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Trata-se de artigo científico que foi desenvolvido utilizando-se como metodologia a pesquisa exploratória baseada em revisão bibliográfica no intuito de investigar a importância do conhecimento médico a respeito do status secretor dos glicoconjugados do sistema ABH, o qual já foi objeto de diversas análises empíricas realizadas por meio de inferências estatísticas. Utilizandose o referido método de testagem imuno-hematológica pode-se analisar a predisposição dos pacientes a certas doenças que acometem de forma diversa um tipo de status secretor com relação ao outro. Algumas patologias tais como o câncer de mama, infecção por HIV-1 e candidíase vaginal apresentam taxas de incidência e de progressão da doença muitas vezes bastante diferentes quando são comparados indivíduos secretores e não-secretores. Assim, tal ferramenta pode e deve ser utilizada para o tratamento precoce e prevenção do agravamento de determinadas patologias ou pode sugerir a realização de exames mais avançados em busca de sintomas e causas prováveis na realização do diagnóstico médico. No Brasil, os desafios para a adoção do referido exame sanguíneo e de secreções estão relacionados principalmente aos custos, ausência de laboratórios que se disponibilizem a prestar tais serviços e ao desconhecimento dos profissionais da saúde a respeito de sua existência.

"En previos estudios se ha reportado que en lesiones premalignas de bajo y alto grado, así como en CaCu, existen modificaciones a nivel de glicosilación, así como cambios en la expresión de genes que codifican para las enzimas que participan en la síntesis de las estructuras alteradas. Dado que algunos de estos cambios han sido detectados en etapas premalignas, se ha sugerido que podrían ser utilizados como biomarcadores para el diagnóstico temprano de la enfermedad. Por otro lado, la infección con VPH de alto riesgo es el principal factor de riesgo para el desarrollo de CaCu, por lo que identificar cambios a nivel de la glicosilación asociados a la presencia del virus permitiría identificar cambios tempranos de la transformación maligna del cérvix asociados a la infección viral. Estudios “in vitro” han mostrado que la oncoproteína E6 del VPH 16 tiene un efecto sobre la glicosilación. Además, se ha reportado que las oncoproteínas E6 y E7 del VPH 18 modifican la expresión de transcritos de diversos glicogenes. Considerando que la oncoproteína E5 se expresa de manera importante en lesiones precursoras, identificar los cambios generados por esta proteína a nivel de glicosilación, podrían servir para identificar blancos diagnósticos, para la detección temprana de la enfermedad."

La merluza común, Merluccius hubbsi, representa uno de los recursos pesqueros más importantes del Océano Atlántico Sudoccidental. En la plataforma argentina existen dos poblaciones, una población bonaerense, al norte del paralelo 41°, con un pico reproductivo en el mes de mayo; y una población patagónica, al sur del paralelo 41° cuyo pico reproductivo ocurre durante el mes de enero. En esta especie, así como en el resto de los peces teleósteos no elopomorfos, la etapa larval constituye una etapa crítica con los mayores índices de mortalidad (cerca del 99%) durante la ontogenia. Entre los órganos y sistemas que se desarrollan durante este periodo, el sistema digestivo ha sido objeto de estudio de gran interés debido a que permite capturar, ingerir, digerir y absorber el alimento. Comprender el desarrollo del tracto digestivo es importante para evaluar la fisiología nutritiva de las larvas de los peces. Asimismo, en especies comerciales y de cultivo, el conocimiento del desarrollo de este sistema permite establecer protocolos de alimentación que cumplan con los requisitos nutricionales de las larvas. Por otro lado, el estudio del estado nutricional o “condición” permite evaluar individualmente el estado fisiológico de las larvas, y es considerado un método útil para estimar la susceptibilidad a la muerte de las larvas y tener una aproximación al reclutamiento de la especie. En este trabajo se estudia por primera vez, la ontogenia del sistema digestivo de las larvas de Merluccius hubbsi, de ambas poblaciones (bonaerense y patagónica), mediante técnicas histológicas e histoquímicas. Además, utilizando herramientas morfométricas y bioquímicas, se analiza si existen diferencias en la condición de las larvas entre ambas poblaciones. Asimismo, se describen las características ambientales de las áreas de crianza. El análisis histológico indica un patrón ontogénico del sistema digestivo similar al encontrado en la mayoría de los peces teleósteos. Las técnicas histoquímicas evidencian un patrón de glicosilación que varía de acuerdo el estadio de desarrollo de las larvas, y que se complejiza conforme la larva aumenta de tamaño. Por otro lado, mediante la utilización de técnicas morfométricas, no se detectan diferencias en la condición nutricional entre las poblaciones. Sin embargo, utilizando técnicas bioquímicas se demuestra que la población patagónica se encuentra en mejores condiciones nutricionales que la población bonaerense. Se discute el alcance de ambas metodologías. Fil: Cohen, Stefanía. Autor; . Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras; Argentina

Orientador : Prof. Dr. Alan Guilherme Gonçalves Coorientador : Prof. Dr. Diogo Ricardo Bazan Ducatti Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa : Curitiba, 26/01/2018 Inclui referências : p. 163-169 Resumo : Os receptores muscarínicos são estruturas proteicas transmembrana responsáveis pela transdução de sinais para o interior das células. Os conhecimentos adquiridos à cerca da estrutura dessa maquinaria de sinalização impulsionaram o desenvolvimento de candidatos a fármacos para interação com tais receptores. Desses estudos resultam compostos otimizados, mais seletivos, potentes e seguros. Derivados glicídicos oferecem excelente base para o planejamento de ligantes alvo-específicos. Eles possuem estereoquímica definida e permitem uma infinidade de modificações químicas em suas estruturas. Não obstante, o uso de polissacarídeos para a obtenção de blocos estruturais e modificações químicas para obtenção de substâncias bioativas também apresentam grande potencial nessa área. Este trabalho explorou a utilidade de derivados glicídicos (provenientes das estruturas nativas dos polissacarídeos agarose e kappa-carragenana) e não-glicídicos (arilpirróis) para a obtenção de ligantes dos receptores muscarínicos visando a obtenção de novos candidatos a fármacos com melhor perfil farmacológico. O estudo empregou ferramentas de análise computacional que antecederam a fase de síntese. Foram realizadas similaçãos de atracamento molecular utilizando o programa DockThor e simulações de druglikeness utilizando o programa SwissADME. Além dos experimentos de atracamento frente aos receptores muscarínicos do subtipo M1 e M3, foram explorados também outros dois tipos de receptores, os adrenérgicos B2 e histaminérgico H1 para a interação com derivados glicídicos. De uma biblioteca de 27 compostos hipotéticos, foram identificadas quatro glicaminas capazes de formar complexos receptor-ligante mais estáveis com os diferentes receptores testados, sendo denotada a importância da conformação do anel tetrahidrofurano e a posição dos grupos hidroxila presentes nessa classe de compostos. A síntese envolveu reações de hidrólise, aminação redutiva e N-alquilação para obtenção dos derivados de carboidratos; e reações de N-acilação e N-alquilação para os arilpirróis. Os rendimentos globais variaram de 19% a 30% para os intermediários glicaminas, aproximadamente 13% para os compostos quaternizado; de 15% a 51% para os intermediários carboxamidas e de 6% a 50% para os derivados arilpirróis finais. Foram testados in vitro 41 compostos empregando-se a quantificação de mio-inositol-1-fosfato para avaliação da atividade dos derivados arilpirrólicos em receptores muscarínicos do subtipo M1. Foi possível identificar um composto capaz de modular a ação do neurotransmissor acetilcolina nos receptores M1 o qual apresentou perfil farmacológico mais adequado para evitar efeitos adverso graves que ocorrem com o uso dessa classe de compostos no tratamento da doença de Alzheimer. Palavras-chave: receptores acoplados à proteína G, glicaminas, arilpirróis. Abstract : Muscarinic receptors are transmembrane proteins involved in cell signaling. Due to the recent discoveries related to their structure and function, the development of drug candidates targeting such receptors has been increasingly successful. These studies resulted in optimized, selective, more potent and safe compounds for clinical uses. Sugar scaffolds provide an excellent platform to design target-specific ligands. They have definite quiral centers and allow a number of chemical modifications in their structures. Nevertheless, the use of polysaccharides to obtain building blocks and their structural modifications, to obtain bioactive substances, has great potential in this area. Herein we explored glycidic derivatives (obtained from the native structures of agarose and kappa-carrageenan polysaccharides) and non-glycerides (arylpyrroles) to obtain muscarinic receptor ligands as novel drug candidates presenting better pharmacological profiles. We used computational tools to select compounds prior to the synthesis. Docking experiments were performed using the software DockThor and druglikeness predictions were performed using the SwissADME program. In addition to the docking with the muscarinic receptors M1 and M3, other two proteins were tests to the interaction with glycidic derivatives, the B2 adrenergic and H1 histaminic receptors. From a library of 27 hypothetical compounds, four glycamines were capable to dock with at least one of the receptors yielding stable receptor-ligand complexes. We denoted the importance of the tetrahydrofuran ring conformation and the position of the hydroxyl groups in the structure of these compounds. Synthesis was achieved using hydrolysis, reductive amination and N-alkylation reaction (to obtain the carbohydrate derivatives) and N-acylation, N-alkylation (to obtain the arylpyrrol derivatives). Overall yields ranged from 19% to 30% for the glycamine intermediates, approximately 13% for the quaternized compounds; from 15% to 51% for the carboxamide intermediates and from 6% to 50% for the final arylpyrrole derivatives. We tested 41 compounds in vitro using myoinositol- 1-phosphate accumulation assays to evaluate the activity of the arylpyrrole derivatives at the M1 muscarinic receptor. We were able to find a compound with improved pharmacological profile, which modulates the efficacy of the neurotransmitter acetylcholine, presenting less inherent potency. This profile is believed to reduce serious adverse effects that occur with this class of compounds in the treatment of Alzheimer's disease. Key words: G protein-coupled receptors, glycamines, arylpyrroles.

A novel series of carbohydrate-based naphthoquinones was synthesized and evaluated for cytotoxicity against different cancer cell lines. The compounds derived from 5-hydroxy-1,4-naphthoquinone (juglone) showed better cytotoxicity profiles against HCT-116, A-549 and MDA-MB 435 human cancer cells than the parent compound. The results suggest that the hydroxyl group on the aromatic ring increased the pro-oxidant activity of these new naphthoquinone derivatives. Furthermore, two derivatives were found to be more active against melanoma cells (MDA-MB435) than the clinically useful anticancer agent doxorubicin, and none of the compounds caused mouse erythrocyte lysis.

Se realizó la síntesis y caracterización por Resonancia Magnética Nuclear y cromatografía RP-HPLC de los N-glucosilaminoácidos: Fmoc-Phe-O-(2,3,4,6-tetra-O-Acetil-β-D-N-glucopiranosil), Fmoc-Leu-O-(2,3,4,6-tetra-O-Acetil-β-D-N-glucopiranosil), Fmoc-Lys-(Boc)-O-(2,3,4,6-tetra-O-Acetil-β-D-N-glucopiranosil), Fmoc-Asp-(OtBu)-O-(2,3,4,6-tetra-O-Acetil-β-D-N-glucopiranosil), L-Phe-O-β-1N(D-glucopiranosil), L-Leu-O-β-1N(D-glucopiranosil), L-Lys-O-β-1N(D-glucopiranosil) y Asp-O-β-1N(D-glucopiranosil). La síntesis de estos N-glucosilaminoácidos no ha sido reportada hasta el momento. Se diseñó e implementó la ruta sintética utilizando metodologías más amigables con el medio ambiente. Fue posible identificar los puntos criticos de la ruta sintética y buscar estrategias de mejora. Los resultados obtenidos muestran que la metodología empleada puede ser considerada como una alternativa viable y novedosa para la obtención de glucoconjugados aminoácido-carbohidrato. Este trabajo contribuirá al diseño y obtención de N-glucosilaminoácidos que pueden ser considerados para estudios de la inhibición de la adhesión de Pasteurella Multocida a tejido epitelial de conejo. Abstract: The synthesis and characterization by Nuclear Magnetic Resonance and RP-HPLC chromatography of N-glycosyl amino acids were perfomed. The N-glycosyl amino acids obtained were: Fmoc-Phe-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-N-glucopyranose), Fmoc-Leu--(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-N-glucopyranose), Fmoc-Lys-(Boc)-O-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-N-glucopyranose), Fmoc-Asp-(OtBu)-O-(2,3,4,6-tetra-O-Acetil-β-D-Nglucopyranose), L-Phe-O-β-1N(D-glucopyranose), L-Leu-O-β-1N(D-glucopyranose), LLys-O-β-1N(D-glucopyranose) and Asp-O-β-1N(Dglucopyranose. Until now, the synthesis of these N-glucosyl amino acids has not been reported in literature. The synthetic route was designed and performed using environmentally-friendlier methodologies. It was possible to identify the critical points in the synthetic route and to look for improvement strategies. The obtained results showed that the methodology carried out can be considered as a viable and novel alternative for the obtention of glicoconjugates amino acid-carbohydrate. The present work will contribute to the design and obtention of N-glucosyl amino acids that could be used to evaluate adhesion inhibition of Pasteurella multocida to rabbit epithelial tissue. Maestría

Sulfation, a post-translational modification which plays a key role in various biological processes, is inhibited by competition with chlorate. In Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas’ disease, sulfated structures have been described as part of glycolipids and we have reported sulfated high-mannose type oligosaccharides in the C-T domain of the cruzipain (Cz) glycoprotein. However, sulfation pathways have not been described yet in this parasite. Herein, we studied the effect of chlorate treatment on T. cruzi with the aim to gain some knowledge about sulfation metabolism and the role of sulfated molecules in this parasite. In chlorate-treated epimastigotes, immunoblotting with anti-sulfates enriched Cz IgGs (AS-enriched IgGs) showed Cz undersulfation. Accordingly, a Cz mobility shift toward higher isoelectric points was observed in 2D-PAGE probed with anti-Cz antibodies. Ultrastructural membrane abnormalities and a significant decrease of dark lipid reservosomes were shown by electron microscopy and a significant decrease in sulfatide levels was confirmed by TLC/UV-MALDI-TOF-MS analysis. Altogether, these results suggest T. cruzi sulfation occurs via PAPS. Sulfated epitopes in trypomastigote and amastigote forms were evidenced using AS-enriched IgGs by immunoblotting. Their presence on trypomastigotes surface was demonstrated by flow cytometry and IF with Cz/dCz specific antibodies. Interestingly, the percentage of infected cardiac HL-1 cells decreased 40% when using chlorate-treated trypomastigotes, suggesting sulfates are involved in the invasion process. The same effect was observed when cells were pre-incubated with dCz, dC-T or an anti-high mannose receptor (HMR) antibody, suggesting Cz sulfates and HMR are also involved in the infection process by T. cruzi. Fil: Ferrero, Maximiliano Ruben. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud. Instituto Nacional de Parasitología; Argentina Fil: Soprano, Luciana Lía. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud. Instituto Nacional de Parasitología; Argentina Fil: Acosta, Diana Maria. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud. Instituto Nacional de Parasitología; Argentina Fil: Garcia, Gabriela Andrea. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud. Instituto Nacional de Parasitología; Argentina Fil: Esteva, Monica I.. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud. Instituto Nacional de Parasitología; Argentina Fil: Couto, Alicia Susana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono; Argentina Fil: Duschak, Vilma Gladys. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorio e Instituto de Salud. Instituto Nacional de Parasitología; Argentina

El abadejo manchado Genypterus blacodes es un ofidiforme de amplia distribución que habita aguas desde los 22°35’S (Rio de Janeiro, Brasil) hasta aproximadamente los 43°S (Argentina). Esta especie es uno de los recursos pesqueros demersales más importantes del Mar Argentino, principalmente por su gran tamaño y su carne de calidad. Los ovarios de G. blacodes presentan una forma alargada y están suspendidos de la pared dorsal por el mesovario. Cuando los peces están en condición reproductiva, las crestas ovígeras contienen ovocitos en distintos estadios: previtelogenicos, en crecimiento primario y vitelogénicos. Una capa simple de epitelio tapiza las crestas ovígeras, y las células epiteliales varían en forma y altura a lo largo del ciclo gonadal. Este epitelio, en la mayoría de los teleósteos, está involucrado en la formación del fluido ovárico. El ovario del abadejo manchado tiene la particularidad de secretar una abundante cantidad de glicoconjugados no sólo a nivel del epitelio de sus crestas, sino también en las distintas estructuras ovocitarias. El objetivo de la presente investigación es realizar una revisión bibliográfica del ovario de G. blacodes en relación a la síntesis de glicoconjugados y su importancia fisiológica en la biología reproductiva de esta especie., The pink cuskeel, Genypterus blacodes, is a widely distributed ophidiiform inhabiting waters from 22 ° 35'S (Rio de Janeiro, Brazil) to about 43 ° S (Argentina). This species is one of the most valuable demersal fish resources in the Argentine Sea, mainly due its large size and flesh quality. The ovaries of G. blacodes present an elongated shape and are suspended by mesenteries from the dorsal body wall. When fish are in reproductive condition, the lamellae contain oocytes at different developmental stages: previtellogenic, primary growth and vitellogenic oocytes. A single-layer flat epithelium lines the lamellae, and the epitelial cells present variations in size and morphology depending on the gonad maturity stage. In most teleost fishes this epithelium is involved in the formation of ovarian fluid. Particularly, the ovary of G. blacodes secretes large quantities of glycoconjugates, not only at the epithelium of the lamellae, but also in different oocyte structures. The aim of this research is to review literature of the ovary of G. blacodes in relation to the synthesis of glycoconjugates and their importance in the reproductive biology of this species., Sociedad de Ciencias Morfológicas de La Plata

Leishmaniapromastigotes express several prominent glycoconjugates, either secreted or anchored to the parasite surface. Of these lipophosphoglycan (LPG) is the most abundant, and along with other phosphoglycan-bearing molecules, plays important roles in parasite infectivity and pathogenesis in both the sand fly and the mammalian host. Besides its contribution for parasite survival in the sand fly vector, LPG is important for modulation the host immune responses to favor the establishment of mammalian infection. This review will summarize the current knowledge regarding the role of LPG inLeishmaniainfectivity, focusing on the interaction of LPG and innate immune cells and in the subversion of mammalian functions by this molecule.

11 pages, 6 figures, 2 tables., [EN] Toadfish Halobatrachus didactylus gastric mucosa was studied using conventional and lectin histochemistry. Conventional histochemistry revealed neutral glycoconjugates predominating over acidic ones in the apical zone of both surface epithelial cells and pit cells. The neck cells contained a few neutral glycoconjugates, whereas gastric glands were negative to PAS and AB staining. Lectin histochemistry showed different oligosaccharide expression along the columnar cells. The sub-nuclear cytoplasm was stained with RCA120, SBA, HPA, GSA I-B4, GSA II, UEA I, LTA, Con A, KOH-sialidase-WGA. The Golgi zone reacted with RCA120, DBA, SBA, HPA, KOH-sialidase-WGA, GSA I-B4, GSA II, UEA I, LTA, MAL II, SNA, and showed an increase in DBA staining after KOH-sialidase treatment. The granules of the apical zone stained with PNA, UEA I, LTA and showed increased PNA reactivity after KOH-sialidase treatment. The luminal cell coat reacted with PNA, HPA, Con A, KOH-sialidase-WGA, UEA I, LTA, MAL II, SNA and KOH-sialidase-PNA. Pit cells showed a minor expression of lectin-binding sites with respect to columnar cells. Neck cells linked UEA I and LTA and gastric glands reacted with PNA, DBA, SBA, HPA, Con A, GSA I-B4, KOH-sialidase-WGA and KOH-sialidase-DBA. The results suggest that the stomach of the toadfish H. didactylus is characterised by a species-specific glycoconjugate pattern., [ES] Se ha estudiado la expresión de residuos glucídicos de glucoconjugados en la mucosa gástrica del pez sapo, Halobatrachus didactylus usando histoquímica convencional y de lectinas. La histoquímica clásica reveló la presencia de glicoconjugados neutros predominando sobre los ácidos en la zona apical de la superficie de las células epiteliales y de la criptas gástricas. Las células del cuello contienen algunas glicoproteínas neutras, mientras las glándulas gástricas han sido negativas al PAS y al Azul Alcián (AB). La histoquímica de lectinas mostró diferente expresión de oligosacáridos a lo largo de las células columnares. El citoplasma sub-nuclear reaccionó con las lectinas RCA, SBA, HPA, GSA, I-B4, GSA II, UEA I, LTA, Con A, KOH-sialidasa-WGA. La expresión de RCA120, DBA, SBA, HPA, KOH-sialidasa-WGA, GSA I-B4, GSA II, UEA I, LTA, MAL II y SNA se localizó en la zona del Golgi, donde se observó un incremento de la reactividad de la lectina DBA después del tratamiento con KOH. Los gránulos de la zona apical reaccionaron con PNA, UEA I, LTA, mostrando un incremento de la reactividad hacia la lectina PNA después del tratamiento con KOH. El borde de las células del lumen reaccionó con PNA, HPA, ConA, KOH-sialidasa-WGA, UEA I, LTA, MAL II, SNA, KOH-sialidasa-PNA. Los sitios de unión de la expresión de las lectinas-glucoconjugados fue menor en las células del cuello de las criptas gastricas que en las células columnares epiteliales. Las células del cuello reaccionaron con la UEA I y LTA, y las glándulas gástricas con PNA, DBA, SBA, HPA, Con A, GSA I-B4, KOH-sialidasa-WGA y KOH-sialidasa-DBA. Los resultados sugieren que el estómago del pez sapo, Halobatrachus didactylus, se caracteriza por un patrón especie-específico de expresión de glicoconjugados.

The Neotropical catfish Corydoras paleatus is a facultative air-breather and the caudal half of the intestine is involved in gas exchange. In South America, air-breathing fishes are found in tropical or sub-tropical freshwaters where the probability of hypoxia is high. The aim of this study was to characterize by traditional histochemical and lectinhistochemical methods the pattern of carbohydrate in the intestinal mucosa. Intestine samples were taken from 25 healthy adult specimens collected in Buenos Aires (Argentina). Samples were fixed by immersion in 10 % buffered formalin and routinely processed and embedded in paraffin wax. Subsequently, these sections were incubated in the biotinylated lectins battery. Labeled Streptavidin-Biotin (LSAB) system was used for detection, diaminobenzidine as chromogen and haematoxylin as a contrast. To locate and distinguish glycoconjugates (GCs) of the globet cells, we used the following histochemical methods: PAS; PAS*S; KOH/ PA*S; PA/Bh/KOH/PAS; KOH/PA*/Bh/PAS; Alcian Blue and Toluidine Blue at different pHs. Microscopically, the general structure of vertebrate intestine was observed and showed all the cell types characteristic of the intestinal epithelium. The cranial sector of catfish intestine is a site of digestion and absorption and its structure is similar to other fish groups. In contrast, enterocytes of the caudal portion are low cuboidal cells; and between these, globet cells and capillaries are observed, these latter may reach the mucosal lumen. Underlying the epithelium, observed a well-developed lamina propria-submucosa made of connective tissue; this layer was highly vascularized and did not exhibit glands. According to histochemistry, the diverse GCs elaborated and secreted in the intestine are associated with specific functions in relation to their physiological significance, with special reference to their role in lubrication, buffering effect and prevention of proteolytic damage to the epithelium together with other biological processes, such as osmoregulation and ion exchange. The lectinhistochemical analysis of the intestinal mucosa reveals the presence of terminal residues of glucose, mannose and galactose. In conclusion, this study has shown that GCs synthesized in the intestine of C. paleatus exhibit a high level of histochemical complexity and that the lectin binding pattern of the intestinal mucosa is characteristic of each species and the variations are related with the multiple functions performed by the mucus in the digestive tract. The information generated here may be a relevant biological tool for comparing and analyzing the possible glycosidic changes in the intestinal mucus under different conditions, such as changes in diet or different pathological stages., El pez neotropical Corydoras paleatus, de respiración aérea de tipo facultativa, utiliza el sector caudal del intestino para el intercambio gaseoso. En América del Sur, los peces con respiración aérea se encuentran en las aguas dulceacuícolas tropicales y subtropicales, donde la probabilidad de hipoxia es alta. El objetivo de este trabajo fue caracterizar mediante técnicas histoquímicas tradicionales y de lectinhistoquímica el patrón de carbohidratos de la mucosa intestinal. Para ello se utilizaron muestras de intestino de 25 ejemplares sanos adultos recolectados en la provincia de Buenos Aires (Argentina). Las muestras fueron fijadas en formol amortiguado al 10 % y se procesaron para su inclusión en parafina. Posteriormente, los cortes fueron incubados con una batería de lectinas biotiniladas. Se utilizó el sistema de marcado con estreptavidina-biotina (LSAB) para su detección, diaminobencidina como cromógeno y hematoxilina como colorante de contraste. Para localizar y diferenciar los glicoconjugados (GCs) de las células caliciformes, se utilizaron las siguientes técnicas histoquímicas: PAS, PAS*S, PAPS, KOH/PA*S, PA/Bh/KOH/PAS, KOH/PA*/ Bh/PAS, Azul Alcian y Azul de Toluidina a diferentes pHs. Microscópicamente, se observa la estructura general del intestino de los vertebrados y el epitelio intestinal presenta todos los tipos celulares característicos de esta región. El sector craneal del intestino de este teleósteo, es el sitio de digestión y absorción, y posee una estructura similar a la de otros grupos de peces. En cambio, los enterocitos de la porción caudal, son células cúbicas bajas, entre ellos se observan células caliciformes y capilares sanguíneas que llegan hasta el lumen de la mucosa. Por fuera del epitelio, se observa una lámina propia-submucosa muy desarrollada compuesta por tejido conectivo, altamente vascularizada que no presenta glándulas. De acuerdo con las técnicas histoquímicas, los diversos GCs elaborados y secretados por la mucosa intestinal se encuentran asociados con funciones específicas de importancia fisiológica, como su rol en la lubricación, su efecto amortiguador y la prevención de daños proteolíticos del epitelio junto con otros procesos biológicos, tales como la osmorregulación y el intercambio iónico. El análisis lectinhistoquímico de la mucosa intestinal revela la presencia de residuos terminales de glucosa, manosa y galactosa. En conclusión, en este estudio se demuestra que los GCs sintetizados en el intestino de C. paleatus muestran un alto nivel de complejidad histoquímica y que el patrón de unión de lectina de la mucosa intestinal es característico para cada especie y las variaciones se hallan relacionadas con las múltiples funciones realizadas por el mucus en el tracto digestivo. La información brindada en este trabajo es una herramienta de relevancia biológica para comparar y analizar los posibles cambios glicosídicos del mucus intestinal bajo diferentes condiciones como los cambios en la dieta o diferentes estados patológicos., Facultad de Ciencias Veterinarias

La fracción antigénica F2/3 de tripomastigotes contiene epitopes detectables por anticuerpos representativos de infección activa. Después del tratamiento con benznidazol, se comparó la cinética de negativización de la serología convencional (SC) y de los anticuerpos anti-F2/3 en 21 pacientes con Chagas congénito. Los pacientes se dividieron en 2 grupos: A) Edad < de 8 meses al diagnóstico; B) Edad > de 9 meses al diagnóstico; el grupo A negativizó la SC a los 6.6 m (IC95 3.4-9.8 m) y anti-F2/3 a los 4 m (IC95 0.9-7.1 m) p = 0.18. El grupo B negativizó la SC a los 63.1 m (IC95 42.1-84.2 m) y anti-F2/3 a los 21.9 m (IC95 5.7-38.1 m) p = 0.0025. El grupo A presentó una temprana negativización tanto de la SC como de los anti-F2/3. En el grupo B la negativización de los anti-F2/3 anticipó significativamente a la SC. La negativización de los anticuerpos anti-F2/3 es un marcador temprano de curación, particularmente en pacientes con mayor tiempo de infección.The F2/3 antigenic fraction isolated from Trypanosoma cruzi trypomastigotes contains epitopes recognised by antibodies which are representative of active infection. The kinetics of disappearance of conventional serology (CS) and anti-F2/3 antibodies were compared in 21 patients with congenital Chagas´disease after receiving benznidazole treatment. Patients were divided into 2 groups: (A) Age < 8 months at diagnosis; (B) Age > 9 months at diagnosis. Group A presented negative outcome for CS at 6.6 mo. (CI95 3.4-9.8 mo.) and for anti-F2/3 at 4 mo. (CI95 0.9-7.1 mo.), p = 0.18. Group B exhibited non-reactive CS at 63.1 mo. (CI95 42.1-84.2 mo.) whereas anti-F2/3 antibody determination became negative at 21.9 mo. (CI95 5.7-38.1 mo.), p = 0.0025. In patients belonging to group A, antibodies were undetectable by both CS and anti-F2/3 ELISA soon after receiving chemotherapy. In infants included into group B, a negative result for anti-F2/3 antibody detection significantly anticipated the disappearance of CS reactivity. Consequently, an anti-F2/3 antibody assay becoming negative should be considered as an early marker for assessment of cure, particularly in those patients with prolonged time of infection.

A parede celular micobacteriana é uma característica marcante do gênero Mycobacterium, apresentando lipídios e glicoconjugados bioativos, como fosfatidilinositol manosídeos (PIMs), lipomanana (LM) e lipoarabinomanana (LAM). A infecção crônica no interior de macrófagos pulmonares é relacionada com o acúmulo de colesterol na célula hospedeira, conferindo uma fonte alternativa de energia e carbono para o bacilo manter suas funções fisiológicas. Com base na atividade imunomoduladora desses glicoconjugados e na adaptação em outro ambiente no interior da célula hospedeira infectada, propomos investigar a possível modulação da biossíntese de LM/LAM em Mycobacterium smegmatis (saprofítico), após o cultivo em meio mínimo (MM) suplementado com glicerol e/ou colesterol. Como resultados, obtivemos que o bacilo, mesmo sendo saprofítico, foi capaz de acumular colesterol e influenciar na fisiologia bacteriana por apresentar um crescimento lento com densidade bacteriana comprometida. Além disso, o colesterol diminuiu o acúmulo de PIMs e promoveu mudanças morfológicas e de agregação bacteriana, mesmo mantendo a parede celular com sua característica físico-química específica (resistência a descoloração por álcool e ácido). A mudança mais marcante induzida pelo consumo do colesterol foi na biossíntese de LAM, que apresentou migração eletroforética diferenciada, compatível às massas moleculares maiores, assemelhando-se a de bacilos não saprofíticos (de 25 – 30 KDa para 30 – 50 KDa). Estes resultados mostram que o colesterol, quando utilizado como principal alternativa de fonte de energia e carbono, pode induzir mudanças fisiológicas em micobactérias, principalmente na biossíntese de LAM, uma das principais moléculas imunoreguladoras presente na parede celular. Estes dados sugerem que micobactérias podem sofrer mudanças semelhantes no interior de granulomas, e que estas mudanças podem ajudar na evolução da tuberculose para a forma crônica multibacilar, marcada por um aspecto imunodeficiente contra o bacilo. Mycobacterial cell wall is a hallmark of Mycobacterium genus, constituted of bioactive lipids and glycoconjugates: phosphatidylinositol mannoside (PIMs), lipomannan (LM) and lipoarabinomannan (LAM). The chronic infection inside lung macrophages is related with cholesterol accumulation into host cells as an alternative source of carbon and energy to maintain the bacilli with its physiological functions. To understand the activity of these immunomodulatory glycoconjugates during adaptation under the unusual environment inside the host infected cells, the present work propose to investigate the possible modulation of LM/LAM biosynthesis in Mycobacterium smegmatis (saprophytic) after culture in minimal medium (MM), supplemented with glycerol and/or cholesterol. Our results showed that saprophytic bacilli are able to accumulate the cholesterol and change the bacterial physiology due to slow growth and restrict cell density. Furthermore, the cholesterol consumption decreased the accumulation of PIMs and promoted morphological changes and bacterial aggregates, even maintaining the cell wall with its specific physic-chemistry characteristic (alcohol-acid resistance). The most impressive change after cholesterol consumption was the LAM biosynthesis, which showed distinct electrophoresis migration, compatible to high molecular weight of LAM from non-saprophytic bacilli (from 25 – 30 KDa to 30 – 50 KDa). These results showed that cholesterol consumption, when utilized as principal alternative of carbon and energy source, is able to induce physiological changes in mycobacteria, mainly in LAM biosynthesis, one of the most immunoregulatory molecules of cell wall. Ours data suggest that similar changes in mycobacteria may occur inside the granuloma, and that changes may help the evolution of tuberculosis to chronic and multibacillary form, hallmarked by immunodeficient aspect against the bacilli.

O presente trabalho descreve o desenvolvimento e aplicação de metodologias para glicoconjugação utilizando o átomo de selênio como conexão entre uma porção derivada de carboidrato e uma biomolécula quiral. Para tal foram realizadas modificações em D-carboidratos disponíveis comercialmente (D-galactose, D-xilose, D-ribose e D-manose) para a reação com dicalcogenetos de organoíla levando à obtenção de produtos arilcalcogenocarboidratos não glicosídicos, moléculas que apresentaram atividade biológica promissora. No âmbito da obtenção de produtos de maior complexidade estrutural, foram sintetizados disselenetos derivados de carboidratos e sua posterior aplicação como espécies para a glicoconjugação. Foi possível realizar a subtituição nucleofílica em carboidratos ou ainda em aziridinas preparadas a partir de L-aminoácidos, levando à obtenção de pseudodissacarídeos e neoglicoconjugados. Foi desenvolvida uma estratégia de introdução do selenocarboidrato em esteroides em diferentes posições a partir da abertura nucleofílica de 5,6--epóxidos e ainda por substituição na posição 3, levando à estruturas análogas à de produtos naturais glicoconjugados. A caracterização espectroscópica das novas moléculas foi realizada através de ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono, as quais foram úteis para a observação de efeitos estereoeletrônicos no caso dos arilcalcogenocarboidratos. Para os derivados esteroidais, técnicas bidimensionais foram aplicadas para a comprovação da estereosseletividade das reações de abertura de epóxido e substituição nucleofílica, que corroboram com o mecanismo proposto para a obtenção dos derivados 6B- e 3x- selenoesteroides glicoconjugados. The present work describes the development and application of methodologies for glycoconjugation by using selenuim atom as a linker between a carbohydrate moiety and a chiral biomolecule. Thus it was performed modifications on commercially available D-carbohydrates (D-galactose, D-xylose, D-ribose and D-mannose) by reaction with organoyl dichalcogenides leading to non-glycosidic arylchalcogenocarbohydrates, molecules that have shown promising biological activity. In the context of achievement of products with higher structural complexity, carbohydrate-derived diselenides were synthesized and its prior application as glycoconjugation species. It was possible to perform nucleophilic substitution on carbohydrates or even in aziridines prepared from Laminoacids, leading to pseudodisacharides and neoglycoconjugates. A strategy of introducing selenocarbohydrates into different position of steroids was developed from nucleophilic 5,6--epoxides opening and also from substitution at position 3, affording structures analogous to glycoconjugated natural products. Spectroscopyc characterization of the novel molecules was made by nuclear magnetig ressonance of hydrogen and carbon, which were useful for observing stereoelectronic effects in the case of arylchalcogenocarbohydrates. For steroid derivatives, bidimensional techniques were employed to prove the stereoselectivity of epoxide opening and nucleophilic substitution reactions, which supports the proposed mechanism of obtention of glycoconjugated 6B- and 3x-selenosteroids.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-07-12T18:11:30Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_ Patricia Oliveira Santos.pdf: 1373839 bytes, checksum: 29a4da7d68cc1c212a78497b9ae8ec0d (MD5) Made available in DSpace on 2013-07-12T18:11:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_ Patricia Oliveira Santos.pdf: 1373839 bytes, checksum: 29a4da7d68cc1c212a78497b9ae8ec0d (MD5) O protozoário Toxoplasma gondii tem os felídeos como seus hospedeiros definitivos e diversos outros animais como hospedeiros intermediários. Em ovinos e humanos, a toxoplasmose é responsável por abortamentos e doença neonatal quando a primoinfecção ocorre durante a gestação. Apesar da resposta imunológica desenvolvida pelos hospedeiros, o protozoário persiste no organismo parasitado, e a ingestão de carne ovina (crua ou mal cozida) contaminada constitui importante fonte de infecção humana. Recentemente, proteínas ligadas a glicosilfosfatidilinositol (GlyC) têm sido apontadas como importantes na ativação da resposta imune inata e constituem grande parte das proteínas de superfície de taquizoítos de T. gondii, além de serem reconhecidas por soros humanos na fase aguda da toxoplasmose. O presente estudo objetivou estudar a cinética da resposta imunológica humoral e celular na fase aguda da infecção pelo T. gondii em ovinos, e após imunização com GlyC, e desenvolver teste sorológico baseado em GlyC. O ELISA para detecção de IgG anti-lisado antigênico (LA) e anti-GlyC apresentou 100% e 30% de sensibilidade, e 96% e 94% de especificidade, respectivamente. Os ovinos infectados produziram IgM anti-LA e GlyC, e IgG anti-GlyC (p < 0.05); e os imunizados, IgM anti-LA e IgG anti-LA e GlyC (p < 0.05). A imunização com GlyC induziu aumento de células CD8+ e redução de células expressando MHC de classe II na circulação 60 dias após a injeção. O ELISA baseado em GlyC apresenta alta especificidade. GlyC é imunogênico para a espécie ovina e deve ser melhor avaliado como ferramenta diagnóstica e profilática na referida espécie. Salvador

The Mangalô bean (Lablab purpureus (L.) Sweet) is consumed in many places around the world, including Brazil. These leguminous contain Lectins, which are glycoproteins that bound to glico- conjugates and induce many biological responses. The present study is a research on the immunogenic capacity of the Lablab purpureus seeds proteins in orally immunized mice. The lectins’ ability to act as humoral immune response modulators when associated to egg albumin (OVA) and carbohydrates was also analyzed. Mice groups were immunized respectively with L. purpureus total exctract (ET), with L. purpureus ET associated to OVA and L. purpureus ET associated with different carbohydrates, by oral route. The mice fed with the L. purpureus total extract (ET) synthesized specific serological antibodies anti-ET and that response was due to the proteins of high molecular weight (above 45kDa). When the ET was associated to different sugars, the synthesis of specific antibodies anti-ET was mostly inhibited by N-Acetil-D-Glucosamine (p O feijão Mangalô (Lablab purpureus (L.) Sweet) é consumido em várias regiões do mundo, inclusive no Brasil. Esta leguminosa contém Lectinas, que são glicoproteínas capazes de ligar-se a glicoconjugados e estimular várias respostas biológicas. O presente trabalho é um estudo da capacidade imunogênica de proteínas de sementes de Lablab purpureus em camundongos quando imunizados pela via oral. Também foi analisada a capacidade das Lectinas de modular a resposta imune humoral quando associadas a ovalbumina (OVA) e quando associadas a diferentes carboidratos. Grupos de camundongos foram imunizados respectivamente com extrato total (ET) de L. purpureus, com ET de L. purpureus associado com OVA e com ET de L. purpureus associado com diferentes carboidratos pela via oral. Os animais alimentados com ET de L. purpureus sintetizaram anticorpos sorológicos específicos anti-ET e o Immunoblotting revelou que as proteínas de alto peso molecular (acima de 45kDa) foram as responsáveis por tal resposta. A síntese de anticorpos anti-ET foi inibida respectivamente por N-Acetil-D-Glicosamina (p

The composition and distribution of the glycoconjugates (GCs) secreted by the epithelium of ovarian lamellae with reference to the reproductive biology of Genypterus blacodes (Schneider, 1801) through lectin hi stochemistry is here discussed. In this species, the epithelial cells that line the ovarian c avity presented sharp morphological variations along the reproductive cycle related to the mucus secretion that accompanies oocyte ma turation. During sp awning season, residues of mannose and N-acetylglucosamine were detected in the glycocalyx of those cells using lectinhistochemistry. N-acetylgalactosamine and fucose were also observed in the same zone. The greatest variations in the lectinhistochemical pattern were found in the apical cytoplasm composition in comparison to the basal zone of the cells. The results of the present study were discussed by comparing their possible functional implications., Facultad de Ciencias Veterinarias

La entrada de los rotavirus a las células involucra un proceso complejo de múltiples pasos. Al menos tres tipos de receptores de superficie celular interactúan secuencialmente con las proteínas estructurales del virus, por un mecanismo que implicaría cambios conformacionales de las proteínas del virion. En este trabajo, se describen los estudios que implican a la proteína disulfuro isomerasa (PDI) asociada a la membrana celular durante el proceso de entrada del rotavirus. Los resultados señalan que PDI está inmersa en los microdominios lípidicos rafts, asociada con la proteína Hsc70 y la integrina αvβ3. Dos bloqueadores del intercambio tiol-disulfuro, DTNB y bacitracina, que no permean la membrana celular inhibieron la infección por rotavirus en un 50%. La especificidad del bloqueo de la infección viral fue confirmada adicionando anticuerpos anti-PDI; éstos disminuyeron la infección viral en un 45%, mientras que anticuerpos anti- ERp57 no tuvieron efecto. La interferencia de los bloqueadores tiol-disulfuro fue abolida por adición de PDI exógena al inoculo viral; además se demostró la interacción de PDI con las partículas virales. Péptidos sintéticos que contenían cisteínas tanto de secuencias rotavirales como de secuencias no relacionadas con rotavirus afectaron el proceso infeccioso, cuando fueron incubados con las células MA104. Anticuerpos generados contra los péptidos sintéticos inhibieron la infección por rotavirus cuando fueron adicionados después de la unión del virus a las células. El análisis por ELISA de captura del complejo PDI-péptido, indica que existe interacción directa entre la proteína y los péptidos que contienen cisteínas. Los bloqueadores de la actividad disulfuro isomerasa (DTNB, bacitracina y anticuerpos anti-PDI), los péptidos sintéticos o sus anticuerpos anti-péptidos no inhibieron la unión del virus a la célula, tampoco afectaron el proceso de permeabilización celular inducida por el rotavirus en los primeros eventos de entrada a las células. PDI podría ser un potencial blanco de interferencia con agentes antivirales que reaccionen con enlaces disulfuro. / Abstract. The rotavirus entry mechanism seems to involve a complex multistep process in which at least three different cell surface receptors interact sequentially with virus structural proteins. Conformational changes affecting virus proteins have been suggested as part of this mechanism. In this work, we describe studies demonstrating cell membrane-bound protein disulfide isomerase (PDI) implication during the virus entry process. Results showed that PDI is associated with Hsc70, integrin αvβ3 and rotavirus particles in membrane micro-domains (lipid rafts) from MA104 cells. DTNB and bacitracin, two membrane-impermeant thiol/disulfide blockers, were able to decrease rotavirus infection by about 50%. Viral infection blockade specificity was further confirmed by adding anti-PDI antibodies, which decreased viral infection by about 45%, whereas anti-ERp57 antibodies had no effect on infection. Thiol/disulphide blockers’ inhibitory effect was abolished by addition of exogenous PDI to viral inoculums, and PDI-rotavirus particle interaction was demonstrated. Rotavirus and non-related synthetic peptides containing cysteine residues also significantly affected viral infection when added to cells. Antibodies to cysteine residue-containing rotavirus synthetic peptides mainly inhibited rotavirus infection of MA104 cells when such antibodies were added following virus attachment. Incubating PDI with VP4 and VP7 synthetic peptides, followed by ELISA detection of specific antibodies against the respective synthetic peptides, revealed that PDI interacted with virion protein-derived peptides. Thiol/disulfide blockers, synthetic peptides and anti-PDI antibodies were unable to interfering virus attachment to cell, and rotavirus-induced cell permeabilisation, whereas all of them affected virus infectivity. PDI could thus be a potential target for antiviral agents reacting with disulfide bonds. Doctorado

Toadfish Halobatrachus didactylus gastric mucosa was studied using conventional and lectin histochemistry. Conventional histochemistry revealed neutral glycoconjugates predominating over acidic ones in the apical zone of both surface epithelial cells and pit cells. The neck cells contained a few neutral glycoconjugates, whereas gastric glands were negative to PAS and AB staining. Lectin histochemistry showed different oligosaccharide expression along the columnar cells. The sub-nuclear cytoplasm was stained with RCA120, SBA, HPA, GSA I-B4, GSA II, UEA I, LTA, Con A, KOH-sialidase-WGA. The Golgi zone reacted with RCA120, DBA, SBA, HPA, KOH-sialidase-WGA, GSA I-B4, GSA II, UEA I, LTA, MAL II, SNA, and showed an increase in DBA staining after KOH-sialidase treatment. The granules of the apical zone stained with PNA, UEA I, LTA and showed increased PNA reactivity after KOH-sialidase treatment. The luminal cell coat reacted with PNA, HPA, Con A, KOH-sialidase-WGA, UEA I, LTA, MAL II, SNA and KOH-sialidase-PNA. Pit cells showed a minor expression of lectin-binding sites with respect to columnar cells. Neck cells linked UEA I and LTA and gastric glands reacted with PNA, DBA, SBA, HPA, Con A, GSA I-B4, KOH-sialidase-WGA and KOH-sialidase-DBA. The results suggest that the stomach of the toadfish H. didactylus is characterised by a species-specific glycoconjugate pattern., Se ha estudiado la expresion de residuos glucidicos de glucoconjugados en la mucosa gastrica del pez sapo, Halobatrachus didactylus usando histoquimica convencional y de lectinas. La histoquimica clasica revelo la presencia de glicoconjugados neutros predominando sobre los acidos en la zona apical de la superficie de las celulas epiteliales y de la criptas gastricas. Las celulas del cuello contienen algunas glicoproteinas neutras, mientras las glandulas gastricas han sido negativas al PAS y al Azul Alcian (AB). La histoquimica de lectinas mostro diferente expresion de oligosacaridos a lo largo de las celulas columnares. El citoplasma sub-nuclear reacciono con las lectinas RCA, SBA, HPA, GSA, I-B4, GSA II, UEA I, LTA, Con A, KOH-sialidasa-WGA. La expresion de RCA120, DBA, SBA, HPA, KOH-sialidasa-WGA, GSA I-B4, GSA II, UEA I, LTA, MAL II y SNA se localizo en la zona del Golgi, donde se observo un incremento de la reactividad de la lectina DBA despues del tratamiento con KOH. Los granulos de la zona apical reaccionaron con PNA, UEA I, LTA, mostrando un incremento de la reactividad hacia la lectina PNA despues del tratamiento con KOH. El borde de las celulas del lumen reacciono con PNA, HPA, ConA, KOH-sialidasa-WGA, UEA I, LTA, MAL II, SNA, KOH-sialidasa-PNA. Los sitios de union de la expresion de las lectinas-glucoconjugados fue menor en las celulas del cuello de las criptas gastricas que en las celulas columnares epiteliales. Las celulas del cuello reaccionaron con la UEA I y LTA, y las glandulas gastricas con PNA, DBA, SBA, HPA, Con A, GSA I-B4, KOH-sialidasa-WGA y KOH-sialidasa-DBA. Los resultados sugieren que el estomago del pez sapo, Halobatrachus didactylus, se caracteriza por un patron especie-especifico de expresion de glicoconjugados.

House dust mites as Dermatophagoides pteronyssinus (Dp) are considered important allergen sources for sensitization of genetically predisposed subjects. Several allergens are commonly constituted by glycoconjugates that may have affinity with lectins, such as Concanavalin A (ConA). The aim of this study was to evaluate IgE, IgG1 and IgG4 reactivity to ConA-related components from Dp extract in allergic and non-allergic subjects. ConA-bound and ConA-unbound components were obtained from Dp crude extract after fractionation on ConA-Sepharose affinity chromatography and all extracts were evaluated by ELISA and immunoblotting for detection of IgE, IgG1, and IgG4 in sera from 95 mite-sensitized patients (DP+)and 92 non-allergic (NA) subjects. In DP+ patients, IgE and IgG1 seropositivity to crude Dp extract was higher (100% and 84,2%, respectively) than to ConA-related extracts, while IgG4 seropositivity was higher to ConA-bound Dp (83,2%) as compared to other Dp extracts. Interestingly, IgG4 seropositivity to ConA-related Dp extracts, especially ConA-bound Dp, was higher in DP+ than NA subjects. Inhibition ELISA for all antibody isotypes showed a high (>80%) cross-reactivity between crude Dp and ConA-related extracts or D. farinae extract (>70%). However, partial inhibition for IgG1 (67%) and IgG4 (33%), but not for IgE, was found when using Blomia tropicalis extract. Immunoblotting revealed immunodominant bands recognized by IgE (14 and 25 kDa) and IgG4 (25 and 88 kDa) mostly in crude Dp and ConAunbound extracts, whereas IgG1 recognized bands above 78 kDa mainly in crude Dp extract. ConA-bound and ConA-unbound Dp extracts demonstrate high crossreactivity and are constituted by components that are able to induce IgE synthesis in allergic patients, and IgG1 and IgG4 in allergic and non allergic subjects. Ácaros da poeira domiciliar, como Dermatophagoides pteronyssinus (Dp) são importantes fontes de alérgenos envolvidos na sensibilização de indivíduos geneticamente predispostos. Vários alérgenos são constituídos de glicoconjugados, que apresentam afinidade com lectinas, como a Concanavalina A (ConA). O objetivo deste estudo foi avaliar a reatividade de IgE, IgG1 e IgG4 aos componentes do extrato Dp não ligantes e ligantes à ConA em pacientes alérgicos e indivíduos não alérgicos. As frações não ligantes (FNL) e ligantes (FL) de ConA foram obtidas do extrato Dp bruto após o fracionamento por cromatografia de afinidade de ConASepharose e todos os extratos foram avaliados por ELISA e Immunoblotting para detecção de IgE, IgG1 e IgG4 no soro de 95 pacientes alérgicos a ácaros (DP+) e 92 indivíduos não alérgicos (NA). Em pacientes do grupo DP+, a soropositividade de IgE e IgG1 ao extrato Dp bruto (100% e 84,2%, respectivamente) foi maior do que às demais frações, enquanto a soropositividade de IgG4 foi maior à FL (83,2%), quando comparado aos demais extratos. Curiosamente, a soropositicbbvidade de IgG4 às frações relacionadas à ConA foram maiores no grupo DP+ comparados ao grupo NA, especialmente à FL. O ELISA de inibição competitiva para todos os anticorpos testados representou uma alta (>80%) reatividade cruzada entre o extrato Dp bruto e frações relacionadas à ConA ou extrato de D. farinae (>70%). Entretanto, inibições menores foram encontradas para IgG1 (67%) e IgG4 (33%), mas não para IgE, quando utilizado o extrato de Blomia tropicalis. O Immunoblotting revelou bandas imunodominantes reconhecidas por IgE (14 e 25kDa) e IgG4 (25 e 88kDa) em maior quantidade no extrato Dp e FNL, ao passo que IgG1 reconheceu somente bandas acima de 78kDa, principalmente no extrato Dp bruto. Frações não ligantes e ligantes de ConA derivadas de D. pteronyssinus apresentam alta reatividade cruzada e se constituem de componentes capazes de induzir a síntese de IgE em pacientes alérgicos, além de IgG1 e IgG4 em indivíduos alérgicos e não alérgicos. Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

This paper reports a histological, histochemical and immunohistochemical characterisation of growing oocytes of the swordfish Xiphias gladius. The presence and distribution of carbohydrates, proteins, lipids, calcium, iron, vitellogenin/Vg, zona radiata protein/Zrp, metallothionein/Mt, and thyroid hormones/T3-T4 were studied during oogenesis (cortical alveoli, globules, yolk-granules, cytoplasm, follicular and radiata envelopes). During the initial vitellogenic phase, the oocytes showed cortical alveoli and oil globules containing neutral lipids exclusively. During this phase, small yolk granules appeared around the peripheral cytoplasm, and they increased through exogenous vitellogenesis. Yolk granules were composed of glycoproteins, calcium, iron, and proteins rich in lysine, arginine, tyrosine, tryptophan, cysteine and cystine. Vg and Mt were immunohistochemically detected in yolk. The follicular envelope contained proteins rich in amino acids. Moreover, calcium and thyroid hormones (triiodotyronine and thyroxine/T3, T4) were detected in this cell envelope. Cortical alveoli, which contained carboxylated and neutral glycoconjugates, were especially rich in N-acetyl-D-galactosamine, N-acetyl-D-glucosamine, galactose and sialic acid. Finally, the zona radiata was mainly proteinaceous in nature and was composed of calcium and neutral glycoproteins. The egg envelope or chorion and the liver showed specific immunoreactivities by using anti-salmon Zrp as the primary antiserum., En este trabajo se realiza una caracterización histológica, histoquímica e inmunohistoquímica de los ovocitos en crecimiento del pez espada, Xiphias gladius. Se estudia la presencia y distribución de carbohidratos, proteínas, lípidos, calcio, hierro, vitelogenina/Vg, proteína radiada/Zrp, metalotioneina/Mt y hormonas tiroideas/ T3-T4 durante la ovogénesis (alveolos corticales, glóbulos, gránulosvitelo, citoplasma, capas folicular y radiada). Durante la fase inicial de la vitelogénesis, los ovocitos presentan alveolos corticales y una gota lipídica conteniendo exclusivamente lípidos neutros. Durante esta fase en la periferia del citoplasma aparecen pequeños granulos de vitelo, incrementando progresivamente durante la vitelogénesis exógena. Los gránulos de vitelo están compuestos por glicoproteínas, calcio, hierro, proteínas ricas en lisina, arginina, tirosina, triptófano, cisteina y cistina, y contienen Vg y Mt. La capa folicular de los ovocitos del pez espada está compuesta por glicoproteínas y proteínas ricas en diferentes aminoácidos. Esta envuelta contiene calcio y hormonas tiroideas/ T3 y T4. Los alveolos corticales están constituidos por glicoconjugados carboxilados y neutros, y son especialmente ricos en N-acetil-D-galactosamina, N-acetil- D-glucosamina, galactosa y ácido siálico. Finalmente, la capa radiada, fundamentalmente proteica, contiene calcio y glicoproteínas neutras. Utilizando anti-salmon Zrp, como anticuerpo primario, el corion o capa radiada y el hígado muestran una immunoreactividad específica.

The histochemical characteristics of the mucous cells located in the gills of the fish Apareiodon affinis (Steindachner, 1879) (Characiformes, Paradontidae) were investigated. Several methods for the localization and characterization of glycoconjugates (GCs) with oxidizable vicinal diols, O -acyl sugars, O- sulphate esters and sialic acids residues without O-acyl substitution or with O-acyl substitution at C7, C8 or C9 were employed. Mucous cells were observed among the epithelial cells of the filament and the gill lamellae. No histochemical differences were detected between the mucous cells of primary and secondary lamellae. They contained high amounts of GCs with carboxyl groups and O-sulphate esters, together with moderate amounts of GCs with oxidizable vicinal diols, and low amounts of GCs with sialic acids. This work demonstrated the heterogeneity of the mucous cells GCs, which could be associated with different functions such as lubrication, protection and inhibition of the invasion and proliferation of pathogenic microorganisms and ionic regulation., Las características histoquímicas de las células mucosas de las branquias de Apareiodon affinis (Steindachner, 1879) (Characiformes, Paradontidae) fueron investigadas. Se utilizaron métodos para la localización y caracterización de glicoconjugados (GCs) con dioles vecinos oxidables, O-acil azúcares, ésteres orto-sulfatados y residuos de ácidos siálicos sin substitución o con substitución O-acilo en C7, C8 y/o C9. Se observaron células mucosas entre las células epiteliales del filamento y las laminillas secundarias. No se encontraron diferencias histoquímicas entre las células mucosas de las laminillas primarias y secundarias. Ellas poseen abundantes GCs con grupos carboxílicos y esteres O-sulfatados, junto con moderada proporción de GCs con dioles vecinos oxidables y baja cantidad de GCs con ácido siálico. Este trabajo demostró la heterogeneidad de los GCs de las células mucosas que podría asociarse con funciones diferentes como la lubricación, protección e inhibición de la invasión y proliferación de microorganismos patógenos y la regulación iónica., Sociedad de Ciencias Morfológicas de La Plata

El objetivo de este trabajo fue mejorar un método estándar para la purificación de lipopolisacárido (LPS) de Porphyromonas gingivalis libre de polisacáridos usando una estrategia de extracción, digestión enzimática y cromatografía de alta resolución. La bacteria P. gingivalis se cultivó en condiciones de anaerobiosis y se hizo extracción de las membranas con el método de fenol-agua. Luego de una digestión enzimática (DNAsa, RNAsa y proteasa) se separó el extracto por filtración por gel con Sephacryl S-200. La muestra purificada se caracterizó por electroforesis en gel de acrilamida con tinción de plata y por el método Purpald se detecto el ácido 2-ceto-3-desoxioctu- losónico (KDO). Se obtuvo una preparación libre de ácidos nucleicos, proteínas y polisacáridos. La separación por cromatografía fue de alta resolución al permitir la obtención de dos picos con diferentes componentes. El protocolo de purificación nos permitió obtener LPS de P. gingivalis con alto grado de pureza, el cual podría ser usado en próximos ensayos para evaluar su función en ensayos in vitro e in vivo; así como iniciar la obtención de LPS de otras bacterias períodontopáticas, con el fin de investigar la asociación de enfermedad períodontal con enfermedades cardiovasculares. The aim of this work was to improve a standard methodology to purify Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide (LPS) using a protocol of extraction, enzymatic digestión and high resolution chromatography. P. gingivalis bacteria was cultured in anaerobiosis, their membranes were extracted using the phenol-water method, then subjected to DNAse, RNAse and protease digestion and finally, the extract was separated by chromatography using Sephacryl S-200. The purified extract was characterized by silver staining after polyacrylamide gel electrophoresis and 2-keto-3-deoxioctanoic acid (KDO) was detected using the Purpald’s method. A preparation free of nucleic acid-, protein- or polysaccharides was obtained. The chromatographic separation showed high resolution since there was two discrete peaks with different components. The purification protocol allowed us to obtain a highly purified P. gingivalis LPS which could be used in future tests to evaluate its behavior in vitro and in vivo and elucidate its function, as well as to obtain LPS from other períodontopatic bacteria to address the association of períodontal disease with cardiovascular diseases.

Background: Components from species of mites found in the house dust showed an important role in respiratory diseases. Many of these components are glycosylated and some lectins, like Concanavalin A (ConA) showed an affinity to those molecules. Objectives: To determine the levels of speific IgE to Df crude extract and Df- ConA bound fraction in allergic patients and their cross-reaction between D. pteronyssinus and B. tropicalis crude extracts by ELISA and Inhibition ELISA, respectively. The presence of allergic components in Df crude extract and Df- ConA bound reactive to IgE by Immunoblot also was verified. Methods: Concanavalin A affinity chromatography was used to obtain glycosylated fraction with α-D-mannose and β-D-glucose residues from Dermatophagoides farinae (Df) crude extract. ConA-unbound and ConA-bound fractions and also Df crude extract were used to evaluate IgE reactivity by ELISA and Immunoblot in sera from 41 mite-sensitive patients with allergic rhinitis history and 31 non-allergic subjects selected by skin prick test. Results: All allergic patients were positive SPT to D. farinae and D. pteronyssinus, and 93% of co-positivity to B. tropicalis. ELISA showed a great positivity in all extracts, but higher levels of IgE were found in Df crude extract and ConA-unbound fractions when comparing with ConA-bound fraction. However, both ConA-unbound and ConA-bound fractions showed a significant positive correlation with Df crude extract. Inhibition ELISA assay showed a high cross-reactivity between Dermatophagoides farinae and Dermatophagoides pteronyssinus extracts. High frequency IgE reactivity to apparently high molecular bands in the ConA-bound fraction was observed by Immunoblot analysis. Conclusion: Dermatophagoides farinae represent an important source of glycosylated allergens with Concanavalin A affinity which are involved in the mechanisms of IgE induction in allergic rhinitis. Introdução: Os componentes de espécies de ácaro encontrados na poeira de casas mostraram um importante papel nas doenças respiratórias. Muitos desses componentes são glicosilados e algumas lectinas, como a Concanavalina A (ConA) mostraram afinidade à aquelas moléculas.. Objetivos: Determinar os níveis de IgE específica ao extrato Df total à fração Df-ConA em pacientes alérgicos e sua reatividade cruzada entre os extratos brutos de D. pteronyssinus e B. tropicalis por ELISA e ELISA.de inibição respectivamente. A presença de componentes alergênicos no extrato Df total e na fração Df-ConA reativos à IgE por Immunoblot também foi verificada. Material e Métodos: A cromatografia de afinidade em coluna de afinidade ConA-Sepharose foi usada para obter frações gilcosiladas com resíduos de α- D-manose and β-D-glicose do extrato bruto de Dermatophagoides farinae (Df total). As frações Df-nConA e Df-ConA e também o extrato Df total foi usado para avaliar a reatividade de IgE por ELISA e Immunoblot e soro de 41 pacientes com histórico de rinite alérgica e sensíveis ao ácaro e 31 indivíduos não alérgicos selecionados pelo Teste Cutâneo de Puntura. Resultados: Todos os pacientes foram positivos ao D. farinae e D. pteronyssinus, e 93% de co-positividade à B. tropicalis. O ELISA mostrou uma grande positividade em todos os extratos, mas níveis mais altos de IgE foram encontrados no extrato Df total e na fração Df-nConA quando comparados à fração Df-ConA. Entretanto, ambas as frações Df-nConA e Df-ConA, mostraram uma correlação positiva com o extrato Df. O ELISA de inibição mostrou uma alta reação cruzada entre os extratos de Dermatophagoides farinae e Dermatophagoides pteronyssinus. Alta freqüência de IgE reativa a bandas de alta massa molecular aparente na fração Df-ConA foram observadas pelo Immunoblot. Conclusão: Dermatophagoides farinae representa uma importante fonte de alérgenos glicosilados com afinidade a Concanavalia A, os quais estão envolvidos nos mecanismos de indução da IgE na rinite alérgica. Palavras-Chave: Rinite alérgica, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus, Blomia tropicalis, Concanavalina A, Reatividade cruzada, Glicoconjugados. Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

The use of mushrooms as nutritional and medicinal through the milenar culture in oriental has arrived progressively in the Occident, take by the necessity of the population to search of a more healthy nutrition. Further more, the scientific community has revealed through publications, important findings in relation to the nutritional values and the therapeutic activities of mushrooms. As a contribution for a better knowledge of the properties of this fungus, studies are being tackled with Agaricus blazei Murill cultivated in Brazil in two distinct regions: Piedade, in the state of São Paulo and Guaramiranga, in the state of Ceará. In the first stage, the studies were devoted to the cultivated mushrooms in Ceará (Cog-Ce). The results of the spectroscopy analysis (FTIR and NMR) demonstrated that the purified polysaccharides and fractions (F1 and F4) showed characteristics of the presence of carbohydrates and proteins. After the fractionation was completed, through successive precipitations in ethanol, it was observed by the FTIR spectrum, a reduction of the carbohydrate content and an increase in the protein content. Molecular absorption of the samples indicated the absence of free protein in the purificated polysaccharides and its fractions, which point to the existence of the effective link between carbohydrate and protein, characteristics of the proteoglucans. The analyses revealed the presence of glucans of configuration b(1®6) and a(1®4), with the first having the most representative content. The glucose monosaccharides were predominant between the sugars present and the mineral phosphorus element was the major constituent between the elements analysed. The study of the purified polysaccharides and the isolated fractions of the Agaricus blazei Murill, cultivated in São Paulo (Cog-SP) were carried out in a second stage of the research. The isolated purified polysaccharides, after analyses of the constituents, were characterized and its properties in solutions were investigated, taking into consideration physical-chemical parameters and rheological properties. Furthermore, biological assays were also carried out for evaluation in the case of therapeutic activities. The analyses by 1H and 13C NMR made evident the presence of b glucans (1®6) and a(1®4), which the glucana b(1®6) was predominant. The presence of glucans a(1®4) were greater in relation to the presented content by Cog- Ce. The glucose monosaccharides and the mineral phosphorus element were also predominants in Cog-SP, in relation to the sugars and the minerals present respectively. The greater protein content and the smallest carbohydrate content were found for the purified polysaccharides of Cog-SP when compared to the Cog-Ce. Glucans b(1®6) were isolated through the specific purification procedure with the use of Timol. FTIR and 1H, 13C NMR and the bidimensional COSY and HMQC, confirmed the purity of the material in the b(1®6) configuration, with indication of the link to protein group. The study of purified polysaccharides in solutions showed compounds with high molecular weight. The confirmation of random coils was strongly suggested by light scattering, which was, probably, due to the presence of protein and mineral elements. Low viscosities were observed in the polysaccharides when compared to those of the glucans traditionally used in foods. Rheological measurements demonstrated a Newtonian behavior of the materials. Physical-chemical parameters, such as surface tension and critical micelle concentration (cmc), as well as others, demonstrated similar characteristics to those found for polymers with tensoactive properties. Due to these characteristics, the purified polysaccharides were tested in relation to the solubilizing capacity using the poorly water soluble drug griseofulvin as a model solubilizate. The preliminary test suggest that these polysaccharides, in the gluco-protein form, in solution, are potentially useful to act as a solubilizer for aromatic drugs. The biological test carried out with the purified polysaccharides and/or proteoglucans, demonstrated that they present anti-tumoral activities in vitro, through inhibition of the replication of poliovirus and anti-tumoral in vivo against the Sarcoma 180. cultura milenar do uso dos cogumelos pelos orientais como alimento funcional e medicinal tem chegado progressivamente ao ocidente, levada pelo anseio da população na busca de uma alimentação mais saudável. Além disso, a comunidade científica tem revelado por meio de publicações, descobertas importantes em relação ao valor nutritivo e às atividades terapêuticas dos cogumelos. Como uma contribuição para um melhor conhecimento das propriedades destes fungos, neste trabalho, estão sendo abordados os estudos realizados com o cogumelo Agaricus blazei Murill cultivado no Brasil em duas regiões distintas: Piedade, no Estado de São Paulo e Guaramiranga, no Estado do Ceará. Na primeira etapa, os estudos foram voltados para o cogumelo cultivado no Ceará (Cog-Ce). Os resultados das análises espectroscópicas (FTIR e RMN) mostraram que os polissacarídeos purificados e frações (F1 a F4) apresentam características da presença de carboidratos e proteínas. Na seqüência em que o fracionamento foi realizado, através de precipitações sucessivas em etanol, observou-se nos espectros FTIR uma redução do teor de carboidratos e aumento no conteúdo protéico. Espectros de absorção molecular das amostras indicaram a ausência de proteína livre nos polissacarídeos purificados e suas frações, o que aponta para a existência de ligação efetiva entre carboidrato e proteína, característica dos proteoglucanos. As análises revelaram a presença de glucanas de configurações 1®6) e a(1®4), sendo a primeira de conteúdo mais representativo. O monossacarídeo glicose foi predominante entre os açúcares presentes e o elemento mineral fósforo foi o maior constituinte entre os elementos analisados. O estudo dos polissacarídeos purificados e frações isolados do Agaricus blazei Murill cultivado em São Paulo (Cog-SP) foi realizado em uma segunda etapa do trabalho. Os polissacarídeos purificados isolados, após análise dos constituintes, foram caracterizados e suas propriedades em solução investigadas, considerando-se parâmetros físico-químicos e propriedades reológicas. Além disso, foram realizados ensaios biológicos para avaliação quanto a atividades terapêuticas. As análises por RMN 1H e 13C evidenciaram a presença de glucanas (1®6) e a(1®4), sendo predominante a glucana (1®6). A presença de glucanas a(1®4) foi maior em relação ao teor apresentado pelo Cog-Ce. O monossacarídeo glicose e o elemento mineral fósforo também foram predominantes no Cog-SP, entre os açúcares e os minerais presentes, espectivamente. Maior teor de proteína e menor conteúdo de carboidratos foram encontrados para os polissacarídeos purificados do Cog-SP quando comparados ao Cog-Ce. Glucanas de configuração (1®6) foram isoladas através de procedimentos específicos de purificação com uso de Timol. Análises de FTIR e RMN 1H, 13C e os bidimensionais COSY e HMQC confirmaram a pureza do material na configuração (1®6) com indícios de ligação com grupo protéico (proteoglucano). O estudo dos polissacarídeos purificados em solução mostrou materiais de elevadas massas molares. Uma conformação de novelo aleatório foi fortemente sugerida pelas medidas de Espalhamento de Luz, sendo, provavelmente, devida à presença da proteína e elementos minerais. Baixas viscosidades foram observadas nos polissacarídeos quando comparadas às das glucanas tradicionalmente usadas na alimentação. Medidas reológicas mostraram o comportamento Newtoniano dos materiais. Parâmetros físico-químicos, tais como, tensão superficial e concentração micelar crítica (cmc), entre outros, apresentaram-se semelhantes àqueles encontrados para polímeros com propriedades tensoativas. Em razão destas características, os polissacarídeos purificados foram testados em relação à capacidade de solubilizar o fármaco modelo griseofulvina. Os testes preliminares sugerem que esses polissacarídeos, na forma de proteoglucanos, em solução, são potencialmente úteis para atuar como meio solubilizante para drogas aromáticas. Os testes biológicos realizados com os polissacarídeos e/ou proteoglucanos purificados mostraram que estes apresentam atividades antiviral in vitro, pela inibição da replicação do poliovírus e antitumoral in vivo contra o Sarcoma 180.

Orientadores: Aureo Tatsumi Yamada, Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O fenômeno da gestação em mamíferos de placentação hemocorial, onde o feto alogênico, apresentando metade dos genes de origem paterna, desenvolve um íntimo contato com o tecido materno sem desencadear uma resposta de rejeição pelo sistema imune materno, é ainda uma questão da imunologia da reprodução não esclarecida completamente. O diálogo na interface materno-fetal do útero gestante envolve uma gama de citocinas da categoria Th1fTh2, bem como de várias populações celulares, onde se destacam as células Natural KiUer uterinas (uNK). As uNK são populações linfocitárias transitórias que migram a partir de progenitores localizados em órgãos linfóides secundários como linfonodo e baço para o útero gestante e, neste proliferam e diferenciam ao longo da gestação. A presença destas células no útero gestante tem sido relacionada com o reconhecimento dos antígenos HLA-G e HLA-E expressos pelos trofoblastos, resultando na inibição tanto da resposta imune inata quanto da adaptativa. Esta atuação peculiar das uNK sugere que a modulação destas células no útero gestante esteja relacionada com a expressão de receptores específicos não compartilhada com células NK circulantes (eNK). Em uNK de camundongos, a lectina DBA (Doliehos biflorus agglutin) identifica glicoconjugados contendo N-acetil D-galactosamina presentes na superfície destas células e que não são expressos por outros linfócitos, corroborando com a hipótese de que as uNK expressam receptores específicos não comuns às eNK Neste trabalho, nós propusemos avaliar a possível expressão de moléculas específicas na superfície das células uNK de camundongos e identificar as proteínas candidatas através de técnicas proteômicas. Para tanto foram inicialmente utilizadas células uNK isoladas e purificadas de úteros de camundongos prenhes como in6culos antigênicos em machos da mesma espécie, para avaliar a capacidade de indução de uma resposta imune com produção de anticorpos reativos a esses antígenos. Outra estratégia utilizada foi o isolamento de proteínas de homogenados uterinos, de células uNK e da membrana destas células, na tentativa de isolar e identificar aquelas reativas à lectina DBA. Como resultado das inoculaçães de células uNK, os camundongos receptores produziram anticorpos séricos que reconheciam células uNK através de reações imunocitoquímicas. Este resultado confirma a expressão de moléculas específicas em células uNK, que por sua vez as caracteriza como uma subpopulação de NK específica da gestação. Dos dois animais com maior nível de anticorpos séricos foram coletados os baços para o preparo das células empregadas em experimentos de fusão celular para a obtenção de hibridomas secretores de anticorpos monoclonais. Um dos anticorpos monoclonais obtidos reconheceu moléculas presentes na superfície e no citoplasma das células uNK de várias linhagens de camundongos, assim como moléculas em células presentes no endométrio de ratas prenhes e no endométrio gestacional de humanos, sugerindo que moléculas homólogas são expressas em uNK de outras espécies. No entanto, este anticorpo monoclonal anti-uNK de camundongo (mamuNK1) apresentou reação cruzada com componentes citoplasmáticos de outras células, sugerindo não serem específicos para uNK Em relação ao isolamento dos glicoconjugados lectina DBA reativos observouse que através da cromatografia de gel filtração o isolamento mostrou-se pouco eficiente para o "pool" de proteínas contidas no homogenado uterino, ou mesmo de homogenado de células uNK, em decorrência da existência de múltiplas frações de proteínas capazes de ligar à lectina DBA. Restringindo-se o "pool" de proteínas àquelas obtidas apenas da membrana de células uNK e, através da eletroforese de duas dimensões pode-se delimitar as proteínas de interesse, as quais foram submetidas à análise proteomica. A identificação das proteínas isoladas das membranas de células uNK através de técnicas proteomicas sugeriram as proteínas Conserved oligomeric Golgí complex component 4 (COG4) e Heat shock 70-líke proteín 1 (Hsp 70 L1) como potenciais candidatas relacionadas com as atividades das células natural kíller no útero gestante Abstract: The phenomenon of pregnancy in mammalians with hemochorial type placenta ions where the allogeneic fetus presenting the half of gene from paternal origins growth in tight contact with maternal tissues, without triggering the rejections responses of maternal immune system is still a non-solved question of immunology of reproduction. The cross-talk at maternal-fetal interface in the pregnant uterus involves a range of Th1rrh2 cytokines, as well as, several cell populations with accentuated participation of uterine Natural Killer (uNK) Iymphocytes. The uNK .are transient leukocyte population that migrate from precursor cells localized at secondary Iymphoid organs such as Iymph nodes and spleen into the pregnant uterus and proliferate and differentiate during the gestation. The presence of these cells in the pregnant uterus has been related to recognition of the HLAG and HLA-E antigen present in the trophoblast, which results in inhibition of both innate and adaptive immune response. This peculiar activity of uNK suggests that the modulation of such cells in the pregnant uterus should be related with the expression of specific receptors not shared with peripheral blood circulating NK (cNK) cell. In the mouse uNK, the DBA (Dolichos biflorus agglutin) lectin identify n-acetyl D-galactosamine containing glycoconjugates present on the surface of these cells not expressed by other Iymphocytes, which corroborate the hypothesis of uNK expressing specific receptors not shared by cNK. The present work aimed to evaluate the presumed expression of specific molecules on mouse uNK cell surface and identify the candidate proteins by proteomic methods. Initially were used uNK cells isolated and purified from pregnant mice uteri as antigen to be inoculated in the male mice and evaluate the capacity of induction of immune response with production of antibodies reactive to these antigens. Other strategy was to realize procedures of protein isolation from uterine homogenates, uNK cells and the membrane of these cells, in the attempt to isolate and identify those reactive to DBA lectin. As results of inoculation of uNK cells were verified responses in the inoculated males by presence of serum antibodies that recognized uNK with immunocytochemistry. These results confinn the expression of specific molecules in uNK cells which characterize these cells as specific NK subset of pregnancy. From two animaIs with highest levei of antibodies in 1he serum were collected the spleen to isolate the Iymphocytes clones for monoclonal antibodies obtantion. One of these antibodies recognized antigen molecules found on the surface and cytoplasm of the uNK cells of several mice strains, as well as, molecules in cells present in the pregnant rats and human beings endometrium, which suggests the expression of homologous molecules in uNK of other species. However, this mouse anti-mouse uterine NK (mamuNK1) was reactive with citoplasmatic components the other cells, suggesting not be specific to uNK. About the isolation of DBA lectin reactive glycoconjugates by purification in gel filtration chromatography revealed low efficiency to the pool of proteins contained in the uterine homogenate, or even in the homogenate of isolated uNK cells due to the multiple DBA lectin positive protein fractions. By restriction of protein pool to those obtained from the uNK cells membrane and by two dimension electrophoresis was delimited the target proteins that were submitted to the proteomic analysis. The identification of isolated proteins of the membranes of uNK cells with proteomics methods suggested the Conserved proteins oligomeric Golgi complex Component (4 COG4) and Heat shock 7D-like protein 1 (Hsp 70 L1) as potential candidates related to the activity of the natural to killer cells in the pregnant uterus Doutorado Histologia Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Title: Molecular Basis of The Glycoconjugate Specificity of Lectins From SubTribe Diocleinae. Background: Proteins exhibiting non-catalytic binding sites towards carbohydrates form a class of very heterogeneous molecules commonly designed lectins. These proteins have been used as study-model molecules to understand the molecular basis of protein-carbohydrate interactions. Seeds of the subtribe Diocleinae are a rich source of lectins whose primary specificity is addressed to glucose/mannose monosaccharides. However, despite this and many other structural features shared by Diocleinae lectins they display difterent recognition to glycoconjugates like N-acetyllactosamine and oligomannoside types. The present work aimed to determine the molecular basis of the oligosaccharide specificity of the Diocleinae lectins towards glycoproteins and purified glycopeptides on a comparative basis to other legume lectins. The experimental strategy included analysis of the kinetic interaction (and inhibition) of soluble lectins with immobilized glycoproteins based on Surface Plasmon Resonance (RPS-BiaCore Technology); Aftinity of immobilized lectins to soluble radio-Iabelled oligosaccharides and glycopeptides and autoradiography analysis of the fractionated structures upon lectin aftinity column. Material and Methods: The seed lectins from Canavalia brasiliensis, C. maritima, C. bonariensis, Cratylia floribunda, Dioclea grandiflora, D. virgata and D. violacea, D. guianensis were purified by aftinity chromatography as previously described in the literature. The purified lectins were assayed for kinetic interaction analysis with immobilized glycoproteins exhibiting distinct oligosaccharide structures of N-acetyllactosamine and oligomannoside types and inhibition of the interaction by monosaccharides. Further, the glycoconjugate specificity of the lectins was investigated by aftinity chromatography of radio-Iabeled glycopeptides and oligosaccharides of difterent origins and well-defined structures on lectin-Sepharose 4B columns. The ability of these lectins to fractionate complex mixtures of closely related oligomannoside structures was determined by autoradiography analysis of the chromatography fractions eluted from the lectin columns. Results: The lectins showed ability to interact with glycoproteins exhibiting both Nacetyllactosamine and oligomannoside type glycans. The kinetic interaction varied considerably among the proteins under similar experimental conditions. The monosaccharides glucose and mannose were eftective to diminish lectinglycoprotein interactions at concentrations as lower as 25 mM. Upon affinity chromatography, the lectins showed interaction with N-acetyllactosamine type asparagin-glycopeptides but the recognition was limited to biantennary structures. Larger structures possessing three or more antennas were completely devoid of interaction. The lectins seem to bind and discriminate biantennary glyeopeptides/oligosaeeharides of N-aeetyllaetosamine type but failed to reeognize their eounterparts with multi-antennas. They were able to diseriminate native and asialo forms of the biantennary N-aeety//aetosamiane glyeopeptide purified from human serum transferrin. The affinity was maxima when the glycopeptide was previously digested to exhibit galactose and further N-acetylglucosamine in its non-reducing end. Its related oligosaccharide, devoid of sialic acid was recognized by D. virgata but not by D. violacea. Glycopeptides from Orosomucoide, containing mainly a mixture of bi- tri- and tetra-antennary glycopeptides were not recognized by the lectins. Interaction with oligomannosides was drastically differentiated. Affinity was proven to be stronger proportionally to the presence and number of mannose residues a-(1 -> 2) linked in the outer of structures. Thus Man9 was strongly recognized while Man5 was poorly. Of great relevance was that the lectins seems to be able to separate some of the oligomanoside structures within a complex mixture and it is not ruled out that Man8 or Man7 isomers could be fractionated under well-determined experimental conditions. Conclusions: Requisites for bind glycopeptides or oligosaccharides in the carbohydrate-binding site of the lectins include the presence of the monosaccharide inhibitor of the lectin activity and the accessibility for it, but does not define the affinity of the lectins for glycoconjugates. According to the results, the lectins may recognize internal mannose residues in the N-acetyllaetosamine type oligosaeeharides and the affinity increases as much exposed as the trimannoside core is presented. Regarding the recognition of oligomannosides the rule is opposite. The presence of Mannose residues a-(1->2) linked in the outer of structures seems to play a key role in the affinity. However the presence of these residues as occurs in Man6 and mainly in Man7 up to Man9 suggests that the monosaccharide that arbors the lectins should not be the same that plays this role in the interaction with N-acetyllactosamine type. Comparing this performance with that of other mannose-binding legume as Parkia platycephala and non-Iegume leetins it makes clear that the affinity to binding oligosaeeharides is not defined solely by the carbohydrate-binding but instead it, the vicinity of the monosaccharide pocket should possesses structural characteristies to differentiate each lectin-glycoconjugate complex that is supported by the concept of extended binding-site and epitope recognition. Divergences in affinity among Diocleinae lectins ought reflect this hypothesis and thus explain at least in part their differential performance in binding the same structure. This work was supported by grants from CAPES/COFECUB, CNPq, FUNCAPCe and International Foundation for Science. Título: Bases Moleculares da Interação de Lectinas da Sub-Tribo Diocleinae Com Glicoconjugados. Introdução: Proteínas que exibem um sítio de ligação não catalítico para carboidratos formam uma classe de moléculas muito heterogênea comumente denominada lectinas. Essas proteínas têm sido utilizadas como modelo de estudo no entendimento das bases moleculares das interações entre proteína-carboidrato. Sementes da subtribo Diocleinae são uma rica fonte de lectinas que apresentam especificidade primária dirigida para monossacarídeos glucose/manose. Todavia, apesar de lectinas Diocleinae compartilharem muitas características, elas exibem reconhecimento diferente para os glicoconjugados N-acetillactosamina e oligomanosídeo. O presente trabalho têm como objetivo determinar as bases moleculares da especificidade por oligossacarídeos de lectinas Diocleinae com realação a glicoproteínas e glicopeptídeos purificados comparando a outras lectinas de leguminosas. A estratégia experimental inclui análise da cinética de interação (e inibição) de lectinas solúveis com glicoproteínas imobilizadas baseado em Ressonância Plasmônica de Superfície (RPS-BiaCore Technology), afinidade de lectinas imobilidadas em Sepharose4B frente a glicopeptídeos e oligossacarídeos solúveis radiomarcados juntamente com a análise de autoradiografia de estruturas fracionadas a partir colunas de afinidade com lectinas imobilizadas. Material e Métodos: Lectinas de sementes de Canavalia brasiliensis, C. marítima, C. bonariensis, Cratylia floribunda, Dioclea grandiflora, D. Virgata, D. Víolacea e D. guianensis foram purificadas por cromatografia de afinidade como previamente descrito na literatura. As lectinas purificadas foram analisadas através de cinética de interação com glicoproteínas imobilizadas que exibiam diferentes estruturas oligossacarídicas dos tipos N-acetillactosamina e oligomanosídica e inibição destas interações por monossacarídeos. Além disso, a especificidade das lectinas por glicoconjugados foi investigada por cromatografia de afinidade de glicopeptídeos e oligossacarídeos de diferentes origens, com estruturas bem definidas, sobre colunas de lectinas-Sepharose 4B. A capacidade dessas lectinas de fracionar misturas complexas de estruturas oligomanosídicas com grande similaridade na estrutura linear foi determinada pela análise de autoradiografias das frações cromatográficas provindas das colunas de lectinas. Resultados: As lectinas mostraram habilidade de interagir com glicoproteínas que exibem glicanos dos tipos N-acetillactosamina e oligomanosídico. A cinética de interação variou consideravelmente entre as proteínas sobre as mesmas condições experimentais. Os monossacarídeos glucose e manose foram eficazes em reduzir a interação lectina-glicoproteínas em concentrações menor que 25mM. A partir do ensaio de cromatografia de afinidade, as lectinas mostraram interação com glicopeptídeos ligados a asparagina do tipo N-acetillactosamina, entretanto o reconhecimento foi limitado as estruturas biantenadas. Estruturas maiores possuindo três ou mais antenas foram completamente destituídas de interação. As lectinas parecem se ligar e diferenciar glicopeptídeos/oligossacarídeos biantenados do tipo N-acetillactosamina, mas falham em reconhecer estruturas multiantenadas. Foram capazes de diferenciar formas nativas e asialo de glicopeptídeos biantenados purificados da sorotransferrina humana. A atividade máxima observada foi quando o glicopeptídeo foi previamente digerido para exibir galactose e N-acetilglucosamina não reduzida na extremidade terminal. Este oligossacarídeo destituído de ácido siálico foi reconhecido por D. virgata, mas não por D. violacea. Glicopeptídeos de orosomucóide, apresentando principalmente uma mistura de glicanos bi- tri- e tetra-antenados não foram reconhecidos pelas lectinas. Interações com oligomanosídeos foram eficazmente diferenciadas. A afinidade foi demonstrada ser proporcionalmente mais forte quando há resíduos de manose ligado em a-(1 ~2) a estruturas externas. Neste caso Man9 foi fortemente reconhecido enquanto Man5 demonstrou uma fraca interação. A grande relevância foi que lectinas parecem ser capazes de separar estruturas oligomanisídicas dentro de uma mistura complexa. Isômeros de Man7 ou Man8 podem ser fracionados sob condições experimentais bem determinadas. Conclusões: Requisitos para ligações de glicopeptídeos ou oligossacarídeos em sítios de ligaçpes de carboidratos de lectinas incluem a presença de inibidor de monossacarídeos da atividade lectínica e a sua acessibilidade, mas não define a afinidade de lectinas para glicoconjugados. De acordo com os resultados, as lectinas podem reconhecer resíduos de manose interna em oligossacarídeos do tipo N-acetillactosamina e a afinidade é maior a proporção que a exposição do núcleo trimanosídeo aumenta. Com relação ao reconhecimento de oligomanosídeos o critério é oposto. A presença de resíduos de manose ligados a-(1 ~2) em outra estrutura parece ser a principal explicação para a afinidade. Entretanto a presença desses resíduos como ocorrem em Man6 e principalmente em Man7 até Man9 sugere que o monossacarídeo aceptor das lectinas poderia não ter o mesmo papel que desempenham na interação com o tipo N-acetillactosamina. Comparando esta performance com outras leguminosas que se ligam a manose como a lectina de semente de Parkia platycephala e lectina de não leguminosa fica claro que a afinidade de ligação a oligossacarídeos não se deve exclusivamente a ligação de carboidratos, além disso, as proximidades da cavidade para monossacarídeos poderiam possuir características estruturais diferenciadas em cada complexo lectina-glicoconjugado o que é sustentado pelo conceito de sítio de ligação estendido e reconhecimento de epítopo. Divergências de afinidades entre lectinas Diocleinae refletem essa hipótese e deste modo explica, ao menos em parte, suas diferenças de ligações pela mesma estrutura. Este trabalho foi financiado com auxílio de CAPES/COFECUB, CNPq, FUNCAP-Ce e International Foundation for Science (IFS). Bases moléculaires de Ia spécificité des lectines de Ia sous-tribu des Diocleinae envers les N- glycoprotéines. Situation du sujet: Les lectines sont des protéines três hétérogênes présentant des sites de reconnaissance des sucres et dépourvues d'activités enzymatiques. Ces lectines sont utilisées pour comprendre les bases moléculaires des interactions protéines-sucres. Les graines de Ia sous-tribu des Diocleinae sont três riches en lectines dites glucose ou mannose spécifiques. Cependant, malgré cette spécificité primaire et en dépit d'éléments structuraux communs, les lectines des Diocleinae reconnaissent différemment des N-glycoprotéines avec des glycannes de type N-acétyllactosaminique ou de type oligomannosidique. Ce travail a pour but Ia détermination des bases moléculaires de Ia reconnaissance par ces lectines de séquences oligosaccharidiques appartenant à des N-glycoprotéines ou à des N-glycopeptides. L'approche expérimentale fait appel à des études d'interaction et d'inhibition des interactions en temps réel entre des glycoprotéines immobilisées et les lectines en solution suivies par résonance plasmonique de surface (Technologie RPS-BiaCore) et à I'étude du comportement d'oligosaccharides ou de glycopeptides radiomarqués sur des colonnes de lectines immobilisées. Matériels et méthodes: Les lectines de graines de Canavalía brasiliensis, C. marítima, C. bonariensis, Cratylia floribunda, Dioclea grandiflora, D. virgata, D. violacea et D. guianensis ont été isolées par chromatographie d'aftinité selon les méthodes décrites dans Ia Iittérature. L'analyse des interactions entre ces lectines purifiées et des N-glycoprotéines avec des structures glycanniques de type N-acétyllactosaminique ou oligomannosidique connues immobilisées ainsi que I'inhibition de ces interactions par diftérents monosaccharides a été suivie en temps réel par résonance plasmonique de surface (appareil BiaCore). La spécificité fine de ces lectines a également été suivie par étude du comportement chromatographique d'oligosaccharides ou de N-glycopeptides de structures connues sur des colonnes de lectines immobilisées sur Sepharose 4B. La possibilité de fractionner un mélange complexe de structures oligomannosidiques à I'aide de ces lectines immobilisées a été étudiée par analyse autoradiographique des diftérentes fractions obtenues. Résultats: Les lectines de Diocleinae interagissent avec diftérentes Nglycoprotéines présentant des glycannes de type N-acétyllactosaminique ou oligomannosidique. Cependant, dans des conditions identiques, les cinétiques d'interaction obtenues avec les diftérentes lectines varient considérablement. O'autre part, même à faible concentration (25mM), le glucose et le mannose inhibent les interactions lectines-glycoprotéines. Les lectines immobilisées présentent une affinité pour des N-glycopeptides contenant des glycannes de type N-acétyllactosaminique biantennés ou pour les oligosaccharides correspondants. Des N-glycopeptides avec des glycannes de type N-acétyllactosaminique tri- ou tétraantennés ou les oligosaccharides correspondants ne sont pas reconnus. L'affinité optimale est dirigée envers des structures biantennées présentant 2 résidus de N-acétylglucosamine en position terminale non réductrice. Cependant, les asialoglycannes biantennés correspondants sont reconnus par Ia lectine de D. virgata alors que celle de D. violacea ne les reconnait pas. L'affinité des lectines envers différentes structures oligomannosidiques dépend de Ia présence et du nombre de résidus de mannose liés en, 1-2 en position terminale non réductrice.xwvutsrqponm Conclusions: Les résultats obtenus montrent que les lectines de Diocleinae étudiées sont capables de reconnaitre les résidus de mannose internes du noyau trimannosidique de glycannes de type N-acétyllactosaminique biantennés. Cette affinité augmente en fonction de I'accessibilité du noyau trimannosidique à Ia lectine. D'autre part, I'affinité de ces lectines envers différentes structures oligomannosidiques dépend de Ia présence de résidus de mannose liés en, 1-2 en position terminale non réductrice et augmente en fonction du nombre de ces résidus de mannose accessibles à Ia lectine. Ce travail a été subventionné par le CAPES/COFECUB, le CNPq, le FUNCAP-Ce et l'lnternational Foundation for Science.

El campo de la glicobiología incluye el estudio de los glicoconjugados, las enzimas que catalizan su síntesis y las lectinas que los reconocen. Los monosacáridos, que intervienen en su composición, pueden combinarse en varios puntos y form ar estructuras lineales o ram ificadas, m ientras que los nucleótidos y los aminoácidos sólo pueden formar compuestos lineales, lo que restringe su diversidad. Hoy resulta evidente que los carbohidratos poseen una enorme capacidad para transmitir información, mucho mayor que los ácidos nucleicos y las proteínas. Numerosos carbohidratos tienen roles específicos cruciales en procesos tan variados como infección, inflamación, inmunidad, fertilización, diseminación de células tumorales y plegamiento de proteínas, por nombrar algunos pocos. El glicoma, esto es, la totalidad de los carbohidratos de un organismo, es miles de veces más complejo que el genoma y que el proteoma, debido a su diversidad. Los carbohidratos intervienen como transmisores de información en todos “los rincones” de la biología. El conocimiento de los mecanismos de síntesis y degradación de estos compuestos es de gran importancia para comprender, diagnosticar y tratar enfermedades., The field of glycobiology encom passes the study of glycoconjugates, the enzymes that catalise their biosynthesis and the lectins that recognize them. The component molecules of carbohydrates, the monosaccharides, can interconect at several points to form a wide variety of branched or linear structures. The aminoacids in proteins as well as nucleotides in nucleic acids can form only linear assemblies, which restricts their diversity. It is now evident that carbohydrates offer the highest capacity for carrying information when compared with nucleic acids and proteins. Many carbohydrates play crucial roles in many biological processes like infection, inflammation, immunity, fertilization, dissemination of cancer cells and protein folding. The glicome is the collective identity of the entirety of carbohydrates in an organism. The glycome is many thousands of times more complicated than the genome and the proteome.The glycoconjugates transfer relevant information in “every corner of biology” . The knowledge of the control mechanisms in the biosynthesis and degradation of glycoprotein glycans may be helpful in understanding, diagnosing, and treating disease., Academia Nacional de Agronomía y Veterinaria

Resumen de la comunicación presentada en el XV Congreso de Estudiantes de Medicina, Alicante, 15-16 octubre 1997.