24 adultos de P. megistus, com um índice de infecção pelo T. cruzi de 53,3% (182/329). Índice de infecção semelhante, de 56,5% (78/ 138), foi também encontrado nos adultos de P. megistus oriundos dos ecótopos silvestres e capturados nos domicílios pelos moradores, no período de 1983 a 1991. Os testes de precipitina revelaram, em 94,0% dos insetos examinados (170/181), sangue de uma única fonte alimentar e presença de sangue humano em 80,6% (25/31) dos adultos e em 5,8% (1/17) das ninfas capturados nos domicílios. Os resultados encontrados sugerem a necessidade de adoção de medidas de vigilância epidemiológica com a participação da comunidade, face o risco potencial de domiciliação do P. megistus.

Trypanosoma rangeli is an important hemoflagellate parasite of several mammalian species in Central and South America, sharing geographical areas, vectors and reservoirs with T. cruzi, the causative agent of Chagas disease. Thus, the occurrence of single and/or mixed infections, including in humans, must be expected and are of great importance for specific diagnosis and epidemiology. In comparison to several Trypanosomatidae species, the T. rangeli biology and genome are little known, reinforcing the needs of a gene discovery initiative. The T. rangeli transcriptome initiative aims to promote gene discovery through the generation of expressed sequence tags (ESTs) and Orestes (ORF ESTs) from both epimastigote and trypomastigote forms of the parasite, allowing further studies of the parasite biology, taxonomy and phylogeny.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2021. A leishmaniose visceral é uma doença infecciosa, não contagiosa, causada pelo protozoário Leishmania infantum e está entre as 17 doenças mais negligenciadas no mundo. No Brasil, está em franca expansão e tem os cães domésticos como principais reservatórios do parasito no contexto urbano de transmissão. Assim, o parasito pode acometer cães causando a Leishmaniose Visceral Canina (LVC) e, atualmente, existe no Brasil apenas um medicamento aprovado para o tratamento desses animais, a miltefosina. Existem relatos na literatura sobre alguns genes relacionados ao fenótipo de resistência do parasito à miltefosina, tais como: LiMT, LiRos3, LiABCG4, LiABCG6 e AQP1. Para avaliar a susceptibilidade e o perfil de expressão desses genes em L. infantum, o presente estudo contou com sete isolados de L. infantum, sendo cinco provenientes do município de Florianópolis (SC) e dois provenientes do estado de Minas Gerais (MG). Um total de cinco isolados são provenientes de cães que passaram por tratamento com a miltefosina após diagnóstico de LVC, e três outros são de cães soropositivos que foram submetidos à eutanásia e posterior necrópsia. Todas as cepas tiveram a taxa de infecção individual, a susceptibilidade in vitro à miltefosina e os respectivos valores de IC50 determinados. Além disso, as taxas de expressão relativa ao gene referência SSU foram determinadas para os cinco genes em ensaios de RT-qPCR. Os dados de IC50 aliados com as taxas de infecção, bem como a taxa de amastigotas por macrófago e a taxa de expressão dos genes de interesse mostraram que as cepas provenientes de MG são sensíveis à miltefosina. Em contrapartida, alguns isolados de L. infantum provenientes de cães de Florianópolis (SC) apresentaram perfil de resistência à miltefosina, fato que foi corroborado por análises realizadas após o tratamento dos animais. A quantificação relativa de transcritos dos genes LiMT, LiRos3 e AQP1 apresentou melhor concordância e associação com o fenótipo de resistência observado nos ensaios in vitro de susceptibilidade, seguida pela transcrição do gene LiABCG4. Em contrapartida, a quantificação da expressão do gene LiABCG6 não pôde ser considerada um bom marcador de resistência ou susceptibilidade do parasito. Em suma, os resultados deste estudo chamam a atenção para a importância da avaliação da resistência de populações de L. infantum à miltefosina utilizando-se a RTqPCR dirigida a genes envolvidos na resistência, permitindo o monitoramento da infecção de cães submetidos ao tratamento para LVC com miltefosina. Abstract: Visceral leishmaniasis is an infectious, non-contagious disease caused by the protozoan Leishmania infantum and is among the 17 most neglected diseases in the world. In Brazil, it is booming and has domestic dogs as the main reservoirs of the parasite in the urban context of transmission. Thus, the parasite can affect dogs causing Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) and, currently, there is only one drug approved in Brazil for the treatment of these animals, miltefosine. There are reports in the literature about some genes related to the parasite resistance phenotype to miltefosine, such as: LiMT, LiRos3, LiABCG4, LiABCG6 and AQP1. To assess the susceptibility and expression profile of these genes in L. infantum, the present study included seven isolates of L. infantum, five from the municipality of Florianópolis (SC) and two from the state of Minas Gerais (MG). A total of five isolates come from dogs that underwent treatment with miltefosine after being diagnosed with CVL, and two others are from seropositive dogs that underwent euthanasia and subsequent necropsy. All strains had their individual infection rate, in vitro susceptibility to miltefosine and their IC50 values determined. In addition, expression rates relative to the SSU reference gene were determined for the five genes in RT-qPCR assays. IC50 data combined with infection rates, as well as amastigotes per macrophage rate and the expression rate of genes of interest showed that strains from MG are sensitive to miltefosine. On the other hand, some isolates of L. infantum from dogs in Florianópolis (SC) showed a profile of resistance to miltefosine, a fact that was corroborated by analyzes carried out after the treatment of the animals. The relative quantification of transcripts from the LiMT, LiRos3 and AQP1 genes showed better agreement and association with the resistance phenotype observed in the in vitro susceptibility assays, followed by transcription of the LiABCG4 gene. On the other hand, the quantification of LiABCG6 gene expression could not be considered a good marker of resistance or susceptibility of the parasite. In short, the results of this study draw attention to the importance of evaluating the resistance of L. infantum populations to miltefosine using RT-qPCR directed to genes involved in resistance, allowing the monitoring of infection in dogs undergoing treatment for LVC with miltefosine.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2020. Os tripanosomatídeos possuem uma estrutura celular particular, possuindo um único flagelo que emerge da bolsa flagelar sendo aderido ao corpo celular através da zona de adesão flagelar (FAZ). Esta região define o sítio de início da fenda de clivagem durante o processo de divisão celular e, dentre as proteínas envolvidas nestes processos, a FLA1BP e a CIF1 foram descritas em Trypanosoma brucei, sendo essenciais para a adesão flagelar (FLA1BP) e regulação da citocinese (CIF1). Como são escassos estudos comparando essas proteínas em outras espécies, o presente trabalho buscou investigar a diversificação destas proteínas em tripanosomatídeos, especialmente no gênero Trypanosoma. A análise de genômica comparativa de diferentes espécies revelou a ausência de conservação de sequências de CIF1, incluindo a ausência de domínios proteicos, assim como uma diversificação das proteínas que interagem com CIF1, podendo indicar que T. brucei passou por adaptações na via de ativação da citocinese. Em Trypanosoma rangeli, CIF1 não possui os domínios coiled-coil e zinc finger, sendo 28% idêntica à TbCIF1 e possuindo menos sítios de fosforilação quanto comparada à esta. Além disso, os níveis de transcrição e de expressão da TrCIF1 não são alterados durante a divisão celular, podendo sugerir uma função distinta desta proteína em T. rangeli. Quanto à FLA1BP, observou-se que os genes encontrados em T. rangeli e Trypanosoma cruzi estão presentes em cópia única no genoma e são sintênicos à TbFLA1BP e, apesar de divergências nas sequências, a localização e a função desta proteína parecem ser conservadas dentro do gênero Trypanosoma. Uma análise comparativa de sequências de FLA1BP de diferentes espécies, revelou uma sequência conservada de 12 aminoácidos polares e hidrofóbicos, os quais podem constituir um domínio de endereçamento ou ancoramento de FLA1BP na FAZ. Nossos resultados sugerem que a ativação da citocinese em T. brucei pode não ser conservada em relação aos demais tripanosomatídeos, porém a adesão flagelar dependente de FLA1BP é conservada. Abstract: Trypanosomatids possess a unique cell structure, containing a single flagellum emerging from the flagellar pocket which is attached along the cell body through the flagellar attachment zone (FAZ). The distal end of the FAZ defines the site for initiation of the cleavage furrow during cell division. Among several proteins involved in such processes, FLA1BP and CIF1 were described in Trypanosoma brucei and are essential for flagellar adhesion (FLA1BP) and cytokinesis regulation (CIF1). Due to the lack of comparative studies of these proteins in other trypanosomatids species, we aimed to investigate the presence and the variability of FLA1BP and CIF1 within the Trypanosoma genus. Comparative genome analysis shows the absence of domains and sequence conservation of T. brucei CIF1 and CIF1-interacting proteins in other species, suggesting adaptations of the cytokinesis activation in this taxon. The Trypanosoma rangeli CIF1 is 28% identical to TbCIF1, lacks the coiled-coil and zinc finger domains and contains fewer phosphorylation sites when compared to TbCIF1. Also, TrCIF1 transcription and expression levels are not related to cell division, might be indicating a distinct role of CIF1 in this species. The T. rangeli and Trypanosoma cruzi FLA1BP genes are single-copy genes syntenic to TbFLA1BP and, despite sequence divergencies, the localization and function of FLA1BP appear to be conserved within the Trypanosoma genus. Alignment of the FLA1BP sequence from different species revealed a conserved 12 amino acid sequence composed by polar and hydrophobic residues that may constitute the addressing or anchoring domain of FLA1BP on the FAZ. Our results indicate a conserved FLA1BP role in flagellar attachment among Trypanosomes and suggest that cytokinesis activation in T. brucei has diverged from other trypanosomatids.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. O Trypanosoma rangeli, é um protozoário de ciclo heteroxênico, e para que esta alternância de hospedeiros ocorra, o parasito possui uma regulação gênica em nível pós- transcricional, que permite rápida mudança nos padrões de expressão gênica, possibilitando uma adaptação do parasito a diferentes ambientes. As amastinas constituem uma família multigênica, subdividida em quatro grupos: a, ß, ? e d. Genes representativos de amastinas estão presentes no genoma do T. rangeli, mas o seu padrão de expressão, localização celular, envolvimento na interação com células do hospedeiro neste parasito ainda precisam ser investigados. Sendo assim, este estudo, têm como objetivo avaliar o ciclo celular do Trypanosoma rangeli com a finalidade de atribuir o possível papel das amastinas e tuzina na interação parasito/hospedeiro. Neste trabalho foram identificados 21 (sendo quatro genes truncados) genes pertencentes à família das amastinas, divididos em sete grupos, e um gene referente à tuzina e ambos com localização membranar. Através de uma análise filogenética, classificar esses genes de amastinas como pertencentes ao grupo das a, ß e d-amastinas. Analisamos dois genes de duas diferentes subfamílias TrAma7_1 (ß ?amastina) e TrAma4_1 (a-amastina) quanto a produção dos níveis de transcritos e de expressão proteica, observamos que ambos os genes produzem níveis de transcritos nas formas evolutivas epimastigotas e tripomastigotas com diferença entre as mesmas, mas, apenas para TrAma4_1 foi observada a expressão proteica no Western blot. Para Tuzina, observamos que as mesmas encontram-se intercaladas no genoma com as d-amastinas, e apresar de os níveis de transcritos serem diferentes entre diferentes formas evolutivas analisadas, os níveis de proteína expressa são iguais entre todas as formas, tanto para T. rangeli e T. cruzi. Com isso, observamos então que o nível de proteína expressa não é estágio dependendo como a produção dos níveis de transcritos, para ambos os genes. Parasitos da cepa Choachí de T. rangeli foram transfectados com amastinas de T. cruzi de duas diferentes subfamílias e com a TrAma4_1 de T. rangeli fusionadas com GFP, e com base nos resultados encontrados no estudo in vivo da infecção experimental com essas cepas transfectadas em comparação com a cepa parental pudemos observar que não houveram diferenças significativas na evolução da infecção. Abstract : Trypanosoma rangeli is a protozoan of heteroxenic cycle and for this host alternation to occur the parasite has a post-transcriptional level of gene regulation that allows a rapid change in the gene expression patterns, allowing an adaptation of the parasite to different environments. The amastins constitute a multigenic family, subdivided into four groups: a, ß, ? and d. Representative amastin genes are present in the T. rangeli genome, but their pattern of expression, cell localization, involvement with host cells interaction in this parasite still needs to be investigated. Thus, this study aims to evaluate the cell cycle of Trypanosoma rangeli in order to attribute the possible role of amastines and tuzin in the parasite/host interaction. In this work 21 genes (those: four are truncated genes) were identified belonging to the amastine family, divided into seven groups, and one gene related to the tuzin and both of them with membrane localization. Through a phylogenetic analysis, these amastine genes were classify belonging to the a, ß and d-amastins group. We analyzed two different genes from two different amastin subfamilies: TrAma7_1 (ß-amastine) and TrAma4_1 (a -amastine) for the production of transcript levels and protein expression, and we observed that both genes produce levels of transcripts in epimastigote and trypomastigote evolutionary forms with difference between thenselves but only for TrAma4_1 was observed protein expression in the Western blot. For Tuzin, we observed that they are intercalated in the genome with the d-amastines, and the transcript levels are different between different evolutionary forms analyzed, expressed protein levels are equal between all forms, both for T. rangeli and T. cruzi. So, until now we observed that the protein expression levels are not stage specific, diferent os the transcriptions levels. Parasites of T. rangeli strain Choachi were transfected with four different T. cruzi amastins from two different subfamilies and with T. rangeli TrAma4_1 and fused with GFP, and based on the results found in the in vivo study of the experimental infection with these strains transfected into comparison with the parental strain showed that there were no significant differences in the evolution of the infection.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. Exossoma de RNA é um complexo multiproteico composto por 12 subunidades, que possui atividade catalítica no sentido 3 ? 5 e está envolvido no processamento e degradação de vários tipos de RNAs. As subunidades RRP6 (Ribossomal RNA Processing 6) e RRP44 (Ribossomal RNA Processing 44) são responsáveis pela atividade catalítica e as demais subunidades envolvidas no direcionamento e seleção de transcritos para processamento ou degradação. O Trypanosoma rangeli, juntamente com outros tripanosomatídeos, apresentam deficiência no sistema de regulação de fatores de transcrição, portanto o mecanismo de regulação da expressão gênica nestes organismos ocorre predominantemente a níveis pós-transcricionais através da regulação dos níveis de RNA, sendo esses níveis regulados a partir da degradação dos transcritos. No presente estudo realizamos a caracterização de três subunidades do complexo exossoma de T. rangeli. A subunidade RRP6 de T. rangeli possui uma janela aberta de leitura de 2.133 pares de base que codifica para um polipeptídio de 710 aminoácidos (± 78,7 kDa). Foram identificados os domínios conservados PMC2NT, DEDD-Y e HRDC, que também se encontram presentes em outros organismos em que o complexo exossoma de RNA está caracterizado. Foi realizado teste de expressão heteróloga desta proteína em E. coli BL21 CodonPlus, porém sem sucesso de isolamento. A subunidade RRP44 de T. rangeli possui uma janela aberta de leitura de 3012 pares de base que codifica para um polipeptídio de 1003 aminoácidos (± 113,2 kDa). Os domínios conservados presentes nesta proteína são PIN, Exoribonuclease R e RNB. Foi realizada a expressão heteróloga desta proteína em E. coli BL21 CodonPlus, porém não tivemos sucesso do rendimento da proteína para o posterior etapa de purificação. A subunidade EAP3 (Exosome Associated Protein 3) possui uma janela aberta de leitura de 547 pares de base que codifica para um polipeptídio de 181 aminoácidos (± 20 kDa) e está descrita como uma proteína associada ao exossoma de RNA formando um heterodímero com a subunidade RRP6. Em ensaios de Western blot utilizando o antissoro produzido essa interação in vivo foi comprovada, uma vez que a ligação do anticorpo ocorreu na banda de ±150 kDa. As sequências do complexo exossoma de RNA apresentam porcentagens de identidade altas, demonstrando ser uma maquinaria conservada entre os tripanosomatídeos, porém com sua funcionalidade ainda desconhecida. Abstract : RNA exosome complex is a multiprotein complex composed of 12 subunits, which has 3 '? 5' catalytic activity and is involved in the processing and degradation of several types of RNAs. The subunits RRP6 (Ribosomal RNA Processing 6) and RRP44 (Ribosomal RNA Processing 44) are responsible for the catalytic activity, and the other subunits are involved in the targeting and selection of transcripts for processing or degradation. Trypanosoma rangeli, together with other trypanosomatids, are deficient in the regulation system of transcription factors, so the regulation mechanism of gene expression in these organisms occurs exclusively at post-transcriptional levels through of RNA levels regulation, these levels being regulated from the degradation of the transcripts. In the present study we performed the characterization of subunits of the T. rangeli exosome complex. The RRP6 subunit of T. rangeli has an open reading frame of 2,133 base pairs coding for a polypeptide of 710 amino acids (± 78.7 kDa). The conserved domains identified was PMC2NT, DEDD-Y and HRDC, which are also present in other organisms in which the RNA exosome complex is characterized, have been identified. A heterologous expression test of this protein was performed in E. coli BL21 CodonPlus, but with no success of isolation. The RRP44 subunit of T. rangeli has an open reading frame of 3012 base pairs encoding a polypeptide of 1003 amino acids (± 113.2 kDa). The conserved domains present in this protein are PIN, Exoribonuclease R and RNB. The heterologous expression of this protein was performed in E. coli BL21 Codon Plus, but we did not have a success of protein yield for the subsequent protein purification process. The EAP3 (Exosome Associated Protein 3) subunit has an open reading frame of 547 base pairs encoding a polypeptide of 181 amino acid (± 20 kDa) and is described as a protein associated with the RNA exosome forming a heterodimer with the subunit RRP6. In Western Blotting assays using the antiserum produced from purified protein this in vivo interaction was proven, since antibody binding occurred in the ~ 150 kDa band, which corresponds to the sum of the proteins. The sequences of the RNA exosome complex have high identity percentages, demonstrating that it is a conserved machinery among the trypanosomatids, but with its still unknown functionality.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. O mecanismo de RNA de interferência (RNAi) é um sistema pós-transcricional de silenciamento gênico com ampla distribuição nos organismos eucariotos. Os pequenos RNA (siRNA e miRNA) são considerados moléculas chaves nesse mecanismo, os quais são gerados pela proteína Dicer. A presença desse sistema parece não seguir um padrão de distribuição filogenético e a sua evolução ainda não foi compreendida. Entre os protozoários, o mecanismo de RNAi está muito bem caracterizado em Trypanosoma brucei, entretanto é ausente em Trypanosoma cruzi e em muitas espécies de Leishmania. O Trypanosoma rangeli não possui vários componentes da maquinaria de RNAi, tornando-a não funcional. Entretanto, o gene que codifica para a Dicer- Like2 (DCL2) foi encontrado completo em seu genoma, enquanto os demais genes codificantes para as outras proteínas da maquinaria estão truncados (pseudogenes). No presente estudo realizamos a caracterização do gene DCL2 de T. rangeli (TrDCL2), o qual apresentou-se como cópia única no genoma do parasito, possuindo uma janela aberta de leitura com 2.667 pb que codifica para uma proteína de 889 aminoácidos (±100 kDa). Foram reveladas diferenças nas sequências aminoacídicas da TrDCL2 entre as cepas KP1(+) e KP1(-) de T. rangeli e devido uma mudança na fase de leitura não é possível identificar os domínios RNAse III nas cepas KP1(-). O gene TrDCL2 é transcrito nas cepas KP1(+), sendo que os níveis de mRNA não apresentam alterações significativas durante o processo de diferenciação celular in vitro do parasito. Visando a avaliação da atividade enzimática e análise da presença e níveis proteicos, realizamos a expressão heteróloga de dois fragmentos e da proteína TrDCL2 inteira. Um dos fragmentos foi utilizado para a produção de um antissoro policlonal anti-TrDCL2. Este antissoro reconheceu uma proteína do tamanho esperado (±100 kDa) nos extratos proteicos totais das formas epimastigotas e tripomastigotas de T. rangeli. Os ensaios de imunofluorescência indireta, utilizando o mesmo antissoro, revelaram uma distribuição difusa da proteína pelo citoplasma de ambas as formas do parasito. A TrDCL2 é expressa em algumas cepas do T. rangeli, entretanto a determinação do seu papel biológico neste parasito ainda permanece a ser elucidada. Abstract : The interference RNA mechanism (RNAi) is a system of post-transcriptional gene silencing with wide distribution in the eukaryotes. Small RNA (siRNA e miRNA) are considered key molecules in this mechanism, which are generated by Dicer protein. The presence of this system seems not follow a pattern of phylogenetic distribution and its evolution is still not understood. Between trypanosomatids, the RNAi mechanism is well described in Trypanosoma brucei, but is absent in Trypanosoma cruzi and some Leishmania species. Trypanosoma rangeli does not have many components of RNAi machinery, making it not functional. However, the Dicer-Like2 (DCL2) coding gene was fully encountered in its genome, while the other genes of this machinery are truncated (pseudogenes). In the present study, we have realized the characterization of DLC2 gene of T. rangeli (TrDCL2), which presented a single copy in the parasite genome, having an open reading frame with 2.667 bp that encodes a protein with 889 amino acids (±100 kDa). Differences in aminoacidic sequences were revealed between strains KP1(+) and KP1(-) of T. rangeli and due to a change in the reading phase it was not possible to identify RNAse III domains in the KP1(-) strains. TrDCL2 gene is transcripted in the KP1(+), the mRNA levels do not show significant alterations during the process of cellular differentiation in vitro. Aiming the evaluation of the enzymatic activity and the analysis of the presence of the protein and its levels, we realized the heterologous expression of two fragments and the whole protein TrDCL2. One of the fragments was used to produce a polyclonal antiserum anti-TrDCL2. This antiserum recognized a protein with the expected size (±100 kDa) in the total protein extracts of the epimastigotes and trypomastigotes of T. rangeli. Imunofluorescence assays, using the same antiserum, revealed a diffuse distribution of the protein in the cytoplasm in both forms of the parasite. The TrDCL2 is expressed in some strains of T. rangeli, but the determination of its biological role in this parasite still needs to be elucidated.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. O Trypanosoma rangeli (Kinetoplastida; Trypanosomatidae) é um parasito hemoflagelado que compartilha reservatórios e vetores com o Trypanosoma cruzi, sendo capaz de infectar mamíferos silvestres e domésticos, assim como o ser humano. Dentre as proteínas envolvidas na regulação do metabolismo energético do T. rangeli, avaliamos neste trabalho a expressão e a atividade enzimática da arginina quinase (AK), enzima que possui atividade de fosfotransferase e cataliza a interconversão entre a fosfoarginina e ADP, assim como arginina e ATP, sendo essencial para diferentes processos celulares em tripanosomatídeos, como por exemplo, infecção, multiplicação celular e diferenciação celular. O crescimento dos parasitos em meio LIT foi acompanhado durante nove dias, sendo observada uma menor expressão da AK somente no dia 1, aumentando no dia 2 e mantendo-se estável nos dias subsequentes. A atividade enzimática da AK aumentou progressivamente até o 5º dia de cultivo, decaindo gradativamente nos dias subsequentes. Durante a diferenciação celular de formas epimastigotas para tripomastigotas realizada ao longo de oito dias em meio DMEM, a maior expressão da AK foi detectada nas formas epimastigotas (dia 0) e a maior atividade enzimática nas formas de transição (dia 4). Durante a diferenciação de tripomastigotas em epimastigotas foi observada uma menor expressão da AK somente nos dias 3 e 4, sendo aumentada no dia 5 e mantendo-se estável nos dias subsequentes. A atividade enzimática da AK se manteve constante nos tripomastigotas recém isolados e no primeiro dia de cultivo, aumentando no segundo dia e se mantendo constante até o sexto dia, quando teve um aumento da atividade, que novamente se manteve constante até o nono dia e então decaindo nos últimos dias. Embora estudo prévio tenha demonstrado uma localização flagelar da TrAK a maior parte da atividade da AK foi encontrada na fração citosólica após purificação do citoesqueleto e flagelo. Na comparação entre diferentes espécies e cepas de tripanosomatídeos, a cepa SC 58 de T. rangeli apresentou uma atividade quase duas vezes maior do que a cepa Choachí. A atividade nas cepas de T. cruzi foi praticamente constante quando comparadas entre si e também com a cepa Choachí. Através destes resultados é possível inferir que a atividade da AK parece estar relacionada à multiplicação celular e a adaptação à condições metabólicas adversas (ex. diferenciação celular), sendo influenciada pela demanda energética do parasito. Abstract : Trypanosoma rangeli (Kinetoplastida; Trypanosomatidae) is a hemoflagellate parasite that infects wild and domestic mammals, as well as humans, sharing reservoirs and vectors with Trypanosoma cruzi. In this work we evaluate the expression and the enzymatic activity of the T. rangeli arginine kinase (AK), an enzyme with phosphotransferase activity that catalyzes the interconversion between phosphoarginine and ATP¸ as the arginine and ATP. AK is essential in trypanosomatids for diferent cellular processes, like infection, cellular multiplication and cellular diferentiation. The AK expression was monitored during the T. rangeli epimastigotes growth in LIT medium for nine days, revealing an increasing expression of AK during the first couple of days and then stabilizing. The enzymatic AK activity have increased up to the fifth day of in vitro culture and then gradually decreased during the subsequent days. During the cellular differentiation in vitro, higher AK expression levels were observed for the epimastigote forms (day 0) but the higher enzymatic activity was detected for the transition forms (day 4). During the in vitro differentiation of bloodstream forms to replicative forms the AK expression have increased up to the fifth day and remained stable up to the ninth day. During this process the AK enzymatic activity revealed a slight increase up to the second day and the stabilised up to the sixth day when a second peak of activity was observed followed by decay up to the ninth day. Although previous studies have demonstrated a flagellar localization for the TrAK, higher AK activity was found on the cytosolic fraction. The AK activity revealed to be distinct among T. rangeli strains, being two times higher for the SC58 strain when compared to the Choachí strain, which revealed similar AK activity as observed for T. cruzi. We conclude that AK activity might be related to the T. rangeli cellular multiplication, differentiation and metabolic adaptation to adverse conditions, being influenced by the parasite?s energetic demands.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. Trypanosoma rangeli é um parasito hemoflagelado pertencente à Ordem Kinetoplastea, grupo ancestral de protistas que contém grande diversidade de espécies, entre elas organismos de vida livre e parasitos com distintos mecanismos de resposta ao estresse oxidativo. Um dos objetivos deste trabalho foi caracterizar in silico enzimas envolvidas direta ou indiretamente na defesa antioxidante de T. rangeli, além de compará-las a suas ortólogas junto a diferentes espécies de Kinetoplastídeos. Dos genes analisados, não foram identificados em T. rangeli: cisteína sintase, ornitina decarboxilase, glutamilespermidina sintase e ascorbato peroxidase, embora o primeiro e o último tenham sido identificados como pseudogenes. Todos os genes foram identificados em Bodo saltans, sugerindo que os mecanismos antioxidantes evoluíram antes do aparecimento do parasitismo nesse grupo. De forma geral, observou-se que a variabilidade de enzimas no sistema antioxidante a nível genômico entre tripanosomatídeos relaciona-se a adaptações específicas ao parasitismo em ampla gama de hospedeiros e sua transmissão pelos vetores e não somente ao isolamento geográfico. Entre as enzimas analisadas, duas destacam-se em relação a infectividade e virulência em tripanosomatídeos patogênicos, a tripanotiona redutase (TRed) e triparedoxina peroxidase em suas isoformas citosólica (TRPxcit) e mitocondrial (TRPxmit). O gene da TrTRed possui uma ORF de 1.473 pb (~490 aa/ 53 kDa) estando presente em cópia única no genoma haploide de T. rangeli. A análise da proteína predita da TrTRed revelou a presença de dois domínios relacionados à ação oxidoredutase. O gene da TrTRPxcit apresentou-se com 549 pb gerando uma proteína com 182 aminoácidos (~ 20 kDa), enquanto para TrTRPxmit a ORF possui 681pb que prediz uma sequência de 266 aminoácidos (~25 kDa). A análise das sequências aminoacídicas deduzidas da TrTRPxcit e TrTRPxmit revelou a presença dos domínios VCP e ICP, respectivamente, além das cisteínas peroxidásica (Cp) e de resolução (Cr). A análise da expressão gênica e proteíca de TrTREd, TrTRPxcit e TrTRPxmit revelou ausência de expressão significativa estágio-específica, porém a espressão da TRed é significativamente maior em T. cruzi do que em T. rangeli. O estresse oxidativo gerado pela adição de H2O2 não induziu alterações significativas na expressão de nenhuma proteína analisada. A presença de antioxidantes como N-acetilcisteína (NAC) e glutationa reduzida (GSH) no meio induziu a proliferação de epimastigotas in vitro, mas não alterou o perfil de expressão da TrTRed ao longo do tempo. A síntese de NADPH foi reduzida e a produção endógena de H2O2 é maior em T. rangeli quando comparada a T. cruzi. Estudos enzimáticos em extratos de T. rangeli mostraram maior atividade da TRed em epimastigotas do que em tripomastigotas. A superexpressão da proteína TrTRed não influenciou o crescimento ou o processo de diferenciação em tripomastigotas in vitro e os parasitos transfectados (TRed+) mostraram aumento na resistência ao estresse induzido pelo H2O2. Conclui-se que o T. rangeli apresenta uma maquinaria de defesa antioxidante semelhante ao T. brucei e ao T. cruzi em função de presença/ausência de genes e quanto à similaridade nas sequências, respectivamente. Além disso, a TrTRed parece não ser a principal envolvida na resposta do T. rangeli ao ambiente oxidante em células do hospedeiro vertebrado, mas possui papel crucial durante a infecção do hospedeiro invertebrado. Abstract : Trypanosoma rangeli belongs to the Order Kinetoplastea, an ancestral group of protists containing a variety of free-living and parasitic species with distinct mechanisms of antioxidant defence. In this study we have characterized in silico the enzymes directly or indirectly involved on the T. rangeli response t oxidative stress and to comparatively characterize to its orthologs on other kinetoplastids. Ornithine decarboxylase, glutamyl spermidin synthase were not found on the T. rangeli genome while cysteine synthase and ascorbate peroxidase were found as pseudogenes. Since all genes related to antioxidant defence were found on Bodo saltans we hypothesize that such mechanism has evolved prior the parasitic lifestyle. As a rule, we have observed that genomic variability among the antioxidant system genes from trypanosomatids are related to specific adaptations to a parasitic lifestyle between distinct hosts and vectors instead of geographical isolation. Among the studied enzymes, the trypanotion reductase (TRed) and the cytosolic (TRPxcit) and mitochondrial (TRPxmit) forms of tryparedoxin peroxidase are related to virulence and infectivity. The T. rangeli TRed (TrTRed) is a singe-copy gene and has an ORF of 1.473 bp (~490 aa/ 53 kDa) and the predicted TrTRed proteins revealed two oxidoreductase-related domains. The TrTRPxcit gene is 549 bp long coding to a 182 aa protein (~ 20 kDa) while the TrTRPxmit is 681 bp long, predicting to 266 aa protein (~25 kDa). Both TrTRPxcit and TrTRPxmit proteins revealed the presence of the VCP and ICP domains, respectively, along the peroxidatic cysteine (Cp) and resolving cysteine (Cr). The transcription and expression profiles of TrTREd, TrTRPxcit and TrTRPxmit revealed the no stage-specific differences, but was significatly higher in T. cruzi than T. rangeli. No differences on expression were observed for any of the analyzed genes when parasites were exposed to an H2O2-induced stress. Addition of antioxidants such as NAC and GSH on the culture media induced proliferation of epimastigotes in vitro, not altering the TrTRed expression overtime. NADPH generation is lower and production of endogenous H2O2 is higher in T. rangeli Choachí strain than in T. cruzi Y strain epimastigotes. Enzymatic assays revealed an increased activity of TRed on T. rangeli epimastigotes than trypomastigotes. Overexpression of TrTRed has no influence on the growth or on the in vitro differentiation to trypomastigotes, but transfectants revealed an increased resistance to a H2O2-induced stress. Based on the presence/absence of genes and on the sequence similarity, the T. rangeli antioxidant machinery is related to T. brucei and to T. cruzi, respectively. Also, TrTRed seems not to be the main enzyme involved on the T. rangeli response to the oxidative stress on the mamalian host, but having crucial relevance on the infection of the insect vectors.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015 O Trypanosoma cruzi e o Trypanosoma rangeli são duas espécies de protozoários de ocorrência simpátrica entre as Américas do Sul e Central e que compartilham os mesmos hospedeiros invertebrados, hospedeiros mamíferos silvestres e domésticos, incluindo seres humanos. Uma vez que infecções mistas T. rangeli/T. cruzi já foram relatadas para diversos hospedeiros, buscamos gerar ferramentas para analisar a dinâmica da co-infecção, tendo gerado cepas de ambas as espécies que expressassem marcadores fluorescentes diferentes. Após a obtenção das cepas transfectadas, as mesmas foram clonadas e ensaios de PFGE confirmaram a integração dos plasmídeos pTREXmRFP/pTREXnGFP-Neo, pTREXmRFP-Hygro e pROCKGFP-Neo no genoma dos parasitos. Com estas ferramentas foi possível realizar um estudo quantitativo da cinética da infecção mista e das variações populacionais dos parasitos em ambos os hospedeiros mamífero e invertebrado. A avaliação do crescimento em diferentes proporções das duas espécies em co-cultivo axênico em meio LIT não revelou diferenças significativas se comparado ao cultivo isolado de cada cepa. Infecções de células THP-1 com os parasitos transfectados revelou uma diferença significativa no que diz respeito às cepas selvagens e transfectadas de T. cruzi, sendo caracterizada por um número menor de formas amastigotas por célula infectada em relação à cepa parental nos tempos de 2, 4, 8 e 24 h de infecção, porém ao comparar as taxas e tempos de multiplicação de cada uma das cepas, as diferenças não foram significativas. Ensaios preliminares in vitro da interação de hemócitos extraídos de Rhodnius prolixus com uma cepa de T. rangeli transfectada com o plasmídeo pTREXnGFP-Neo permitiram evidenciar uma rápida interação do parasito com estes tipos celulares, sendo registrada a internalização em várias situações, não sendo evidenciados sinais de multiplicação do T. rangeli nestes tipos celulares. Foram também realizados ensaios preliminares in vivo de co-infecção de Rhodnius prolixus por T. cruzi e T. rangeli, revelando uma resposta diferencial frente à infecção exclusiva pelo T. cruzi e T. rangeli em relação à co- infecção neste vetor. Em camundongos Balb/C a infecção prévia pelo T. rangeli não foi capaz de gerar uma proteção significativa contra a infecção subsequente pelo T. cruzi, porém é capaz de gerar uma redução da parasitemia causada pelo T. cruzi além de aumentar a sobrevida dos animais infectados.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014. A família das trans-sialidases (TS) é a maior família gênica de Trypanosoma cruzi. O grupo II da superfamília TS reúne diversas glicoproteínas (entre elas, a gp82 e a gp85) presentes na superfície das formas tripomastigotas do T. cruzi. A gp82 está envolvida no processo de adesão do parasito à célula hospedeira e a gp85 na adesão e penetração. Embora sialidases estejam presentes no T. rangeli, a função destas proteínas no ciclo de vida deste parasito ainda não foi esclarecida. Em função disso, o objetivo deste estudo foi estudar os genes de T. rangeli relacionados à superfamília das TS e avaliar a expressão heteróloga da gp82 de T. cruzi por T. rangeli (T. rangeli-gp82). Inicialmente, foram identificadas no genoma do T. rangeli oito ORFs completas similares a gp82 e gp85 de T. cruzi. Por se tratar de várias cópias gênicas, diferentes sequências foram analisadas a partir de amplificação e clonagem destes genes em duas cepas de T. rangeli. As sequências avaliadas continham de um a dois motivos Asp, um motivo subterminal, sítio de ancoramento a GPI e um domínio que pertence a superfamília das glucanases/lectina tipo Concanavalina A. Após a obtenção da cepa recombinante T. rangeli-gp82, observou-se que a gp82 foi expressa na superfície dos parasitos de forma semelhante ao T. cruzi. Além disso, a expressão da gp82 não interferiu nos padrões de crescimento e de diferenciação in vitro do T. rangeli. Em ensaios de interação destes parasitos com células Vero, verificamos um maior número de parasitos da cepa T. rangeli-gp82 nas células hospedeiras em relação à cepa selvagem, além de um maior número de parasitos aderidos às células em relação as demais cepas analisadas. Tanto as formas epimastigotas quanto tripomastigotas de T. rangeli-gp82 foram capazes de mobilizar cálcio intracelular. Estes resultados diferem do observado na interação com células THP-1, onde não verificamos diferença significativa entre T. rangeli-gp82 e as demais cepas analisadas. Em triatomíneos, verificamos que a cepa T. rangeli-gp82 apresenta desenvolvimento semelhante à cepa selvagem, sendo capaz de colonizar a hemolinfa e invadir as glândulas salivares de R. prolixus. Em camundongos, tripomastigotas de todas as cepas de T. rangeli foram observados na corrente sanguínea de animais C57BL/6 infectados via intraperitoneal, porém não foi observada proliferação, sendo a cinética parasitêmica similar para todas as cepas do T. rangeli. Quando estes camundongos foram desafiados com T. cruzi, não observamos alteração na parasitemia deste parasito em relação à infecção controle, entretanto houve uma diminuição do parasitismo tecidual por este parasito nos animais pré-infectados com as três cepas de T. rangeli, principalmente T. rangeli-selvagem e GFP. Com estes resultados, podemos inferir que a proteína gp82 facilita a adesão e penetração do parasito a célula hospedeira, entretanto a expressão desta proteína pelo T. rangeli não promove uma proteção substancial contra a infecção por T. cruzi.