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Orientadores: Aline Carvalho da Costa, Walter van Gulik e José Geraldo da Cruz Pradella Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química e Universidade Técnica de Delft Resumo: Trichoderma harzianum P49P11 foi selecionado entre diversos micro-organismos no Laboratório Nacional de Biorenováveis (LNBR) e foi considerado promissor para a produção de celulase. Neste projeto, um modelo matemático e plataformas de simulação foram desenvolvidos como ferramentas para maximizar a produção de celulase no modo batelada alimentada (Capítulo 2). Estratégias de alimentação foram simuladas para maximizar a produção de celulase, inicialmente usando apenas celulose como substrato, em seguida, usando glicerol para crescimento celular e celulose para produção de celulase. Embora o modelo matemático e as plataformas de simulação foram construídos para uma cepa selvagem, essas ferramentas ajudam a prever dados e podem ser adaptadas para micro-organismos otimizados. O Capítulo 3 avalia a produção contínua de enzimas usando diferentes fontes de carbono em condições limitadas de carbono. Verificou-se que a glicose proporcionou uma influência positiva na produção de enzimas que podem catalisar a hidrólise do p-nitrofenil-?-D-glicopiranosídeo (PNPGase). A sacarose e a frutose parecem inibir a síntese da PNPGase, no entanto, esses substratos também podem ter uma influência positiva na síntese de outras enzimas que não foram avaliadas neste projeto. As células podem consumir glicose sem a necessidade de sintetizar enzimas extracelulares como a PNPGase. O aumento da produção de PNPGase durante a cultura contínua usando glicose como fonte de carbono indica a presença de indutores. A presença de polissacarídeos foi confirmada no sobrenadante de todas as condições usando glicose, frutose/glicose e sacarose (Capítulo 4 e Capítulo 5). Isto sugere que os possíveis indutores podem ter vindo de fragmentos dos polissacarídeos extracelulares. A análise de açúcares sugeriu a presença da gentiobiose no sobrenadante das condições usando glicose como fonte de carbono. Esse dissacarídeo pode ser um fragmento de polímeros liberados da parede celular. Gentiobiose pode ter atuado como um indutor de enzimas. Além disso, também foi proposto um mecanismo para a produção contínua de PNPGase em condições limitadas de glicose, assumindo que a PNPGase inclui beta-glicosidase (Capítulo 4). As fontes de carbono utilizadas em condições de carbono limitado influenciaram a produtividade da PNPGase e, possivelmente, todo o coquetel enzimático secretado pelo fungo. Por esse motivo, foram realizadas análises proteômica por shotgun e SDS-PAGE para as proteínas presentes no sobrenadante das condições, usando glicose, frutose/glicose e sacarose (Capítulo 4). A análise proteômica sugeriu que as diferentes fontes de carbono utilizadas proporcionaram a produção de diferentes proteínas extracelulares, incluindo diversas proteínas não caracterizadas. Isso traz a possibilidade de criar uma hipótese de que diferentes fontes de carbono, facilmente assimiláveis ??pelas células, podem levar à síntese de diferentes indutores (fragmentos de polissacarídeos extracelulares), que podem induzir a síntese de diferentes enzimas em condições limitadas de carbono. Polissacarídeos extracelulares foram os subprodutos descobertos neste projeto durante a produção de enzimas em condições limitadas de carbono. O comportamento dos metabólitos intracelulares (glicólise, ciclo do ácido cítrico, via das pentoses fosfato e nucleotídeos) foi avaliado em quatro condições diferentes em duplicata durante a produção de polissacarídeos extracelulares por Trichoderma harzianum em condições limitadas de carbono (Capítulo 5). Este capítulo forneceu o primeiro passo para a otimização da produção de polissacarídeos extracelulares e as informações sobre o comportamento dos metabólitos intracelulares usando essa cepa selvagem são essenciais para o desenvolvimento de cepas ótimas Abstract: Trichoderma harzianum P49P11 was selected among several other microorganisms at the Biorenewables National Laboratory (LNBR, Brazil) and it was considered a promising strain to produce cellulase. Here in this project, a mathematical model and simulation platforms were developed as potential tools to be used for cellulase maximization using fed-batch mode (Chapter 2). Feeding strategies were simulated to maximize cellulase production, at first, only using cellulose as the substrate, and then using glycerol for cell growth and cellulose for cellulase production. Although the mathematical model and simulation platforms were built up for a wild type strain, these tools help to predict data and they can be adapted for optimized strains. Chapter 3 evaluates the continuous production of enzymes using different carbon sources under carbon-limited conditions. It was found that glucose has a positive influence on the production of enzymes that can catalyse the hydrolysis of p-nitrophenyl-?-D-glucopyranoside (PNPGase). Sucrose and fructose seem to inhibit PNPGase synthesis; however, these substrates could also have a positive influence on the synthesis of other enzymes not evaluated in this project. Cells can uptake glucose without the need to synthesize extracellular enzymes like PNPGase. The increase in the production of PNPGase during the continuous culture using glucose as the carbon source indicates the presence of inducers. It was also discovered in this project that polysaccharides were present in the supernatant of all conditions using glucose, fructose/glucose and sucrose (Chapter 4 and Chapter 5). This suggests that the possible inducers could have come from fragments of the extracellular polysaccharides. Sugar analysis showed the presence of sugar with the same retention time as gentiobiose in the supernatant of the conditions using glucose as the carbon source, which could be a fragment from polymers released from the cell wall. Gentiobiose could be acting as an inducer of enzymes. In addition, a mechanism was also proposed for continuous PNPGase production under glucose-limited conditions assuming that PNPGase includes beta-glucosidase (Chapter 4). The carbon sources used under carbon-limited conditions influenced the PNPGase productivity and possibly the whole enzymatic cocktail secreted by the fungus. For this reason, shotgun proteomics and SDS-PAGE analysis were performed for the proteins present in the supernatant of the conditions using glucose, fructose/glucose and sucrose (Chapter 4). The shotgun proteomics analysis suggested that the different carbon sources used provided the production of different extracellular proteins including several uncharacterized proteins, which can also include different enzymes. This brings the possibility of creating a hypothesis that different carbon sources easily assimilated by the cells could lead to the synthesis of different inducers (fragments of extracellular polysaccharides), which could induce the synthesis of different enzymes under carbon-limited conditions. Extracellular polysaccharides were the by-products discovered in this project during the production of enzymes under carbon-limited conditions. The behaviour of intracellular metabolites (glycolysis, citric acid cycle, pentose phosphate pathway and nucleotides) was evaluated under four different conditions in duplicate during the production of extracellular polysaccharides by Trichoderma harzianum under carbon-limited conditions (Chapter 5). This chapter has provided the first step for the optimization of the production of extracellular polysaccharides and the information about the behaviour of intracellular metabolites using this wild type strain is essential to the development of optimal strains Doutorado Engenharia Química Doutor em Engenharia Química FAPESP 2014/22537-9 CNPQ 142478/2014-8