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Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Horse breeding industry is an activity in ascension worldwide, and is responsible for generating jobs and income. In Brazil, especially in Rio Grande do Sul state, there are several horse breeding farms with high-standard equines. Although these herds are under strict sanitary control, the occurrence of respiratory diseases is an important cause of mortality in foals and reduced athletic performance. Among the respiratory diseases, equine rhodococcosis, caused by the bacterium Rhodococcus equi, is the major cause of pneumonia in foals. Rhodococcus equi is worldwide distributed, and have emerged as an important cause of economic losses due to pneumonia in young animals. However, preventive measures and effective control of the disease are still challenges to be reached. In R. equi infection, iron (Fe) is classified as an essential element not only for the bacterium multiplication, but also as a key for the expression of virulence factors. Studies have shown the presence of specific Fe uptake mechanisms in R. equi, which have been determining its survival in both saprophytic and pathogenic life styles. However, as a type of nutritional immunity, mammals, including horses, reduce the plasmatic concentration of Fe through its binding in proteins, including the transferrin (Tf). In this context, the present thesis was developed to study aspects related to metabolism and acquisition of Fe by R. equi and Fe importance in the pathogenesis of equine rhodococcosis (manuscript 1), control and treatment of infections caused by R. equi through drugs with capability to reduce the availability of intracellular Fe (manuscript 2), and genetic susceptibility to R. equi pneumonia (manuscript 3), including the assessment of polymorphisms in the equine Tf gene as risk factors related to susceptibility and/or resistance to equine rhodococcosis (manuscript 4 ). We conclude that R. equi is evolving to specialize it in the acquisition and utilization of Fe from the host, skills that should be considered as key points for the development of chemotherapeutic agents. Once R. equi encodes redundant mechanisms of acquisition and utilization of Fe, it is likely that chemotherapeutic agents will need act on multiple cellular mechanisms or be used in combination. Furthermore, the term "nutritional immunity" may be considered an important strategy to minimize antimicrobial resistance observed in R. equi. As an example of chemotherapy associated with iron metabolism, we observed that chloroquine inhibits the intracellular multiplication of R. equi, most likely due to intracellular iron deprivation. However, further studies are necessary to evaluate the chloroquine therapeutic potential against R. equi infections. We also observed important chromosomal regions positively associated with R. equi pneumonia, which seem to possess genes associated with immune response against intracellular pathogens. This observation allows us to classify the equine rhodococcosis as a disease of polygenic basis, as postulated by previous studies. Finally, we found that polymorphisms in the Tf gene, including some not described yet in the literature, occur in Brazilian Sport Horses and Brazilian Thoroughbred Horses. There is the occurrence of two alleles between the breeds studied, including heterozygosis for these alleles. We believe that there is a relationship between equine Tf variants, and genetic susceptibility to R. equi pneumonia in the breeds evaluated. Summarizing, we have demonstrated that the modulation of Fe availability may be a useful approach to control the disease. A equideocultura é uma atividade em ascensão mundial, responsável pela geração de empregos e renda. No Brasil, em especial no Rio Grande do Sul, encontram-se diversos locais de criação de equinos de alto padrão zootécnico. Embora estes rebanhos estejam sob rigoroso controle sanitário, a ocorrência de doenças respiratórias é causa importante de mortalidade em potros e redução de seu desempenho atlético. Dentre as doenças respiratórias, a rodococose equina, causada pela bactéria Rhodococcus equi, é a principal causa de pneumonia nesta categoria animal. R. equi está distribuído mundialmente, e cresce como causa de perdas econômicas devido à pneumonia observada em animais jovens. No entanto, medidas preventivas e efetivo controle da enfermidade são ainda desafios a serem alcançados. Na infecção por R. equi, o ferro (Fe) apresenta-se como um elemento fundamental não somente para multiplicação da bactéria, mas também, como um determinante para a expressão de fatores de virulência. Estudos têm demonstrado a presença de mecanismos específicos de captação de Fe em R. equi, os quais determinam sua sobrevivência tanto durante seu estilo de vida saprófito quanto patogênico. Em contrapartida, como uma forma de imunidade nutricional, mamíferos, entre eles os equinos, diminuem a concentração plasmática de Fe através de sua ligação em proteínas, entre elas, a transferrina (Tf). Neste contexto, esta tese foi elaborada visando contemplar aspectos relacionados ao metabolismo e aquisição de Fe por R. equi e sua importância para patogenia da rodococose equina (manuscrito 1), controle e tratamento de infecções por R. equi através de drogas com capacidade de modular a disponibilidade de Fe intracelular (manuscrito 2), e susceptibilidade genética à pneumonia por R. equi (manuscrito 3), incluindo a avaliação de polimorfismos no gene da Tf equina como fatores de risco relacionados à susceptibilidade e/ou resistência genética à rodococose equina (manuscrito 4). Concluímos que R. equi está evoluindo de forma a especializar-se na aquisição e utilização de Fe a partir do hospedeiro, habilidades que devem ser consideradas como pontos chave no desenvolvimento de agentes quimioterápicos. Uma vez que R. equi codifica redundantes mecanismos de aquisição e utilização de Fe, é provável que agentes quimioterápicos deverão inibir múltiplos mecanismos ou ser utilizados em combinação. Além disso, o conceito de imunidade nutricional pode considerado uma importante estratégia para minimizar a resistência antimicrobiana observada em R. equi. Como um exemplo de quimioterápicos associados ao metabolismo de Fe, observados que chloroquine inibir a multiplicação intracelular de R. equi, muito provavelmente devido à deprivação de Fe intracelular. No entanto, ainda são necessários estudos avaliando o potencial terapêutico de chloroquine como tratamento alternativo de infecções por R. equi. Observou-se, também, importantes regiões cromossômicas positivamente associadas à pneumonia por R. equi, as quais parecem possuir genes associados à resposta imune contra patógenos intracelulares. Esta observação nos permite classificar a rodococose equina como uma enfermidade de base poligênica, como postulado por estudos anteriores. Por fim, verificamos que polimorfismos no gene da Tf, inclusive polimorfismos ainda não descritos na literatura, ocorrem em equinos das raças Brasileiro de Hipismo e Puro Sangue de Corrida, criados no Brasil. Existe a ocorrência de dois alelos entre as raças estudas, incluindo animais heterozigotos para estes alelos. Acredita-se que exista uma relação entre variantes de Tf equina e susceptibilidade genética à pneumonia por R. equi nas raças analisadas. Em suma, demonstrou-se através de diferentes estudos que a modulação da disponibilidade de Fe pode ser uma forma de controle da rodococose equina.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico The goal of this study was to determine the occurrence of two resistance mechanisms described in micro-organisms, but not described in R. equi isolates from horses and environment samples. The first mechanism studied it was the biofilm formation in R. equi isolates from clinical (n=41) and fecal (n=72) equine samples. In order to verify the biofilm formation it was employed the biofilm-culturing assay (with and without glucose supplementation) and the epifluorescence microscopy method. Biofilm-producers R. equi isolates (n=8) were selected and analyzed by two in vitro susceptibility tests with three antimicrobial agents belonging to macrolides group and commonly used in equine rhodococcosis treatment. The biofilm formation was observed in 80.5% of fecal and 63.4% of clinical isolates of R. equi. The methods used in this study were useful to verify the biofilm formation by R. equi isolates. However, the glucose supplementation was an important factor for biofilm formation in fecal samples. Antimicrobial resistance was demonstrated in biofilm antimicrobial susceptibility test. The second mechanism studied included the efflux system in R. equi isolates from clinical (n=30), fecal (n=30) and soil (n=30) sources. The presence of req_39680 gene, encoding a putative efflux system, was determined by PCR. Phenotypic expression of efflux systems was determined in agar containing ethidium bromide. The req_39680 gene was detected in 60% of the isolates and the phenotypic expression in 20%. In clinical isolates was observed high correlation between the presence of this gene and the expression of efflux systems. Both mechanisms studied were demonstrated in R. equi and may be contributing to increase the antimicrobial resistance, as well as to be associated to the survival of R. equi in the environment and host. O objetivo do presente estudo foi determinar a ocorrência de dois mecanismos de resistência descritos em micro-organismos, porém, ainda não verificados em isolados de R. equi provenientes de amostras de equinos e de solo. O primeiro mecanismo estudado foi a formação de biofilmes em isolados de R. equi de amostras clínicas (n=41) e fecais (n=72) de equinos. Para verificação da formação de biofilmes empregaram-se as técnicas de formação de biofilme em cultura (com e sem a suplementação de glicose) e a microscopia de epifluorescência. Oito isolados formadores de biofilme foram selecionados e submetidos a testes de susceptibilidade frente a três antimicrobianos da classe dos macrolídeos, comumente utilizados no tratamento da rodococose equina. A formação de biofilmes foi observada em 80,5% dos isolados fecais e em 63,4% dos clínicos. Os métodos utilizados neste estudo foram adequados para verificar a formação de biofilmes nos isolados de R. equi. No entanto, foi constatado que a glicose é um substrato importante para formação de biofilme em isolados de origem fecal. Nos testes de susceptibilidade observou-se resistência aos antimicrobianos testados apenas quando os isolados de R. equi foram desafiados na forma de biofilme. O segundo mecanismo explorado envolveu a pesquisa de sistema de efluxo em isolados de R. equi de origem clínica (n=30) fecal (n=30) e de solo (n=30). Neste estudo buscou-se identificar a presença de um gene denominado req_39680, o qual foi descrito como codificador de um possível sistema de efluxo, Por fim, avaliou-se a expressão fenotípica de mecanismo de efluxo nos isolados analisados. A presença do gene req_39680, foi determinada por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e a análise da expressão fenotípica de mecanismo de efluxo foi visualizada em ágar contendo brometo de etídeo. Foi evidenciada a presença do gene req_39680 em 60% dos isolados e a expressão fenotípica em 20%. Nos isolados de origem clínica, um alto índice de correlação entre a presença do gene estudado e a expressão de mecanismo de efluxo foi observada. Ambos os mecanismos estudados estão presentes em R. equi e podem estar contribuindo para a crescente resistência aos antimicrobianos, bem como, estar relacionados à sobrevivência de R. equi tanto no ambiente quanto no hospedeiro.

A bactéria do gênero Campylobacter está comumente envolvida em surtos de abortos ovinos em muitos países. No Brasil, até o presente momento, ainda não houve relato sobre a ocorrência de aborto em ovinos causado pelo C. fetus, subespécie fetus (C. fetus ssp. fetus). No presente trabalho, relata-se a detecção deste agente em fetos e natimortos ovinos naturalmente infectados. Desse modo, alerta-se para a possibilidade de novos casos de aborto em ovinos causados por C. fetus ssp. fetus. The bacteria of genus Campylobacter spp, is commonly involved in outbreaks of ovine abortion in many countries. In Brazil, until now, there has been no report on the occurrence of abortion in sheep caused by C. fetus subsp. fetus. In this paper, we report the detection this bacteria in ovine fetuses naturally infected. Thus, alert for possible cases of abortion in sheep caused by C. fetus subsp. fetus.

A bactéria do gênero Campylobacter está comumente envolvida em surtos de abortos ovinos em muitos países. No Brasil, até o presente momento, ainda não houve relato sobre a ocorrência de aborto em ovinos causado pelo C. fetus, subespécie fetus (C. fetus ssp. fetus). No presente trabalho, relata-se a detecção deste agente em fetos e natimortos ovinos naturalmente infectados. Desse modo, alerta-se para a possibilidade de novos casos de aborto em ovinos causados por C. fetus ssp. fetus.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Otitis, pyodermitis and contaminated wounds are common pathologies in company animals and are frequently infected and/or coinfected with bacteria resistant to conventional antibiotics. The treatment of those lesions is a challenge at veterinary clinics; therefore, new therapeutic options are needed to deal with those pathogens. In this context, the photodynamic therapy (PDT) emerges as an alternative once it has been used efficiently on different microorganisms’ inactivation. The PDT consists of the use of a photosensitizer that, when irradiated with light, react with molecular oxygen, generating reactive oxygen species (ROS), which are toxic to bacterial cell, promoting its inactivation. The tetracationic porphyrin 3H2TMeP and 4-H2TMeP are photosensitizer that stand out for being water soluble, positively charged (favoring its biding with the bacterial cell, negatively charged), do not stain the animal skin, and are commercially available. This dissertation aimed to evaluate the PDT in vitro efficacy utilizing tetracationic porphyrins against to multidrug resistant bacteria isolated from superficial lesions of dogs, cats, and horses, both in monoculture and in bacteria associations (polyculture). To evaluate the antibacterial activity front to monocultures, was used isolates of Staphylococcus pseudointermedius, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Serratia marcescens with multidrug resistant profile. Solutions of those bacteria were incubated with each one of porphyrins at a non-cytotoxic concentration for eukaryotic cells (40µM), and exposed to light for 0, 15 and 30 minutes for Gram-positive, and 0, 30, 60 and 90 minutes for Gram-negative bacteria, or maintained at dark (control). Then, the solution was plated in culture media, which were incubated at 37ºC for 24 hours, when was realized the plate counting of colonies former units (CFU) and compared to the control plates. The porphyrin 4H2TMeP was able to totally inactivate S. pseudointermedius e P. aeruginosa isolates and significantly reduced the concentration of E. coli, K. pneumoniae, e S. marcescens. So, it was chosen for polyculture assays and evaluation of atomic force assays. Polycultures of multidrug resistant of S. pseudointermedius and P. aeruginosa; E. coli and Proteus mirabilis; P. aeruginosa and P. mirabilis; S. pseudointermedius and E. coli; Staphylococcus pseudointermedius and P. mirabilis; was incubated with 40µM of 4-H2TMeP porphyrin and irradiated with the same conditions as in monocultures, for 0, 30 and 90 minutes. There was a significant reduction of bacteria concentration, with totally inactivation of E. coli and S. pseudointermedius, P. aeruginosa and S. pseudointermedius, P. aeruginosa and Proteus mirabilis associations. PDT effect at adhesion force on the bacteria wall, indicated weakness at Gram-positive bacteria, and a hardness at Gram-negative bacteria related to control. Both alterations may cause difficult the bacteria survive and multiplication. The porphyrin 4H 2 TMeP i n vitro results demonstrated that the PDT utilizing the was effective against multidrug resistant bacteria, both in pure cultures (monocultures) as in polycultures and validate this therapy for animal´s t permit to plan future studies to reatment of integumentary lesions. Otites, piodermites e feridas contaminadas são patologias muito comuns em animais de companhia e, frequentemente, estão infectadas e/ou coinfectadas por bactérias resistentes aos antimicrobianos convencionais. O tratamento dessas lesões é um desafio na clínica veterinária e, por isso, novas opções terapêuticas são necessárias no combate desses patógenos. Neste contexto, a terapia fotodinâmica (PDT) tem sido estudada com a finalidade de ser utilizada como um método de inativação de diferentes microrganismos. A PDT consiste no uso de um fotossensibilizador que, quando irradiado pela luz, reage com o oxigênio molecular, gerando espécies reativas de oxigênio, as quais são tóxicas para a célula bacteriana, promovendo a sua inativação. As porfirinas tetracatiônicas 3-H2TMeP e 4-H2TMeP são fotossensibilizadores que se destacam por serem hidrossolúveis, carregadas positivamente (favorecendo sua ligação com a célula bacteriana, carregada negativamente), não mancharem a pele dos animais, e estarem disponíveis comercialmente. Assim, esta dissertação teve como objetivo avaliar a eficácia da PDT in vitro utilizando porfirinas tetracatiônicas frente a bactérias multirresistentes isoladas de lesões superficiais de cães, gatos e equinos, tanto em monocultivos quanto em associações bacterianas (policultivos). Para a avaliação da atividade antibacteriana em monocultivos foram utilizados isolados clínicos de Staphylococcus pseudointermedius, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Serratia marcescens com perfil de multirresistência aos antimicrobianos. Soluções dessas bactérias foram incubadas com cada uma das porfirinas em concentração não-citotóxica para células eucariotas (40µM), e expostas à luz por 0, 15 e 30 min para Gram-positivas, e 0, 30, 60 e 90 min para bactérias Gram-negativas, ou mantidas no escuro (controle). Em seguida, a solução foi plaqueada em meios de cultivo, que foram incubados a 37ºC por 24 h, quando foi realizada a contagem das unidades formadoras de colônia (UFC) e comparadas com o controle. A porfirina 4-H2TMeP foi capaz de inativar completamente isolados de S. pseudointermedius e P. aeruginosa, e reduzir significativamente a concentração de E. coli, K. pneumoniae, e S. marcescens. Desta forma, foi selecionada para os ensaios em policultivos e para a avaliação de força atômica. Policultivos de representantes multirresistentes de S. pseudointermedius e P. aeruginosa; E. coli e Proteus mirabilis; P. aeruginosa e P. mirabilis; S. pseudointermedius e E. coli; S. pseudointermedius e P. mirabilis; foram incubados com 40µM de 4-H2TMeP e irradiados nas mesmas condições dos monocultivos, por 0, 30 e 90 min. Houve uma redução significativa nas concentrações bacterianas, inclusive inativando completamente as associações de E. coli e S. pseudointermedius, P. aeruginosa e S. pseudointermedius, P. aeruginosa e Proteus mirabilis. O efeito da PDT sobre a força de adesão na parede bacteriana, indicou fragilidade em Gram-positiva, e maior rigidez em Gram-negativa em relação ao controle. Ambas as alterações dificultam a sobrevivência e multiplicação bacteriana, e indicam que a porfirina interfere na integridade da parede bacteriana. Os resultados obtidos nestes ensaios in vitro demonstraram que a PDT utilizando a porfirina 4-H2TMeP foi eficiente frente a bactérias multirresistentes tanto em culturas puras como em policultivos, e permitem o planejamento de futuros estudos para a validação desta terapia no tratamento de lesões tegumentares de animais.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq Equine adenitis is a highly contagious acute inflammatory disease that affects the upper respiratory tract of horses and responsible for large economic losses and deficit in the performance of affected animals. The etiologic agent, Streptococcus equi subsp. equi (SEE), has a repertoire of virulence factors that combined provide the microorganism with the ability to infect and cause disease in horses. Worldwide, equine adenitis is considered the horse disease with the highest number of notifications. Thus, tools and strategies aimed to improve the prevention of equine adenitis outbreaks are extremely necessary and a matter of investigation in several laboratories worldwide. In this scenario, one of the objectives of this study was the standardization of an ELISA to detect horse antibodies to SEE. The antigen we used was extracted from the surface of SEE cultivated in liquid media. For this purpose, the liquid culture was centrifuged and the bacterial pellet obtained was solubilized in an aqueous solution with 0.025% sodium deoxycholate. After a process of centrifugation and dialysis, the antigen was used to sensitize three different commercial ELISA plates. In addition to the best plate, the best concentrations of antigen and dilution of equine sera were also evaluated. Once optimized, the assay had the following configuration: MaxiSorp® plates, sensitized with 1.2 μg of the extracted antigen, and equine sera tested at a dilution of 1:100. With these settings and a cutoff of OD450nm 0.250, the assay had 100% specificity and 95.9% sensitivity. A second objective of this study was to evaluate in Swiss mice the immunogenicity and protecting capability of 4 different SEE bacterin. For this purpose, two strains of SEE (ATCC and VE) were cultivated and the raw (RA) or processed antigen (PA) was used to formulate four distinct vaccines: ATCC RA, ATCC PA, VE RA and VE PA which were inoculated in mice twice, 14 days apart. Two weeks after the second immunization the mice were challenged intranasally. After the experimental challenge, clinical signs, weight loss, survival and nasal cavity colonization were monitored. At the end of the experiment, 83.3% of the mice vaccinated with formulations based on SEE VE (RA and PA) survived the challenge. Protection in groups immunized with SEE ATCC vaccines varied according to the antigen formulation. With the exception of SEE ATCC PA, all formulations resulted in significantly (p

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Infectious keratoconjunctivitis (IBK) is the most important eye disease in ruminant worldwide and, although it is not fatal, it can cause large losses in animal production. The primary agent of the disease is Moraxella bovis, but M. ovis and M. bovoculi are commonly isolated from animals with IBK. The therapeutic measures available for its control have limited success and generate high costs, justifying the importance of searching for new treatment alternatives. Photodynamic therapy is a method that uses photoactive molecules, such as porphyrins, that interact with light generating reactive oxygen species that cause cell death. Thus, this dissertation aimed to evaluate the antibacterial activity of tetra-cationic metalloporphyrins (H2TMeP and ZnTMeP) against isolates and reference strains of Moraxella spp., in vitro, in an ex vivo model and on sessile cells. In experiment 1 (chapter 1) the antibacterial activity of porphyrins against planktonic cells of Moraxella spp. in vitro and ex vivo. For in vitro analysis, each porphyrin (4.0 μM) was incubated with ~1x104 colony forming units (CFU) per mL of each Moraxella spp. (n=22). This solution (200 μL) was exposed to artificial light for 0; 2.5; 5.0 and 7.5 min, or kept in the dark (control) and then plated and incubated for 24 h for CFU quantification. All clinical isolates and reference strains of Moraxella spp. were completely inactivated by ZnTMeP porphyrin within 7.5 min of irradiation. H2TMeP did not show antibacterial activity against Moraxella spp., therefore, the other experiments were performed only with the porphyrin ZnTMeP. For the ex vivo assay, corneas excised from the eyeballs of slaughtered cattle were irrigated with a culture of Moraxella spp. (~1x104 CFU/mL) followed by addition of porphyrin. The pieces were irradiated by 0; 7.5 and 30 min, or kept in the dark. Corneal swabs were collected and seeded for CFU quantification. ZnTMeP promoted a significant reduction (p

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Bovine genital campylobacteriosis (BGC) is an important reproductive disease of the venereal nature, caused by the bacterium Campylobacter fetus subsp. venerealis and entails worldwide economic losses. The main virulence factors of this agent are related to adhesion, motility, surface proteins, production of toxins and secretion and regulation systems. This pathogen has surface proteins (SapA), which are considered important in the pathogenesis of CGB due to antigenic variation and are responsible for the persistence of infection in the bovine genital tract. Sampling and diagnosis are laborious, and the recommended samples for diagnosis are muco vaginal, preputial smegma and semen, placenta and aborted fetuses. The prevention and control of this disease are based on vaccination, the use of bulls negative for the disease and the implementation of artificial insemination programs. In order to simplify the laboratory procedures, this study aimed to standardize the production of a chimeric protein of C. fetus and evaluate its potential as a tool for the diagnosis and prevention of BGC. Using nine sapA sequences of C. fetus gene publicly available, two regions were determined for the construction of a synthetic gene, called sapAN78, with the possibility of cloning and expression of the whole gene and also of the two subunits. The whole fragment and subunits were cloned into plasmid pAE, expressed by Escherichia coli BL21 (DE3) pLySs and purified by nickel affinity chromatography. Recombinant chimera of approximately 60 kDa and subunits were obtained in significant amounts as inclusion bodies, solubilized with urea and detected by Western blot with anti-polyhistidine monoclonal antibody and by antibodies present in BGC positive bovine serum. rSapAn78 was used for rabbit hyperimmunization, presenting seroconversion from the first immunization and the antibodies produced at the end of the hyperimmunization protocol were avid by the ammonium thiocyanate assay. These antibodies also recognized the rSapAn78 in Dot blot as well as rSapAn78 and native proteins in C. fetus strains by Western blot and ELISA. In this way, the immunogenicity and antigenicity of the constructed chimeric protein and its potential for applications in future research for the diagnosis and prevention of BGC were demonstrated. A campilobacteriose genital bovina (CGB) é uma importante enfermidade reprodutiva de caráter venéreo, causada pela bactéria Campylobacter fetus subsp. venerealis e que acarreta perdas econômicas mundialmente significativas. Os principais fatores de virulência deste agente são relacionados com a adesão, motilidade, proteínas de superfície, produção de toxinas e sistemas de secreção e regulação. Esse patógeno possui proteínas de superfície (SapA), as quais são consideradas importantes na patogenia da CGB por apresentar variação antigênica e são responsáveis pela persistência da infecção no trato genital bovino. A colheita de amostras e o diagnóstico são bastante laborioso, sendo as amostras preconizadas para o diagnóstico são muco vaginal, esmegma prepucial e sêmen, placenta e fetos abortados. A prevenção e o controle desta enfermidade baseiam-se na vacinação, no uso de touros negativos para a enfermidade e implementação de programas de inseminação artificial. Com o intuito de simplificar as análises laboratoriais, este estudo objetivou a padronização dos processos de produção de uma proteína quimérica recombinante de C. fetus e avaliação de seu potencial como ferramenta para o diagnóstico e prevenção da CGB. Utilizando as sequências dos nove genes homólogos de sapA de C. fetus publicamente disponíveis, foram determinadas duas regiões para a contrução de um gene sintético, denominado sapAN78, com a possibilidade da clonagem e expressão do gene total e também das duas subunidades. O fragmento total e as subunidades foram clonados no plasmídeo pAE, expressos em Escherichia coli BL21(DE3) pLySs e purificados por cromatografia de afinidade ao níquel. A quimera recombinante de aproximadamente 60 kDa e as subunidades foram obtidas em quantidades significativas como corpos de inclusão, solubilizadas com ureia e detectadas por Western blot com anticorpo monoclonal anti-polihistidina e por anticorpos presentes no soro de bovinos positivos para CGB. A rSapAn78 foi utilizada para hiperimunização de coelhos, apresentando soroconversão desde a primeira imunização e os anticorpos produzidos ao final do protocolo de hiperimunização demonstraram-se ávidos ao ensaio com tiocianato de amônio. Estes anticorpos também reconheceram a rSapAn78 em testes de Dot blot, bem como a rSapAn78 e as proteínas nativas em cepas de C. fetus por Western blot e ELISA. Desta forma, demonstrou-se a imunogenicidade e antigenicidade da proteína quimérica contruída e seu potencial para aplicações em pesquisas futuras para o diagnóstico e prevenção da CGB.

The sanitary conditions to which the animals are submitted in aquaculture are often inadequate, being stressing factors triggering pathological processes as bacterial infections. In this context, bacterial resistance arises through the indiscriminate and misuse of antibiotics, leading in recent years to an increase in the number of antimicrobial resistance. This growth is reflected in aquaculture, where non-responsive pathologies in fish culminate in economic and environmental losses. The large increase in antibiotic resistance and the residual effects of conventional antibiotics stimulates the search for new antimicrobial therapies of low environmental impact that can be used in the prevention and / or treatment of bacterial infections in fish. Looking for this new approach, the tree Maclura tinctoria (Moraceae), contains in its extracts components with recognized antimicrobial properties. The objective of this study was to investigate the in vitro antimicrobial activity of ethanolic extracts of the leaves, bark, sapwood and heartwood of this plant against bacteria of the genus Aeromonas obtained from naturally infected silver catfish (Rhamdia quelen). In addition, we investigated the central depressant activity of the extracts as well as their effects in silver catfish after long exposition, in order to evaluate the safety of a possible therapeutic strategy based on these extracts. In addition, the extract which presented the most promising results in the above- mentioned assays had its effect evaluated in vivo on the survival of silver catfish experimentally infected with A. hydrophila. The in vitro antimicrobial activity was evaluated by the Microdilution method in cation-adjusted-Müller-Hinton broth. The evaluation of the central depressant activity was performed by determining the induction times to the sedative and / or anesthetic state and its subsequent recovery at 30, 100 and 300 mg/L. In the long exposure test the fish were exposed to the concentrations of 30 and 100 mg/L of the extracts for 24 hours. In the in vivo antimicrobial assay, silver catfish were exposed to baths for five days with 30 mg/L of the heartwood extract. The chemical composition of the heartwood extract was analyzed by HPLC-DAD-MS. The heartwood extract showed promising in vitro antimicrobial activity, while the other samples presented weak activity. In the central depressant activity test the leaves extract was the only one to induce a stage of deep sedation, the other extracts induced the light sedation stage in the three analyzed concentrations. The long exposure experiment showed a behavior that ranged from normal to light sedation for the animals submitted to extracts of the bark, sapwood and heartwood, and the leaf extract caused a deepening of the sedation stages. The in vivo antimicrobial assay revealed a high survival rate (85.4%) of the animals exposed to the heartwood extract compared to the untreated control (6.9%) without statistical difference to florfenicol (100%). The chemical composition revealed the presence of compounds of the polyphenol class. Heartwood extract showed to be an alternative for the treatment of bacterial infections caused by A. hydrophila in silver catfish. Em aquicultura, frequentemente as condições sanitárias a que os animais são submetidos são inadequadas, sendo considerados fatores estressantes desencadeadores de processos patológicos como as infecções bacterianas. A resistência bacteriana surge nesse contexto através do uso indiscriminado e equivocado de terapias antibióticas, provocando nos últimos anos um aumento no número de casos de resistência a antimicrobianos. Esse crescimento é refletido em criações aquícolas, onde as patologias em peixes não responsivas culminam em prejuízos econômicos e ambientais. O grande aumento de resistência aos antibióticos e os efeitos residuais de seu uso convencional estimula a procura por novos agentes antimicrobianos de baixo impacto ambiental e que possam ser utilizados na prevenção e/ ou tratamento de infecções bacterianas em peixes. Buscando essa nova abordagem, a espécie vegetal Maclura tinctoria (Moraceae), contém em seus extratos componentes com propriedades antimicrobianas reconhecidas. Este estudo teve por objetivo investigar a atividade antimicrobiana in vitro de extratos etanólicos brutos de folhas, casca, alburno e cerne dessa espécie vegetal frente a bactérias do gênero Aeromonas obtidas de jundiás (Rhamdia quelen) naturalmente infectados. Adicionalmente investigamos a atividade depressora central dos extratos bem como os efeitos provocados em jundiás quando expostos aos mesmos por longo período, visando avaliar a segurança de uma possível estratégia terapêutica à base destes extratos. Além disso, o extrato que apresentou os resultados mais promissores nos ensaios anteriormente citados teve seu efeito avaliado in vivo sobre a sobrevivência de jundiás experimentalmente infectados com A. hydrophila. A atividade antimicrobiana in vitro foi avaliada pelo método de Microdiluição em caldo Müller-Hinton cátion ajustado. A atividade depressora central foi avaliada pela determinação dos tempos de indução ao estado sedativo e/ou anestésico e sua posterior recuperação em 30, 100 e 300 mg/L. No teste de longa exposição os peixes foram expostos às concentrações de 30 e 100 mg/L dos extratos por 24 horas. No ensaio antimicrobiano in vivo, os jundiás foram expostos a banhos por cinco dias com 30 mg/L do extrato do cerne. A composição química do extrato do cerne foi analisada por CLAE-DAD-MS. O extrato do cerne apresentou promissora atividade antimicrobiana in vitro, enquanto que as outras amostras apresentaram fraca atividade. No teste de atividade depressora central o extrato de folhas foi o único a induzir estágio de sedação profunda, os demais extratos induziram o estágio de sedação leve nas três concentrações analisadas. O ensaio de longa exposição demostrou que os animais submetidos aos extratos da casca, alburno e cerne apresentaram um comportamento que variou de normal à sedação leve, já o extrato de folhas provocou um aprofundamento dos estágios de sedação. O ensaio antimicrobiano in vivo revelou uma alta taxa de sobrevivência (85,4%) dos animais expostos ao extrato do cerne em comparação com o controle infectado sem tratamento (6,9%), não diferindo estatisticamente do florfenicol (100%). A composição química revelou a presença de compostos da classe dos polifenóis. O extrato do cerne mostrou ser uma alternativa para o tratamento de infecções bacterianas causadas por A. hydrophila em jundiás.

Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq Streptococcus equi subspecies equi (S. equi) is the causative agent of srangles, one of the most frequently diagnosed infectious disease worldwide. After the short duration acute disease, characterized by abscess formation in the head and neck lymph nodes, some horses remain as S. equi carriers for long periods. Equine carriers are the key point for the bacteria maintenance and occurrence of the disease continuously. Therefore, it becomes important to understand what triggers the carrier state, why not all animals can eliminate the bacteria after clinical improvement. This dissertation describes the phenotypic and genotypic characterization of S. equi strains isolated from diseased horses (n = 42) and carriers (n = 18) in the Rio Grande do Sul state. Evaluating colonies’ color and appearance, sugars fermentation tests (ribose, lac-tose, trehalose and sorbitol), capsule visualization, antimicrobial susceptibility test, biofilm formation capacity and detection of virulence factors encoding genes (hasA, hasB, hasC, eqbE, eqbG, seeH and seeI) it was possible to show considerable differences between the two groups of isolates. S. equi isolated from equine carriers presented dry, opaque and white-gray colonies (100%), capsule in small quantity (38.9%) or absent (61.1%), capable of fermenting at least two sugars tested (100%) and resistance on average to 3.6 (1-7) antimicrobials classes. On the other hand, strains isolated from diseased horses had predominantly mucoid and honey color colonies (95.2%), with a large capsule (92.8%), unable to ferment any of the sugars (92.8%) and resistant in mean to 2.1 (0-7) antimicrobials classes. A higher proportion of multiresistant strains was observed in the isolates from carrier animals group (13/18 = 72.2%) compared to the group of isolates from diseased animals (5/42 = 11.9%). Biofilm formation capacity was detected in 94.4% of the isolates from diseased animals and 78.6% from carriers, with no difference between the groups. All the equine carriers’ isolates showed deletion of the eqbE gene and 66.7% of them also in hasA and hasB genes. The loss of these gene loci by isolates from carrier horses had already been reported in another study. Thus, our results complement those of the international literature by associating the genotypic characteristics of the isolates of animal carriers with their phenotypic characteristics, and evidencing differ-ences with those isolated from horses with clinical manifestation. Further studies are needed to elucidate which other events are associated to the persistence of S.equi in the host after clinical cure. Streptococcus equi subespécie equi (S. equi) é o agente causador da adenite equina, uma das doenças infecciosas mais frequentemente diagnosticadas em todo o mundo. Após a doença aguda de curta duração, caracterizada pelo enfartamento dos linfonodos da cabeça e pescoço, parte dos equinos permanece portador da bactéria por longos períodos, sendo este o ponto chave para a manutenção do agente e ocorrência da doença de forma contínua. Em vista disso, se torna importante entender o que desencadeia o estado de portador, o motivo de nem todos os animais conseguirem eliminar a bactéria após a melhora clínica. Esta dissertação descreve a caracterização fenotípica e genotípica de cepas de S. equi isoladas de equinos doentes (n=42) e portadores (n=18) no estado do Rio Grande do Sul. Por meio da avaliação da colora-ção e aspecto das colônias, provas de fermentação de açúcares (ribose, lactose, trealose e sor-bitol), visualização da cápsula, teste de suscetibilidade aos antimicrobianos, avaliação da ca-pacidade de formação de biofilme e detecção de genes que codificam fatores de virulência (hasA, hasB, hasC, eqbE, eqbG, seeH e seeI) foi possível evidenciar diferenças consideráveis entre os dois grupos de isolados. S. equi isolados de equinos portadores apresentaram colônias opacas e branco-acinzentadas (100%), cápsula em pequena quantidade (38,9%) ou ausente (61,1%), com capacidade de fermentar pelo menos dois dos açúcares testados (100%) e resis-tência em média a 3,6 (1-7) classes de antimicrobianos. Por outro lado, cepas isoladas de e-quinos doentes apresentaram predominantemente colônias mucóides e cor de mel (95,2%), com muita cápsula (92,8%), incapazes de fermentar qualquer um dos açúcares (92,8%) e re-sistentes em média a 2,1 (0-7) classes de antimicrobianos. Foi obsevada uma maior proporção de cepas multirresistentes no grupo de isolados de animais portadores (13/18 = 72,2%) em comparação ao grupo de isolados de animais doentes (5/42 = 11,9%). Capacidade de formar biofilme foi detectada em 94,4% dos isolados de animais doentes e 78,6% de portadores, não havendo diferença entre os grupos. Todos os isolados de equinos portadores apresentaram deleção do gene eqbE e 66,7% dos mesmos também em hasA e hasB. A perda desses loci gênicos por isolados de equinos portadores já havia sido reportada em outro estudo. Desta forma, nossos resultados complementam os da literatura internacional ao associar as caracte-rísticas genotípicas dos isolados de animais portadores com suas características fenotípicas, e evidenciar diferenças com aquelas de isolados de equinos com manifestação clínica. Estudos mais aprofundados são necessários para elucidar quais outros eventos estão envolvidos na persistência de S. equi no hospedeiro após a cura clínica.

Infectious keratoconjunctivitis (IK) is the most important ocular disease in cattle and sheep. The disease represents significant economic losses in herds worldwide, since its aetiological agent is highly contagious. Moraxella bovis is considered mainly causative agent of infection, however M. ovis and M. bovoculi have also been recovered from animals with the disease. IK is documented to be a carrier disease, and these animals play a key role in maintaining the microorganism in a herd. However, it is still unclear which factors are related to the ability of Moraxella spp. survive in the conjunctiva and nasal mucosa of animals without promoting disease, as well as remain viable even after treatment with high antimicrobial dosages. In the current study, biofilm formation in M. bovis, M. ovis and M. bovoculi was considered as a factor associated with this maintenance of animals in the form of a carrier. In addition, the resistance capacity of Moraxella spp. to lysozyme, an important antibacterial enzyme present in the tear and acts as the first line of defense the invasion of the cornea by microorganisms. The resistance of microorganisms to lysozyme is associated with the ability to adhere to the cornea and to promote infection. In this research, it was evidenced that all the isolates of M. bovis (15/54), M. ovis (21/54) and M. bovoculi (18/54) tested (54/54) were able to form biofilm and were classified according to the intensity of biofilm formation. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of lysozyme were determined for 33 isolates of the three Moraxella species in planktonic cells. It was verified that MIC and MBC were quite variable intraspecies, of 79.12 μg ml-1 to values higher than 1266 μg ml-1, and there was no statistical difference in susceptibility to lysozyme among Moraxella spp. However, when tested in sessile forms, lysozyme did not have the capacity to eradicate the biofilms, but it promoted a reduction in the biofilms production. In addition, it was observed that in the consolidated biofilms there was no decrease after the addition of lysozyme, demonstrating that there is no action of this enzyme in previously established biofilms. The results of this research allow us to infer that the biofilm formation capacity of M. bovis, M. ovis and M. bovoculi and the resistance to lysozyme concentrations, equal to or greater than the physiological levels of the teat of cattle and sheep, may be linked not only to the ability to colonize the conjunctiva, but also the microorganism can remain at this site even after healing of the lesions and the infected animal will be considered a carrier and a reservoir of the etiologic agent of the disease in a herd. Ceratoconjuntivite infecciosa (CI) é a enfermidade ocular mais importante em bovinos e ovinos. A doença representa significativas perdas econômicas em rebanhos no mundo inteiro, em decorrência de sua característica altamente contagiosa. O agente etiológico primário desta enfermidade é Moraxella bovis, porém M. bovoculi e M. ovis também têm sido recuperados de animais com a doença. A CI é documentada como sendo uma doença de portador, e esses animais possuem um papel fundamental na manutenção do micro-organismo em um rebanho. Todavia, ainda, não estão claros, quais fatores estão relacionados a capacidade de Moraxella spp. sobreviver na conjuntiva e na mucosa nasal de animais sem promover doença, bem como permanecer viável mesmo após o tratamento com dosagens elevadas de antimicrobianos. No presente estudo, abordou-se a formação de biofilme em M. bovis, M. bovoculi e M. ovis como fator associado à manutenção de animais na forma de portador. Adicionalmente, pesquisou-se a resistência de Moraxella spp. à lisozima, importante enzima antibacteriana, presente na lágrima e que atua como primeira linha de defesa a invasão da córnea por micro- organismos. A resistência dos micro-organismos frente à lisozima está associada à capacidade de conseguir aderir à córnea e promover a infecção. Nesta pesquisa, foi possível evidenciar que todos os isolados de M. bovis (15/54), M. ovis (21/54) e M. bovoculi (18/54) testados (54/54) foram capazes de formar biofilme e foram classificados quanto à intensidade de formação de biofilme. A concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração bactericida mínima (CBM) da lisozima foram determinadas para 33 isolados das três espécies de Moraxella em células planctônicas. Verificou-se que CIM e CBM foram bastante variáveis intraespécies, de 79,12 μg ml-1 até valores superiores à 1266 μg ml-1, não havendo diferença estatística na susceptibilidade à lisozima entre Moraxella spp. No entanto, quando testada em formas sésseis, a lisozima não apresentou capacidade de erradicar os biofilmes, porém promoveu uma redução na produção destes e nos biofilmes consolidados não houve diminuição após o acréscimo da lisozima, demonstrando não haver ação desta enzima em biofilmes previamente estabelecidos. Com os resultados obtidos neste estudo, é possível inferir que a capacidade de formação de biofilmes por M. bovis, M. ovis e M. bovoculi e a resistência às concentrações de lisozima, iguais ou superiores aos níveis fisiológicos da lágrima de bovinos e ovinos, pode estar ligada não apenas à capacidade de colonizar a conjuntiva, mas, também, permanecer neste local mesmo após a cura das lesões, na condição de indivíduo portador e servindo como um reservatório do agente etiológico da doença em um rebanho.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Escherichia coli is a component of intestinal microbiota of animals and humans, with ability to colonize different niches, causing enteric and extra-enteric infections. Presents genetic plasticity through by acquisition and loss of genes, resulting in genotypic and phenotypic differences among them. Genotypic and phenotypic characterization of E. coli isolates from farm animals (cattle, sheep, horses and broilers) was performed. The genotypic analysis was composed by phylogenetic classification; search for virulence factors – fimbriae (F4, F5, F6, F18 and F41) and toxins (LT, STa, STb and STx2), curli (csgA) and cellulose (bcsA) – from isolates associated with bovine mastitis and feces of calves with and without diarrhea; besides the research of 29 genes related to the virulence of APEC pathotype (avian pathogenic E. coli) on two extraintestinal E. coli isolates from an avian colisepticemia outbreak. Phenotypic analysis was performed by curli and cellulose expression and biofilm formation of E. coli isolates from bovine mastitis and feces of calves with and without diarrhea; and antimicrobial susceptibility testing in all isolates, with evaluation of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) in isolates from bovine mastitis. The majority of E. coli isolates belonged commensal phylo-groups: (i) bovine mastitis: A (50%), B1 (30%), B2 (3.3%), C (6.7%), D (3.3%) and F (6.7%); (ii) feces of calves without diarrhea: B1 (83.3%), E (10%) and unknown (6.7%); (iii) feces of diarrheic calves: B1 (70%), B2 (3.33%), C (3.33%), D (3.33%), E (13.33%) and unknown (6.7%); (iv) E. coli subpopulations of calves without diarrhea: B1 (93.3%), B2 (20%) and E (46.7%); (v) E. coli subpopulations of diarrheic calves: A (6.7%), B1 (80%), D (33.3%) and E (40%); (vi) feces of foals: A (4.62%), B1 (50.77%), C (15.38%), E (21.54%), F (1.54%) and unknown (6.15%); (vii) feces of lambs: A (6.15%), B1 (81.54%), C (10.77%) and E (1.54%); (viii) extraintestinal E. coli isolates: A (100%). No isolates from bovine mastitis were positive for fimbriae and toxins, unrelated to intestinal clinical isolates. E. coli isolates from calves feces presented variable results: (i) without diarrhea: STb (66.7%), LT (56.7%) and STa (33.3%) toxins and no fimbriae; (ii) diarrheic: LT (23.3%), STa (3.3%), STb (3.3%) and STx2 (3.3%) toxins and F5 (16.7 %) and F18 (13.3%) fimbriae. The frequencies of csgA and bcsA genes were: (i) E. coli isolates from bovine mastitis: 48% and 34%, respectively; (ii) isolates from feces of calves without diarrhea: 96.7% and 83.3%, respectively; and (iii) isolates associated with diarrhea: 90% for both genes. The extraintestinal E. coli isolates from avian colisepticemia outbreak, presented several virulence factors important for Avian Pathogenic E. coli (APEC) related to adhesion (fimH, papC, mat), invasion (tia), iron acquisition system (iroN) and serum resistance (iss, ompA, traT), but divergence in others (adhesin: hrlA/hek; invasin: gimB; iron acquisition system: sitD ep. and fyuA; toxins: sat and hylA) characterizing an coinfection. In vitro biofilm formation was observed in 10% of the isolates from bovine mastitis, and curli and cellulose expression was verified in these isolates. Among the isolates from calves without diarrhea, curli and cellulose was expressed in 83.3%, and among isolates of diarrheal calves, there was 100% expression. Biofilm formation was verified in a single isolate from calves without diarrhea. Host factors may be to influence gene expression important for this mechanism. Antimicrobial resistance was observed in isolates from all animal species of this study, with emphasis to bovine mastitis isolates, which showed greater resistance to tetracycline (46%) and ampicillin (40%), with 24% and 10% multidrug resistant and ESBL isolates, respectively; and isolates from diarrhea in calves, with greater resistance to tetracycline (63,3%), ampicillin (50%), streptomycin (50%) and sulfonamide (46,7%), with 53,3% multidrug resistant isolates. The resistance rates of E. coli isolates in the present study following global trends, associated with the careless use of antimicrobials in animal production. Escherichia coli apresenta grande plasticidade genética, e possui a capacidade de colonizar diferentes nichos, causando infecções entéricas e extraentéricas. O presente estudo objetivou caracterizar genotípica e fenotipicamente isolados de E. coli oriundos de animais de produção (bovinos, ovinos, equinos e aves). A análise genotípica consistiu de classificação em grupos filogenéticos; pesquisa de fatores de virulência, como fímbrias (F4, F5, F6, F18 e F41) e toxinas (LT, STa, STb e STx2), e curli (csgA) e celulose (bcsA) para os isolados associados à mastite bovina e fezes de bezerros com e sem diarreia; além da pesquisa de 29 genes relacionados à virulência do patotipo APEC (E. coli patogênica aviária) em dois isolados extraintestinais de E. coli associados a um surto de colisepticemia em aves. A análise fenotípica foi composta pela expressão de curli e celulose e formação de biofilme in vitro nos isolados de E. coli de mastite bovina e de fezes de bezerros com e sem diarreia; e ainda teste de susceptibilidade aos antimicrobianos em todos os isolados, com avaliação da produção de beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) para os isolados associados à mastite bovina. A classificação filogenética dos isolados de E. coli possibilitou verificar a maior predominância de filo-grupos comensais. A proporção de filo-grupos foi a seguinte: (i) mastite bovina: A (50%), B1 (30%), B2 (3,3%), C (6,7%), D (3,3%) e F (6,7%); (ii) fezes de bezerros sem diarreia: B1 (83,3%), E (10%) e desconhecidos (6,7%); (iii) fezes diarreicas de bezerros: B1 (70%), B2 (3,33%), C (3,33%), D (3,33%), E (13,33%) e desconhecidos (6,7%); (iv) subpopulações de E. coli de bezerros sem diarreia: B1 (93,3%), B2 (20%) e E (46,7%); (v) subpopulações de E. coli de bezerros diarreicos: A (6,7%), B1 (80%), D (33,3%) e E (40%); (vi) fezes de potros : A (4,62%), B1 (50,77%), C (15,38%), E (21,54%), F (1,54%) e desconhecidos (6,15%); (vii) fezes de cordeiros : A (6,15%), B1 (81,54%), C (10,77%) e E (1,54%); e (viii) isolados extraintestinais de E. coli de aves: A (100%). Quanto à presença de fímbrias e toxinas, os isolados de mastite bovina foram negativos para esses fatores, não havendo relação com isolados clínicos intestinais. Os isolados de E. coli de fezes de bezerros apresentaram resultados variáveis: (i) sem diarreia: presença de toxinas STb (66,7%), LT (56,7%) e STa (33,3%) e ausência de fímbrias; (ii) diarreicos: toxinas LT (23,3%), STa (3,3%), STb (3,3%) e STx2 (3,3%) e fímbrias F5 (16,7 %) e F18 (13,3%). As frequências dos genes csgA e bcsA foram: (i) isolados E. coli oriundos de mastite bovina: 48% e 34% respectivamente; (ii) isolados oriundos de fezes de bezerros sem diarreia: 96,7% e 83,3% e (iii) isolados associados à diarreia: 90% para ambos os genes. Em relação aos isolados de E. coli extraintestinais oriundos de septicemia em ave, ambos apresentaram diversos fatores de virulência associados ao patotipo APEC, divergindo em adesinas: hrlA/hek; invasinas: gimB; sistemas de aquisição de ferro: sitD ep. e fyuA; toxinas: sat e hlyA, caracterizando uma coinfecção. A formação de biofilme in vitro foi observada em 10% dos isolados associados à mastite, sendo que a expressão de curli e celulose também foi verificada nesses isolados. Entre os isolados de bezerros sem diarreia, 83,3% expressaram curli e celulose, e entre os isolados de bezerros diarreicos 100% de expressão. Entre os isolados intestinais, a formação de biofilme foi verificada em um único isolado oriundo de bezerros sem diarreia. Resistência aos antimicrobianos foi observada em isolados de todas as espécies animais neste estudo, destacando-se os isolados de mastite bovina, que apresentaram maior resistência à tetraciclina (46%) e ampicilina (40%), com 24% de isolados multirresistentes e 10% ESBL, e os isolados associados a diarreias em bezerros, os quais apresentaram maior resistência à tetraciclina (63,3%), ampicilina (50%), estreptomicina (50%) e sulfonamida (46,7%), sendo 53,3% multirresistentes. Os isolados de E. coli avaliados no presente estudo apresentaram taxas de resistência que acompanham tendências mundiais, fortemente associado ao uso não racional de antimicrobianos na produção animal.