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Enterochromaffin-like (ECL) Zellen sind neuroendokrine Zellen der Magenschleimhaut, die eine wichtige Rolle bei der peripheren Regulation der Magensäureproduktion spielen. Nach Stimulation mit Gastrin kommt es zur calciumabhängigen Freisetzung von Histamin, das in Parietalzellen die Synthese und Sekretion von Magensäure auslöst. In vorliegender Arbeit wurden Bedeutung und Entstehung des Calciumsignals für die gastrininduzierte Histaminsekretion sowie Expression der Endozytoseproteine Amphiphysin und Dynamin untersucht. Für die Erhöhung von [Ca2+]i war die Aktivierung von InsP3-Rezeptoren, nicht jedoch die Entleerung intrazellulärer Calciumspeicher nötig. Der für die Exozytose notwendige Calciumeinstrom konnte durch Nimodipin gehemmt werden, was eine Beteilung spannungsgesteuerter L-Typ Calciumkanäle nahe legt. Alle Dynamin- und Amphiphysin-Isoformen konnten auf mRNA- und Proteinebene nachgewiesen werden. Eine neue Splice-Variante von Amphiphysin-2 wurde ebenfalls entdeckt., Enterochromaffin-like (ECL) cells are neuroendocrine cells of the gastric mucosa that are important for the peripheral regulation of gastric acid secretion. Following stimulation with gastrin, histamine is released from ECL cells in a calcium-dependent manner, inducing synthesis and secretion of gastric acid in parietal cells. In this thesis, importance and generation of the calcium signal necessary for gastrin-induced histamine secretion were investigated, as well as the expression of the endocytic proteins amphiphysin and dynamin. Activation of InsP3 receports but not calcium release from intracellular stores was nessecary for the increase in [Ca2+]i. Calcium influx could be inhibited by nimodipine, indicating involvement of voltage-activated L-type calcium channels. All known dynamin and amphiphysin isoforms could be detected on mRNA and protein levels. Furthermore, a novel splice form of amphiphysin-2 was found to be expressed in ECL cells.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde das den Neurotransmitter GABA synthetisierende Enzym GAD, der vesikuläre GABA-Transporter VGAT und GABA-Rezeptoren im Hoden von Nagern und Menschen nachgewiesen. Sowohl die Quelle von GABA, als auch GABA-Rezeptoren wurden in endokrinen Zellen des Hodens, den Testosteron bildenden Leydigzellen, lokalisiert. Weiterhin zeigten zellbiologische Untersuchungen, dass die etablierte Leydigzelllinie TM3 enzymatisch aktives GAD besitzt und auf GABAerge Stimulation mit einem Anstieg ihrer Zellproliferation reagiert. Die pharmakologische Charakterisierung der Proliferationswirkung ergab eine Übertragung durch GABA-A-Rezeptoren. Außerdem wurden die Gene c-fos und hsf-1 durch einen cDNA-Array als Bestandteile des Signaltransduktionswegs der GABA-A-Rezeptor vermittelten Wirkung nachgewiesen. Leydigzellen verfügen demnach über ein GABAerges System, wobei GABA auto- bzw. parakrin durch GABA-A-Rezeptoren die Proliferation von Leydigzellen reguliert., In context of this work the GABA synthesizing enzyme GAD, the vesicular GABA transporter VGAT and GABA receptors were identified in rodent and human testis. GABAergic sources, as well as GABA receptors were localized in testosteron producing Leydig cells in the endocrine compartment of the testis. Furthermore cell biological studies showed that the established Leydig cell line TM3 exhibits enzymatically active GAD and that GABAergic stimulation of TM3 cells leads to increased cell proliferation. Pharmacological characterization of this proliferative action of GABA revealed an GABA-A receptor mediated mechanism. Moreover the genes c-fos and hsf-1 were identified by c-DNA-array experiments to be components of the GABA-A receptor mediated signal transduction cascade. In conclusion Leydig cells posses a GABAergic system, whereby GABA regulates Leydig cell proliferation via GABA-A receptors in an auto- or paracrine manner.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde das den Neurotransmitter GABA synthetisierende Enzym GAD, der vesikuläre GABA-Transporter VGAT und GABA-Rezeptoren im Hoden von Nagern und Menschen nachgewiesen. Sowohl die Quelle von GABA, als auch GABA-Rezeptoren wurden in endokrinen Zellen des Hodens, den Testosteron bildenden Leydigzellen, lokalisiert. Weiterhin zeigten zellbiologische Untersuchungen, dass die etablierte Leydigzelllinie TM3 enzymatisch aktives GAD besitzt und auf GABAerge Stimulation mit einem Anstieg ihrer Zellproliferation reagiert. Die pharmakologische Charakterisierung der Proliferationswirkung ergab eine Übertragung durch GABA-A-Rezeptoren. Außerdem wurden die Gene c-fos und hsf-1 durch einen cDNA-Array als Bestandteile des Signaltransduktionswegs der GABA-A-Rezeptor vermittelten Wirkung nachgewiesen. Leydigzellen verfügen demnach über ein GABAerges System, wobei GABA auto- bzw. parakrin durch GABA-A-Rezeptoren die Proliferation von Leydigzellen reguliert., In context of this work the GABA synthesizing enzyme GAD, the vesicular GABA transporter VGAT and GABA receptors were identified in rodent and human testis. GABAergic sources, as well as GABA receptors were localized in testosteron producing Leydig cells in the endocrine compartment of the testis. Furthermore cell biological studies showed that the established Leydig cell line TM3 exhibits enzymatically active GAD and that GABAergic stimulation of TM3 cells leads to increased cell proliferation. Pharmacological characterization of this proliferative action of GABA revealed an GABA-A receptor mediated mechanism. Moreover the genes c-fos and hsf-1 were identified by c-DNA-array experiments to be components of the GABA-A receptor mediated signal transduction cascade. In conclusion Leydig cells posses a GABAergic system, whereby GABA regulates Leydig cell proliferation via GABA-A receptors in an auto- or paracrine manner.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle der synaptischen Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin bei Wachstum und Differenzierung der primär dissoziierten hippocampalen Zellkultur 17 Tage alter Mäuseembryonen zu untersuchen. Besonderes Interesse galt dabei dem Fortsatzwachstum und der Synaptogenese. Durch Beobachtung von Zellmorphologie und Zellwachstum wurde gezeigt, daß die Ausbildung charakteristischer Zelltypen ein intrinsischer Prozeß der hippocampalen Neurone ist. Die Synaptogenese wurde durch die Darstellung der entwicklungsabhängigen Verteilung der synaptischen Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin mittels Immunfluoreszenzmarkierung dokumentiert. Durch elektronenmikroskopische Aufnahmen wurde die Differenzierung subzellulärer Strukturen der hippocampalen Zellkultur charakterisiert und die Verteilung von Synaptophysin und Synaptobrevin entwicklungsabhängig dargestellt. Synaptophysin fand sich nicht nur in axonalen Präsynapsen, sondern auch in Dendriten. Synaptobrevin war im Gegensatz zu Synaptophysin nicht in allen synaptischen Vesikeln der Axonterminalen darstellbar. Um die Wirkungen von Synaptophysin und Synaptobrevin auf hippocampale Neurone in der Kultur genauer zu untersuchen, standen zwei Versuchsmodelle zur Verfügung: 1. die Synaptophysin-defiziente Maus und 2. das clostridiale Neurotoxin Tetanustoxin (TeNT), das Synaptobrevin spezifisch spaltet. Anhand der Depletion von Synaptophysin wurde untersucht, ob in vitro das Fehlen des Proteins Konsequenzen in Bezug auf Synapsenbildung und morphologisches Erscheinungsbild der Neurone hat. Es konnten lichtmikroskopisch und auch im elektronenmikroskopischen Bild keine Unterschiede zu Kontrollkulturen festgestellt werden. Durch morphometrische Messungen zeigte sich, daß in der Kultur der Synaptophysin-depletierten Maus nach 2 DIV mit hoher Signifikanz die Dendriten länger als in Kontrollkulturen waren. Dies spricht für regulatorische Funktionen des Proteins bei Exo- und Endozytosevorgäng, Goal of this work was to investigate the role of the synaptic vesicle proteins synaptophysin and synaptobrevin during development and differentiation of mouse fetal hippocampal neurons in primary culture. The outgrowth of dendritic and axonal fibers and the mechanisms of synaptogenesis were of special interest. Observation of morphology and development showed that generation of characteristic cell types is an intrinsic process of hippocampal neurons. Differentiation of cellular and subcellular structures in hippocampal cell culture, characteristics of synaptogenesis and the stage-dependent distribution of synaptophysin and synaptobrevin were demonstrated by immunofluorescence and electron microscopy. Synaptophysin was localized in presynaptic axon terminals but also in dendrites. In contrast with synaptophysin immunoreaction for synaptobrevin could not be found in all synaptic vesicles of the presynaptic axon terminal. To investigate the influence of synaptophysin and synaptobrevin on hippocampal neurons in culture two experimental models were used, first a synaptophysin-knock-out-mouse and second the clostridial neurotoxin tetanustoxin (TeNT) which selectively cleaves synaptobrevin. With the depletion of synaptophysin we investigated if there are consequences in development of synapses and morphological features of the neurons in vitro. In both, light and electron microscopy, there was no difference to control cultures. In morphometric measurements there was a significant difference in the lenght of developing dendrites after 2 DIV with longer dendrites in the synaptophysin-knock-out-mouse. Therefore synaptophysin may have a regulatory function for exo-/ endocytosis during dendritic growth. Specific inactivation of synaptobrevin by tetanustoxin had no consequences in morphological features, synaptogenesis and growing of the hippoacampal neurons in vitro. Morphometric measurements showed no significant differences between TeNT and control. Therefore we conclude that

Obwohl die Struktur und das Ausmaß dendritischer Verzweigungen eine wichtige Rolle bei der Informationsübertragung neuronaler Zellen spielen, ist bislang wenig über die Bausteine und Molekularmechanismen des Dendritenwachstums bekannt. Unter der Verwendung primär dissoziierter hippocampaler Zellkulturen embryonaler Mäuse untersuchte ich frühe Stadien des Zellfortsatzwachstums. Dabei konnte ich SNAP-25 (synaptosomal associated protein of 25 kDA), ein Schlüsselprotein der regulierten Exozytose, nicht nur in Axonen und terminalen Axonendigungen, sondern auch anhand von Doppelimmunmarkierungen mit den dendritischen Markern Transferrin-Rezeptor und MAP-2 in Dendriten lokalisieren. Die spezifische Inaktivierung von SNAP-25 durch Botulinumneurotoxin A (BoNT/A) führte zur Hemmung des Axonwachstums und des Vesikelrecyclings in terminalen Axonendigungen. Darüberhinaus wurde auch das Wachstum dendritischer Fortsätze von Körner- und Pyramidenzellen durch BoNT/A signifikant gehemmt. Daraus läßt sich schließen, daß SNAP-25, im Gegensatz zu Synaptobrevin, an konstitutiven Prozessen in den Axonen und Dendriten hippocampaler Neurone beteiligt ist., Structure and dimension of the dendritic arbor are important determinants of information processing by the nerve cell, but mechanisms and molecules involved in dendritic growth are essentially unknown. I investigated early mechanisms of dendritic growth using mouse fetal hippocampal neurons in primary culture, which form processes during the first week in vitro. I detected a key component of regulated exocytosis, SNAP-25 (synaptosomal associated protein of 25 kDa)., in axons and axonal terminals as well as in dendrites identified by the occurrence of the dendritic markers transferrin receptor and MAP2. Selective inactivation of SNAP-25 by botulinum neurotoxin A (BoNTA) resulted in inhibition of axonal growth and of vesicle recycling in axonal terminals. In addition, dendritic growth of hippocampal pyramidal and granule neurons was significantly inhibited by BoNTA. These observations indicate that SNAP-25, but not synaptobrevin, is involved in constitutive axonal growth and dendrite formation by hippocampal neurons.