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Los métodos de análisis geoquímico para el estudio de relaciones isotópicas de Sr existentes en la actualidad consisten en procesos que implican una preparación de muestra y separación del Sr del Rb en sala limpia y una posterior detección de la composición isotópica 87Sr/86Sr mediante espectrometría de masas de alta resolución. Cada uno de estos procesos tiene una larga duración en el tiempo. Además, los sucesivos pasos que se deben realizar para la separación del Sr pueden introducir errores e incluso contaminación en las muestras. En la primera parte de la presente Tesis Doctoral se propone una alternativa para la determinación del valor de 87Sr/86Sr en la que la separación del Sr del Rb y de su matriz se realiza en línea mediante el acoplamiento de un sistema de cromatografía de líquidos a un espectrómetro de masas de alta resolución. De esta forma la separación del Sr y su detección se realiza en un único proceso sencillo y rápido que implica un mínimo manejo de la muestra. Posteriormente este método se aplica a dos problemas geoquímicos.

Tesis doctoral con mención internacional

Tesis con mención internacional. Tesis doctoral por el sistema de compendio de publicaciones, El ciclo biogeoquímico del mercurio en el medio ambiente ha recibido considerable atención en las últimas décadas. Los niveles de Hg en la atmósfera siguen aumentando por emisiones naturales, pero especialmente por emisiones antropogénicas, como la quema de combustibles fósiles o la minería de oro artesanal. La transferencia de Hg dentro del ciclo biogeoquímico depende en gran medida de la forma química en que se encuentre. El Hg(II) depositado se transforma en MeHg en el medio acuático, el cual es bioacumulado y biomagnificado a través de la cadena trófica. Los seres humanos están expuestos a este compuesto tóxico debido al consumo de pescado. Además, la exposición ocupacional a mercurio a nivel industrial también requiere de un control. Las agencias de Naciones Unidas, OMS y PNUMA han desarrollado una guía para identificar individuos expuestos a través de concentraciones en sangre, orina y pelo. La complejidad de las muestras y los bajos niveles de concentración en los que se encuentran los compuestos de interés, hace que se utilicen tratamientos de muestra largos y complicados que pueden introducir errores en el resultado final. Por otro lado, el estudio de la biogeoquímica de isótopos estables de Hg se considera una herramienta con un gran potencial para trazar el ciclo del Hg y elucidar las diferentes vías de transformación de este elemento en el medio ambiente. Se sabe que la especiación tiene una gran importancia en la movilidad o en la bioacumulación del Hg. Sin embargo, la mayoría de los estudios de fraccionamiento isotópico se basan en el análisis total de Hg y no en su especiación. La composición isotópica del MeHg sólo se ha evaluado en materiales que se espera que contengan una proporción muy elevada de MeHg en comparación con las demás especies, como es el pescado. El fraccionamiento isotópico del MeHg tiene un gran interés toxicológico ya que aún se desconocen los mecanismos y las vías por las que se origina a nivel medioambiental. Por todo lo dicho anteriormente, la presente Tesis Doctoral desarrolla metodologías analíticas para la determinación de la concentración y el fraccionamiento isotópico de especies de mercurio en muestras biológicas mediante el acoplamiento de la Cromatografía de Gases a distintos espectrómetros de masas. Para ello se han desarrollado y evaluado metodologías de análisis por dilución isotópica con múltiple trazador específico de las especies de Hg, en concentraciones en el rango de ng g-1. Esta metodología desarrollada ha sido aplicada a muestras humanas con el objetivo de determinar las concentraciones de las especies de Hg en sangre, orina y pelo. En el caso del estudio del fraccionamiento isotópico se ha desarrollado una metodología para la medida precisa y exacta de relaciones isotópicas específicas del compuesto en muestras biológicas. Además, se ha desarrollado otra metodología de alta sensibilidad para la medida exacta y precisa de relaciones isotópicas del C del MeHg. Los resultados que permitiría obtener esta metodología centrada en el MeHg, pueden aportar información muy valiosa acerca del origen y transformaciones que experimentan dicha especie química.

Tesis doctoral por el sistema de compendio de publicaciones, El principal objetivo de la Tesis que se presenta es el desarrollo de metodologías analíticas basadas en el uso de compuestos orgánicos enriquecidos isotópicamente para su aplicación en Química Clínica y Metabolómica. En la Química Clínica, el análisis por dilución isotópica y espectrometría de masas (IDMS) es una técnica analítica ampliamente usada para la certificación de materiales de referencia y en ejercicios de intercomparación. Esta técnica se aplica al análisis de compuestos orgánicos utilizando trazadores enriquecidos en varios átomos de 13C, 2H, o 15N y la concentración del analito se obtiene a partir de la construcción de un calibrado metodológico lo que condiciona su aplicación al análisis de rutina. Por tanto, se requieren procedimientos alternativos basados en IDMS que impliquen la eliminación del calibrado con el correspondiente ahorro de coste y tiempo, posibilitando su aplicación en los laboratorios clínicos de rutina y además en los que estén corregidas todas las posibles fuentes de error. En Metabolómica, se necesita una medida exacta y precisa de la distribución isotópica para el estudio tanto de la regulación y comprensión de las rutas metabólicas, como de la biosíntesis de proteínas utilizando compuestos enriquecidos isotópicamente. La medida de la distribución isotópica en la investigación de las rutas metabólicas implica métodos basados en la integración de las áreas de pico de los diferentes isotopólogos o basadas en regresión lineal múltiple en los cuales se tienen que llevar a cabo complejos cálculos matemáticos para la corrección natural del 13C, mientras que en la biosíntesis de proteínas los cálculos implican complejos y tediosos procedimientos matemáticos que requieren el uso de ajustes polinómicos. Por lo tanto se requiere también el desarrollo de metodologías alternativas simples, novedosas, rápidas, exactas y precisas para el campo de la Metabolómica en estudios basados en el empleo de compuestos enriquecidos isotópicamente.

La Dilución Isotópica en línea de Carbono con Espectrometría de Masas se puede definir como el primer detector universal y genérico para cromatografía de gases. La conversión cuantitativa del eluyente cromatográfico a CO2 y la adición de la misma especie enriquecida en 13C como trazador permiten alcanzar el equilibrio isotópico requerido antes de la entrada en la fuente de ionización. De esta manera, se mide una única especie en el espectrómetro de masas y por tanto, se garantiza una respuesta independiente del compuesto sin importar la fuente de ionización utilizada. La ionización independiente del compuesto permite la cuantificación genérica de los analitos a través de la detección de carbono, elemento presente en todo compuesto orgánico, sin la necesidad de estándares específicos ni calibración. Para el desarrollo de la metodología se empleó un instrumento comercial GC-MS de tipo cuadrupolo, sobre el que se realizaron tres modificaciones: (i) una interfase de combustión para la conversión cuantitativa de los analitos a CO2, (ii) un sistema para la adición de un flujo constante de trazador, y (iii) una válvula de 6 vías. Esta instrumentación permitió la validación de la metodología mediante el análisis de diferentes familias de compuestos orgánicos simples (n-alcanos, BTEX, y ésteres) y su aplicación a muestras reales. La extensión de la metodología a un mayor número de compuestos orgánicos permitirá definir el detector desarrollado como el primer detector verdaderamente genérico y universal para cromatografía de gases. Sin embargo, las características instrumentales del prototipo original desarrollado no fueron lo suficientemente adecuadas para la cuantificación de compuestos orgánicos con determinadas propiedades físico químicas. En este contexto, la presente Tesis Doctoral se centró en la búsqueda de la instrumentación adecuada que permitiera ampliar el campo de aplicación de la Dilución Isotópica en línea de Carbono a compuestos orgánicos de alto punto de ebullición y con heteroátomos en su estructura, cuyo comportamiento no había sido estudiado hasta ese momento. La instrumentación GC-IRMS, ampliamente utilizada para las medidas de alta precisión de las pequeñas variaciones existentes en las abundancias naturales de los isótopos estables de elementos ligeros, dispone de las características instrumentales adecuadas para la extensión de la metodología de la Dilución Isotópica en línea de Carbono. Sólo fueron necesarias dos sencillas modificaciones para hacer posible la aplicación de la metodología: (i) un sistema para la introducción del flujo de trazador, y (ii) una configuración en la amplificación del detector que permita la medida de la relación isotópica 12C/13C tras la adición del trazador enriquecido. Además se demostró que el empleo de un inyector de Temperatura Programada permitía la transmisión cuantitativa sin discriminación de todos los compuestos con un amplísimo intervalo de temperatura de ebullición (218 – 525ºC). Se evaluaron las características analíticas de la metodología, y se demostró que la respuesta instrumental es independiente de la especie, sin importar ni el punto de ebullición ni la presencia de heteroátomos. Finalmente, se evaluó la aplicabilidad a muestras reales mediante el análisis de los FAMEs saturados e insaturados presentes en muestras de biodiesel, tanto patrones certificados como muestras reales. Se comparó la respuesta genérica del detector con la de detector más universal y establecido para compuestos orgánicos en GC, el detector de ionización de llama (FID), tanto de forma directa (como se emplea en la Norma Europea correspondiente) como con corrección del Número de Carbonos Equivalente (ECN). Se encontró que sólo la metodología propuesta es realmente genérica y no requiere patrones internos de naturaleza y número de Carbonos similar. Las modificaciones instrumentales realizadas sobre la instrumentación GC-IRMS para la aplicación de la IDMS en línea de carbono no repercuten en el funcionamiento del equipo para realizar el análisis isotópico específico del compuesto (CSIA), característico de esta instrumentación. Por ello fue posible determinar las pequeñas variaciones en las abundancias isotópicas naturales de cada FAME individual presente en las muestras de biodiesel a través del cálculo de los deltas de carbono con la exactitud y precisión adecuadas. Dicha información, junto con el perfil cuantitativo exacto y preciso de los FAMEs presentes obtenido por la dilución isotópica en línea de C, pudo ser aplicado para estudios de discriminación por el origen en muestras de biodiesel.

Tesis doctoral por el sistema de compendio de publicaciones, El principal objetivo de la Tesis que se presenta es el desarrollo de metodologías analíticas para la determinación de compuestos orgánicos como bifenilos policlorados (PCBs) y α-, β- y γ-hexabromociclododecano (HBCD) con el uso de la dilución isotópica y la espectrometría de masas (IDMS). El control analítico de este tipo de contaminantes es necesario, ya que se encuentran incluidos en el Convenio de Estocolmo. El desarrollo de metodologías analítica sencillas, rápidas y fiables para la determinación de contaminantes orgánicos halogenados es necesario en muestras sólidas de naturaleza medioambiental y biológica. La dilución isotópica se basa en la modificación de la composición isotópica del elemento o compuesto a determinar en la muestra, por la adición del elemento o compuesto enriquecido isotópicamente. De esta manera, los compuestos enriquecidos isotópicamente son necesarios para desarrollar las metodologías IDMS. IDMS proporciona resultados de una mayor calidad metrológica, en comparación con estrategias clásicas de calibración como pueden ser la calibración externa o las adiciones estándar. Por este motivo, el primer paso en la determinación de los PCBs es la síntesis y caracterización de los doce PCBs enriquecidos en 37Cl. El paso de la extracción con el uso de la técnica de microondas focalizadas permite disminuir el tiempo necesario en el proceso global de la determinación, en combinación con el uso de IDMS. Además, utilizando los PCBs enriquecidos en 37Cl es posible emplear diferentes fuentes de ionización y analizadores de masas para la determinación de los PCBs mediante IDMS. Por lo tanto, otro de los objetivos de la presente Tesis es el uso de los compuestos enriquecidos isotópicamente para comparar diferentes instrumentos de espectrometría de masas. No solo los PCBs han sido determinados en este trabajo, también otro tipo de contaminantes orgánicos fueron estudiados, como son α-, β- y γ-hexabromociclododecano (HBCD). Estos contaminantes han sido incluidos también en el Convenio de Estocolmo, y se encuentran regulados desde 2013 por una legislación Europea para muestras de aguas superficiales continentales. La estrategia de cuantificación basada en metodologías IDMS, también utiliza análogos enriquecidos isotópicamente. En este caso, los diastereoisómeros del HBCD enriquecidos en 81Br fueron utilizados para su determinación en muestras de agua por IDMS. El desarrollo de metodologías IDMS permite determinaciones exactas y precisas de los diastereoisómeros del HBCD a niveles por debajo de los requeridos por la Directiva Europea en muestras de agua reales. Los compuestos halogenados (PCBs) y también los bifenil éteres bromados (PBDEs) han sido utilizados para desarrollar un método capaz de evaluar la exactitud espectral de los espectrómetros de masas, en instrumentos de cuadrupolo sencillo e instrumentos de triple cuadrupolo.

Tesis por compendio de publicaciones, El mercurio es un metal pesado muy tóxico para la salud humana y el medioambiente. Es un elemento que puede estar presente en el agua, suelo, sedimentos y en la atmósfera. A pesar de sus bajos niveles de fondo en la naturaleza, la actividad humana (minería, generación eléctrica, etc.) ha incrementado de forma notable la concentración de este elemento en el medioambiente. El mercurio se puede encontrar en diversas especies químicas, cuyas propiedades físicas y químicas varían de una especie a otra. Estas propiedades van a determinar el comportamiento y distribución del mercurio en el medioambiente, su biodisponibilidad y su toxicidad para el ser humano, así como, el desarrollo de estrategias medioambientales que permitan eficazmente su reducción y control. La determinación analítica de algunas de las especies orgánicas de mercurio más peligrosas, como es el metilmercurio, ya está implantada en muchos laboratorios. Sin embargo, la identificación y cuantificación de las especies inorgánicas de mercurio continua siendo una tarea complicada. La desorción térmica programada es una técnica que se basa en la separación de las especies de mercurio en función de su temperatura de volatilización característica. Es un método que permite el análisis de especies de mercurio de forma simple, directa y rápida. Sin embargo, aún presenta algunas limitaciones inherentes a la técnica que necesitan ser optimizadas, como por ejemplo, la obtención de muestras de referencia que simulen la desorción térmica de cada especie de mercurio en cualquier tipo de matriz, la optimización de las condiciones experimentales para evitar la superposición de picos o la eliminación de cualquier interferencia durante el análisis de las especies de mercurio, concretamente, aquellas que son debidas a los compuestos volátiles desprendidos de muestras con elevado contenido en materia carbonosa. El objetivo de esta tesis ha sido desarrollar un dispositivo basado en la desorción térmica programada que permita identificar las especies de mercurio en cualquier tipo de sólido de forma sensible y selectiva. Para ello se prepararon una serie de muestras de referencia de los compuestos de mercurio que están presentes habitualmente en la naturaleza y en los procesos de utilización de carbón. Un dispositivo basado en la desorción térmica, que está disponible comercialmente para el análisis de la concentración total de mercurio, se puso a punto para el análisis de especies de mercurio. Mediante el análisis con este dispositivo (HgTPD) de las muestras de referencia se construyó una librería con las temperaturas características de desorción térmica para cada compuesto de mercurio. HgTPD demostró su utilidad en la determinación de las especies de mercurio en muestras con bajo contenido en materia orgánica, concretamente en cenizas volantes, suelos, yesos y chars. La especiación de mercurio en estos sólidos permitió por un lado, evaluar el riesgo de algunos de estos sub-productos cuando van a ser depositados en escombreras o reutilizados y por otro, a mejorar el desarrollo de sorbentes específicos para la retención de mercurio en procesos de combustión de carbón a través de identificar el tipo de interacción Hg/sorbente. La reproducibilidad de la técnica HgTPD fue evaluada mediante el análisis de diferentes muestras con tres dispositivos que trabajan en diferentes condiciones. Las especies de mercurio identificadas con los tres dispositivos fueron similares. Sin embargo, el análisis de muestras carbonosas no pudo ser realizado cuando el gas portador es inerte, debido a la interferencia que causa el humo que se desprende de la materia orgánica y que impide la detección. Un nuevo dispositivo basado en la desorción térmica fue construido el cual permite la especiación de mercurio en todo tipo de muestras, incluidas aquellas ricas en materia orgánica. La novedad principal de este dispositivo es que consta de dos hornos y dos entradas de gas. Esta nueva configuración es capaz de determinar cada especie de mercurio sin ninguna interferencia e independiente de la matriz en la que se encuentre. El equipo y método desarrollado fue empleado para la determinación de las especies de mercurio en muestras de carbones. Diferente especiación de mercurio fue observada en función del rango del carbón. Además se identificaron las especies de mercurio retenidas en carbones activos usados como sorbentes en procesos de combustión de carbón, como resultado de lo cual se propuso un mecanismo de retención Hg/sorbente

La búsqueda de nuevos biomarcadores de enfermedades en general y tumores malignos en particular es uno de los grandes campos de investigación clínica. De los diferentes tejidos y fluidos que pueden ser objeto de análisis, la orina constituye una muestra ideal para la monitorización de estas sustancias dado que no requiere de métodos invasivos. Además, los perfiles metabolómicos en orina están siendo objeto de investigación para desarrollar nuevos ensayos clínicos basados en este tipo de biomarcadores. Por otro lado, las técnicas hibridas que combinan potentes técnicas de separación cromatográficas o electroforéticas con la espectrometría de masas en general y la espectrometría de masas con fuente ICP en particular abre la posibilidad de nuevas estrategias analíticas dentro de este campo. En nuestro caso, basándonos en estudios previos realizados en nuestro laboratorio, hemos evaluado la posibilidad de utilizar las medidas de relaciones isotópicas de azufre en los metabolitos presentes en la orina como método para detectar pacientes con determinadas patologías como por ejemplo cáncer de próstata. La hipótesis fue la siguiente: al suministrar una dosis de levadura enriquecida en 34S a un individuo sano y a un paciente, si el metabolismo de estos individuos es diferente como consecuencia de la enfermedad, debería observarse la aparición de un enriquecimiento isotópico en azufre diferente en algunos de los metabolitos de azufre presentes en la orina de estos individuos. El objetivo principal de esta tesis doctoral fue evaluar si esto es así o no, ya que en caso afirmativo estos metabolitos podrían proponerse como posibles biomarcadores de la enfermedad. 1- Síntesis de levadura enriquecida en azufre 34 En primer lugar se procedió a sintetizar levadura Saccharomyces Cerevisiae enriquecida en azufre 34. Para ello se partió de la experiencia previa en nuestro grupo de investigación en este campo, pero modificando y optimizando algunos aspectos de los métodos anteriormente desarrollados con objeto de obtener un enriquecimiento mayor en el isótopo 34 del azufre. Esta levadura se empleó en los estudios posteriores. Por otro lado, se preparó un patrón de metionina enriquecida isotópicamente a partir de la levadura sintetizada, con objeto de utilizarla en la determinación de metionina en muestras de interés clínico. En este sentido, se ha puesto a punto un método para la determinación de metionina en suero humano mediante dilución isotópica HPLC-ICP-MS. Este método fue validado comparando los resultados obtenidos por nuestro método con los del HUCA utilizando un método alternativo. 2. Desarrollo de una metodología analítica cuantitativa para la monitorización de metabolitos de azufre en orina Era esperable que los enriquecimientos isotópicas de azufre en los metabolitos presentes en la orina tras una dosis única de levadura enriquecida fuesen muy pequeños. Para poder detectar diferencias entre individuos sanos y enfermos es necesario utilizar técnicas que alcancen una alta precisión en la medida de relaciones isotópicas. Por ello, se han comparado dos equipos ICP-MS de doble enfoque, uno con detección secuencial y otro con detección simultaena, fundamentalmente en lo que se refiere a la precisión en la medida de relaciones isotópicas. Los resultados mostraron una clara ventaja del equipo multicolector midiendo relaciones isotópicas de azufre con los SEM a bajas concentraciones o con las copas de Faraday a concentraciones elevadas. Por otro lado, se ha desarrollado un método HPLC para separar los principales metabolitos de azufre en orina, comparando diferentes tipos de cromatografía resultando la cromatografía de fase reversa la que permitía la separación de un mayor número de metabolitos. Además, se utilizó un novedoso sistema de desolvatación que permitía utilizar altas concentraciones de disolvente orgánico en las fases móviles. Finalmente con objeto de cuantificar el azufre endógeno y exógeno presente en cada pico cromatográfico, se añadía en continuo un flujo post-columna de azufre 33 enriquecido y se aplicó la herramienta matemática de IPD. 3. Evaluación del enriquecimiento isotópico de azufre en orina de animales de laboratorio tras suminístrales una dosis de levadura enriquecida. Se realizaron estudios tanto en ratas Wistar como en ratones C57 tras administrarles una dosis de levadura enriquecida en 34S. Los primeros estudios revelaron que la marca isotópica se podía observar en compuestos de azufre excretados en la orina, encontrándose a las 12 horas el máximo de este enriquecimiento. Posteriormente, se realizaron estudios entre ratones sanos y enfermos de cáncer de próstata para buscar diferencias en el enriquecimiento de azufre entre estas dos poblaciones. Un primer estudio reveló ciertas diferencias en animales sanos y enfermos en un estadio avanzado de la enfermedad. Por ello, se realizó un segundo estudio de los diferentes estadios de la enfermedad durante 40 semanas. Se observaron diferencias entre las poblaciones de ratones sanos y enfermos, desde estadios iniciales, utilizando para el tratamiento de datos técnicas quimiométricas, tanto en lo que se refiere a la identificación de los compuestos que presentaban un comportamiento distinto en ambas poblaciones, como para establecer diferencias globales entre las mismas

Cuando a principios del siglo pasado se descubrió la naturaleza isotópica del neón era difícil prever el impacto que los isótopos estables podrían llegar a tener durante las siguientes décadas. Actualmente las relaciones isotópicas suponen una potente herramienta útil en una gran variedad de ramas del conocimiento. Por ello es lógico pensar en la necesidad de desarrollar nuevas metodologías de medida rápidas, fiables, precisas y de fácil aplicación. Bajo esta premisa, la presente Tesis Doctoral tiene como objetivo el desarrollo de nuevas metodologías para la medida directa de relaciones isotópicas en muestras sólidas mediante ablación láser acoplado a ICP-MS y su aplicación a la resolución de distintos problemas analíticos dentro del campo de los estudios de trazabilidad. A lo largo de este trabajo se consideraron tanto sistemas naturales, donde la medida de relaciones isotópicas fue utilizable para definir el origen de un material (arqueología y denominación de origen de alimentos), como sistemas artificiales donde se utilizaron isótopos enriquecidos para marcar sustancias u organismos. Dentro de este objetivo general se plantearon los siguientes objetivos parciales: 1. Medida de relaciones isotópicas de molibdeno para el marcaje isotópico de productos y organismos vivos. El desarrollo de metodologías de medida de relaciones isotópicas de molibdeno en muestras sólidas viene ligado directamente al uso de este elemento como trazador en procesos de marcaje isotópico. El marcaje de productos con doble huella isotópica de molibdeno ha resultado beneficioso para la codificación de fabas, tintas y documentos, extendiendo así el campo de aplicabilidad de esta metodología de marcaje desarrollada en el grupo de investigación de Isótopos Estables de la Universidad de Oviedo. La detección directa de la marca isotópica de molibdeno en el interior de la faba permitió diferenciar distintos lotes de muestras de manera rápida y eficaz, así como llevar a cabo estudios de asimilación de nutrientes por las diferentes partes de la planta. El marcaje encubierto de tintas y documentos mediante esta doble huella isotópica es una herramienta útil en la lucha antifraude y en estudios forenses. 2. Medida de relaciones isotópicas de plomo para el estudio de minerales y de procedencia de materiales arqueológicos. Desde finales del siglo XX la evaluación de las relaciones isotópicas de plomo ha ido de la mano de estudios de procedencia de minerales o artefactos arqueológicos. El plomo, presente en concentraciones traza en este tipo de muestras, permite trazar una línea directa entre el objeto en estudio y el lugar de procedencia del mineral con el que está fabricado. En este trabajo se midieron las relaciones isotópicas de plomo mediante ablación láser acoplada a espectrometría de masas de minerales procedentes de la mina La Profunda tales como malaquita, azurita y zeunerita, y también se analizaron 27 artefactos arqueológicos metálicos encontrados en la región oriental de Asturias. A través de ambos estudios se pretendió comprobar las ventajas del análisis directo de sólidos mediante LA-MC-ICP-MS con respecto al análisis en disolución típicamente aceptado. 3. Huella isotópica de estroncio como indicador de procedencia Cada lecho geológico se caracteriza por tener una huella isotópica de estroncio característica, por lo que la composición isotópica de estroncio presente en minerales, plantas, animales o alimentos permitiría ligar estas muestras con su lugar de origen. El principal interferente del estroncio en el análisis directo de sólidos es el rubidio. En este trabajo se evaluó la regresión lineal múltiple como método matemático para la corrección de la contribución del 87Rb a la señal del 87Sr. Esta metodología fue aplicada a minerales pobres en rubidio como el yeso y la calcita, así como a muestras con un alto contenido en rubidio, como son las fabas. En este último caso, la huella isotópica de estroncio permitió certificar el origen geográfico de este alimento

Análisis de las impurezas metálicas presentes en 27 muestras de bronce procedentes de diversos depósitos asturianos. Este análisis multielemental se realizó mediante un ICP-MS de tipo cuadrupolo.

En este Trabajo Fin de Máster (TFM) se estudia el contenido en tierras raras de las fluoritas, fluoruro cálcico, procedentes de Asturias (Caravia-Berbes, Villabona-Solís y La Collada) empleando la técnica LA-ICP-MS para relacionar estas impurezas con las líneas de crecimiento que presentan estos cristales de forma natural.

Tesis doctoral por el sistema de Compendio de Publicaciones, Las técnicas cromatográficas son, en la actualidad, las herramientas más potentes de las que dispone la química analítica cuando se pretenden analizar compuestos específicos presentes en mezclas complejas. Sin embargo, la mayoría de los sistemas de detección utilizados en cromatografía, requieren de la calibración previa de la señal mediante el uso de estándares específicos para cada analito de interés. Aparte del aumento en el coste y en el tiempo de análisis que supone la calibración instrumental, el continuo desarrollo de nuevos compuestos orgánicos por parte de las industrias química y farmacéutica hace que, en ocasiones, no se disponga comercialmente de los patrones de calibración necesarios para su cuantificación. Algunos sistemas de detección elementales, como el ICPMS, son capaces de generar una respuesta instrumental para un determinado elemento independiente de la especie química en que se encuentre, permitiendo utilizar un único patrón genérico para cuantificar varias especies que contengan dicho elemento en su estructura. Ésta notable característica puede verse mejorada mediante la adición en continuo de un isótopo enriquecido del elemento a determinar, técnica conocida como dilución isotópica en línea, ya que la medida relativa de la señal del elemento natural frente al enriquecido permite la corrección en tiempo real de la deriva instrumental debida a gradientes cromatográficos o a interferencias de matriz. Sin embargo, el uso de esta técnica está limitado al análisis de especies que contengan elementos detectables por ICPMS, es decir, cualquier elemento a excepción de C, H, N y O, lo cual supone una importante limitación de la técnica para el análisis de compuestos orgánicos. Por otra parte, las fuentes de ionización utilizadas habitualmente en el análisis de compuestos orgánicos, tales como la ionización electrónica o el electrospray, generan una respuesta variable en función del analito y por tanto, no permiten cuantificar mediante dilución isotópica en línea. En este contexto, la presente Tesis Doctoral se centró en el desarrollo de nuevas metodologías analíticas que permitan ampliar el campo de aplicación de la dilución isotópica en línea a la mayoría de compuestos orgánicos, y que puedan ejercer como sistemas de detección genéricos en cromatografía. La base de estas metodologías consistió en intercalar una reacción química, combustión u oxidación, entre el sistema cromatográfico y el espectrómetro de masas, de manera que todo compuesto orgánico, una vez que eluye, se transforma cuantitativamente en dióxido de carbono. De esta manera sólo se mide una única especie en el espectrómetro de masas y por tanto, se garantiza una respuesta independiente del compuesto sin importar la fuente de ionización utilizada. Mediante la adición en continuo de un compuesto enriquecido en carbono-13, el cual también será convertido cuantitativamente en CO2, en este caso enriquecido, se completa el desarrollo de un sistema de dilución isotópica en línea para la detección de carbono, elemento presente en todo compuesto orgánico. Dicho metodología se aplicó tanto en tanto a compuestos volátiles (usando Cromatografía de Gases) como a compuestos no volátiles (empleando FIA o HPLC): Desarrollo y evaluación de un sistema de cuantificación universal de compuestos orgánicos volátiles basado en cromatografía de gases-combustión-espectrometría de masas y dilución isotópica post-columna de 13C. Se modificó un instrumento GC-MS, implementando una interfase de combustión para la conversión de los analitos a CO2, un depósito presurizado para la adición de un flujo constante de trazador (13CO2 disuelto en helio) y una válvula de 6 vías que posibilitaba dirigir la salida de la columna bien hacia la interfase de combustión, o bien directamente a la fuente de ionización, permitiendo así utilizar el instrumento como un GC-MS convencional. Se evaluaron las características analíticas del método mediante el análisis de diferentes hidrocarburos volátiles, y se demostró que la respuesta instrumental es independiente de la especie. Se evaluó la aplicabilidad a muestras complejas mediante el análisis de un gasóleo y se demostró la utilidad de la metodología en la evaluación de técnicas de extracción y pre-concentración para el caso concreto de la micro-extracción en fase sólida. Desarrollo de un sistema de cuantificación genérico de compuestos orgánicos solubles en agua, basado en FIA/HPLC-oxidación-MS y dilución isotópica en línea de 13C. En primer lugar se desarrolló y validó un sencillo sistema FIA para la cuantificación de CO2 en disolución acuosa, mediante dilución isotópica en línea, simplemente tras la acidificación en línea del agua y extracción del CO2 formado mediante una membrana permeable a este gas. Posteriormente, se utilizó un instrumento comercial de LC-IRMS que consta de una interfase que permite la oxidación en línea de compuestos orgánicos. Se optimizaron las condiciones de trabajo para para lograr oxidar de forma completa distintos tipos de compuestos orgánicos y se aplicó a la cuantificación de distintas sustancias puras y mezclas sencillas de patrones mediante FIA y cromatografía líquida, respectivamente. La metodología se validó en primer lugar para la determinación de pureza de compuestos orgánicos polares de baja complejidad estructural mediante la participación en el estudio de intercomparación P117-c, ¿Evaluación de la pureza de l-Valina¿ organizado por el CCQM (Comité Consultatif pour la Quantité de Matiére). Posteriormente se demostró y validó su uso potencial para la determinación directa de la pureza en masa de estándares de péptidos mediante el análisis de distintos péptidos sintéticos comparando con resultados obtenidos por distintas técnicas (AAA, ICPMS), y la medida del material de referencia NIST RM8327.

Tesis doctoral por el sistema de Compendio de Publicaciones, La alteración intencionada de la composición isotópica de un elemento dado en un organismo vivo permite obtener información metabólica del elemento. La composición isotópica del azufre varía en la naturaleza por lo que para seguir la pista del azufre en un ser vivo utilizando un trazador marcado isotópicamente, la cantidad de trazador metabólico utilizada debe ser lo suficientemente elevada como para alterar la composición isotópica del azufre por encima de los límites de variabilidad natural. Los equipos ICP-MS multicolectores permiten realizar medidas de relaciones isotópicas de azufre con excelentes precisiones instrumentales, necesarias para la determinación de variaciones isotópicas naturales. Tradicionalmente, los estudios de metabolismo con trazadores de azufre se han llevado a cabo utilizando el isótopo radiactivo de azufre-35. En los últimos años, la creciente popularidad del ICP-MS ha acelerado el uso de isótopos estables para estudios de metabolismo. En este sentido, la baja abundancia isotópica que presentan los isótopos estables azufre-33 y azufre-34 en el azufre natural, los hace muy adecuados para su uso como trazadores. Sin embargo, hasta el comienzo de la presente Tesis Doctoral, el número de estudios de metabolismo utilizando isótopos estables de azufre que empleasen ICP-MS era muy escaso. Además, no se había descrito ninguna aplicación con trazadores múltiples de azufre. La determinación de azufre por ICP-MS puede ser usada como una herramienta genérica para la detección y cuantificación de péptidos y proteínas. Ningún estudio de metabolismo de proteínas en mamíferos utilizando isótopos estables enriquecidos de azufre había sido descrito con anterioridad. Estos estudios requieren la síntesis previa de cisteína y/o metionina marcada con el isótopo enriquecido dado que los mamíferos no son capaces de sintetizar estos aminoácidos y necesitan obtenerlos a través de la alimentación. Particularmente, se podría administrar levadura marcada con isótopos estables de azufre como alimento por vía oral para realizar estudios de metabolismo del azufre evitando los riesgos derivados de la exposición a la radiación. En este contexto, la presente Tesis Doctoral se centró en el desarrollo de metodologías analíticas para el estudio del metabolismo del azufre utilizando isótopos estables enriquecidos. Este objetivo general se abordó a través de las investigaciones que se resumen a continuación: 1. Estudios de variabilidad natural de la composición isotópica de azufre mediante ICP-MS multicolector. En primer lugar, se desarrolló un procedimiento directo para la medida de la variabilidad natural de la composición isotópica de azufre en muestras de cerveza mediante ICP-MS multicolector. Asimismo, se desarrolló una metodología analítica que permite realizar la medida de variaciones naturales en la composición isotópica de azufre a lo largo de un pelo mediante un sistema de ablación láser acoplado a un ICP-MS multicolector. 2. Preparación y caracterización de levadura marcada con azufre-34. Se preparó levadura marcada isotópicamente con azufre-34 en un medio de cultivo exento de azufre de abundancia natural. La levadura marcada se caracterizó tanto en composición isotópica como en concentración total de azufre mediante ICP-MS multicolector. A continuación, se evaluaron diferentes estrategias analíticas para la cuantificación de biomoléculas que contienen azufre mediante HPLC-ICP-MS. Se desarrolló un procedimiento basado en la deconvolución de perfiles isotópicos y el análisis por dilución isotópica inespecífica para la determinación simultánea de concentración y composición isotópica de azufre en especies individuales y se aplicó a la caracterización de la levadura marcada con azufre-34. 3. Estudios in vitro e in vivo del metabolismo del azufre utilizando isótopos estables enriquecidos. Se simuló in vitro una digestión gastrointestinal de la levadura marcada con azufre-34 y el hidrolizado se caracterizó mediante SDS-PAGE y HPLC-ICP-MS. Finalmente, se realizaron estudios con trazadores estables de azufre en animales de laboratorio utilizando levadura marcada con azufre-34. Se puede concluir que a lo largo de la presente Tesis Doctoral se han desarrollado metodologías analíticas novedosas para el estudio del metabolismo del azufre utilizando isótopos estables enriquecidos. En particular, la combinación del enriquecimiento isotópico en azufre-34 (utilizando azufre-34 como trazador metabólico) y la cuantificación absoluta de biomoléculas (utilizando azufre-33 como trazador de cuantificación) mediante HPLC-ICP-MS se podría establecer como una estrategia alternativa en estudios metabólicos de compuestos que contengan azufre en su estructura.

Tesis doctoral por el sistema de Compendio de Publicaciones, Los compuestos orgánicos halogenados son un amplio grupo de sustancias que la industria química ha sintetizado durante años para su empleo en todo tipo de aplicaciones. Como consecuencia, estas sustancias se han ido incorporando al medioambiente. La exposición continuada a este tipo de contaminantes puede provocar importantes efectos adversos sobre la salud humana, que dependerán del tipo de sustancia y del grado y duración de la exposición a la misma. La gran preocupación surgida en relación con los efectos adversos que pueden provocar estas sustancias sobre los seres vivos y su entorno ha obligado a las instituciones encargadas de la protección de la salud pública y ambiental a tomar medidas para evaluar los niveles máximos de estas sustancias que no supongan un riesgo inaceptable para los seres vivos y para controlar los niveles máximos permitidos. Todo esto hace necesario el desarrollo de nuevas metodologías analíticas sencillas, rápidas y fiables para la determinación de estas sustancias en distintos tipos de muestras de origen biológico y medioambiental. Estas metodologías han de combinar sistemas de extracción, limpieza y preconcentración seguidos de separaciones cromatográficas con sistemas de detección suficientemente sensibles y selectivos entre los que destaca la Espectrometría de Masas (MS) en sus diversas variantes. En este contexto, la presente Tesis Doctoral se centró en el desarrollo de nuevas metodologías analíticas para el control de ciertos contaminantes orgánicos halogenados empleando distintas técnicas de MS. En primer lugar se desarrolló y validó una metodología para la determinación de trihalometanos (THMs) en aguas de consumo humano. Los THMs son un tipo de compuestos orgánicos volátiles halogenados (HVOCs) que se generan como subproductos de desinfección durante el proceso de cloración del agua y que según muchos estudios toxicológicos resultan tóxicos y potencialmente carcinogénicos, de modo que, al tratarse de sustancias a las que estamos expuestos de forma habitual, resulta esencial su control analítico en las aguas de consumo humano. Para ello fue necesario optimizar las condiciones de trabajo del sistema GC-(ICP)MS y comprobar que la respuesta proporcionada por este sistema sea independiente de la estructura molecular del analito. Finalmente se puso a punto una metodología para la determinación de THMs en aguas de consumo mediante calibrado independiente del compuesto (CIC) con patrón interno GC-(ICP)MS. Por otro lado, se desarrollaron y validaron distintas metodologías para la determinación de difenil éteres polibromados (PBDEs) en muestras de interés medioambiental. Los PBDEs son un tipo de contaminantes orgánicos persistentes (POPs) que se emplean como retardantes de llama en muchos materiales poliméricos que forman parte de gran variedad de productos de uso cotidiano. Estas sustancias se pueden liberarse con facilidad de su matriz dispersándose en su entorno, por lo que los niveles de concentración encontrados en muestras biológicas y medioambientales son cada vez más elevados. Los importantes efectos adversos relacionados con la exposición a PBDEs hacen necesario el control de estas sustancias en todo tipo de muestras de interés medioambiental. Las metodologías desarrolladas para la determinación de PBDEs se basaron en la técnica de análisis por dilución isotópica (IDA), caracterizada por la calidad de sus resultados analíticos en términos de exactitud y precisión. Para aprovechar todas las ventajas que ofrece IDA se trabajó en el modo específico, por lo que fue necesario sintetizar los compuestos marcados isotópicamente en 81Br y purificarlos con el fin de obtener un trazador adecuado para esta aplicación. Dicho trazador fue caracterizado en abundancias isotópicas y en concentraciones y se evaluó su aplicabilidad a la determinación de PBDEs mediante IDA en términos de estabilidad y contaminación con sus análogos naturales. Finalmente se utilizó como trazador para la determinación de PBDEs en una muestra de pescado mediante GC-(EI)MS y en muestras de agua de río mediante GC-(NCI)MS.

Trabajo de fin de Máster. Estudio de la fragmentación y cuantificación de sk-digitoxosil mitramicina en muestras de plasma de rata mediante HPLC acoplada a MS-MS Entrechem SL.