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As hemorfinas são peptídeos derivados da cadeia β-globina da hemoglobina. LVV-hemorfina-6 e LVV-hemorfina-7 (LVVs) são hemorfinas bioativas, que apresentam sequência de resíduos de aminoácidos semelhante, diferindo apenas pelo aminoácido Fenilalanina na extremidade N-terminal de LVVhemorfina- 7. Ambas hemorfinas reduzem o comportamento tipo-ansiedade e tipo-depressão, sendo este último, promovido pela LVV-h7, dependente da ativação e receptores de ocitocina, mas não o efeito evocado pela LVV-h6. Somado a isso, os dados na literatura acerca dos efeitos cardiovasculares evocados pela LVV-h7, são controversos e não há estudos dos efeitos de LVV-h6 sobre esse sistema fisiológico. Diante disso, o objetivo deste estudo foi identificar os mecanismos envolvidos nos efeitos comportamentais e, também verificar os efeitos sobre a vasomotricidade e função cardíaca na artéria aorta e coração isolado de ratos Wistar. Os protocolos experimentais foram realizados de acordo com as normas de uso de animais, sob aprovação do projeto pelo comitê de ética e uso de animais da UFG (Protocolo de aprovação nº 090/14). Foi utilizado o Labirinto em Cruz Elevada (LCE) para avaliação do comportamento tipo-ansiedade e, em seguida foram colocados no campo aberto (CA) para avaliação da locomoção. Para avaliar o comportamento tipo- depressão foi utilizado o teste de Nado Forçado (NF). A técnica de vaso isolado foi utilizada para avaliar a reatividade vascular em anéis isolados da aorta torácica e a técnica Langendorff para avaliar a função cardíaca em coração isolado de ratos Wistar. O efeito tipo-ansiolítico de ambas hemorfinas não depende da rota de biossíntese de catecolaminas ou da ativação de receptores opióides. Contudo, o efeito tipo-antidepressivo das LVVs, foi revertido pelo bloqueio de receptores opióides, indicando a ativação desses receptores como mecanismo potencial. Ambas LVVs, reduzem de maneira similar a pressão de perfusão, a dP/dt máxima e mínima e a pressão intraventricular sistólica e diastólica em coração isolado de ratos, sem promover contração ou relaxamento de anéis de aorta isolada de ratos. Assim, apesar das LVVs provocarem os mesmos efeitos sobre o comportamento tipo-ansiedade e tipo-depressão, os mecanismos subjacentes são parcialmente diferentes, mesmo com uma substancial similaridade na estrutura primária dessas hemorfinas. Além disso LVVs atuam diminuindo a função cardíaca, nos parâmetros avaliados, em coração isolado de ratos normotensos sem afetar a vasomotricidade de anéis isolados da artéria aorta de ratos normotensos. Hemorphins are peptides derived from the hemoglobin β-globin chain. LVV- hemorphine-6 and LVV-hemorphine-7 (LVVs) are bioactive hemorphins, which exhibit similar amino acid residue sequence, differing only by the amino acid Phenylalanine at the N-terminus of LVV-hemorphine-7. Both hemorphins reduce anxiety-like and depression-like behavior, the latter being promoted by LVV-h7, is oxytocin receptors dependent, but not the effect evoked by LVV-h6. In addition, the data in the literature about the cardiovascular effects evoked by LVV-h7 are controversial and there are no studies on the effects of LVV-h6 on this physiological system. Therefore, the objective of this study was to identify the mechanisms involved in behavioral effects and also to verify the effects on vasomotricity and cardiac function in the aorta artery and isolated heart of Wistar rats. The experimental protocols were carried out according to the norms of use of animals, under project approval by the committee of ethics and animal use of the UFG (Protocol of approval nº 090/14). The Elevated Pluz Maze (EPM) was used to evaluate the anxiety-like behavior and were then placed in the Open Field (OF) to evaluate locomotion. To evaluate the depression-like behavior, the Forced Swim test (FST) was used. The isolated vessel technique was used to evaluate vascular reactivity in thoracic aorta rings isolated and the Langendorff technique to evaluate heart function in heart i solated from Wistar rats. The anxiolytic-like effect of both hemorphins does not depend on the route of biosynthesis of catecholamines or the activation of opioid receptors. However, the antidepressant-like effect of LVVs was reversed by blockade of opioid receptors, indicating the activation of these receptors as a potential mechanism. Both LVVs similarly reduce perfusion pressure, maximal and minimum dP/dt and systolic and diastolic intraventricular pressure in heart isolated from rats, without promoting contraction or relaxation of aorta rings isolated from rats. Thus, although LVVs cause the same effects on anxiety-like and depression-like behavior, the underlying mechanisms are partially different, even with a substantial similarity in the primary structure of these hemorphins. In addition, LVVs act by decreasing cardiac function, in the evaluated parameters, in isolated heart of normotensive rats without affecting the vasomotricity of aorta rings isolated of normotensive rats. Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás

Os oligopeptídeos ricos em prolina (PROs) foram identificados no veneno bruto das serpentes Bothrops jararaca (Bj), Bothrops cotiara (Bc) e Bothrops fonsecai (Bf). Estudos anteriores demonstram que os PROs promoveram efeitos hipotensor/anti-hipertensivo em ratos normotensos e espontaneamente hipertensos (SHR). No entanto, os efeitos diretos dos PROs em aorta e coração isolado, bem como, os mecanismos de ação envolvidos nestes efeitos são desconhecidos. No presente estudo, foram avaliados os efeitos cardiovasculares de seis PROs, Bj-PRO-5a, Bj-PRO-7a, Bj-PRO-10c, Bc-PRO-10e, Bf-PRO-10d e Bf-PRO-10f. Os anéis de aorta com (E+) e sem endotélio (E-) foram pré-constritos com fenilefrina (Phe, 0,1 µmol/L), seguido de concentrações cumulativas dos PROs (0,1 nmol/L – 1 µmol/L) na presença ou ausência de um antagonista não seletivo dos receptores muscarínicos (atropina, 3 µmol/L), antagonista do receptor muscarínico M1 (pirezenpina, 1 µmol/L), inibidor da óxido nítrico sintase (L-NAME, 3 µmol/L), inibidor da adenilato ciclase (MDL12,330a, 3 µmol/L), inibidor da guanilato ciclase (ODQ, 3 µmol/L) ou inibidor da argininosuccinato sintetase (MDLA, 1 µmol/L). Para avaliar os efeitos dos PROs na coronária e contratilidade cardíaca, os corações foram perfundidos de acordo com a técnica de Langendorff. Os corações foram perfundidos por um período basal com solução Krebs Ringer contendo os PROs (0,05 ou 5 nmol/L) na presença ou ausência de L-NAME (10 nmol/L, ODQ (200 nmol/L) ou MDL (1µmol/L). Todos os PROs utilizados neste estudo induziram vasorelaxamento dependente do endotélio em anéis de aorta de ratos Wistar e SHR. Atropina e pirenzepina bloquearam os efeito vasorelaxante do Bj-PRO-7a em aorta isolada de ratos Wistar e SHR. L-NAME, ODQ e MDL inibiram o vasorelaxamento induzido pelo Bj-PRO-7a e Bj-PRO-10c em ambas as linhagens. O MDLA inibiu o vasorelaxamento induzido pelo Bj-PRO-10c somente em anéis de aorta de SHRs. Somente os peptídeos Bj-PRO-7a e Bj-PRO-10c promoveram uma vasodilatação coronariana em corações isolados de ratos Wistar e SHR. A vasodilatação coronariana induzida pelo Bj-PRO-7a foi inibida na presença de L-NAME em corações de ratos Wistar. Já em corações isolados de SHRs este efeito abolido por com L-NAME, ODQ ou MDL. O Bc-PRO-10e e Bf-PRO-10f não induziram efeitos significantes na contratilidade cardíaca. No entanto, o Bj-PRO-5a, Bj-PRO-7a, Bj-PRO-10c e Bf-PRO-10f promoveram efeito inotrópico negativo em corações isolados de ratos Wistar e/ou SHRs. Este efeito desencadeado pelo Bj-PRO-7a foi inibido na presença de L-NAME em corações isolados de Wistar. Diferentemente, o efeito do Bj-PRO-10c foi bloqueado pelo L-NAME, ODQ ou MDL em ambas as linhagens. Sumarizando, os PROs utilizados neste estudo induziram vasorelaxamento dependente do endotélio. Os dados demonstram a participação das vias NO/GC/GMPc e AC/AMPc nos efeitos vasorelaxantes promovidos pelos peptídeos Bj-PRO-7a e Bj-PRO-10c. Além disso, os receptores muscarínicos estão envolvidos nos efeitos vasorelaxantes do peptídeo Bj-PRO-7a em anéis de ratos Wistar e SHRs. O efeito inotrópico negativo induzidos pelo Bj-PRO-7a e Bj-PRO-10c está relacionado com a ativação do NO em cardiomiócitos de ratos normotensos e hipertensos. The proline-riche-oligopeptides (PROs) were identified in the crude venom of snakes Bothrops jararaca (Bj), Bothrops cotiara (Bc) and Bothrops fonsecai (Bf). Previous studies have shown hypotensive/antihypertensive effects of the PROs in normotensive and hypertensive (SHR) rats. However, the direct effect of PROs in the aorta and heart isolated, as well as, the action mechanisms involved in these effects is unknown. In the presenty study, were evaluated the cardiovascular effect of six PROs, Bj-PRO-5a,-7a,-10c, Bc-PRO-10e, Bf-PRO-10d,-10f. The aortic rings, with (E+) or without (E-) endothelium, were preconstricted with phenylephine (Phe, 0.1 μmol/L), following increasing concentrations of PROs (0.1 nmol/L – 1 μmol/L) in presence or absence of a nonselective antagonist muscarinic receptors (Atropine, 3µmol/L), M1 muscarinic receptor antagonist (Pirenzepine, 1 µmol/L), synthase nitric oxide inhibitor (L-NAME, 1 µmol/L), adenylyl cyclase inhibitor (MDL 12.330A, 3 µmol/L), guanylyl cyclase inhibitor (ODQ, 3µmol/L) or argininosuccinate synthetase inhibitor (MDLA, 1 µmol/L). To evaluated the coronary and cardiac contractility effects of PROs, the hearts were perfused according Langendorff technique. The hearts were perfused for a basal period with Krebs Ringer solution containing the PROs (0.05 or 5 nmol/L) in presence or absence of L-NAME (10 nmol/L), ODQ (200 nmol/L) or MDL (1 µmol/L). The PROs utilized in this study induced endothelium-dependend vasorelaxation in aortic rings of Wistars and SHRs. Atropine and pirezenpine blocked the vasorelaxant effect of Bj-PRO-7a in isolated aorta from Wistar and SHR. L-NAME, ODQ or MDL inhibited the aortic vasorelaxation induced by Bj-PRO-7a and Bj-PRO-10c in both strains. MDLA inhibited the Bj-PRO-10c-induced vasorelaxation in aortic rings of SHR, but not in Wistar. Just the peptides Bj-PRO-7a and Bj-PRO-10c promoted a significant coronary vasodilatation in isolated heart from Wistar and SHR rats. The coronary vasodilatation induced by Bj-PRO-7a was inhibited in the presence of L-NAME in isolated heart from Wistar. Already in isolated heart from SHR this effect was abolished by L-NAME, ODQ or MDL. The Bc-PRO-10e and Bf-PRO-10f did not induce significant effects on cardiac contractility. However, the Bj-PRO-5a, -7a, -10c and Bf-PRO-10f promoted negative inotropic effect in the isolated hearts from Wistar and/or SHR. This effect in isolated hearts perfused by Bj-PRO-7a was inhibited in the presence of L-NAME in Wistars. Differently, the effect of Bj-PRO-10c was blocked by L-NAME, ODQ or MDL in both strains. Sumarizing, the PROs utilized in this study induced endothelium-dependend vasorelaxation. The data demonstrated participation of pathways NO/GCs/GMPc and AC/AMPc in the vasorelaxant effect of peptides Bj-PRO-7a and Bj-PRO-10c. In addition, the muscarinic receptors are involved in the vasorelaxant effects induced by peptide Bj-PRO-7a in aortic rings from Wistar and SHR rats. Moreover, the negative inotropic effect induced by Bj-PRO-7a and Bj-PRO-10c is linked with activation of NO in cardiomyocyte of normotensive and hypertensive rats. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG

LVV-h7 e LVV-h6 são peptídeos bioativos resultantes da degradação da cadeia β-globina da hemoglobina. LVV-h7 é um agonista do receptor de angiotensina IV. Esse receptor pertence a classe de aminopeptidases reguladas por insulina (IRAP), que também exerce atividade ocitocinase. Ao se ligar ao receptor, LVV-h7 inibe a atividade catalítica de IRAP sobre neuropeptídeos, incluindo ocitocina (OT), levando ao aumento nos níveis de ocitocina. Assim, nossos objetivos foram: i) avaliar se as LVVs modificam o comportamento organizado centralmente e as respostas cardiovascular ao estresse agudo emocional e ii) verificar se os mecanismos responsáveis pelos efeitos, envolvem a ativação de receptores de ocitocina, como resultado da redução da atividade proteolítica de IRAP sobre a OT. Ratos Wistar, adultos, (270-370 g) receberam injeções i.p. de LVV-h6 e LVV-h7 (153nmol/Kg), ou veículo (0,1 ml). Diferentes protocolos foram usados: i) labirinto em cruz elevada para comportamento tipo-ansiedade; ii) campo aberto para atividade locomotora/exploratória; iii) nado forçado para comportamento tipo-depressão e iv) estresse por jato de ar para reatividade cardiovascular à exposição ao estresse agudo. Diazepam (2 mg/Kg) e imipramina (15 mg/Kg) foram usados como controle positivo para LCE e NF, respectivamente. O antagonista de receptores de OT, atosibano (1 e 0,1 mg/Kg), foi usado para determinar o envolvimento de vias ocitocinérgicas. Ambas LVVs: i) aumentaram o número de entradas e o tempo despendido nos braços abertos do LCE, um indicativo de ansiólise; ii) reduziram a imobilidade durante o NF, indicando efeito tipo antidepressivo e, iii) aumentaram a atividade exploratória no CA, episódios de locomoção foram significativamente aumentados apenas pela LVV-h7; iv) o antagonista de receptores de OT não alterou o efeito evocado pela LVVs sobre o efeito tipo ansiolítico. Entretanto, reverteu o aumento na exploração evocado pelas LVV’s e também o efeito tipo antidepressivo evocado apenas pela LVV-h7. Além disso, LVV-h6 e LVV-h7 não alteraram a resposta pressora, taquicárdica e neuroendócrina evocada pelo estresse egudo emocional. Nós concluímos que LVVs modulam o comportamento, desempenhando efeito tipo ansiolítico e tipo antidepressivo e não são capazes de alterar a reatividade cardiovascular ao estresse. Os efeitos comportamentais de LVV-h7 são mediados, em parte, por receptores de OT. LVV-hemorphin-7 (LVV-h7) and LVV-hemorphin-6 (LVV-h6) are bioactive peptides resulting from degradation of hemoglobin β-globin chain. LVV-h7 is a specific agonist of angiotensin IV receptor. This receptor belongs to the class of insulin-regulated aminopeptidases (IRAP), which also exerts oxytocinase activity. Herein, our aims were: i) to evaluate whether LVVs modify centrally-organized behavior and cardiovascular responses to stress and ii) to assess whether underlying mechanisms involve activation of oxytocin (OT) receptors, as result of reduction of IRAP proteolytic activity upon OT. Adult male Wistar rats (270-370g) received (ip) injections of LVV-h7 and LVV-h6 (153nmol/Kg), or vehicle (0.1ml). Different protocols were used: i) open field (OP) test for locomotor/exploratory activities; ii) elevated plus maze (EPM) for anxiety-like behavior; iii) forced swimming (FS) test for depression-like behavior and iv) air jet for cardiovascular reactivity to acute stress exposure. Diazepam (2mg/Kg) and imipramine (15mg/Kg) were used as positive control for EPM and FS tests, respectively. The antagonist of OT receptors, atosiban (1 e 0,1 mg/Kg), was used to determine the involvement of oxytocinergic paths. Both LVVs: i) increased the number of entries and the time spent in open arms of the maze, an indicative of anxiolysis; ii) reduced the immobility during FS test, an indicative of antidepressant effect; and iii) increased the exploratory activity, but locomotion episodes were significantly increased only by LVV-h7; while the specific OT antagonist, atosiban, did not revert the effect anxiolytic-like evoked by LVVs. It also changed the effects upon exploration evoked by LVV’s and the antidepressant-like effect promoted by LVV-h7. Besides, LVV-h6 and LVV-h7 did not change the cardiovascular reactivity and neuroendocrine responses to acute stress. We conclude that LVVs modulate behavior, display antidepressant and anxiolytic effects and do not change the cardiovascular reactivity to acute stress exposure. LVV-h7 behavioral effects are mediated in part by oxytocin receptors. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Segundo a Organização Mundial de Saúde (2013), as doenças cardiovasculares (DCV) são as maiores causas de morte no mundo, sendo a Hipertensão Arterial um dos principais fatores de risco. O Sistema Renina-Angiotensina (SRA) é um sistema fundamental para a regulação das funções cardiovasculares. Dentre os componentes do SRA, podemos destacar a Angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)]. Sabe-se que o efeito vasodilatador da Ang-(1-7) é dependente do endotélio. A hipertensão arterial acarreta conseqüências sobre a estrutura vascular, de forma especial no endotélio, acarretando a disfunção endotelial, nesta condição o efeito vasodilatador da Ang-(1-7) fica prejudicado. No entanto, tem sido demonstrado que algumas classes de anti- hipertensivos (BRA, iECA e BCC) são importantes na melhora da função endotelial. Porém, ainda não se sabe se estes fármacos podem melhorar o efeito vasorrelaxante da Ang-(1-7) em condições de sobrecarga pressórica. Como diversos trabalhos tem apontado a Ang-(1-7)/ Receptor Mas como um potencial terapêutico para as doenças cardiovasculares, é de grande importância um melhor conhecimento sobre a influência de fármacos anti-hipertensivos nos efeitos vasculares da Ang-(1-7). Desta forma, a proposta do trabalho foi avaliar a influência de fármacos anti-hipertensivos nos efeitos vasculares da Angiotensina-(1-7) em ratos submetidos à sobrecarga pressórica. Para isto, ratos Wistar foram submetidos à coarctação da aorta abdominal (CoA). Como controles, foram utilizados animais onde foi realizado o procedimento cirúrgico fictício (Sham). Decorridos 21 dias da coarctação, a pressão arterial (PA) foi registrada pela canulação da artéria carótida. Posteriormente, o efeito vasorrelaxante da Ang-(1-7) foi avaliado em anéis de ratos CoA com ou sem o pré-tratamento agudo (in vitro) de losartan 1 µmol/L, captopril 1 µmol/L ou anlodipino 1 µmol/L. Para avaliar o efeito do tratamento crônico (in vivo), os animais receberam os seguintes tratamentos:losartan 1 ou 5 mg/kg/dia, captopril 1 ou 5 mg/kg/dia, anlodipino 1 ou 5 mg/kg/dia ou DIZE 1 ou 5 mg/kg/dia.Ao final do tratamento, os anéis de aorta de ratos foram isolados para a realização da curva de Ang-(1-7). Os animais CoA apresentaram aumento da PA e nenhum dos tratamentos foi capaz de reduzir a pressão arterial. A sobrecarga pressórica diminuiu o relaxamento induzido por Ang-(1-7) nos anéis de aorta isolados. O pré-tratamento in vitro com losartan, captopril ou anlodipino restaurou o efeito vasorrelaxante promovido por Ang-(1-7). Entretanto, em anéis de aorta de ratos CoA pré-tratados “in vitro” com losartan e A-779 ou losartan e L-NAME, tiveram o vasorrelaxamento promovido por Ang-(1-7) abolido. Já o tratamento in vivo nos animais CoA com losartan 1 mg/kg/dia, captopril 1 mg/kg/dia, anlodipino 1 mg/kg/dia ou DIZE 1 e 5 mg/kg/dia não foram efetivos em melhorar o efeito vasorrelaxante da Ang-(1-7). No entanto, o tratamento com losartan 5 mg/kg/dia, captopril 5 mg/kg/dia ou anlodipino 5 mg/kg/dia melhorou a resposta vasorrelaxante da Ang-(1-7) em animais CoA. Estes resultados demonstram que o tratamento in vitro ou in vivo com alguns anti-hipertensivos (losartan, captopril ou anlodipino) foi capaz de melhorar o vasorrelaxamento promovido por Ang-(1-7) em aorta de animais submetidos à sobrecarga pressórica por mecanismos independentes da pressão arterial. Portanto, a utilização de Ang-(1-7) associada a doses sub-pressóricas de fármacos anti- hipertensivos pode ser uma nova ferramenta terapêutica para o tratamento da hipertensão arterial. According to the World Health Organization (2013),cardiovascular diseases(CVD) are the major causes of death world wide. High blood pressure is the main risk factors for these diseases. The Renin-angiotensin System (RAS) is a important regulator of the cardiovascular functions. Among the components of the RAS, we can highlight the Angiotensin-(1-7) [Ang (1-7)]. It is known that the vasodilator effect of Ang-(1-7) is endothelium-dependent. Hypertension cause changes in the vascular structure and function, especially in the endothelium cells, leading to endothelial dysfunction and, consequently, impairment in the vasodilator effect of Ang (1-7). However, it has been shown that some classes of antihypertensive drugs (Angiotensin II receptor blockers, angiotensin-converting enzyme inhibitors and Calcium channel blocker) improve the endothelial function. However, it is unknown if these drugs are able to improve the vasorelaxant effect of Ang-(1-7) in pressure-overload condition. Since several studies have pointed to Ang-(1-7)/Mas axis as a therapeutic potential for cardiovascular disease, is very important to understand the influence of the anti hypertensive drugs on the vascular effects of Ang-(1-7). Thus, the purpose of this study was to evaluate the influence of anti hypertensive drugs on the vascular effects of Angiotensin-(1-7) in pressure-overload rats. Wistar rats were submitted to abdominal aorta coarctation (ACo). Sham surgery was performed in the controls group. After 21 days of coarctation, blood pressure (BP) was recorded by carotid artery catheterization. Subsequently,the vasorelaxant effect of Ang-(1-7) were evaluated in aortic rings with or without acute pre-treatment (in vitro) of losartan 1µmol/L, captopril 1µmol/L or amlodipine 1µmol/L. To evaluate the effect of chronic treatment (in vivo), the ACo animals received the following treatments after surgery procedure: losartan 1 or 5 mg/kg/day, captopril 1 or 5 mg/kg/day, amlodipine 1 or 5 mg/kg/day, or DIZE 1 or 5 mg/kg/day. At the end of treatment, the aortic rings were isolated and the vasorrelaxant effect of Ang-(1-7) was evaluated. The increase of the BP was confirmed in the ACo rats. None of the treatment was able to reduce the blood pressure in ACo rats. Pressure overload decreased the relaxation induced by Ang (1-7) in isolated aortic rings. The in vitro pre treatment with losartan, captopril or amlodipine restored the vasorelaxant effect promoted by Ang-(1-7).A-779 or L-NAME blunted the vasorelaxant effect of Ang-(1-7) in aortic rings from CoA rats in presence of losartan.The in vivo treatment with losartan 1 mg/kg/day, captopril 1 mg/kg/day, amlodipine 1 mg/kg/day or DIZE 1 and 5 mg/kg/day was not effective in improving the vasorelaxant effect of Ang (1-7) in CoA aortic rings. However, losartan 5 mg/kg/day, captopril 5 mg/kg/day or amlodipine 5 mg/kg/Day improved the vasorelaxant effect of Ang-(1-7) in aortic rings from CoA rats. These results demonstrate that treatment in vitro or in vivo with some antihypertensive drugs (losartan, captopril and amlodipine) was able to improve the vasorelaxation effect of Ang (1-7) in the aorta from pressure-overloaded animals through mechanisms independent of blood pressure reduction. Therefore, the use of Ang-(1-7) associated with sub-pressor doses of antihypertensive agents may be a new therapeutic tool for the hypertension treatment. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES