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International audience; Single-molecule data are of great significance in biology, chemistry, and medicine. However, new experimental tools to characterize, in a multiplexed manner, protein bond rupture under force are still needed. Acoustic force spectroscopy (AFS) is an emerging manipulation technique which generates acoustic waves to apply force in parallel on multiple microbeads tethered to a surface. We here exploite this configuration in combination with the recently developed modular junctured-DNA (J-DNA) scaffold that have been designed to study protein-protein interactions at the single-molecule level. By applying repetitive constant force steps on the FKBP12-rapamycin-FRB complex, we measure its unbinding kinetics under force at the single-bond level. Special efforts are made in analyzing the data in order to identify potential pitfalls. We propose a calibration method allowing in situ force determination during the course of the unbinding measurement. We compare our results with well-established techniques, such as magnetic tweezers, to ensure their accuracy. We also apply our strategy to study the force dependent rupture of a single domain antibody with its antigen. Overall, we get a good agreement with the published parameters that have been obtained at zero force and population level. Thus, our technique offers single-molecule precision for multiplexed measurements of interactions of biotechnological and medical interest.

International audience; Les études spectro-microscopiques dans la gamme spectrale des rayons X couvrant les seuils d'absorption du C, K, Ca, N et jusqu'à l'O, appelée «fenêtre de l'eau », présentent un intérêt particulier pour les systèmes bio-physico-chimiques hydratés, en phase liquide et pour les interfaces liquide/solide. La longueur d'atténuation des rayons X dans l'eau dans cette gamme d'énergie permet l'utilisation de cellules fermées avec des épaisseurs des quelques microns. La complexité de la mise en place de ce type d'environnement est liée à la difficulté de faire coexister un système hermétiquement fermé, situé dans une chambre à vide, avec les exigences de transparence nécessaires pour les mesures en transmission des photons X. Nous présentons ici le design d'une cellule (Fig. 1) dédiée à l'étude des liquides et des interfaces liquide/solide, ainsi que les tests préliminaires réalisés avec le microscope STXM (Scanning Transmission X-ray Microscope) de la ligne de lumière HERMES du synchrotron SOLEIL. Le design sera détaillé en soulignant les choix techniques en lien avec les contraintes fluidiques et d'utilisation du microscope.Nous démontrons ensuite, pour la première fois à notre connaissance, un parfait contrôle hydrodynamique de la cellule (Fig. 2). Pour cela un système de contrôle microfluidique commercial , par pressurisation d'un gaz (azote, dans notre cas), a été choisi pour l'actuation des liquides. Des mesures tests ont mis en évidence la possibilité d'un échange de liquide sans mélange décelable. Plus encore, des premiers tests utilisant des électrovannes contrôlées ont démontré la possibilité de réduire le temps d'échange du liquide de la cellule d'un facteur > 50. De cette manière, et grâce à une gestion des signaux TTL entre la mesure STXM et l’ouverture de ces électrovannes, nous pouvons envisager des schémas de mesure plus complexes.

Axonal guidance is a very important process during brain development, allowing to give it its structure and organization. The neuroscience scientific community has a growing interest in it during the last years. Several tools belonging to the field of microtechnologies, microfluidics and micropatterning are of important help to study axonal guidance in vitro. They allow to confine neurons and their axons and to apply gradients of guidance molecules. During this thesis, my goal was to develop a system to study the effect of guidance molecules gradients on axonal guidance. For that, I tested several configurations of microfluidic devices, micropatterns and combinations of both.First, we used two approaches to isolate dissociated neurons axons from their somas. Our goal was to study the effect of the molecular environment on neurons growth cones, with a high throughput. The first approach consisted in growing neurons on different proteins patterns. It also allowed to show their capacity to adhere on these patterns. The second one consisted in seeding neurons in a microfluidic device in which, during their growth, axons are separated from somas by microchannels. Then we studied the effect, on the axons, of guidance molecules gradients. To begin, we measured the effect of two guidance molecules: ephrin and semaphorin, by culturing neurons in the presence of patterned gradients of these two molecules. After that, we studied another model where neurons are closer from their environment in vivo, explants growing on laminin patterns containing a gradient. To help the explant positioning, we polymerized hydrogels. Then, we put explants next to patterned gradients of ephrin. Finally, we tried to obtain a soluble gradient of guidance molecules, over a long period of time (days), closer to existing gradients in vivo. In that goal, we wanted to build a microfluidic device enabling the application of a soluble gradient of guidance molecules on neurons. To obtain a constant gradient, we also cultured neurons next to cells expressing netrin, another guidance molecule. Finally, we cultured dissociated neurons and glial cells to study their interactions.All these experiments did not allow to obtain a reliable device to study the effect of molecules on axons growth and guidance. Nevertheless, the configuration consisting in a coculture of neurons next to cells releasing netrin allows us to obtain promising preliminary results. We thus drew up a group of methods that will enable us to finalize the development of a system to study axonal guidance, functional and efficient., Le guidage axonal est un processus très important dans le développement du cerveau, permettant de lui donner sa structure et son organisation. La communauté scientifique des neurosciences lui porte un intérêt grandissant ces dernières années. Plusieurs outils appartenant au domaine des microtechnologies, que sont la microfluidique et le micropatterning, sont d’une aide importante pour étudier le guidage axonal in vitro. Ils permettent de confiner les neurones et leurs axones et de leur appliquer des gradients de molécules de guidage. Lors de ce travail de thèse, j’ai voulu développer un système pour étudier l’effet de gradients de molécules de guidage sur le guidage axonal. J’ai pour cela testé plusieurs configurations de dispositifs microfluidiques, de micromotifs (micropatterns) et de combinaisons de ces derniers.Nous avons d’abord utilisé deux approches pour isoler les axones de neurones dissociés de leurs somas afin de pouvoir étudier, à haut débit, l’effet de l’environnement moléculaire sur les cônes de croissance des neurones. La première approche consistait à faire pousser des neurones sur des motifs (patterns) de différentes protéines. Elle a permis de montrer leur capacité d’adhésion spécifique sur ces motifs. La seconde consistait à ensemencer des neurones dans un dispositif microfluidique dans lequel, lors de leur pousse, les axones sont séparés des somas par des microcanaux. Nous avons ensuite étudié l’effet, sur les axones, de gradients de molécules de guidage. Pour commencer, nous avons mesuré l’effet de deux molécules de guidage : l’éphrine et la sémaphorine, en cultivant des neurones en présence de gradients patternés de ces deux molécules. Par la suite, nous avons étudié un autre modèle où les neurones sont plus proches de leur environnement in vivo, des explants poussant sur des motifs de laminine contenant un gradient. Pour aider au positionnement de l’explant, nous avons polymérisé des hydrogels. Ensuite, nous avons mis des explants à côté de gradients patternés d’éphrine. Enfin, nous avons cherché à obtenir un gradient soluble de molécules de guidage entretenu sur des temps longs, plus proche des gradients existant in vivo. Dans ce but, nous avons voulu fabriquer un dispositif microfluidique permettant d’appliquer un gradient soluble de molécules de guidage sur des neurones. Pour obtenir un gradient stable dans le temps, nous avons aussi cultivé des neurones à côté de cellules exprimant la nétrine, une autre molécule de guidage. Pour finir, nous avons cultivé des neurones et des glies dissociés pour étudier leurs interactions.L’ensemble de ces recherches n’a pas permis d’obtenir un dispositif fiable pour étudier l’effet de molécules sur la pousse et le guidage des axones. Néanmoins, la configuration consistant en une coculture de neurones à proximité de cellules relargant de la nétrine nous a permis d’obtenir des premiers résultats encourageants. Nous avons ainsi mis au point un ensemble de méthodes qui pourront nous permettre de finaliser le développement d’un système pour étudier le guidage axonal, fonctionnel et efficace.