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Ilustraciones El cultivo de tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.) es un cultivo que, aunque es muy conocido y sus frutos muy consumidos en Colombia, no se encuentra tecnificado, como muchos otros cultivos en el país. Este frutal es susceptible a plagas como mosca blanca y áfidos, y a enfermedades como las causadas por virosis o por hongos, por ejemplo, la antracnosis, enfermedad causada por los hongos Colletotrichum, que causa daños principalmente en el fruto, ya sea antes o después de su cosecha, y también afecta partes jóvenes como flores y primordios foliares. Con miras a la transformación estable de tomate de árbol común para eventualmente poder generar alguna resistencia a enfermedades como la antracnosis, en este trabajo se optimizó la regeneración in vitro de esta especie vía organogénesis obteniéndose un promedio de 18 brotes por explante, en el caso de hojas. Se evaluó la expresión transitoria en hojas de tomate de árbol común in vitro, mediante el plásmido pCambia 1305.2 con el gen reportero gusPlus y la agroinfiltración de hojas en planta, esta última utilizando la cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens con el plásmido pMDC85, portando los genes para una endoquitinasa (pcht28) o para una β-1,3-glucanasa (PpGlu); hasta la fecha no hay reportes de la evaluación de la expresión transitoria en hojas de tomate de árbol mediante agroinfiltración. Mediante el gen gus se encontró una eficiencia de transformación del 97,5% para la cepa EHA105, con base en el número de explantes gus positivos. Se llevaron a cabo ensayos in vitro para evaluar la expresión de los genes pcht28 y PpGlu en segmentos de hojas de tomate de árbol común, y se encontró un alto sobrecremiento de Agrobacterium y una alta tasa de muerte del tejido in vitro. (Texto tomado de la fuente) Tree tomato (Solanum betaceum Cav.) is a crop well known and its fruits widely consumed in Colombia, but it is not technified, like many other crops in the country. This fruit tree is susceptible to pests such as whiteflies and aphids, and to diseases caused by viruses or fungi, for example, anthracnose, disease caused by Colletotrichum fungi, which mainly causes damage to the fruit, either before or after harvest, and it also affects the young parts as flowers and leaf primordia. For the purpose of the stable transformation of common tree tomato, in the future, to eventually be able to generate some resistance to diseases such as anthracnose, in this work the in vitro regeneration of this species via organogenesis was optimized, obtaining an average of 18 shoots per explant, in the case of leaves. The transient expression in common tree tomato leaves in vitro was evaluated by means of the pCambia 1305.2 plasmid with the gusPlus reporter gene and the agroinfiltration of leaves in the plant, this last one using the EHA105 strain of Agrobacterium tumefaciens with the plasmid pMDC85, carrying the genes for an endochitinase (pcht28) or for a β-1,3-glucanase (PpGlu). To date there are no reports of the evaluation of transient expression in tree tomato leaves by agroinfiltration. Using the gus gene, a transformation efficiency of 97,5% was found for the EHA105 strain, based on the number of positive gus explants. In vitro assays were carried out to evaluate the expression of pcht28 and PpGlu genes in segments of common tree tomato leaves, and a high overgrowth of Agrobacterium and a high rate of tissue death in vitro were found. Doctorado Doctor en Biotecnología Área curricular Biotecnología

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas In vitro antagonistic capacity of a strain of Trichoderma atroviride (CMU-08) against different phytopathogens was evaluated in this study, through assays of confrontation in dual cultures, of inhibition by volatile compounds and antibiosis using malt extract agar (AEM), potato-dextrose agar (PDA) and Vogel minimum media (MMV). The antagonism of strain CMU-08 towards Fusarium sp. in confrontation assays was Type 1 in the three culture media, in the case of Colletotrichum gloeosporioides the greatest inhibition was through the production of volatile metabolites, being 92.8% in MMV. Phytophthora cinnamomi, was efficiently antagonized by confrontation and antibiosis with 70.2% inhibition in MMV; volatile inhibition for Botrytis cinerea was 67.0% in AEM. No basal activity of β-1,3 glucanase and chitinase of the CMU-08 strain of T. atroviride was found in basal condition using minimal Vogel (MMV) and induction medium in MMV supplemented with cell walls. The activity of β-1,3 glucanase induced by cell walls (0.5% w / v) of B. cinerea (Bc) reached maximum (484.1 ± 223.9 U / μL) at 18 h of incubation, while in the presence of Fusarium sp. (Fsp) showed the maximum (721.0 ± 53.1 U / μL) at 12 h.Chitinase activity in medium supplemented with Bc and Fsp cell walls was detected from six hours of incubation, reaching the maximum in both cases, with 1625.6 (± 803.4) U / μL and 2671.3 (± 542.9) U / μL, respectively. In dual cultures it was observed that the three chitinase genes, ech42, chit33 and chit36, as well as the gluc18 gene encoding an endoglucanase are expressed during and after the contact of CMU-08 with Fusarium sp. The expression of these genes is greater after contact with the phytopathogen. En el presente trabajo se evaluó la capacidad antagónica in vitro de una cepa de Trichoderma atroviride (CMU-08) contra distintos fitopatógenos, mediante ensayos de confrontación en cultivos duales, de inhibición por compuestos volátiles y antibiosis empleando agar extracto de malta (AEM), agar papa-dextrosa (PDA) y medio mínimo Vogel (MMV). El antagonismo de la cepa CMU-08 hacia Fusarium sp. en los ensayos de confrontación en los tres medios de cultivo fue Tipo 1, en el caso de Colletotrichum gloeosporioides se encontró la mayor inhibición a través de la producción de metabolitos volátiles, siendo de 92.8% en MMV. T. atroviride antagonizó eficientemente mediante confrontación y antibiosis a Phytophthora cinnamomi, con 70.2% de inhibición en MMV; la inhibición por volátiles para Botrytis cinerea fue de 67.0% en AEM. No se encontró actividad basal de β-1,3 glucanasa y quitinasa de la cepa CMU-08 de T. atroviride en condición basal empleando medio mínimo Vogel (MMV) y de inducción en MMV suplementado con paredes celulares. La actividad de β-1,3 glucanasa inducida por paredes celulares (0.5% p/v) de B. cinerea (Bc) alcanzó el máximo (484.1±223.9 U/μL) a las 18 h de incubación, mientras que en presencia de paredes celulares de Fusarium sp. (Fsp) mostró el máximo (721.0±53.1 U/μL) a las 12 h. La actividad de quitinasa en medio suplementado con paredes celulares de Bc y Fsp se detectó desde las seis horas de incubación, alcanzando ahí el máximo en ambos casos, con 1625.6 (±803.4) U/μL y 2671.3 (±542.9) U/μL, respectivamente. En cultivos duales se observó que los tres genes de quitinasas, ech42, chit33 y chit36, así como el gen gluc18, codificante de una endoglucanasa se expresan durante y después del contacto de CMU-08 con Fusarium sp. La expresión de estos genes es mayor después del contacto con el fitopatógeno.

Banana is one of the most important edible crops in the world, however, it’s attacked by different pathogens, one of the most prominent of these is the fungus Mycosphaerella fijiensis, causal agent of Black Sigatoka. The environmental and economic issues related to the pesticides used for its control have encouraged the search for cleaner alternative biomolecules. Previous studies were made by the Biotechnology group from the Universidad de Antioquia searching for a biological alternative for the control of M. fijiensis; in these the antifungal capacity of the fungus Ganoderma lucidum was determined as an antagonist and then as a source of protein extracts with inhibitory activity in vitro and in greenhouse plants; these findings were the foundation of this work, which focuses in the study of the enzymatic capacity of the proteins present in the protein extracts, due to their potential ability to degrade different compounds, including polysaccharides, lipids, peptides and nucleic acids, constituents of essential parts of a living cell; therefore these extracts can act as possible antifungal agents. In this study, protein extracts of G. lucidum obtained from bioreactor cultures (BIOFLO 110 ®) were characterized in terms of their deoxyribonuclease, ribonuclease, protease, glucanase and chitinase enzymatic activities. The extracts were also fractionated and each fraction obtained was evaluated for its inhibitory capacity against the phytopathogen fungus M. fijiensis, and through mass spectrometry analysis the presence of different enzymes with antifungal potential was confirmed. Resumen El banano es uno de los cultivos comestibles más importante en el mundo, sin embargo, es atacado por diferentes patógenos, uno de los más destacados es el hongo Mycosphaerella fijiensis, agente causal de la Sigatoka Negra. Los problemas ambientales y económicos relacionados con los pesticidas usados para su control han estimulado la búsqueda de biomoléculas alternativas no contaminantes. En el grupo de Biotecnología de la Universidad de Antioquia se realizaron estudios previos buscando una alternativa biológica al control de M. fijiensis, en los cuales se determinó la capacidad antifúngica del hongo Ganoderma lucidum como antagonista y posteriormente como fuente de extractos proteicos con actividad inhibitoria in vitro y en plantas de invernadero; estos hallazgos fueron la base de este trabajo, que está enfocado en el estudio de la capacidad enzimática de las proteínas presentes en los extractos proteicos, debido a su capacidad potencial para degradar diferentes compuestos, incluyendo polisacáridos, lípidos, péptidos y ácidos nucleicos, que constituyen partes esenciales de una célula viva; por lo tanto, estos extractos pueden actuar como posibles agentes antifúngicos. En este estudio, los extractos proteicos de G. lucidum obtenidos a partir de cultivos en biorreactor (BIOFLO 110®) fueron caracterizados en términos de sus actividades enzimáticas: deoxyribonucleasa, ribonucleasa, proteasa, glucanasa y quitinasa. Los extractos también fueron fraccionados y cada fracción obtenida fue evaluada para la capacidad inhibitoria contra el hongo fitopatógeno M. fijiensis, y a través de los análisis de espectrometría de masas se confirmó la presencia de diferentes enzimas con potencial antifúngico.

"El propósito de este artículo es proporcionar una revisión de la investigación publicada acerca de la quitosana que es la forma desacetilada de la quitina, un compuesto natural biodegradable que se deriva de cubiertas de crustáceos siendo su principal atributo su naturaleza policatiónica. Se revisan las características químicas y estructurales, métodos de obtención, actividad antimicrobiana y modo de acción. Asimismo, se analiza el potencial de la quitosana para inducir una serie de reacciones de defensa correlacionadas con la actividad enzimática tales como la PAL, ¿-1,3 glucanasa, quitinasa y quitosanasa."

Les glicosidases que hidrolitzen els substrats amb retenció de configuració segueixen un mecanisme general en què després d'una primera etapa d'associació enzim-lligand s'encadenen dues etapes catalítiques que porten a la hidròlisi del substrat conservant la configuració del carboni anomèric en el nou extrem generat. En el present treball es comprova a través d'estudis mecanístics, principalment estudis en estat preestacionari i anàlisis de Hammett, que amb aquest mecanisme tan senzill no es pot descriure correctament l'activitat catalítica de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis, i es proposa el mecanisme que es mostra a continuació: on els complexos enzim-substrat adopten dues conformacions productives (SES* i SES**) i on el balanç entre aquestes dues conformacions en funció del substrat explica els diferents comportaments cinètics en estat estacionari i preestacionari.Un estudi en profunditat sobre la importància que exerceix la interacció entre l'enzim i l'hidroxil a C2 de la unitat de glucopiranosa que ocupa el subseti -1 demostra que en el cas de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis aquesta interacció no juga el paper rellevant que s'ha observat en altres β-glicosidases que actuen amb retenció de configuració.L'estudi de la reacció d'hidratació del glical G4G3G' catalitzada per la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis permet proposar que hi ha un canvi en el residu que fa el paper d'àcid general. De manera que es proposa que l'Asp136 que en la reacció d'hidròlisi de substrats ajuda al posicionament dels residus catalítics i juga un paper en la regulació dels seus pKa, és el residu que fa d'àcid general en la reacció d'hidratació de glicals., Las glicosidasas que hidrolizan substratos con retención de configuración siguen un mecanismo general en que después de una primera etapa de asociación enzima-ligando se encadenan dos etapas catalíticas que llevan a la hidrólisis del substrato conservando la configuración del carbono anomérico en el nuevo extremo generado. En el presente trabajo se comprueba a través de estudios mecanísticos, principalmente estudios en estado pre-estacionario y análisis de Hammett, que con este mecanismo tan sencillo no se puede describir correctamente la actividad catalítica de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis, y se propone el mecanismo que se muestra a continuación: donde los complejos enzima-substrato adoptan dos conformaciones productivas (SES* y SES**) y donde el balance entre estas dos conformaciones en función del substrato explica los diferentes comportamientos cinéticos en estado estacionario y pre-estacionario.Un estudio en profundidad sobre la importancia que ejerce la interacción entre el enzima y el hidroxilo en C2 de la unidad de glucopiranosa que ocupa el subsitio -1 demuestra que en el caso de la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis esta interacción no juega el papel relevante que se ha observado en otras β-glicosidasas que actuan con retención de configuración.El estudio de la reacción de hidratación del glical G4G3G' catalizada por la 1,3-1,4-β-glucanasa de Bacillus licheniformis permite proponer que hay un cambio en el residu que ejerce el papel de ácido general. De manera que se propone que el Asp136 que en la reacción de hidrólisis de substratos ayuda en el posicionamiento de los resíduos catalíticos y juega un papel en la regulación de sus pKa, es el resíduo que actúa de ácido general en la reacción de hidratación de glicales., Retaining glycosidases follow a general mechanism in which the first enzime-ligand association is followed by two catalytic steps that render the product of hydrolysis with the same anomeric configuration as the starting material. In the present work we demonstrate using mechanistic studies, basically pre-steady state kinetics and Hammett analysis, that this mechanism is too simple to properly describe the catalytic activity of Bacillus licheniformis 1,3-1,4-β-glucanase, and the following mechanism is proposed: In this mechanism, the enzim-substrate complexes adopt two productive conformations (SES* and SES**) and the balance between these two conformations depending on the nature of the substrate explains the diferent behaviours observed in pre-steady and steady state kinetics.A deep study on the importance of the interaction between the enzyme and the hydroxyl group at C2 of the glucopyranose residue that occupies the -1 subsite demonstrates that in Bacillus licheniformis 1,3-1,4-β-glucanase this interaction is not the key interaction observed in other retaining β-glycosidases.The study of the G4G3G' glical hydration catalysed by the Bacillus licheniformis 1,3-1,4-β-glucanase let us propose that there is a change in the residue that acts as a general acid. We propose that Asp136, that plays a role positioning the catalytic residues and modulating their pKa in the hydrolysis reaction, acts as the general acid in the hydration of glycals.

IntroducciónLas b(l 3)(l 4) glucanasas son enzimas de gran interés biotecnólogico tanto en la industria cervezera como en la de fabricación de piensos. Los objetivos de esta tesis han sido: rediseñar la glucanasa de bacillus licheniformis con objeto de tratar de mejorar la actividad enzimática y determinar la función del lazo mayor del centro activo en dicho proceso, así como analizar y rediseñar la estabilidad térmica del enzima, en particular determinar la influencia del lazo mayor en la desnaturalización térmica, relacionándolo con el proceso y tipo de plegamiento.Análisis de los mutantes de saturación en la posición 58 de glucanasas1. La reducción de volumen de la cadena lateral aumenta la actividad, aumentado la constante catalítica kcat, si bien disminuye la Km. El mutante M58G presenta la actividad más alta, hasta 6 veces más que el silvestre, y el mutante M58A presenta más de 4 veces la actividad del silvestre, ambos, en términos de kcat/Km. 2. Los residuos hidrófilos disminuyen la actividad. 3. Unicamente en mutantes aromáticos como M58F y M58W, se aprecia una disminución de valores de Km, respecto al enzima silvestre. El análisis de la termorresistencia1. Con respecto al medio, serían claves el pH (por pérdida de interacciones pH dependientes), el tampón (por su posible papel quelante),y la presencia de sustrato (porque estabilizaría).2. Con respecto a la estructura serían claves los aminoácidos del lazo y la coordinación del Ca++. La coordinación del Ca++ puede ser mejorada introduciendo una nueva interacción entre el catión y la beta 15, como en el caso del mutante N236D. 3. Finalmente, la termoinactivación de la glucanasa de Bacillus licheniformis, en todos los mutantes estudiados, siguen un patrón bifásico. Su análisis cinético permite justificar el efecto de diversos mutantes y el comportamiento del enzima frente a la temperatura., IntroductionThe (l-3)(l-4) glucanases are enzymes of great biotechnologyc interest in the brewery industry and in the manufacture of fodder. One objective of this thesis is to redesign the glucanase of bacillus licheniformis trying to improve its enzymatic activity to determine the function that the big loop, situated in the active centre, in this process. Another objective is to analyse and redesign the thermal stability of the enzyme, determining, in particular, the influence of the big loop in the thermal denaturation, and the relation with the process and type of folding.Analysis of the saturation at position 58 of glucanase 1. The reduction of volume of the lateral chain increases the activity, increasing the catalytic constant kcat, although the Km diminishes. Mutant M58G shows the highest activity, up to 6 times more than the wild type, and mutant M58A shows more than 4 times the activity of the wild type, both, in terms of kcat/Km. 2. Hydrophilic residues diminish the activity. 3. Only in the aromatic mutants, like M58F and M58W, we can observe that the Km values diminish, with respect to the wild enzyme. The analysis of the thermoresistance 1. Some factors of the buffer are essential: pH (by loss of pH dependent interactions ), the buffer composition (by its possible chelant action) and the substrate presence (it would stabilize the enzyme).2. Regarding to structure, the amino acids of the loop and the coordination of the Ca++ would be key elements. The coordination of the Ca++ can be improved introducing a new interaction between the cation and beta 15, as in the case of mutant N236D. 3. Finally the thermoinactivation, of the glucanase of Bacillus licheniformis, in all of the mutants studied, follows a two-phases pattern. The kinetic analysis justifies the effect of several mutants and the behaviour of the enzyme versus the temperature.