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Ras-Proteine fungieren als molekulare Schalter in der Signaltransduktion essentieller zellulärer Prozesse, indem sie zwischen einem inaktiven GDP-gebundenen und einem aktiven GTP-gebundenen Zustand wechseln. Onkogene Ras-Mutationen, die in etwa 25 % aller humanen Krebsarten vorkommen und zu einer Fehlregulation des switch Mechanismus führen sind daher attraktive Zielstrukturen in der Präzisionsmedizin. Trotz jahrzehntelanger intensiver Forschung nach Entdeckung der Ras-Onkogene im Jahre 1981 waren Versuche, Ras gezielt zu adressieren, weitestgehend erfolglos und Ras-Proteine galten lange Zeit als nicht adressierbar (engl.: undruggable). Neue Hoffnung ergab sich jedoch im Jahr 2013 durch die erfolgreiche gezielte Adressierung der G12CMutation von Ras durch Kevan Shokat. Neben kovalenten Inhibitoren, die innerhalb der switch-II-Tasche irreversibel an die G12C-Mutation binden und deren Optimierung schließlich im Mai 2021 zur Zulassung des ersten KRasG12C-Inhibitors Sotorasib (Amgen) für die Behandlung von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) führte, wurden zudem Nukleotid-kompetitive Inhibitoren entwickelt, die ebenfalls kovalent an KRasG12C binden können. Strategien, die eine direkte Konkurrenz zur Nukleotidbindung beinhalten, wurden ursprünglich aufgrund der hohen Affinität von GDP/GTP für Ras und der hohen zellulären Nukleotid-Konzentrationen verworfen, erlangten jedoch durch die Kombination mit einem kovalenten Wirkmechanismus der Inhibitoren erneut Aufmerksamkeit im akademischen Umfeld. Die dabei am β-Phosphat der GDP-Derivate eingeführten elektrophilen Gruppen führten jedoch zu einer dramatischen Reduzierung der reversiblen Bindungsaffinität der Nukleotidderivate, da wichtige Wechselwirkungen mit dem Protein und dem Mg2+-Ion verloren gehen. Um diese Limitierung zu überwinden und diesen Ansatz der kovalenten Nukleotid-kompetitiven Inhibitoren an onkogene KRas-Varianten mit Cysteinen im P-loop (KRasG12C und KRasG13C) anzupassen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mittels strukturbasiertem Wirkstoffdesign Nukleotidanaloga synthetisiert, die einen Thiolreaktiven Linker an den 2‘,3‘-OH-Gruppen der Ribose für eine kovalente Proteinmodifikation tragen. Anhand von massenspektrometrischen Experimenten konnte gezeigt werden, dass die dargestellten Nukleotidderivate selektiv an KRasG13C binden, ohne dabei KRasG12C sowie KRasWT zu adressieren. Mittels einer detaillierten kinetischen Charakterisierung wurden anschließend die Affinitäten der Nukleotidanaloga gegenüber KRas im Vergleich zu den unmodifizierten Nukleotiden bestimmt. Neben der Bestimmung der Kinetik der Nukleotidassoziation (kon) mit einer bereits etablierten stopped-flow Methode wurde im Rahmen dieser Arbeit zudem ein HPLC-basierter Assay zur Evaluierung der relativen Affinitäten der Nukleotidanaloga entwickelt. Die Affinitäten der dargestellten Nukleotidderivate sind dabei mit denen der unmodifizierten Nukleotide vergleichbar, sodass der eingeführte Linker keinen Einfluss auf die reversible Wechselwirkung und die Affinität hat, was bei einem Nukleotid-kompetitivem Ansatz von maßgeblicher Bedeutung ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte zudem gezeigt werden, dass bei KRasG13C, welches eine drastisch erhöhte intrinsische Nukleotidaustauschrate im Vergleich zum WT besitzt, infolge einer kovalenten Proteinmodifikation der SOS-katalysierter Nukleotidaustausch verhindert und kovalent modifiziertes KRasG13C im inaktiven Zustand stabilisiert wird. Eine gesteigerte GTP-Hydrolyse in Gegenwart von GAPs konnte für kovalent modifizierte KRasG13C im Vergleich zu KRasWT nicht beobachtet werden, die intrinsische GTP-Hydrolyse ist hingegen vergleichbar mit der von KRasWT. Die in dieser Arbeit generierten Komplexkristallstrukturen von KRasG13C-edaGDP und KRasG13C-bdaGDP ermöglichten darüber hinaus einen detaillierten Einblick in den Bindemodus der Nukleotidderivate und bestätigten den erwarteten Bindemodus sowie die kovalente Bindungsknüpfung an Cys13. Aufgrund der limitierten Verfügbarkeit von KRasG13C-abhängigen Krebszelllinien wurden zunächst erfolgreich artifizielle KRas-abhängige Zelllinien, darunter NIH-3T3 sowie Ba/F3-Zellen generiert, die in Zukunft für die Charakterisierung mutantenselektiver KRas-Inhibitoren genutzt werden können. Für die zelluläre Charakterisierung der in dieser Arbeit dargestellten Nukleotidanaloga, die aufgrund ihres anionischen Charakters nicht die Zellmembran überwinden können, wurden verschiedene Strategien für den Transfer in Zellen getestet, unter anderem ein NTP-Transporter vermittelter Transfer sowie die Elektroporation. Durch Elektroporation rekombinanter KRas-Proteine in Zellen konnte schließlich gezeigt werden, dass bei der Verwendung von kovalent modifiziertem KRasG13C eine onkogene Signalweiterleitung in vivo inhibiert wird, was die Möglichkeit des Einsatzes von kovalenten Nukleotid-basierten Inhibitoren bei KRasG13C-getriebenem Krebs verdeutlicht.

Methods for the analysis of surfactants and proteins by Capillary Electrophoresis (CE) were investigated. Several modifications of the system to achieve detection and separation of these analytes were examined. These modifications included buffer additives, sample additives and surface treatment and modification of the fused silica capillary. For the analysis of anionic surfactants, the addition of an anionic IN absorbing compound to the buffer was investigated to achieve indirect detection of the non-absorbing surfactants. The effect on detection sensitivity and separation efficiency of the absorbing ion was examined. These parameters were affected by differences in the electrophoretic mobilities of the analytes in comparison to the absorbing ion. The use of organic modifiers was also investigated to minimize micelle formation of the surfactants which leads to zone spreading. For the analysis of serum and urine proteins, the use of high pH buffers was investigated to minimize solute/capillary surface interactions and achieve separation. At high pH's the proteins are negatively charged; therefore, they should be repelled by the negatively charged fused silica surface. To improve reproducibility of migration times of the proteins the addition of polyvinyl alcohol to the sample was also investigated. The polyvinyl alcohol improved reproducibility by reversibly covering the active sites on the capillary surface to minimize protein interactions. Migration time reproducibility was also improved by optimizing the capillary cleaning procedure. Lastly, the addition of methyl cellulose to the buffer to work as a dynamic molecular sieving medium was investigated to improve resolution. Analyte/ capillary surface interactions are a major limitation in CE especially for the analyses of proteins. The use of coated capillaries to eliminate these interactions has been widely investigated. However, reproducibility and degree of surface deactivation with these coating can be poor. In this work hydrothennal treatment of the fused silica capillary surface prior to deactivation was examined. Hydrothennal treatment was used to produce a homogenous surface prior to coating which leads to the production of more highly deactivated, reproducible columns. The effects of the treatment were studied by coating the surface with a silane and examining the influence of the coating on electroosmotic flow and analyte adsorption. Ph. D.