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Two major proteins, a-sarcin and an antifungal polypeptide AFP , are secreted by the mould Ž . Aspergillus giganteus MDH 18894 when it is cultured for 70–80 h. A third major protein is also found in the extracellular medium at 48–60 h, but it disappears as the culture proceeds. This protein has been isolated and characterized in terms of apparent molecular mass, electrophoretic and chromatographic behaviour, NH -terminal primary structure, amino acid content, spectroscopical 2 features, reactivity against anti-AFP antibodies, and antifungal activity. Based on the obtained results it would be an extracellular inactive precursor form of AFP, designated as the large form of AFP lf-AFP . Its amino acid composition is Ž . identical to that of AFP but containing six extra residues. NH -terminal sequence analysis of the first eight amino acid 2 residues of this polypeptide revealed that the extra residues can be perfectly accommodated within the DNA-deduced sequence of the precursor form of AFP. Its alignment with precursor sequences of different proteins, secreted by a variety of Aspergillus spp., reveals the existence of a common tetrapeptide at the carboxy-terminal end of their leader peptides. This sequence would be IlerLeu-Xaa-Yaa-Arg, being mostly Xaa and Yaa an acid residue Asp Ž . rGlu and alanine, respectively. The presence of lf-AFP as an extracellular protein would be in perfect agreement with the existence of this tetrapeptide motif, that can be involved in the protein secretion mechanisms of filamentous fungi., Depto. de Bioquímica y Biología Molecular, Fac. de Ciencias Químicas, TRUE, pub

Las proteínas formadoras de poros (PFP) son una familia de toxinas capaces de matar células por choque osmótico, precisamente porque forman poros en sus membranas. En disolución acuosa, estas proteínas permanecen plegadas y estables. Al interactuar con un receptor específico de la membrana (proteína, lípido o azúcar), se unen a ella, oligomerizan y forman un poro a través del núcleo hidrófobo de la membrana. Las actinoporinas son α-PFPs producidas por anémonas marinas como parte de su cóctel venenoso. Son pequeñas (≈ 20 kDa) y suelen tener un punto isoeléctrico básico ( ≈ 9). Comparten un motivo conformacional común, caracterizado por un sándwich β flanqueado por dos hélices α. Su receptor de membrana específico es la esfingomielina. Cuando las actinoporinas se unen a una membrana que contiene este esfingolípido, extienden su segmento helicoidal N-terminal, oligomerizan y forman un poro selectivo de cationes, insertando sus hélices α del extremo N-terminal a través del núcleo de la membrana. Sin embargo, el orden específico de las etapas que conducen a la formación del poro, así como la naturaleza de posibles estados intermedios, o su estequiometría final, todavía son objeto de debate. Estas actinoporinas constituyen además familias multigénicas: una sola especie produce una variedad de toxinas similares que no necesariamente muestran una actividad lítica o una especificidad idénticas. Debido a su simplicidad, son un modelo apropiado para estudiar la todavía no bien comprendida transición de una proteína soluble en agua a un estado en el que se integra en membrana...

Immunotoxins are chimeric molecules that combine the specificity of an antibody to recognize and bind tumor antigens with the potency of the enzymatic activity of a toxin, thus, promoting the death of target cells. Among them, RNases-based immunotoxins have arisen as promising antitumor therapeutic agents. In this work, we describe the production and purification of two new immunoconjugates, based on RNase T1 and the fungal ribotoxin α-sarcin, with optimized properties for tumor treatment due to the inclusion of a furin cleavage site. Circular dichroism spectroscopy, ribonucleolytic activity studies, flow cytometry, fluorescence microscopy, and cell viability assays were carried out for structural and in vitro functional characterization. Our results confirm the enhanced antitumor efficiency showed by these furin-immunotoxin variants as a result of an improved release of their toxic domain to the cytosol, favoring the accessibility of both ribonucleases to their substrates. Overall, these results represent a step forward in the design of immunotoxins with optimized properties for potential therapeutic application in vivo.

El establecimiento de interacciones biológicas entre organismos conlleva en multitud de ocasiones la producción de toxinas de todo tipo. De entre todas estas toxinas destacan, por su potencia, las ribotoxinas. Esta familia de ribonucleasas fúngicas se ha estudiado con detalle desde su descubrimiento a principios de los años 60. Las primeras que se describieron, como la ‐sarcina,están producidas por hongos del género Aspergillus, aunque también se han encontrado en otras especies como el hongo entomopatógeno Hirsutella thompsonii que produce la hirsutelina A (HtA). La estructura tridimensional de varias de estas ribotoxinas se conoce con resolución atómica, y el análisis mutacional ha permitido asignar a diferentes residuos papeles concretos, como su implicación en la catálisis, el reconocimiento del ribosoma o la interacción con membranas. Su elevada especificidad reside en su capacidad para hidrolizar un único enlace fosfodiester de una estructura conservada de rRNA que se conoce como el lazo de sarcina‐ricina (SRL) y que, localizado en la subunidad mayor del ribosoma, juega un papel esencial durante la traducción. El corte de este enlace inhibe la biosíntesis de proteínas y produce la muerte celular. AEl establecimiento de interacciones biológicas entre organismos conlleva en multitud de ocasiones la producción de toxinas de todo tipo. De entre todas estas toxinas destacan, por su potencia, las ribotoxinas. Esta familia de ribonucleasas fúngicas se ha estudiado con detalle desde su descubrimiento a principios de los años 60. Las primeras que se describieron, como la ‐sarcina,están producidas por hongos del género Aspergillus, aunque también se han encontrado en otras especies como el hongo entomopatógeno Hirsutella thompsonii que produce la hirsutelina A (HtA). La estructura tridimensional de varias de estas ribotoxinas se conoce con resolución atómica, y el análisis mutacional ha permitido asignar a diferentes residuos papeles concretos, como su implicación en, Fungi establish a complex network of biological interactions with other organisms in nature. In many cases, these involve the production of toxins. Among these toxins, ribotoxins stand out as promising candidates for their use in biotechnological applications. This family of fungal ribonucleases has been thoroughly studied since their discovery in the 1960's. The first ones to be discovered, like ‐ sarcin, were produced by Aspergillus, although they have also been found in other species like the entomopathogenic fungus Hirsutella thompsonii which produces Hirsutellin A (HtA). The structure of several ribotoxins is already known at atomic resolution and mutational studies have assigned specific roles to specific residues, like their implication in catalysis, ribosome recognition or interaction with membranes. Ribotoxins are highly specific, capable of hydrolyzing a single phosphodiester bond of a rRNA conserved structure known as the sarcin‐ricin loop (SRL), located in the large ribosome subunit and essential for translation. Cleavage of this specific bond inhibits protein biosynthesis and leads to cell death. Furthermore, toxicity of ribotoxins also depends on their ability to cross lipid membranes which lipid composition is important for their specificity, being more efficient on transformed or virus‐infected cells. Moreover, there must be specific interactions with ribosome regions that lead them to the SRL, some of them have already been previously proposed...

El establecimiento de interacciones biológicas entre organismos conlleva en multitud de ocasiones la producción de toxinas de todo tipo. De entre todas estas toxinas destacan, por su potencia, las ribotoxinas. Esta familia de ribonucleasas fúngicas se ha estudiado con detalle desde su descubrimiento a principios de los años 60. Las primeras que se describieron, como la ‐sarcina,están producidas por hongos del género Aspergillus, aunque también se han encontrado en otras especies como el hongo entomopatógeno Hirsutella thompsonii que produce la hirsutelina A (HtA). La estructura tridimensional de varias de estas ribotoxinas se conoce con resolución atómica, y el análisis mutacional ha permitido asignar a diferentes residuos papeles concretos, como su implicación en la catálisis, el reconocimiento del ribosoma o la interacción con membranas. Su elevada especificidad reside en su capacidad para hidrolizar un único enlace fosfodiester de una estructura conservada de rRNA que se conoce como el lazo de sarcina‐ricina (SRL) y que, localizado en la subunidad mayor del ribosoma, juega un papel esencial durante la traducción. El corte de este enlace inhibe la biosíntesis de proteínas y produce la muerte celular. AEl establecimiento de interacciones biológicas entre organismos conlleva en multitud de ocasiones la producción de toxinas de todo tipo. De entre todas estas toxinas destacan, por su potencia, las ribotoxinas. Esta familia de ribonucleasas fúngicas se ha estudiado con detalle desde su descubrimiento a principios de los años 60. Las primeras que se describieron, como la ‐sarcina,están producidas por hongos del género Aspergillus, aunque también se han encontrado en otras especies como el hongo entomopatógeno Hirsutella thompsonii que produce la hirsutelina A (HtA). La estructura tridimensional de varias de estas ribotoxinas se conoce con resolución atómica, y el análisis mutacional ha permitido asignar a diferentes residuos papeles concretos, como su implicación en

Actinoporins are water-soluble proteins with the ability to form pores upon insertion into biological membranes. They constitute a family of proteins with high degree of sequence identities but different hemolytic activities, suggesting that minor conformational arrangements result in major functional changes. A good example of this situation is the sea anemone Stichodactyla helianthus which produces two very similar actinoporins, sticholysins I (StnI) and II (StnII), but of very different hemolytic efficiency. Within this idea, given that the high resolution three-dimensional structure of StnII is already known, we have now solved that one corresponding to StnI in order to analyze the influence of particular residues on the conformation and activity of these proteins. In addition, random mutagenesis has been also used to produce five less hemolytic variants of StnI. All these mutations map to functionally relevant regions because they are probably involved in conformational changes associated with pore formation, which take place after membrane binding, and involve long-distance rearrangements of the polypeptide chain of actinoporins., Ministerio de Ciencia e Innovación, Depto. de Bioquímica y Biología Molecular, Fac. de Ciencias Químicas, TRUE, pub