Search

La citocinesi és el darrer procés regulat del cicle de divisió cel·lular mitòtica eucariota. Les cèl·lules entren en citocinesi un cop la segregació dels cromosomes s’ha completat satisfactòriament. Durant la citocinesi les cèl·lules es separen físicament, donant lloc a dues cèl·lules filles. Els defectes en el control de la citocinesi donen lloc a aneuploïdies i inestabilitat genòmica. Un controlador clau de la citocinesi és l’activitat Quinasa Dependent de Ciclina (M-Cdk1). El nostre projecte deriva de la correlació observada entre l’entrada en citocinesi i l’eliminació de l’activitat M-Cdk1. Complementària a aquesta observació, l’expressió d’un al·lel hiper-estable de la ciclina mitòtica Clb2 bloca la citocinesi. Per tant, la mateixa activitat que empeny les cèl·lules a entrar en mitosi i que hi promou l’anafase, impedeix que la citocinesi pugui iniciar-se prematurament. Aquestes observacions suggereixen que una o més proteïnes, essencials per disparar la citocinesi, són inhibides per fosforilació per MCdk1. La identitat d’aquest/s substrat/s crític/s és desconeguda. Per tant, l’objectiu d’aquesta tesi ha estat el d’avançar en la comprensió de com l’activitat M-Cdk1 evita la citocinesi prematura durant l’anafase, a l’organisme eucariota model Saccharomyces cerevisiae. El treball realitzat revela que, en presència dominant d’activitat M-Cdk1 elevada, la Xarxa de Sortida de Mitosi (Mitotic Exit Network, MEN) està, contra tot pronòstic, parcialment activada en presència d’activitat M-Cdk1 elevada i dominant, i és la responsable de l’alliberament de la fosfatasa Cdc14 al citoplasma en aquestes condicions., Cytokinesis is the final regulated process in the eukaryotic mitotic cell division cycle. Cells enter cytokinesis once that chromosome segregation is satisfactorily completed. During cytokinesis cells physically separate, giving place to two daughter cells. Defects in the control of cytokinesis result in aneuploidies and genomic instability. A key controller of cytokinesis is the mitotic Cdk1 (M-Cdk1) activity. Our project derives from the observed correlation between the onset of cytokinesis and the termination of M-Cdk1 activity. Complementary to such observation, expression of a hyperstable allele of the mitotic cyclin Clb2, blocks cytokinesis. Thus, the very same activity that pushes cells into mitosis and promotes mitotic entry and anaphase, blocks the occurrence of premature cytokinesis. These observations suggest that one or more proteins, essential to trigger cytokinesis, are inhibited by M-Cdk1 phosphorylation. The identity of such critical M-Cdk1 substrate/s is unknown. Therefore, the goal of this thesis is to gain insight on how M-Cdk1 prevents premature cytokinesis during anaphase in the model eukaryotic organism Saccharomyces cerevisiae. The thesis work reveals that the Mitotic Exit Network is unexpectedly partially activated in the presence of prevailing high M-Cdk1 activity, and drives the release of the Cdc14 phosphatase to the cytoplasm under such conditions.

A les cèl·lules eucariotes el checkpoint de la fase S, un dels mecanisme de vigilància de la cèl·lula, respon a agressions genotòxiques per protegir la integritat genòmica. Com a part de la resposta a estrès replicatiu i dany al DNA, aquest checkpoint impedeix el pas a mitosi fins que l’agressió hagi estat superada, evitant així la inestabilitat genòmica conseqüència de la segregació de cromosomes danys o que no han acabat de ser replicats. El cicle cel·lular i els seus mecanisme de control, com el checkpoint de la fase S, han estat identificats i estudiats inicialment en organisme model com Schizosaccharomyces pombe (llevat de fissió) i Saccharomyces cerevisiae (llevat de gemmació). Cal tenir present que els mecanismes identificats i els factors implicats en els organisme model són conservats en humans. En el llevat de fissió, l’entrada a mitosi en presència d’estrès genotòxic és impedida per la fosforilació inhibitòria de la tirosina 15 de Cdk1 per Wee1. Cdk1 és la única quinasa encarregada de dirigir la cèl·lula a través del cicle cel·lular en llevat de fissió i gemmació. En canvi, en llevat de gemmació, Swe1, l’ortòleg de Wee1, i la fosforilació de la tirosina 19 de Cdk1 semblen ser totalment prescindibles en el control de l’entrada a mitosi en presència d’estrès genotòxic. El model actual en llevat de gemmació pel control de la mitosi en presència d’estrès genotòxic contempla com a únic punt de control l’estabilització de Pds1/Securina, evitant així l’activació de Esp1/Separasa que promou el tall de la cohesina que manté unides les cromàtides germanes. En humans, malgrat Wee1 i la seva fosforilació inhibitòria sobre Cdk1 es conserven, no són suficients per impedir totalment l’entrada a mitosis en una fase S compromesa per estrès genotòxic. Els nostres resultats mostren que en Saccharomyces cerevisiae, l’activitat Cdk1 que dirigeix la mitosi està inhibida en presència d’estrès genotòxic. La dispensabilitat de Swe1 i de la fosforilació de la tirosina 19 de Cdk1 s’explica per que l’activitat Cdk1 mitòtica és inhibida, en aquestes condicions, de forma redundant per Swe1 i Rad53, la quinasa efectora del checkpoint de fase S. A més, hem observat que Swe1 està controlada pel checkpoint de la fase S en aquestes condicions. Tanmateix, en presència d’estrès genotòxic, les cèl·lules amb l’activitat Cdk1 mitòtica desregulada o nul·les per Pds1/Securina, segueixen essent competents per impedir la mitosi. Ara bé, quan el control redundant de l’activitat Cdk1 de fase M (necessària per l’elongació del fus mitòtic) és combinant amb la deleció de Pds1/Securina, les cèl·lules són incapaces d’evitar la segregació dels cromosomes no acabats de replicar o danyats., The S phase checkpoint is a surveillance mechanism in eukaryotic cells that preserve genomic integrity in response to genotoxic insults. This checkpoint inhibits mitosis onset till the stress has been solved, avoiding genomic instability that results from the segregation of damaged or not fully replicated chromosomes. Eukaryotic cell cycle and its regulation mechanisms, like the S phase checkpoint, have been initially identified and studied in model organisms like Schizosaccharomyces pombe (fission yeast) and Saccharomyces cerevisiae (budding yeast) and these mechanisms and factors are conserved in humans. Mitosis control in fission yeast in the presence of replication stress relies on the inhibition of mitotic Cdk1 through tyrosine 15 Wee1 mediated phosphorylation. However, in budding yeast, Wee1 ortholog Swe1 and its phosphorylation over Cdk1, seems unnecessary in this control. The present model for budding yeast control of mitosis in the presence of DNA damage relies on the stabilization of Pds1/securin. This chaperone inhibits Esp1/separase which cleaves cohesin, the protein that keeps sister chromatids together. In humans, Wee1 and its phosphorylation over Cdk1 are conserved but they are not enough to inhibit mitotic Cdk1 activity and completely avoid mitosis onset in the presence of genotoxic stress. Our results show that in budding yeast, mitotic Cdk1 is inhibited in the presence of genotòxic stress. Swe1 dispensability is explained by a redundant mechanism regulating mitotic Cdk1 mediated by Swe1 and Rad53, the effector kinase of the S phase checkpoint. Moreover, Swe1 levels stabilization in the presence of genotoxic stress is mediated by the S phase checkpoint. Mitotic Cdk1 deregulation or pds1Δ is not enough to observe DNA segregation in the presence of genotoxic stress. Only cells that cannot regulate mitotic Cdk1 activity together with pds1Δ are able to segregate not fully replicated or damaged chromosomes.

Les quinases dependents de ciclina (CDKs) dirigeixen la progressió del cicle cel·lular a les cèl·lules eucariotes. A l’organisme eucariota model Saccharomyces cerevisiae (llevat de gemmació) una sola quinasa dependent de ciclina, Cdk1, és essencial i suficient per dirigir el cicle cel·lular. Unida alternativament a ciclines de fase G1, S i G2/M, Cdk1 regula els programes transcripcionals del cicle cel·lular, la replicació i segregació dels cromosomes, la dinàmica del fus mitòtic, el creixement cel·lular polar, la morfogènesi, etc. La desregulació de l’activitat CDK promou la proliferació descontrolada i la inestabilitat genòmica. Donada la seva funció essencial en la progressió del cicle cel·lular, Cdk1 és estretament regulada per proteïnes associades (les ciclines, Cks1, i inhibidors de les CDKs –CKIs) i per modificacions post-traduccionals. Tanmateix, molts detalls de la regulació de Cdk1 romanen desconeguts, com és el cas de com les activitats CDK de fase G1 o de fase M són inhibides en resposta a determinats estressos cel·lulars. Quan la progressió del cicle cel·lular és amenaçada per la presència d’estressos genotòxics tals com l’estrès replicatiu o la presència de dany al DNA, un mecanisme de vigilància, l’anomenat checkpoint de la fase S, s’activa per tal de protegir la integritat del genoma. Al llevat de gemmació, el checkpoint de la fase S és mediat per la quinasa Mec1 (ATR/ATM a humans) i la seva quinasa efectora Rad53 (Chk2 a humans). Per explorar si la quinasa efectora Rad53 regula Cdk1 en resposta a estrès genotòxic, hem explorat dues qüestions principals: (1) la fosforilació de Cdk1 per Rad53 i (2) la regulació per Rad53 de proteïnes associades a Cdk1. Pel que fa a la primera qüestió, aprofitant un assaig quinasa in vitro amb Rad53, mostrem que Cdk1 és fosforilat directament per Rad53. Hem identificat proteòmicament dos llocs de Cdk1 (Ser46, Ser258) fosforilats per Rad53 in vitro. Les cèl·lules dirigides per l’al·lel no-fosforilable (Cdk1-2A) mostren un fenotip wee, compatible amb una activitat CDK incrementada/desregulada. Les cèl·lules dirigides per l’al·lel fosfomimètic (Cdk1-2E) són allargades i més grans que les cèl·lules silvestres, compatible amb una activitat CDK reduïda. A més, assignem i quantifiquem les diferents formes fosforilades de Cdk1 in vivo mitjançant electroforesi Phos-tag. Respecte la segona qüestió, hem identificat proteòmicament proteïnes associades a Cdk1 en presència d’estrès replicatiu en forma dependent de Rad53. Hem estudiat en detall el producte del gen de funció desconeguda YPL014W, que bategem Cip1 (per Cdk1 Interacting Protein 1), que obté la puntuació més alta en l’anàlisi. Les nostres dades mostren que Cip1 és una proteïna regulada al llarg del cicle cel·lular. A més, l’abundància de Cip1 s’incrementa en forma dependent de Rad53 en presència d’estrès replicatiu. La sobre-expressió de Cip1 bloqueja les cèl·lules a fase G1 i estabilitza el CKI de fase S Sic1 in vivo. A més, Cip1 interacciona específicament amb el complex de fase G1 Cln2-Cdk1, però no amb el complex de fase S Clb5-Cdk1 or el de fase M Clb2-Cdk1. Cip1 inhibeix l’activitat Cln2-CDK tant in vivo com in vitro. Els nostres resultats suggereixen que Cip1 pot ser un nou CKI de l’activitat CDK de fase G1., Cyclin dependent kinases are drive cell division cycle progression in eukaryotic cells. In the model eukaryotic organism Saccharomyces cerevisiae (budding yeast) a single Cyclin Dependent Kinase, Cdk1, is essential and sufficient to drive the cell cycle. Alternately bound to G1, S and G2/M phase cyclins, Cdk1 regulates cell cycle transcriptional programs, chromosome replication and segregation, spindle dynamics, polarized cell growth, morphogenesis, etc. Misregulated CDK activity induces unscheduled proliferation as well as genomic instability. Given its essential function in cell cycle progression, Cdk1 is tightly regulated by binding partners (cyclins, Cks1 and Cyclin dependent Kinase Inhibitors -CKIs) and post-translational modifications. However, many details on Cdk1 regulation remain unknown, such as how G1 or mitotic CDK activities are inhibited in response to challenging conditions. When the cell cycle progression is challenged by genotoxic stress such as DNA replication stress or DNA damage, a surveillance mechanism, the S phase checkpoint is activated to protect the integrity of the genome. In the budding yeast the S phase checkpoint is mediated by the Mec1 kinase (ATR/ATM in humans) and its downstream effector kinase Rad53 (Chk2 in humans). To explore whether the effector kinase Rad53 regulates Cdk1 in response to genotoxic stress, we have been exploring two main avenues: (1) Cdk1 phosphorylation by the S phase checkpoint effector kinase Rad53 and (2) Rad53 dependent regulation of Cdk1 associated factors. With respect to the first question, taking advantage of a Rad53 in vitro kinase assay, we show that recombinant Cdk1 is directly phosphorylated by Rad53. We also proteomically identified two sites of Cdk1 (Ser46, Ser258) phosphorylated by Rad53 in vitro. Cells carrying the non-phosphorylatable Cdk1 allele (Cdk1-2A) display a wee phenotype, compatible with increased/unrestrained CDK activity. Cells carrying the phosphomimetic Cdk1 allele (Cdk1-2E) are elongated and larger in size than wild type cells. Moreover, we also assign and quantify the different phosphorylation forms of Cdk1 in vivo using Phos-tag electrophoresis technology. With respect to the second question, we have proteomically identified proteins associated with Cdk1 in the presence of replication stress in a Rad53 dependent manner. The product of the unknown function gene YPL014W, which we name Cip1 (for Cdk1 Interacting Protein 1), with the highest score, is further studied. Our data shows that Cip1 is a cell cycle regulated protein. In addition, the abundance of Cip1 increases in a Rad53 dependent manner upon DNA replication stress. Overexpression of Cip1 blocks cells in G1 and stabilizes the S-phase-Cdk1 inhibitor Sic1 in vivo. Moreover, Cip1 specifically interacts with G1 phase Cln2-Cdk1 but not with S phase Clb5-Cdk1 or M phase Clb2-Cdk1. Cip1 inhibits Cln2-CDK activity both in vivo and in vitro. Our finding suggests that Cip1 may be a novel CKI of G1 phase CDK activity.

Progression through the cell cycle is directed by cyclin dependent kinases (CDKs), which are essential for normal and cancer cell proliferation. CDKs are activated by association with cyclins specific to each cell cycle phase (G1, S, G2, and M). Thus, CDK associated with G1 phase cyclins promote the expression of proteins necessary for DNA replication, but is unable to activate it. CDK associated with S phase cyclins, in turn, triggers the activation of chromosomal origins of replication, but is unable to promote chromosome condensation and segregation of sister chromatids, which is carried out by CDK associated with mitotic cyclins. Despite the essential role of CDKs in cell cycle progression, how the different cyclins promote specifically the various processes of the cell cycle was still an open question by the time this thesis was initiated. Since the discovery of cyclins by Nobel laureate Tim Hunt [Evans et al. (1983) Cell 33:389] it was assumed that cyclins confer substrate specificity. However, later on, fellow Nobel laureate Paul Nurse proposed an alternative quantitative model, [Stern & Nurse (1996) Trends Genet 12:345], based on the observation that successive waves of cyclins result in increased levels of CDK activity. While low levels of activity (CDK associated with G1 cyclins) are sufficient promote progression through the G1 phase and start the pro-S phase transcription program, would be unable to trigger replication. Moderate levels of activity (CDK associated with S phase cyclins) would be able to activate replication but not mitosic events, which would require the high CDK activity associated with M phase cyclins. If correct, the quantitative model should fulfill two predictions, but only one was demonstrated by the Nurse lab. Eukaryotic unicellular yeast cells are able to survive with a single mitotic cyclin, which is notwithstanding able to orderly drive the cell through the different cell cycle phases [Fisher & Nurse (1996) EMBO J 15:850]. Therefore M-CDK activity is able to promote the previous phases of the cycle in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe However, if a purely quantitative mechanism applies, the complementary prediction should be true as well: an early cyclin to be able to trigger later events if expressed at levels high enough. To test such prediction we generated a budding yeast Saccharomyces cerevisiae strain carrying a G1 cyclin G1 resistant to degradation, under a strong inducible promoter, and fused to a nuclear localization signal. Our results show that one such cyclin is capable of firing chromosome replication conditions in which the S phase cyclins, G2 and M are suppressed. Therefore, our results support the quantitative model against the requirement of substrate specificity. How eukaryotic cells prevent premature activation of the critical cell cycle processes that lead to genomic instability, seems therefore trust in the regulation of activity levels and limiting the presence of cyclin at specific time and space.