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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Segundo dados do Instituto Nacional do Câncer (INCA) o câncer de mama é um tipo de câncer muito comum entre as mulheres, sendo responsável por cerca de 29% dos casos a cada ano. A forma padrão do diagnóstico é feita por meio da análise visual do tecido coletado, que passa por processos de corte e coloração que podem danificar a amostra, tornando-o muitas vezes demorado e dependente da experiência do patologista. Assim, o desenvolvimento de técnicas que possibilitem uma análise quantitativa dos tecidos de forma a obter novas ferramentas de diagnóstico com uma maior agilidade na análise dos dados seria de grande ajuda aos patologistas e benéfico para os pacientes. Neste trabalho, utilizamos as técnicas de microscopia óptica não linear de Geração de Segundo Harmônico (SHG) e de Fluorescência por Excitação de Dois Fótons (TPEF) com laser pulsado para obter imagens em biópsias de neoplasias mamárias em cadela. As imagens de SHG permitem informações da estrutura do colágeno na matriz extracelular que, juntamente com a as imagens de TPEF das regiões celulares das biópsias, formam uma base para uma análise de imagem abrangente. Para as análises dessas imagens, um software, que utiliza ferramentas já conhecidas em análises desse tipo de imagem, como o tensor estrutural e a extração de redes de fibras (FIRE), foi desenvolvido a fim de automatizar o processo de análise. O software permitiu obter a separação de regiões fibrosas e celulares das imagens SHG e TPEF. Com essa segmentação foi possível a extração de redes de fibras de colágeno e vários parâmetros específicos para cada região (fibras ou células) formando um conjunto de 29 métricas. Com esse conjunto de métricas conseguimos estudar as alterações causadas nos tecidos devido aos diferentes tipos de neoplasias mamárias, como os tumores mistos benignos, carcinoma em tumor misto, carcinoma ductal In Situ, carcinossarcoma, carcinoma micropapilar e carcinoma sólido em comparação com a mama normal, além da análise das alterações sofridas durante a progressão tumoral. Essas alterações foram analisadas por meio de métodos estatísticos análise de variância (MANOVA e ANOVA), para discriminar quais foram as significâncias estatísticas. Além disso, uma análise por discriminante linear (LDA) incluindo todas as métricas extraídas permitiu separar e classificar todos os tipos histológicos estudados. Obtivemos uma sensibilidade de cerca de 90% na classificação entre tecido saudável e canceroso e uma sensibilidade de cerca de 40-60% para comparação entre a mama normal e os subtipos histológicos estudados. According to data from the Institute of Cancer (INCA), breast cancer is a very common type of cancer among women, accounting for about 29% of cases each year. The standard diagnosis is given by visual analysis of the collected tissue, which undergoes cutting and coloring processes that can damage the sample, often making it slowly and dependent on the pathologist's experience. Thus, the development of techniques that enable a quantitative tissue analysis in order to obtain new diagnostic tools with greater agility in data analysis would be of great help to pathologists and beneficial to patients. In this work, we used the non-linear optical microscopy techniques of Second Harmonic Generation (SHG) and Two-Photon Excitation Fluorescence (TPEF) with pulsed laser to obtain images in biopsies of mammary neoplasms in female dogs. SHG images provide information of the collagen structure in the extracellular matrix which, that together with TPEF images of cell regions in the biopsies form a basis for comprehensive imaging analysis. For the image analysis, we developed a software, which uses tools already known for this type of image analysis, such as the structural tensor and the extraction of fiber networks (FIRE). The software was developed in order to automate the image analysis process. It allowed to obtain the separation of the fibrous and cellular regions in the SHG and TPEF images. With this segmentation it was possible to extract the collagen fiber networks and several specific parameters for each region (fibers or cells) forming a set of 29 metrics. With this set of metrics we were able to study the changes in the tissues caused by different types of breast cancer, such as benign mixed tumors, carcinoma in mixed tumor, ductal carcinoma In Situ, carcinosarcoma, micropapillar carcinoma and solid carcinoma in comparison to normal breast. The changes due to the tumor progression were analyzed using the statistical methods of variance (MANOVA and ANOVA). In addition, a linear discriminant analysis (LDA) including all extracted metrics allowed separating and classifying all histological types studied. We obtained a sensitivity of about 90% in the classification between healthy and cancerous tissue and a sensitivity of about 40-60% for comparison between normal breast and all the studied histological subtypes.

Orientadores: Konradin Metze, Carlos Lenz Cesar Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A hipertensão arterial sistêmica (HAS) bem como o envelhecimento provoca mudanças na estrutura dos grandes vasos sanguíneos - aorta e seus ramos - propiciando o desenvolvimento de processos degenerativos que são a causa de diversas doenças. O uso de ferramentas fotônicas na aquisição de imagens, associado a recursos matemáticos para a interpretação delas representa um avanço para as análises histopatológicas, pois permitem a visualização e compreensão de pequenas estruturas que antes eram impossíveis de serem observadas. O objetivo desse trabalho foi associar estas duas tecnologias (ferramentas fotônicas e recursos matemáticos) e com isso criar uma metodologia para a análise simultânea de fibras elásticas e colágenas na aorta. Para tanto utilizamos aorta ascendente de 72 pacientes, sendo 22 normotensos, 38 portadores de HAS e 12 aortas de dissecção. As lâminas coradas com hematoxilina eosina foram examinadas no microscópio multifoton, com dois fótons: laser de argônio para fluorescência da eosina, corante de fibras elásticas e Ti:safira para SHG, sinal gerado por moléculas de colágeno. A distribuição e organização das fibras elásticas e colágenas foram analisadas pelas seguintes variáveis: morfometria geométrica, derivadas da matriz de co-ocorrência de Haralick, Transformada de Fourier e fluorescência ótica integrada. Usando estes descritores da textura associados a fractais, observamos que a geração do SHG é dependente não só da presença do colágeno como também do arranjo destas fibras. Observamos ainda que em indivíduos normotensos, quando comparados aos portadores de HAS, ocorre uma diminuição na distribuição do sinal SHG ao longo da espessura da camada média partindo da íntima em sentido à adventícia. Dessa maneira concluímos que os maiores distúrbios das fibras elásticas, nos indivíduos normais ocorrem na transição do terço interno para o médio, enquanto que nos portadores de HAS eles estão distribuídos em toda a espessura da aorta. Além disso, estes estudos nos permitiram verificar que a dissecção da aorta ocorre entre dois reforços de colágeno, uma vez que este fenômeno foi constatado entre dois picos de SHG Abstract: The arterial hypertension as well as aging induces changes in the structure of large blood vessels - aorta and its branches - leading to development of degenerative processes which are the cause of many diseases. The use of photonics tools for image acquisition, associated to mathematical resources for interpretation of them represents an advance in histopathological analysis, because it allows the visualization and understanding of small structures that were impossible to be observed before. The main objective of this study was to associate both technologies (photonics tool and mathematical resources) to create a new methodology to evaluate, simultaneously, elastic and collagen fibers in aorta. For this we've used autopsies of ascending aortas from 72 patients, being 22 samples from normotensives individuals, 38 from HAS patients and 12 aortas from dissection. HE-stained paraffin sections from ascending aortas were analyzed by multifoton microscopy, with 2 types of photons: Two-photon excited fluorescence (TPEF) for elastin and Ti:safira for SHG to analyze collagen fibers. The distribution and organization of elastic and collagen fibers were analyzed by the following variables: geometric morphometric, derived from the co-occurrence matrix of Haralick, Fourier Transform and Fluorescence optics integrated. Using these texture descriptors associated to analysis of fractals, we've observed that SHG generation is not only dependent on the presence of collagen but on the arrangement of these fibers as well. We also observed that in normotensives individuals, if compared to HAS patients, occurs a decrease in the SHG intensity along the medial thickness from intimate in direction to adventitia. Thus we conclude that the major disorders of elastic fibers in normal subjects occur in the transition from the third layer to the middle, while in HAS individuals these disorders are distributed throughout the thickness of the aorta. Furthermore, this study has allowed us to verify that the aortic dissection has occurred between two peaks of SHG, since this phenomenon was observed between two ribs collagen Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutora em Fisiopatologia Médica

Orientador: Flavio Caldas da Cruz Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica Gleb Wataghin Resumo: Os relógios atômicos são usados na atualidade em um grande número de aplicações científicas e tecnológicas que vão desde experimentos de relatividade e determinação de constantes fundamentais, até sistema de navegação (GPS) e telecomunicações. A proxima geração de relógios atômicos de alta precisão estará baseada em transições ópticas de átomos frios. Neste trabalho foi desenvolvido um laser de estado sólido de Nd:YLF bombeado por um laser de diodo e duplicado em frequência em 657 nm. Este sistema é proposto como oscilador local em um relógio atômico óptico baseado em átomos de cálcio. Comparado com os lasers de diodo, este apresenta uma potência maior no vermelho, um ruído de frequência e amplitude menores e a possibilidade de transferência remota usando obras ópticas no comprimento de onda fundamental de 1314 nm. Duplicação em frequência intra-cavidade é feita usando um cristal de BiBO, com superfícies anti-refletoras, e com um casamento de fase crítico tipo I à temperatura ambiente. Uma potência de 270 mW na saída do vermelho foi obtida para uma potência de bombeamento de 11.6 W. Abstract: Atomic clocks are used today in a number of scientific and technological applications, ranging from tests of relativity, or variations of fundamental constants, to the use in navigation and telecommunication. The next generation of such high precision devices will be based on optical transitions of suitable laser cooled and trapped atoms. In this work we describe a frequency-doubled, diode-pumped solid-state Nd:YLF ring laser emitting at 657 nm, proposed as a local oscillator in an optical atomic clock based on laser cooled and trapped calcium atoms. Compared to diode lasers, its main advantages include higher power, less intrinsic frequency noise, and the possibility of remote transfer in optical fibers using the fundamental light at 1314 nm. Frequency doubling is performed inside the cavity using a 10 mm long AR-coated BiBO crystal, under type I, critical phase-matching at room temperature. Red output power of 270 mW was achieved for 11.6 W of pumping power. Mestrado Física Atômica e Molecular Mestre em Física

Agradecimentos: The equipment used for the development of this work was purchased with the help of Fapesp (the São Paulo Research Foundation; 08/57906-3) and CNPq (the National Council for Scientific and Technological Development; 573913/2008-0). We reviewed the content of the manuscript, followed by Ms Diane Ellis, B.A. in education. Biostatistician Cleide Aparecida Moreira Silva, Research Committee, Biostatistics Division, Medical Sciences School, Unicamp, provided statistical consultation Abstract: Solid tumors typically contain high levels of fibrillar collagen. The increased stromal collagen deposition usually promotes cancer progression since biochemical and biophysical cues from tumor-associated collagen fibers stimulate neoplastic cells. Few studies have investigated the relationship between Merkel cell carcinoma (MCC) and the extracellular matrix (ECM), but there are no works evaluating collagen. This is an observational, analytical, retrospective study including 11 patients with MCC. Primary tumor-stained sections were evaluated by second harmonic generation microscopy and texture analysis. Peritumoral texture features (area fraction, mean gray value, entropy, and contrast) showed much lower values than normal skin (P < .0001) revealing extensively altered structure of peritumoral collagen fibers. These differences were not significant between tumors with unfavorable and favorable known prognostic factors. Profound changes in collagen fibers present in the stroma accompanying primary MCC may contribute to the aggressive behavior of this tumor. Our results indicate that whatever MCC histological subtype, size or anatomical location, MCC promotes the same type of ECM for its development. As an outlook, therapies using ECM macromolecules or fibroblasts (the architects of ECM remodeling) as target could be useful in the treatment of MCC FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Aberto

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Fundo Mackenzie de Pesquisa Materiais bidimensionais (2D) têm sido tema de intensa pesquisa devido às suas propriedades e aplicações. Heteroestruturas de van der Waals são estruturas produzidas pelo empilhamento das camadas de diferentes tipos desses materiais 2D. Este empilhamento permite combinar as propriedades de cada material em uma nova estrutura customizada, possibilitando a fabricação de novos dispositivos em escala atômica, como sensores, transistores e LEDs. As propriedades das heteroestruturas apresentam forte dependência com parâmetros como a sua orientação e simetria. Deste forma, é necessário primeiramente caracterizá-los para que seja possível empregar as estruturas produzidas em novos dispositivos. Para a caracterização destas, é desejado extrair o máximo de informação possível. Técnicas como geração de segundo (SHG) e terceiro (THG) harmônicos, permitem obter informações a respeito de parâmetros como a simetria e até mesmo a orientação cristalina de forma rápida e relativamente simples. Além disso, a geração não linear de novas frequências (como ocorre nos processos de SHG e THG) pode ser aplicada a dispositivos fotônicos, para, por exemplo, o desenvolvimento de conversores totalmente ópticos de frequência, ou para processamento de sinais, tornando ainda mais atrativa a aplicação destas técnicas a materiais e estruturas 2D. Dentre as heteroestruturas, as construídas a partir de dicalcogenetos de metais de transição (TMDs) vêm atraindo a atenção devido às suas propriedades semicondutoras e sua gama de aplicações. Outro exemplo de heteroestrutura são as observadas na natureza, como a franckeíta. Estas, por sua vez, ainda são pouco investigadas necessitando, assim, de maiores estudos. Desta forma, o objetivo deste trabalho é a caracterização de heteroestruturas de van de Waals através das técnicas não lineares de SHG e THG. As amostras aqui investigadas foram as baseadas em TMDs, crescidas pelo método de CVD (do inglês chemical vapor deposition); e as naturais, isoladas por esfoliação mecânica. As amostras crescidas por CVD estudadas neste trabalho são heteroestruturas de MoS2/WS2 crescidas com ângulos de empilhamentos de 0o e 60o e bi e tricamadas de MoS2 e de WS2. A heteroestrutura natural aqui analisada foi a franckeíta, com amostras variando com relação ao número de camadas. A partir dos resultados nas amostras crescidas por CVD é possível notar o aumento na intensidade do sinal de SHG com relação à sua monocamada quando o ângulo de empilhamento é de 0o. Já para o ângulo de empilhamento de 60o a intensidade do sinal de SHG é reduzido com relação à monocamada ou até eliminado, dependendo da amostra. Para as medidas de THG, a intensidade aumentou em todas as estruturas conforme o aumento do número de camadas, independente do ângulo de empilhamento. No caso da SHG, a taxa de aumento do sinal com o número de camadas foi superior ao esperado assumindo-se a soma coerente do sinal gerado individualmente por cada camada, indicando interação entre as camadas empilhadas produzidas por CVD. Para as amostras de franckeíta seu sinal de THG foi comparado com o de uma amostra de grafeno, onde foi visto que o sinal gerado é cerca de 3 ordens de grandeza maior que o medido no grafeno sob mesmas condições. Em paralelo a caracterização por THG contribuiu para a obtenção de informações a respeito da anisotropia do material. Materiais bidimensionais (2D) têm sido tema de intensa pesquisa devido às suas propriedades e aplicações. Heteroestruturas de van der Waals são estruturas produzidas pelo empilhamento das camadas de diferentes tipos desses materiais 2D. Este empilhamento permite combinar as propriedades de cada material em uma nova estrutura customizada, possibilitando a fabricação de novos dispositivos em escala atômica, como sensores, transistores e LEDs. As propriedades das heteroestruturas apresentam forte dependência com parâmetros como a sua orientação e simetria. Deste forma, é necessário primeiramente caracterizá-los para que seja possível empregar as estruturas produzidas em novos dispositivos. Para a caracterização destas, é desejado extrair o máximo de informação possível. Técnicas como geração de segundo (SHG) e terceiro (THG) harmônicos, permitem obter informações a respeito de parâmetros como a simetria e até mesmo a orientação cristalina de forma rápida e relativamente simples. Além disso, a geração não linear de novas frequências (como ocorre nos processos de SHG e THG) pode ser aplicada a dispositivos fotônicos, para, por exemplo, o desenvolvimento de conversores totalmente ópticos de frequência, ou para processamento de sinais, tornando ainda mais atrativa a aplicação destas técnicas a materiais e estruturas 2D. Dentre as heteroestruturas, as construídas a partir de dicalcogenetos de metais de transição (TMDs) vêm atraindo a atenção devido às suas propriedades semicondutoras e sua gama de aplicações. Outro exemplo de heteroestrutura são as observadas na natureza, como a franckeíta. Estas, por sua vez, ainda são pouco investigadas necessitando, assim, de maiores estudos. Desta forma, o objetivo deste trabalho é a caracterização de heteroestruturas de van de Waals através das técnicas não lineares de SHG e THG. As amostras aqui investigadas foram as baseadas em TMDs, crescidas pelo método de CVD (do inglês chemical vapor deposition); e as naturais, isoladas por esfoliação mecânica. As amostras crescidas por CVD estudadas neste trabalho são heteroestruturas de MoS2/WS2 crescidas com ângulos de empilhamentos de 0o e 60o e bi e tricamadas de MoS2 e de WS2. A heteroestrutura natural aqui analisada foi a franckeíta, com amostras variando com relação ao número de camadas. A partir dos resultados nas amostras crescidas por CVD ´e possível notar o aumento na intensidade do sinal de SHG com relação à sua monocamada quando o ângulo de empilhamento é de 0o. Já para o ângulo de empilhamento de 60o a intensidade do sinal de SHG é reduzido com relação à monocamada ou até eliminado, dependendo da amostra. Para as medidas de THG, a intensidade aumentou em todas as estruturas conforme o aumento do número de camadas, independente do ângulo de empilhamento. No caso da SHG, a taxa de aumento do sinal com o número de camadas foi superior ao esperado assumindo-se a soma coerente do sinal gerado individualmente por cada camada, indicando interação entre as camadas empilhadas produzidas por CVD. Para as amostras de franckeíta seu sinal de THG foi comparado com o de uma amostra de grafeno, onde foi visto que o sinal gerado é cerca de 3 ordens de grandeza maior que o medido no grafeno sob mesmas condições. Em paralelo a caracterização por THG contribuiu para a obtenção de informações a respeito da anisotropia do material.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Studies on nanocomposite dicalcogenated transition metals (TMDs) with cellulose nanofibrils (CNFs), called TMD-CNFs, are still scarce in the literature. Among the TMDs, molybdenum disulphide (MoS2) has great application versatility. MoS2 nanocomposite was obtained with CNFs (MoS2-CNFs) and their optical properties were studied by spectral and microscopic techniques. MoS2 monolayers were obtained with CNFs by sonication in aqueous medium and centrifugation. It was demonstrated by the Dynamic Light Scattering (DLS) and Zeta Potential (ZP) analyzes that the sonication process is efficient to obtain a MoS2 monolayer (m-MoS2) and cellulose can be used as a stabilizer of the monolayers, reaching average size of 270 nm for MoS2 and 700 nm for MoS2-CNFs in colloidal suspension, with -37.92 mV of ZP in 20% v/v of added CNFs. It has been found that the CNFs agglutinate on the surface of the MoS2 flakes by Van der Waals forces. Through AFM analysis, the average thickness of 5 nm for the MoS2 flakes was found. It has been shown that the MoS2 presents 2H geometry because it presents a second harmonic emission (SH) null in paired monolayers. UV/VIS spectroscopy analyzes shows that the addition of cellulose caused significant improvements in the absorption bands of the MoS2 monolayers (m-MoS2), similar as a single MoS2 monolayer. Morphological analyzes of the MoS2-CNFs composite indicate that this occurs because the addition of the CNFs reduces the disorientation of the MoS2 flakes. Strong fluorescence (FL) and second harmonic generation (SHG) were found in m-MoS2 through Confocal Microscopy (CM) analyzes. The presence of few m-MoS2 on the surface of the MoS2 flakes justifies the high fluorescence emission of the nanocomposite. Results indicate that addition of CNFs results in loss of fluorescence. However, the amount of SH regions increases as a function of fluorescence. Estudos sobre nanocompósito de metais de transição dicalcogenados (TMDs) com nanofibrilas de celulose (CNFs), denominado TMD-CNFs, ainda são escassos na literatura. Dentre os TMDs, o dissulfeto de molibdênio (MoS2) possui grande versatilidade de aplicações. Obteve-se os nanocompósitos de MoS2 com CNFs (MoS2-CNFs) e suas propriedades ópticas foram estudas por técnicas espectro e microscópicas. Monocamadas de MoS2 foram obtidas com CNFs através de sonicação em meio aquoso e centrifugação. Demonstrou-se através das análises de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) e Potencial Zeta (ZP) que o processo de sonicação é eficiente para obtenção de monocamada de MoS2 (m-MoS2) e a celulose pode ser usada como estabilizante das monocamadas, atingindo tamanho médio de 270 nm para o MoS2 e 700 nm para o MoS2-CNFs em suspensão coloidal, com -37,92 mV de ZP em 20% v/v de CNFs adicionada. Verificou-se que as CNFs aglutinam-se na superfície dos flakes de MoS2 através de forças de Van der Waals. Através de análises de AFM, encontrou-se a espessura média de 5 nm para os flakes de MoS2. Mostrou-se que o MoS2 apresenta geometria 2H devido apresentar emissão de segundo harmônico (SH) nulo em monocamadas pares. Análises de espectroscopia UV/VIS mostram que a adição de celulose ocasionou maior pronunciamento das bandas de absorção das monocamadas de MoS2, similar a uma única monocamada de MoS2. Análises morfológicas do compósito MoS2-CNFs indicam que isso ocorre porque a adição das CNFs reduz a desorientação dos flakes de MoS2. Foram encontradas forte fluorescência (FL) e geração de segundo harmônico (SHG) nas m-MoS2 através de análises de Microscopia Confocal (CM). A presença de poucas m-MoS2 na superfície dos flakes de MoS2 justificam a alta emissão de fluorescência do nanocompósito. Resultados indicam que a adição de CNFs resultam em perda de fluorescência. Entretanto, a quantidade de regiões com SH cresce em função da fluorescência. 1777642

Agradecimentos: This study was supported by the São Paulo Research Foundation—FAPESP (Grant Nos. 2016/22927-7, 2017/17149-8, and 11/51959-0) and by Coordination of Superior Level Staff Improvement (CAPES) (Grant No. 01-P-3368/2017). We would like to express our thanks for the access to equipment and assistance provided by the National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology (INFABIC), which is cofounded by FAPESP (Grant No. 2014/50938-8) and by National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) (Grant Nos. 465699/2014-6 and 312049/2014-5). We are also grateful to Adilson A. Piaza and Mercedes F. Santos for assistance in photographic documentation, Ana C. Piaza and Luzia A. Magalhães for technical assistance, and Cleide A.M. Silva and Juliana L.P. Argenton for statistical assistance Abstract: Sarcoidosis and tuberculoid leprosy (TL) are prototypes of granulomatous inflammation in dermatology, which embody one of the histopathology limitations in distinguishing some diseases. Recent advances in the use of nonlinear optical microscopy in skin have enabled techniques, such as second-harmonic generation (SHG), to become powerful tools to study the physical and biochemical properties of skin. We use SHG images to analyze the collagen network, to distinguish differences between sarcoidosis and TL granulomas. SHG images obtained from skin biopsies of 33 patients with TL and 24 with sarcoidosis retrospectively were analyzed using first-order statistics (FOS) and second-order statistics, such as gray-level co-occurrence matrix (GLCM). Among the four parameters evaluated (optical density, entropy, contrast, and second angular moment), only contrast demonstrated statistical significance, being higher in sarcoidosis (p = 0.02||4908.31 versus 2822.17). The results may indicate insufficient differentiating power for most tested FOS and GLCM parameters in classifying sarcoidosis and TL granulomas, when used individually. But in combination with histopathology (H&E and complementary stains, such as silver and fast acid stains), SHG analysis, like contrast, can contribute to distinguishing between these diseases. This study can provide a way to evaluate collagen distribution in granulomatous diseases FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Aberto

Orientadores: Maria Letícia Cintra, Gislaine Vieira Damiani Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Introdução: Mais de 200.000 casos novos de hanseníase são detectados anualmente em todo o mundo. O Brasil é o segundo país com maior incidência, perdendo apenas para a Índia. Mesmo em locais endêmicos como o Brasil, o diagnóstico da hanseníase pode ser deveras desafiador, haja vista algumas regiões apresentarem um atraso médio de dois anos para que ele seja definido. Com o aumento progressivo dos fluxos migratórios, países não endêmicos também poderão enfretar esse desafio. Outrossim, os médicos comumente têm dificuldade em diferenciar a forma tuberculoide da hanseníase (HT) da manifestação cutânea da sarcoidose, doença esta multissistêmica e também de padrão inflamatório crônico granulomatoso. Classicamente, a histopatologia da HT é caracterizada por granulomas envoltos por rica orla linfocitária, enquanto a da sarcoidose por granulomas nus, ou seja, envoltos por raros linfócitos. Todavia, fato é que tais achados não estão sempre presentes na prática diária, o que torna essas duas doenças, muitas vezes, clínica- e histopatologicamente semelhantes. Neste trabalho, foram pesquisados critérios adicionais de auxílio à distinção destas doenças, seja por meio da microscopia óptica de luz, seja por ferramentas mais novas, como a geração de segundo harmônico - SHG (microscopia óptica não linear). Material e Métodos: Biopsias de pele de 33 pacientes com HT e 24 com sarcoidose foram revisadas, retrospectivamente, sob colorações de rotina - hematoxilina e eosina (H&E) e pela prata (técnica Gomori). Foram avaliados, de forma cega, 24 achados histomorfológicos (dentre eles, o tipo de granuloma, tipo de distribuição granulomatosa; presença de estruturas como Corpos de Schaumann, corpos asteroides, corpos de Hamazaki Wesenberg, células gigantes de Langhans, plasmócitos; presença de fibrose, necrose fibrinoide, necrose caseosa) à coloração pela H&E, por dois observadores distintos, com o intuito de verificar se algum desses achados mostraria valor diagnóstico preditivo significante para HT ou sarcoidose. Os espécimes corados pela prata foram fotografados e avaliados pela morfometria dos cicloides virtuais, com o objetivo de estimar o valor preditivo diagnóstico da densidade média das fibras reticulínicas nos granulomas. A partir das lâminas coradas pela H&E, as imagens do SHG foram obtidas e os dados da avaliação da densidade e textura do colágeno foram analisados. Resultados: Nove das 24 características histomorfológicas analisadas apresentaram valor preditivo significativo para o diagnóstico da HT (granuloma tuberculoide, distribuição peri-neural e peri-anexial, granulomas nos limites do glomérulo sudoríparo substituindo o nervo da região) ou sarcoidose (fibrose, distribuição dos granulomas de modo consecutivo, plasmócitos, elevado número de células gigantes de Langhans convencionais, elevado número de células gigantes bizarras, granulomas junto a resto de nervo). A média da densidade das fibras retinulínicas foi significativamente maior na sarcoidose do que na HT pelo teste de Mann-Whitney. No entanto, ao utilizarmos o método estatístico da regressão logística, essa variável não discriminou as duas doenças. Entre os quatro parâmetros avaliados nas imagens de SHG (densidade óptica, entropia, contraste e segundo momento angular), apenas o contraste demonstrou significância estatística, sendo maior na sarcoidose. Conclusões: as características hitomorfológicas, histomorfométricas, ou a análise de imagem pelo SHG podem ser insuficientes para diferenciar a HT da sarcoidose, se avaliadas isoladamente. Mas, quando combinadas, podem se tornar ferramentas muito úteis nesse intento. Os resultados desse trabalho reforçam a importância da morfometria para uma análise histológica mais objetiva das doenças, e abrem as portas para o estudo do colágeno cutâneo nas afecções granulomatosas Abstract: Background: More than 200,000 new cases of leprosy are detected, annually, around the world. Brazil is the second country in highest incidence, behind only India. Even in endemic places like Brazil, the diagnosis of leprosy can be very challenging, since in some regions there is an average delay of two years for it. With the progressive increase in migratory flows, non-endemic countries may also meet this challenge. Besides, not uncommonly, physicians have difficulty distinguishing tuberculoid form of leprosy (TL) from sarcoidosis' cutaneous manifestation. The latter is multisystemic and also manifests as a chronic granulomatous inflammation. Classically, the histopathology of TL is characterized by granulomas surrounded by evident lymphocytic rim, whereas that of sarcoidosis by naked granulomas, i.e., surrounded by rare lymphocytes. However, such findings are not always present in daily practice, which makes these two diseases often clinically and histopathologically similar. The present work aimed, therefore, investigate criteria that aid in their distinction, either through standard optical microscopy or through newer tools such as second harmonic generation - SHG (non-linear optical microscopy). Material and Methods: Skin biopsies from 33 patients with TL and 24 with sarcoidosis were reviewed in hematoxylin and eosin (H&E) and silver (Gomori technique) staining. Two distinct observers blindly evaluated twenty-four histomorphological findings on H&E staining, in order to verify if any of them had significant predictive diagnosis value to TL or sarcoidosis. The specimens stained by silver were photographed and evaluated through the morphometry of the virtual cycloids in order to estimate the predictive diagnosis value of the mean density of the reticulin fibers. From the H&E stained specimens, the SHG images were obtained and collagen features of density and texture were analyzed. Results: Nine of the 24 histomorphological characteristics analyzed presented significant predictive value for the diagnosis of HT or sarcoidosis. The mean density of reticulin fibers was significantly higher in sarcoidosis than in HT. However, using logistic regression, this variable did not discriminate the two diseases. Among the four characteristics evaluated in SHG images (optical density, entropy, contrast and second angular momentum), only contrast was useful, revealing significant predictive diagnosis value, being higher in sarcoidosis. Conclusions: Histomorphologic, histomorphometric, or SHG imaging may be insufficient to differentiate HT from sarcoidosis, if evaluated alone. However, when combined, they can become very useful tools in this endeavor. Our results reinforce the importance of morphometry for a more objective histological analysis of the diseases, and open the doors for the study of cutaneous collagen in the granulomatous disorders Doutorado Anatomia Patologica Doutora em Ciências FAPESP 2016/22927-7 CAPES 01-P-3368/2017

As propriedades físicas de materiais, em geral, dependem intrinsecamente de simetrias. Uma propriedade claramente dependente da simetria é a capacidade de materiais não centrosimétricos de gerar luz com o dobro da frequência incidente, o efeito denominado geraçãode segundo harmônico (SHG). O efeito não ocorre em materiais centrosimétricos. Nesta dissertação são apresentados resultados obtidos no estudo de cristais bidimensionais de nitreto de boro hexagonal (h-BN) por microscopia de geração de segundo harmônico. O h-BN é uma heterostrutura de nitrogênio e boro, cujas camadas ímpares não possuem simetria de inversão e por isso possuem a condição necessária para a geração do segundo harmônico. Apresentamos resultados para amostras que passaram por tratamento térmico e apresentam rugas. Mostramos que as rugas são formadas de junções do tipo origami, e seguem preferencialmente a direção cristalina armchair. Nossos resultados também mostram que a microscopia por geração de segundo harmônico possibilita acessar informações da topografia cristalina que não são percebidas facilmente por outros tipos de microscopia. Mostramos também resultados de variações da intensidade do SHG para amostras com poucas camadas e uma monocamada de h-BN. Apresentamos um estudo comparativo entre amostras com e sem tratamento térmico. Os resultados mostram que a intensidade do sinal SHG diminui com o aumento do número de camadas, mas a variação é diferente para cada tipo de amostras. In general the physical properties of materials depend intrinsically on symmetries. A property clearly dependent on symmetry is the ability of non-centrosymmetric materials to generate light with twice the incident frequency, an effect named second harmonic generation (SHG). The effect is absent for centrosymmetric materials. In this work we present results for hexagonal boron nitride (h-BN) nano-crystals studied by second harmonic generation microscopy. The h-BN is a heterostructure of nitrogen and boron, whose odd layers have no inversion symmetry and therefore have the necessary condition for the generation of the second harmonic. We present results for samples that underwent thermal treatment that lead to wrinkle formation. We show that the wrinkles are formed from origami-like joints, and preferentially follow the crystal armchair direction. Our results also show that the second harmonic generation microscopy allows access to information of the crystalline topography that is not easily observed by other types of microscopy. We also show results of the SHG intensity dependence on the number of layers for samples with few layers and a monolayer of h-BN. We present a comparative study between samples with and without heat treatment. The results show that the intensity of the SHG signal decreases with the increase in the number of layers, but the layer number dependence is different for each type of sample.

Agradecimentos: This study was funded by the São Paulo Research Foundation (08/57906–3), the National Council for Scientific and Technological Development (573913/2008–0), and the Biologia das Doenças Neoplásicas da Medula Óssea (FAPESP grant 11/51959-0) project with fellowship support from CNPq (310518/2015-6) Abstract: Background: The diagnosis of idiopathic atrophoderma of Pasini and Pierini (IAPP) relies on typical clinical features, particularly distinctive pigmented ovular/round depressed plaques. Histologic examination often reveals no obvious changes, but patterns of collagen distribution, using multiphoton imaging and second harmonic generation can help track hidden details of tissue organization contributing to atrophy. Objective: To identify histologic features that distinguish IAPP from unaffected skin. Methods: Eleven patients were included for conventional analyses. Masson trichromee and Unna-Tanzer orcein-stained sections were evaluated using automated morphometry. Hematoxylin-eosinestained sections were analyzed by multiphoton imaging using 2-photon excited fluorescence and second harmonic generation. Results: No abnormalities were found under light microscopy or by automated quantification. Multiphoton imaging revealed no difference in optical density of either collagen or elastic fibers in lesioned and unaffected skin; however, horizontal collagen fiber organization in lesion specimens increased toward the lower dermis, whereas elastic fibers featured greater disorganization within the upper dermis. Limitations: The low number of patients evaluated. Conclusion: The atrophic appearance of IAPP lesions reflects changes in organization, but not in collagen and elastic tissue content. Minute organizational differences that are imperceptible to the experienced pathologist and undetectable by automated analyses were revealed by multiphoton analyses, particularly second harmonic generation, in association with texture analyses FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Fechado

Dissertação de mestrado em Física (área de especialização Física Fundamental), Os cristais orgânicos têm sido alvo de um especial interesse tecnológico, por apresentarem não-linearidades óticas superiores aos materiais cristalinos inorgânicos. A para-nitroanilina (pNA) é um cristal orgânico que tem sido bastante estudado, pois apresenta uma elevada hiperpolarizabilidade. Contudo, esta cristaliza numa estrutura centro-simétrica, proibindo a ocorrência de respostas óticas não-lineares, como a Geração de Segundo Harmónico (SHG). Verificou-se, porém, que quando estes cristais estão incorporados em nanofibras produzidas pelo processo de electrospin- ning, é medido um alto sinal de SHG. Esta tese tem, assim, como objetivo principal compreender a origem física desta resposta não-linear elevada. Para tal, foram conduzidos dois estudos. O primeiro consiste na criação de um modelo fenomenológico, que pressupõe que a geração de segundo harmónico e proveniente das superfícies, onde existe quebra de centro-simetria do interior do cristal. O segundo estudo procura compreender como o sinal de SHG é afetado com a variação de parâmetros no processo de electrospinning. Para além disso, compara-se o sinal das fibras de pNA com o sinal gerado por nanofibras dopadas com outros cristais orgânicos da mesma família da pNA. Esta análise ser a feita recorrendo aos resultados obtidos através da difracção de raios-X, microscopia electrónica de varrimento e polarimetria de SHG. A medição de um sinal de SHG a partir das nanofibras dopadas com cristais de para-nitroanilina, obtidas por electrospinning, revelou que estas são um gerador de segundo harmónico com bastante potencial, quando são ajustados certos parâmetros do processo mencionado, como o diâmetro de agulha, a taxa de deposição, o potencial aplicado, a concentração do cristal de pNA e o polímero escolhido. Verificou-se, também, uma elevada diferença entre os valores previstos teoricamente através do modelo fenomenológico criado e os valores estimados experimentalmente. Desta forma, o sinal de SHG medido não ser a unicamente proveniente das superfícies do cristal. Aponta-se para uma possível contribuição multipolar ou para um eventual sinal proveniente de uma nova fase que cresce entre as superfícies dos cristais e o polímero e cuja presença não e detetada na difracção de raios-X., Organic crystals have been the focus of a special technological interest, because they present optical nonlinearities superior to inorganic crystalline materials. Paranitroaniline (pNA) is an organic crystal that has been extensively studied due to the fact that it presents a high hyperpolarizability. However, it crystallizes in a centersymmetrical structure, preventing the occurrence of nonlinear optical responses, such as Second Harmonic Generation (SHG). It was found, however, that when these crystals are incorporated into nano bers produced by the electrospinning process, a high SHG signal is measured. Thus, the main objective of this thesis is to understand the physical origin of this high non-linear response. To achieve this goal, two studies were conducted. The rst approaches the creation of a phenomenological model, which assumes that the second harmonic generation is coming from areas where there is a break in the center symmetry in the crystal interior. The second study seeks to understand how the SHG signal is a ected with varying parameters in the electrospinning process and the use of other organic crystals from the same family of pNA in the bers. This analysis will be done using the results obtained by X-ray di raction, scanning electron microscopy and SHG polarimetry. The measurement of the SHG signal from nano bers doped with para-nitroaniline crystals obtained by electrospinning, revealed that these are a second harmonic generator with plenty of potential, when certain parameters of that process are adjusted, as the needle diameter, the deposition rate, the applied potential, the concentration of pNA crystal and polymer selected. It was also found a large di erence between the values experimentally estimated and the values predicted by the created phenomenological model. Thus, it seems that the SHG signal measured does not arise only from the surfaces of the crystal. It is conjectured the existence of a multipolar contribution or a signal from a new phase that grows between the surfaces of the crystals and the polymer and whose presence is not detected in X-ray di raction.

O entendimento das propriedades ópticas não lineares dos nanofios semicondutores é fundamental para pesquisas de materiais bases e fabricação de componentes optoeletrônicos em nanoescala. Um importante fenômeno de óptica não linear é a geração de segundo harmônico, que ocorre em materiais não centrossimétricos e tem sido aplicado no desenvolvimento de novas fontes de luz, uma vez que, é possível gerar um feixe com o dobro da frequência de bombeamento. Além disso, a partir dessa técnica é possível obter informações cristalográficas de alguns materiais, pois o segundo harmônico é sensível às simetrias do cristal. Neste trabalho investigamos a forte influência do politipismo na geração de segundo harmônico de um único nanofio de arseneto de gálio. O arseneto de gálio é um semicondutor que exibe duas estruturas cristalinas: a blenda de zincoe a wurtzita, e é a coexistência dessas duas fases ao longo do nanofio que nomeamos por politipismo. Medidas preliminares de espectroscopia de transmissão mostram que o nanofio contém segmentos de wurtzita, bem como segmentos de blenda de zinco comduas orientações cristalográficas diferentes. Ambas essas estruturas exibem respostas não lineares de segunda ordem, que se comportam de forma distinta, segundo as simetrias de ponto do grupo cristalográfico ao qual pertencem. Desse modo, para investigarcada fase cristalina, medidas de segundo harmônico resolvidas na polarização foram realizadas. E, a partir dos dados experimentais e das simulações teóricas, nós verificamos a presença das duas fases. Além disso, conseguimos determinar a fração de volume dos segmentos de blenda de zinco orientados em direções diferentes, e também a razão entre os elementos do tensor susceptibilidade para a fase wurtzita. The understanding of the nonlinear optical properties of semiconductor nanowires is fundamental for basic material research and manufacturing of optoeletronic components at the nanoescale. An important nonlinear optical phenomenon is the second-harmonic generation that occurs in noncentrosymmetric materials and has been applied in the developmentnew light sources, since it is possible to generate a light beam with a frequency twice that of the pump. Moreover, from this technique one can obtain information about crystallographic features of some materials, because the second-harmonic is sensitive to crystal symmetries. In this work, we investigated the strong influence of polytypism on the second-harmonic generation of a single gallium arsenide nanowire. The gallium arsenide is a semiconductor that exhibits two crystal structures: zinc blende and wurtzite and, is the coexistence of these two phases along the nanowire that we call by polytypism. Preliminary measurements of transmission electron microscopy show that the nanowires have wurtzite segments as well as zinc blende segments with two different crystallographic orientations. Both of these structures exhibit second-order nonlinear responses, which behave differently, according to the symmetry crystallographic point group to which they belong. Thus, to study each crystalline phase, measurements of polarization-resolved second-harmonic generation was performed and, from our experimentaldata we verified the presence of two phases. Furthermore, we can determined the volume fraction of the zinc blende segments oriented in different directions and also the ratio between the elements of the susceptibility tensor of wurtzite phase.

Agradecimentos: We would like to thank Aaron C. Hryciw and J. P. Hadden for their assistance with this project. This work was supported by NRC, CFI, iCORE/AITF, NSERC, and CNPq Abstract: Resonant second harmonic generation between 1550 nm and 775 nm with normalized outside efficiency > 3.8 × 10 - 4 mW - 1 is demonstrated in a gallium phosphide microdisk supporting high-Q modes at visible (Q ~ 10 4) and infrared (Q ~ 10 5) wavelengths. The double resonance condition is satisfied for a specific pump power through intracavity photothermal temperature tuning using ~ 360 µ W of 1550 nm light input to a fiber taper and coupled to a microdisk resonance. Power dependent efficiency consistent with a simple model for thermal tuning of the double resonance condition is observed CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Aberto

Orientador: Carlos Lenz César Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin Resumo: Técnicas de microscopias ópticas são as principais ferramentas capazes de observar células e tecidos biológicos em tempo real e com mínimo dano. Essa área foi revolucionada recentemente através das microscopias confocais de varredura a laser e as microscopias de óptica não linear, naturalmente confocais. Entre os processos não lineares temos, a fluorescência excitada por dois ou mais fótons, geração de segundo harmônico [Second Harmonic Generation - SHG] e terceiro harmônico [Third Harmonic Generation - THG]. SHG e THG são técnicas de óptica não linear coerentes, não necessitam de marcadores exógenos e permitem reconstrução de imagens em três dimensões com resolução espacial subcelular. As técnicas de fluorescência permitem visualizar estruturas específicas no espaço, mas não permitem discriminar as substâncias químicas nas estruturas celulares, e as técnicas de SHG e THG não possuem especificidade química. Espectroscopia Raman possui especificidade química através das propriedades vibracionais das moléculas e pode ser usada como mecanismo de contraste na aquisição de imagens. Comparada com a espectroscopia/microscopia infravermelho, a microscopia Raman traz a informação das vibrações moleculares do infravermelho para o visível, eliminando os problemas da baixa resolução espacial e opacidade das amostras. Entretanto a baixa sensibilidade dessa técnica implica em tempos de aquisição de imagens muito longos, da ordem de horas, inviabilizando acompanhar a dinâmica de processos celulares em tempo real. Como solução para essa baixa sensibilidade do espalhamento Raman espontâneo, surgiu a microscopia por espalhamento Raman Coerente anti-Stokes [Coherent Anti-Stokes Raman Scattering - CARS]. Comparado com Raman espontâneo, a microscopia CARS representa aumento de 4 a 5 ordens de grandeza na sensitividade da técnica, diminuindo os tempos de aquisição ao ponto de viabilizar a aquisição em taxas de vídeos (mais rápido do que 30 quadros por segundo) e estudos em tempo real. Essa tese é dedicada ao estudo experimental e teórico, assim como de algumas aplicações, das técnicas de óptica não linear, com destaque para processos de óptica não linear coerentes. Apresentamos de forma detalhada três sistemas experimentais para a aquisição de imagens de Raman coerente e um sistema integrado com várias técnicas de óptica não linear. Mostramos as primeiras imagens de CARS realizadas no Brasil. Além do CARS convencional, trabalhamos com outra técnica de CARS de ordem mais alta, o CARS cascata [cascade CARS - CCARS], e, no melhor do nosso conhecimento, apresentamos as primeiras imagens internacionais obtidas com essa metodologia. CCARS aumenta o contraste da técnica CARS, diminuindo o fundo não ressonante, um problema que aflige a comunidade científica dedicada ao uso dessa técnica. Além da diminuição do fundo não ressonante, a emissão do CCARS acontece em um comprimento de onda diferente de qualquer outro efeito não linear coerente, significando um acréscimo de complexidade mínimo para sua detecção quando comparado com o CARS. Por último mostramos algumas aplicações realizadas com o sistema experimental desenvolvido para integrar diversas modalidades ópticas em paralelo, especialmente da geração de harmônicos com a fluorescência excitada por dois fótons e suas variantes, como microscopia de tempo de vida de fluorescência (Fluorescence Lifetime Imaging ¿ FLIM) Abstract: Optical microscopies techniques are the main tools capable of observing cell and biological tissues in real time and with minimum damage. This area have recently been revolutionized by confocal laser scanning microscopies and non-linear microscopies, naturally confocal. Among the non-linear process we have, the two or more photons excited fluorescence, second harmonic generation [SHG] and third harmonic generation [THG]. SHG and THG are coherent nonlinear techniques, they do not require exogenous markers and allow three dimension imaging reconstruction with subcellular resolution. The fluorescence techniques allow visualizing specific structures in space, but do not allow discriminating the chemical substances in cellular structures, SHG and THG techniques do not have chemical specificity. Raman spectroscopy has chemical specificity through the vibrational properties of the molecules and can be used as a contrast mechanism for imaging acquisition. Compared to infrared spectroscopy/microscopy, Raman microscopy brings information about molecular vibration from infrared to visible, eliminating the low resolution and sample opacity problems. However, this technique low sensibility implies in very long imaging acquisition times, order of hours, making it not viable for following cellular process dynamics in real time. As an answer for the spontaneous Raman scattering low sensibility, the coherent anti-Stokes Raman scattering [CARS] emerged. Compared to spontaneous Raman, CARS microscopy presents an increase of 4 to 5 orders of magnitude in the sensitivity of the technique, lowering the acquisition times to the point of making video acquisition (faster than 30 frames per second) and real time studies possible. This thesis is dedicated to the experimental and theoretical study, as well as some applications, of the non-linear techniques, with emphasis on coherent non-linear optical processes. We present in detailed form three experimental systems for the acquisition of coherent Raman images, and a system with the integration of various non-linear techniques. We show the first CARS images acquired in Brazil. In addition to conventional CARS, we worked with other higher order CARS technique, the cascade CARS [CCARS], and, in the best of our knowledge, we present the first international image acquired with this methodology. CCARS increases the contrast from CARS technique, decreasing the non-resonant background, a problem that afflicts the scientific community dedicated to the use of this technique. Besides the decrease of the non-resonant background, the CCARS emission occurs in a different wavelength from any other non-linear coherent effect, meaning a minimum complexity increase for its detection when compared with CARS. Finally we show some applications performed with the experimental system developed to integrate several optical modalities in parallel, especially the generation of harmonics with two photons excitation fluorescence and their variants such as Fluorescence Lifetime Imaging [FLIM] Doutorado Física Doutor em Ciências CAPES 830406/2010

Orientador: Luis Eduardo Evangelista de Araujo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin Resumo: Nesta tese, descrevemos o desenvolvimento de um sistema laser simplificado que opera em 423 nm (baseado em um laser de diodo) e a construção de uma célula de vapor de cálcio com potencial uso em espectroscopia de alta resolução. Nosso trabalho começou com a construção de um laser de diodo em cavidade estendida operando em 846 nm e com uma potência útil de 158 mW que foi montado em configuração Littrow. Em seguida, foi duplicada a freqüência deste laser para 423 nm através de um cristal BIBO (BiB3O6), utilizado dentro de uma cavidade óptica de amplificação. A estabilização da cavidade óptica duplicadora de freqüência foi feita pela técnica de Hänsch-Couillaud para travar uma ressonância da cavidade ao laser infravermelho de entrada. Um máximo de potência de 20 mW no azul foi obtido, mas problemas relacionados ao travamento da cavidade duplicadora dificultam seu uso. Por isto, um segundo laser de diodo em cavidade estendia, similar ao anterior, mas com uma potência útil de 75 mW, foi usado com uma potência máxima de 4 mW no azul e apresentado similares dificuldades ao sistema desenvolvido anteriormente. Uma célula de vapor de cálcio foi construída tendo como fonte de átomos de cálcio um dispensador ¿Alvasource¿ da empresa ¿Alvatec¿. Uma primeira caracterização da célula através de espectroscopia de absorção foi realizada demonstrando seu potencial uso para experimentos em Física Atômica Abstract: In this thesis, we describe the development of a simplified laser system that operates at 423 nm (based on a diode laser) and the construction of calcium vapor cell with potential use in high resolution spectroscopy. Our work began with the construction of a extended-cavity diode laser operating at 846 nm with an output of 158 mW that was mounted in Littrow configuration. Then, the laser¿s frequency was doubled to 423 nm through a BIBO (BiB3O6) crystal used within a power enhancement cavity. The stabilization of the frequency doubling cavity was made by Hänsch-Couillaud technique to lock a cavity resonance to the input infrared laser. A maximum power of 20 mW was obtained in the blue, but problems related to locking the doubling cavity hamper its use. Therefore, a second extended-cavity diode laser, similar to the above but with an output of 75 mW was tried, reaching a maximum power of 4 mW in the blue. However, it presented similar difficulties to the system developed earlier. A calcium vapor cell was constructed based on Ca ¿Alvasource¿ dispenser by ¿Alvatec¿. A first characterization of the cell by absorption spectroscopy was performed demonstrating its potential use for experiments in atomic physics Mestrado Ótica Mestre em Física

Agradecimentos: Financial support from FAPESP, CEPOF, and CNPq is gratefully acknowledged. Flavio C. Cruz benefited from stimulating discussions and suggestions from Prof. Marcos Dantus, from Michigan State University Abstract: We demonstrate broadband second harmonic generation of low-energy pulses produced by injecting two single-frequency lasers into a highly nonlinear fiber. Full nonlinear conversion of the corresponding spectra, consisting of broadband (similar to 200 nm) optical frequency combs at similar to 1580 nm, were obtained by using conventional birefringence phase-matching in two BIBO crystals (2-mm and 100-mu m long) with a normal incidence configuration. The crystals were not tilted and the pulses were not compressed. This broadband conversion results from the large phase-matching bandwidth of the nonlinear BIBO crystals at similar to 1550 nm, but also seems to be a consequence of a fundamental comb with small spectral phase variation FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Fechado

Orientador: Carlos Lenz Cesar Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física Gleb Wataghin Resumo: Biologia celular é um novo mundo promissor com enorme impacto social, econômico e na saúde. Organismos vivos são capazes de, produzir a própria energia a partir da luz do sol, se reproduzir, de se auto-reparar, sinalizar e navegar por sinais bioquímicos, biomecânicos, luminosos, térmicos, e outros, e produzir materiais à temperatura ambiente. As possibilidades abertas por essa área incluem, desde bactérias e protozoários usados para destruir células de câncer, regeneração de órgãos inteiros, produção de etanol a partir de algas, e outros. Entretanto, para o entendimento da biologia em seu nível mais profundo, ferramentas de observação não destrutivas fazem-se necessária para seguir os processos celulares durante seu tempo de vida. A óptica tem a única onda não destrutiva capaz de fornecer informações em tempo real com suficiente resolução espacial de eventos acontecendo internamente à célula. Ademais, porque feixes de luz não colidem, a óptica permite a integração de diferentes técnicas capazes de reunir informações simultâneas de processos celulares. Óptica não linear é especialmente adequada para tal, pois não requer marcação ou processamentos especiais de amostras que poderiam destruir, ou modificar, os processos celulares. Além disso, técnicas elásticas, como a geração de segundo e terceiro harmônicos não liberam energia no material que é, portanto, preservado após a observação. O objetivo dessa tese é desenvolver uma plataforma multimodal para observação de processos biológicos pelo uso de microscopias de fluorescência excitada por absorção de dois fótons, geração de segundo harmônico e geração de terceiro harmônico no mesmo instrumento. Nosso grupo foi pioneiro em demonstrar a aquisição de imagens de geração de segundo harmônico no Brasil e, essa tese é a primeira a realizar a aquisição de imagens por geração de terceiro harmônico. Estas três técnicas juntas fornecem informações complementares a respeito da organização de células e tecidos. Enquanto a fluorescência pode ser específica para algumas proteínas alvo, o segundo harmônico pode observar a rede de colágeno da matriz extra celular e, o terceiro harmônico pode observar os núcleos e gotículas de lipídios internas às células. Esta tese descreve o sistema experimental para realizar essas aquisições multimodais de imagens, a física por trás dos sinais não lineares, importantes para entender seu significado biológico, e mostra aplicações das técnicas para diferentes amostras biológicas e inorgânicas Abstract: Cell biology is promising a brave new world with enormous social economic and health impacts. Living organisms are capable of producing their own energy from sun light, reproduce, self-repair, signalize and travel in response to biochemical, biomechanical, light and thermal signals among others, and to produce materials at room temperature. The possibilities opened by this area range from bacteria and protozoa used to destroy cancer cells, whole organs regeneration, ethanol produced from algae, and others. However, to actually understand biology at its deepest level no destructive observation tools are necessary to follow cell processes during their time course. Optics is about the only wave capable to provide non destructive real time information with enough spatial resolution of the events happening inside the cells. Moreover, because light beams do not collide, optics allows the integration of different techniques capable to gather simultaneous information during a cell process. Non linear optics is specially suited for that in the sense that it does not require staining or special sample processing that would destroy, or change, the process. Besides, elastic techniques such as second and third harmonic generation do not release energy at the material which is therefore preserved after the observation. The objective of this thesis is to develop a multimodality platform for biology process observation by using Two Photon Excited Fluorescence, Second Harmonic Generation and Third Harmonic Generation Microscopy with the same instrument. Our group was the first one to demonstrate the acquisition of Second Harmonic Generation images in Brazil and this thesis is the first one to perform the acquisition of third harmonic generation images. These three techniques together provide complementary information respect to cell and tissue organization. While fluorescence can be specific target to some proteins, second harmonic can observe the collagen network of extra cellular matrix and the third harmonic can observe the nucleus and lipid droplets inside the cells. This thesis describe the experimental setup to perform these multimodal image acquisition, the physics behind the non linear signals, important to understand their biological mean, and shows applications of these techniques for different biological and inorganic samples Mestrado Física Mestre em Física

Amorphous materials present macroscopic inversion symmetry. As a consequence, their even order nonlinearities are null. The technological interest in vitreous medium with second order nonlinearity ( χ(2) ) to make photonic devices has stimulated the development of techniques to induce this property. Among them, the thermal-electric field poling is one of the most investigated due its experimental simplicity and results reproducibility. In this work the investigations were directed to the thermal-electric field poling dynamics in soda-lime glasses in view of identify the mainly contributions to the induced nonlinearity stability. Initially were identified the mainly contributions to the induced electrical current. It was observed during the polarizations electroluminescence emission which was shown to be due to ionic displacement and air ionization outside the sample. By using a simplified ionic conduction model was determined two activation energies: ~0,60 and ~3,8eV. The first one, determined from the induced electrical current, was attributed to the sodium conduction; while the second ones, determined by the electroluminescence, attributed to the calcium displacement. Besides the small contribution to the electrical current, the calcium ions, due their small diffusion coefficient, were identified as responsible to the possibility of induce stable second order nonlinearity in soda-lime glasses. Based on these evidences it was used an alternative procedure in which the electrical current flux is controlled. This procedure enabled induce stable χ(2) . This effect was demonstrated to exist 12 months after the polarization procedure, even with a ~50% decrease. The second harmonic generation efficiency was increased in until three times by pumping continuously the polarized samples with infrared radiation from an Nd-YAG laser operating at QSML regime. The threshold applied voltage to observe χ(2) was determined through a modulated applied voltage procedure to be due to the mobility difference between sodium and calcium. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Materiais amorfos apresentam simetria de inversão macroscópica e, como conseqüência, as nãolinearidades ópticas de ordem par são nulas. A necessidade tecnológica de que meios vítreos apresentem não-linearidade de segunda ordem ( χ(2) ), visando principalmente o desenvolvimento de dispositivos fotônicos, fortalece a busca por técnicas para a sua indução. Dentre estas, o processo termo-elétrico de polarização tem sido muito investigado devido, principalmente a sua simplicidade experimental e a reprodutibilidade dos resultados. Neste trabalho as investigações são dedicadas à dinâmica do processo termo-elétrico em vidros soda-lime visando identificar as principais contribuições para a estabilidade da não-linearidade induzida. Inicialmente foram verificadas as principais contribuições à corrente elétrica induzida. Durante as polarizações observou-se emissão de eletroluminescência. Mostrou-se que esta é devido ao deslocamento dos íons de cálcio e possíveis ionizações do ar fora da amostra. Usando um modelo simplificado de condução iônica determinou-se duas energias de ativação: ~0,60 e ~3,8eV. A primeira, determinada a partir da corrente elétrica induzida, foi atribuída à condução dos íons de sódio; enquanto a segunda, determinada pela eletroluminescência, aos íons de cálcio. Apesar de pequena contribuição na corrente elétrica induzida, os íons de cálcio, devido ao baixo coeficiente de difusão, foram identificados como os responsáveis pela possibilidade de indução de χ(2) estável em vidros soda-lime. Baseado nessas evidências foi utilizado um procedimento alternativo de polarização controlando do fluxo de corrente induzida que permitiu a indução de χ(2) estável. Este efeito pôde ser comprovado existir 12 meses após o processo de polarização, mesmo com redução de ~50% do valor inicial. Observou-se que a eficiência na geração de segundo harmônico pôde ser aumentada em até 3 vezes quando as amostras polarizadas foram bombeadas continuamente com laser Nd-YAG operando no regime QSML. Através de procedimento com tensão elétrica aplicada modulada foi identificada a origem da tensão elétrica de limiar como sendo devido à diferença de mobilidade entre os íons de sódio e cálcio.

Universidade Federal de Pernambuco Neste trabalho, observamos evidências da interação de longo alcance entre átomos de Rydberg usando um processo não linear, a geração de segundo harmônico (SHG), em um vapor contendo alta densidade de átomos de rubídio.O sinal de segundo harmônico, ressonante por dois fótons, é observado a partir de estados altamente excitados, s , p e d, onde a assinatura da interação de longo alcance aparece como um alargamento espectral assimétrico para o lado de baixas energias das linhas de ressonância. Esta assimetria é comparada com cálculos teóricos das curvas de potencial assintóticas para os pares de átomos interagentes, mostrando uma boa concordância dos resultados experimentais com as previsões teóricas. Para estados de Rydberg nd, com número quântico principal n≈13, um estudo detalhado da dependência do alargamento com a intensidade do laser de excitação e para diferentes densidades atômicas foi realizado. A observação de uma fraca dependência da intensidade do sinal com a densidade atômica sugere uma supressão da excitação coerente, e/ou a participação de outros processos de decaimento. Para os estados de Rydberg np, com n≈12 , observamos um comportamento distinto para o dubleto de estrutura fina, P 1/2 e P 3/2. Enquanto as linhas P 3/2 apresentam um alargamento assimétrico e uma fraca dependência com a densidade atômica, semelhante ao observado para as linhas nd, as linhas P 1/2, permanecem estreitas e apresentam uma dependência diferenciada com a densidade atômica. Nossos experimentos, usando vapor de Rb com alta densidade atômica e um processo não linear coerente, podem ser vistos como proposta de uma técnica não destrutiva para investigar interação de longo alcance e suas possíveis aplicações em informação quântica

Agradecimentos: The authors thank Joao Batista Rodrigues, from the Quantum Electronics Department machine shop, for his support and excellent work, and Luis E. E. de Araujo for discussions. L. S. Cruz acknowledges a post doctoral fellowship from FAPESP. F. C. Cruz (flavio@ifi.unicamp.br) acknowledges the financial support of FAPESP, CEPOF, CNPq, and AFOSR Abstract: We report on continuous-wave second harmonic generation of near infrared Ti: sapphire lasers using room temperature critically phasematched, angle-tuned BIBO ( bismuth triborate, BiB3O6) crystals, placed both in an external power enhancement cavity and inside the laser resonator. In the first case we generate 70 mW of single-frequency radiation at 423 nm for 330 mW of input power at 846 nm. For intracavity frequency doubling we achieve 690 mW at 423 nm for 7.3 Watts of the Ti: sapphire laser pump power at 532 nm, representing a conversion efficiency of 9.5% from 532 to 423 nm. These tunable blue-violet systems are particularly attractive for laser cooling and trapping of alkaline-Earth atoms FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Aberto

Agradecimentos: This work was supported by FAPESP, CNPq, and CAPES, Brazilian government agencies. We would like to thank Jim Bergquist for many of the design concepts used by us and for the continuing assistance and support; V.S. Bagnato, L.G. Marcassa, and S.C. Zilio for supplying Ti:Al2O3, a TGG crystal, and the mirrors from the University of São Carlos Optics Workshop (Brazil); Nelson B. Sales, Jorge L. Pires, Antônio J. Polaquini, and João B. Rodrigues for the mechanical parts Autor: We describe in detail the design, construction, and characterization of an efficient frequency doubled and stabilized all-solid-state Ti:sapphire laser. The laser frequency has been locked to the resonance of a Fabry-Perot cavity, and doubled in a Brewster-cut potassium niobate crystal placed inside a power enhancement cavity. Up to 200 mW of single frequency blue light with fast frequency instabilities of 40-kHz rms and a drift of 10 MHz/hour has been generated. The spectral distributions of amplitude and frequency noise for the free-running laser have been measured and compared with the case of pumping from an argon ion laser. Our laser is well suited in atomic physics for high resolution spectroscopy and for laser cooling and trapping using transitions in the blue-violet region, as we demonstrate with the calcium resonant transition, at 423 nm FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES Fechado

Estudamos efeitos ópticos não-lineares em vapores alcalinos, quando níveis de Rydberg estão envolvidos como estados intermediários, quase ressonantes, em processos como: mistura de quatro ondas (MQO), absorção de dois fótons, geração de soma (SF) e diferença de freqüência (DF). Analisamos um processo de MQO, com transições de dois fótons envolvendo níveis de Rydberg do átomo de rubídio, e observamos franjas de interferência no sinal não linear. Neste estudo, mostramos que é possível ter um controle coerente sobre os múltiplos caminhos quânticos acessíveis ao sistema atômico, explorando a dependência do sinal não linear com a polarização dos feixes incidentes. Medimos a visibilidade das franjas observadas e obtivemos valores de 100% para o contraste da interferência, na ressonância de dois fótons com um nível de Rydberg. Os resultados experimentais apresentam um bom acordo com cálculos teóricos, baseados no formalismo da matriz densidade aplicado a um sistema atômico de quatro níveis. A distribuição de população para um átomo de quatro níveis foi calculada no regime estacionário, resolvendo as equações da matriz densidade em ordens superiores nos campos incidentes. Mostramos que uma interferência entre os caminhos quânticos de excitação de um estado atômico pode levar ao cancelamento ou ao aumento da população desse nível, dependendo das polarizações dos lasers incidentes. Estudamos também efeitos transientes, resolvendo a equação de Schrödinger dependente do tempo para um sistema de três níveis na configuração V, e previmos a ocorrência de oscilações de Rabi de dois fótons, e batimentos quânticos nas populações do sistema atômico. Finalmente, medimos pela primeira vez a geração da DF em uma amostra de rubídio em alta densidade, através de um processo proibido por dipolo elétrico, envolvendo níveis de Rydberg. Utilizando o modelo do campo elétrico estático, induzido por fotoionização, como um mecanismo de quebra de simetria, desenvolvemos cálculos teóricos que permitiram prever a forma espacial do sinal não linear gerado, e comparar com os resultados existentes na literatura para a geração de segundo harmônico em vapores atômicos

Agradecimentos: We thank Professor R. K. Chang for providing information about electrolytic cycling on Au and Cu. This work was supported by the Division of Materials Sciences, Office of Basic Energy Sciences, U. S. Department of Energy under Contract No. W-7405-ENG-48. One of us (A.R.B.d.C.) acknowledges support from Universidade Estadual de Campinas and Conselho Nacicnal de Pesquisas, Brazil Abstract: Second-harmonic generation at a silver-air interface was enhanced by a factor of 104 by surface roughness. The local-field enhancement is believed to be responsible for the effect. An unusually broad luminescence background extending far beyond the anti-Stokes side of the second harmonic was also observed CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Aberto