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RESUMEN La papa (Solanum tuberosum) es uno de los productos agrícolas con mayor demanda interna en Colombia. Este cultivo es afectado por un complejo de virus que reduce los rendimientos y la calidad de los tubérculos-semilla. En este trabajo se evaluó la prevalencia de cinco virus de ARN (PVY, PVS, PVX, PLRV y PYVV) en brotes de tubérculos-semilla de origen comercial (TC) y no-comercial (TNC) y en sus plantas derivadas, utilizando RT-PCR en tiempo real. Los resultados evidenciaron altos niveles de infección de los cinco virus en el material de siembra e infecciones mixtas hasta con cuatro virus en los tubérculos comerciales. PVY (74%) y PVS (36%) presentaron los mayores niveles de prevalencia en plantas derivadas de tubérculos-semilla. La combinación PVY+PLRV presentó el mayor nivel de prevalencia en tubérculos-semilla TC (24%), mientras que en TNC las combinaciones PVY+PYVV+PVS y PVY+PVS+PLRV se presentaron en 10% de las muestras. La afinidad filogenética de los virus detectados se evaluó mediante secuenciación Sanger de amplicones de cápside, agrupándose en subclados previamente identificados sobre solanáceas en Colombia. Estos resultados señalan la necesidad de tomar acciones urgentes que permitan mejorar los niveles de sanidad viral de los materiales de siembra de papa cultivados en el país. ABSTRACT Potato (Solanum tuberosum L.) is one of the agricultural products with highest internal demand in Colombia. However, this crop is affected by a virus complex that have a dramatic effect in yields and on the quality of tuber-seeds. In this work we tested the prevalence of five RNA viruses (PVY, PVS, PVX, PLRV and PYVV) in tuber-seed sprouts and their corresponding plantlets using real-time RT-PCR. Tuber-seeds were obtained from commercial (TC) and informal seed (TNC) distributors. Our results suggest high levels of infection with all five viruses in seed potatoes. Mixed infections, with up to four different viruses, were found with high frequency in certified or registered seed tubers. PVY (74%) and PVS (36%) were the most prevalent viruses using leaf tissues. The combination PVY+PLRV (24%) was the most common mixed infection in commercial tuber-seeds. In non-commercial seeds the most prevalent mixed infections were PVY+PYVV+PVS and PVY+PVS+PLRV at 10%. The phylogenetic affinity of all viruses under study was determined by partial sequencing of their CP genes, which confirmed their close relationship with previously characterized Colombian strains. These results underscore the urgent need to improve the health status in potato seed-tubers used by farmers in Colombia. RESUMO A batata (Solanum tuberosum) é um dos produtos agrícolas com maior demanda interna na Colômbia. Este cultivo é afetado por um complexo de vírus que reduzem os rendimentos e a qualidade dos tubérculos-semente. Neste trabalho foi avaliada a prevalência de cinco vírus de ARN (PVY, PVS, PVX, PLRV y PYVV) em brotos de tubérculos-semente de origem comercial (TC) e não comercial (TNC) e em plantas derivadas desses brotos, usando RT-PCR em tempo real. Os resultados evidenciaram altos níveis de infecção dos cinco vírus no material de semeadura e infecções mistas com até quatro vírus nos tubérculos comerciais. PVY (74%) e PVS (36%) apresentaram os maiores níveis de prevalência em plantas derivadas de tubérculos-semente. A combinação PVY+PLRV apresentou o maior nível de prevalência em tubérculos-semente TC (24%), enquanto em TCN as combinações PVY+PYVV+PVS e PVY+PVS+PLRV foram detectadas em 10% das amostras. A afinidade filogenética dos vírus detectados foi avaliada por sequenciamento Sanger de amplicons da cápside, agrupandose em subclados previamente identificados sobre solanáceas na Colômbia. Estes resultados indicam a necessidade de tomar ações urgentes para melhorar os níveis de sanidade viral dos materiais de semeadura de batata no país.

La familia Solanaceae es considerada como el tercer taxón botánico más importante a nivel agronómico y uno de los grupos de plantas mejor estudiados en su biología, ecología e interacciones con otros organismos, incluyendo sus patógenos. En la región andina de Colombia, las especies de solanáceas de mayor importancia económica son afectadas por diversas enfermedades de origen biótico que limitan sus rendimientos y la calidad final de sus productos, destacándose las enfermedades de origen viral, ya que no sólo disminuyen los rendimientos de los cultivos, sino también su longevidad y las características organolépticas de sus frutos y/o tubérculos, con la consecuente reducción de su valor comercial. En las regiones andinas de Colombia se cultivan diferentes solanáceas para el consumo interno y con gran potencial para su exportación como frutas y tubérculos exóticos; entre estas especies de plantas se destacan las variedades locales de papa común (Solanum tuberosum subsp. andigena), tomate (S. lycopersicum), pimentón (Capsicum annuum), lulo (S. quitoense) y uchuva (Physalis peruviana). Desafortunadamente, el nivel de conocimiento que se tiene de los agentes causales y de los efectos de las enfermedades virales sobre dichos cultivos es aún incipiente en nuestro país y por consiguiente las estrategias de manejo que emplean los agricultores para su manejo resultan ineficientes y con un alto costo no sólo económico sino ambiental. Dada esta problemática de desconocimiento de los componentes del viroma de solanáceas cultivadas en los Andes, en esta tesis se utilizaron diversas metodologías moleculares, incluyendo la Secuenciación de alto rendimiento (HTS), utilizando como región de estudio el oriente de Antioquia. Como base para los análisis moleculares, se utilizó tanto la extracción de ARN total como de ARN de doble cadena (ARNdc), encontrándose que son metodologías complementarias con respecto a la diversidad viral y a la cobertura de los genomas a identificar. Las secuencias obtenidas mediante HTS fueron empleadas para 7 dirigir la detección por RT-PCR convencional y RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR) de los virus en muestras individuales de dichas plantas. Los resultados del trabajo indicaron la presencia de los virus: PLRV, PYVV, PMTV, PVY, PVX, PVS, BPEV, ANSV y CMV en cultivos de lulo, siendo algunos de estos virus los primeros reportes en el mundo sobre este hospedante. Para el caso de la uchuva, se logró detectar un nuevo virus del género Ilarvirus (CGIV-1); así como PVY, PMTV, PYVV, PYV, STV y PVS. Por otra parte, en pimentón se destaca la detección con altos niveles de incidencia del tospovirus ANSV, así como también del CMV, PVY y BPEV; mientras que, en cultivos de tomate, se detectó por primera vez en el país el virus STV, del cual también se obtuvo su secuencia genómica completa, al igual que del PYVV, PVX, PVS y PVY. En papa se logró aumentar el número de secuencias genómicas de los virus PVY, PVX, PYVV, PLRV y PVS. Finalmente, en el trabajo se evaluó la infección de virus directamente en tubérculos-semilla de papa y en semilla sexual de tomate (comercial y no comercial), evidenciándose una alta prevalencia de algunos virus en este material de siembra. Se espera que la información obtenida sobre el viroma de este grupo de hospedantes sea utilizada en Colombia y en otros países para diseñar programas de manejo integrado de enfermedades virales que reduzcan las pérdidas económicas ocasionadas por dichos patógenos; así como también que se implementen las herramientas moleculares aquí evaluadas para la detección rutinaria de virus en programas cuarentenarios, epidemiológicos, de mejoramiento genético y de producción de semilla certificada en estos cultivos. The Solanaceae family is considered the third most important botanical taxon in agronomy. As such, it is one of the most studied plant groups when it comes to its biology, ecology and plant-microbe interactions. The Andean region of Colombia is known for growing numerous Solanaceae species of great economic importance, which are constantly affected by different diseases of biotic origin that can significantly reduce their yield and compromise the final quality of their products. Among these, viral diseases stand out due to their potential to reduce the crop’s yield, interfere with its longevity and impact the organoleptic properties of its fruits and/or tubers, therefore reducing their commercial value. South America is known for being one of the main centers of diversity of Solanaceae species. In Colombia, these crops are grown both to supply internal demand of produce and as important export products due to their exotic and nutritional properties. Among these Solanaceae species, local varieties of potato (Solanum tuberosum subsp. andigena), tomato (S. lycopersicum), bell pepper (Capsicum annuum), lulo (S. quitoense) and cape gooseberry (Physalis peruviana) stand out. Despite the importance of this Solanaceous crops, information regarding their viral diseases, specific causal agents and their effects on the crop is still scarce. As a consequence, management strategies directed towards preventing or controlling the disease are often ineffective, but nevertheless expensive both from an economic and from an environmental standpoint. 9 The goal of this work was to expand the knowledge about the virome of Solanaceous species cultivated in the Andes, using eastern Antioquia as the study region and different molecular techniques, including Throughput Sequencing (HTS), to identify and characterize viral pathogens. As source material, both total RNA and double stranded RNA (dsRNA) were extracted from plant tissue and analyzed for viral RNA. We found that both methodologies complement each other increasing the sensibility of the analysis. Simultaneously using both techniques resulted in a larger number of virus identified and an improved coverage of their sequenced genomes. The sequences obtained through HTS were used to guide the detection of viruses in individual plant samples by conventional RT-PCR and real time RT-PCR (RT-qPCR). The main result of this work is a comprehensive list of the viruses found infecting different Solanaceous crops. The viruses PLRV, PYVV, PMTV, PVY, PVX, PVS, BPEV, ANSV and CMV were identified in lulo, with some of these being the first worldwide report of the particular virus infecting this crop. In the case of cape gooseberry, a new virus from the genera Ilarvirus (CGIV-1) was detected. Additionally, PVY, PMTV, PYVV, PYV, STV and PVS were also found infecting this crop. For bell pepper, ANSV tospovirus was detected with high incidence, as well as CMV, PVY and BPEV. In tomato, STV virus was reported for the first time in Colombia, and its complete genomic sequence was obtained. PYVV, PVX, PVS and PVY were also identified infecting tomato. Finally, in potato, PVY, PVX, PYVV, PLRV and PVS were detected and sequenced, increasing the number of complete genome sequences available for these viruses. Furthermore, we directly used potato seed tubers and tomato sexual seeds (commercial and non-commercial) for virus detection and we were able to observe a high prevalence of viruses in this planting material. 10 The results obtained in this work regarding the virome of Solanaceous provide valuable information that can be used, not only in Colombia, but many other regions to design more effective integrated management programs for prevention and control of viral diseases. The implementation of informed management decision could significantly decrease the economic losses caused by viral pathogens. In a similar manner, the implementation of the molecular tools evaluated and designed here could facilitate efforts for the routine detection of viruses for quarantine and epidemiological purposes as well as to complement programs focusing on the genetic improvement and certified seed production of these crops. Doctorado

RESUMEN Las enfermedades virales son uno de los principales problemas fitopatológicos de la papa. Con el fin de determinar los virus más prevalentes en cultivos de papa var. Diacol Capiro en el oriente Antioqueño (Colombia), se evaluó mediante RT-qPCR la presencia de diez virus de ARN (PVY, PVA, PVV, TaLMV, PVS, PLRV, PYVV, PVX, ToRSV y PMTV) en 36 muestras de tejido foliar. Los resultados indicaron la ocurrencia de cinco de los diez virus evaluados, con niveles de prevalencia de 88,9 %, 75 %, 75 %, 41,7 % y 25 % para PVY, PVX, PYVV, PLRV y PVS, respectivamente. Con fines comparativos, cuatro virus también se evaluaron mediante ELISA, siendo detectados PVS (80,5 %), PVY (55 %) y PLRV (5,5 %); mientras que PVX no fue encontrado con esta prueba. La comparación de estas técnicas mediante la razón de prevalencia (RP), indicó que la RT-qPCR ofrece niveles superiores de detección con valores de RP = 1,6 y RP = 7,5 para los virus PVY y PLRV; mientras que para PVS la ELISA detectó más muestras positivas que RT-qPCR (RP = 3,22), evidenciándose la necesidad de diseñar nuevos cebadores ajustados a la diversidad de este virus en Antioquia. La coinfección mixta más frecuente fue PVY-PYVV-PVX (22,2 %), mientras que los cinco virus se encontraron en el 11,1 % de las muestras. Finalmente, utilizando secuenciación Sanger de la cápside y NGS para los genomas completos, se confirmó la circulación de todos los virus detectados en los cultivos de papa del oriente Antioqueño. Estos resultados señalan la necesidad de fortalecer los programas de manejo integrado de enfermedades virales en Antioquia. ABSTRACT Viral diseases are one of the main phytopathological problems affecting potato crops worldwide. To determine the most prevalent viruses in potato var. Diacol Capiro crops in Eastern Antioquia, 36 leaf samples were tested for the presence of PVY, PVA, PVV, TaLMV, PVS, PLRV, PYVV, PVX, ToRSV and PMTV using RT-qPCR. Detected viruses included PVY, PVX, PYVV, PLRV and PVS with prevalence levels of 88.9 %, 75.0 %, 75.0 %, 41.7 % and 25.0 %, respectively. PVS, PVY, PLRV and PVX were also tested by ELISA. PVS, PVY and PLRV tested positive in 80.5 %, 55.0 % and 5.5 % of samples; PVX was not detected. Prevalence Ratios (PR) suggests that detection is higher for PVY (PR = 1.6) and PLRV (PR = 7.5) using RT-qPCR. ELISA worked better for PVS with a PR of 3.2; this result suggests that the RT-qPCR primers used for PVS must be adjusted to reflect the genome diversity of virus in Antioquia. The most frequent coinfection was PVY-PYVV-PVX, which occurred in 22.2 % of samples; coinfection with PVY, PVX, PYVV, PLRV and PVS was present in 11.1 % of samples. The circulation of these viruses in Eastern Antioquia was further confirmed using Sanger and high-throughput sequence. This work highlights the need to strengthen integrated disease management programs of viruses in Antioquia.

RESUMEN El Potato virus Y (PVY) es uno de los virus más limitantes para la producción de papa (Solanum tuberosum y S. phureja) en el mundo. Este virus es transmitido por tubérculo-semilla de papa y por diferentes especies de áfidos. Para su manejo es fundamental la siembra de tubérculos certificados por su sanidad viral, para lo que se requieren metodologías de detección altamente sensibles como ELISA y RT-PCR. Para éstas últimas pruebas, es necesario disponer de cebadores específicos que permitan el diagnóstico del virus en tejidos asintomáticos. En este estudio se reportan los cebadores PVY_Col para la detección del PVY en RT-PCR convencional y en tiempo real (RT-qPCR). Estos cebadores fueron diseñados con base en las secuencias de este virus que se han reportado en Colombia sobre diferentes hospedantes, así como de las diferentes variantes encontradas en el mundo. Una particularidad adicional de estos cebadores es que no presentan reacción cruzada con el genoma del Potato virus V (PVV), otro potyvirus que recientemente se ha encontrado afectando cultivos de papa en Colombia. Se espera que los cebadores PVY_Col sean utilizados para apoyar los programas de certificación de material de siembra de papa, así como para adelantar estudios epidemiológicos y de manejo fitosanitario de este virus. ABSTRACT Potato virus Y (PVY) is one of the most limiting viruses in the production of potato (Solanum tuberosum and S. phureja) worldwide. This virus is transmitted by aphids and infected tuber-seeds, and for this reason, disease management of PVY requires, among others, using certified planting material through highly sensitive techniques such as ELISA and RT-PCR. However, RT-PCR-based methods require primers of high specificity to allow the unequivocal detection of viruses in asymptomatic tissues. In this work, we report a new set of primers (PVY_Col) for detection of PVY by RT-PCR and real-time RT-PCR (RT-qPCR). These primers were designed using sequences of PVY isolates from Colombia and the rest of the world. An essential feature of these primers is their specificity, since they don't amplify templates from Potato virus V (PVV), a close PVY relative that also infects potato crops in Colombia. It is expected that the PVY_Col primer set will be useful to support potato seed certification programs, epidemiological studies, and PVY disease management programs.

Potato mop-top virus (PMTV; genus Pomovirus; family Virgaviridae) is the causing agent of the spraing disease in potato (Solanum tuberosum). PMTV is transmitted by Spongospora subterranea f. sp. subterranea (Sss). This disease has a widespread distribution in potato growing regions around the world. The possibility of obtaining strain specific antibodies at low cost can greatly increase the sensitivity and use of serological tests in seed certification programs, plant breeding and quarantine regulations to avoid dissemination of this injurious virus. This work presents an alternative procedure for the production of PMTV specific antibodies useful in serological test such as ELISA and lateral flow. In contrast to standard methods requiring the isolation of viral particles or expression of recombinant capsid, this method uses peptides mimicking the N-terminal region of PMTV capsid protein as antigen for the production of specific polyclonal antibodies. The antibodies were tested against bait plants grown in soil infested with viruliferous Sss, as well as potato plants obtained from naturally Sss infested fields in Colombia. PMTV was detected in 9/14 and 24/28 foliage samples of N. benthamiana and S. phureja, respectively. In the case of field plants, the virus was detected in eight out of 12 root tissues evaluated. The minimum peptide concentration detected by ELISA was of the order of 0.1 nM. Potato mop-top virus (PMTV; género Pomovirus; familia Virgaviridae) es transmitido por Spongospora subterranea f. sp. subterranea (Sss), agente causal de la sarna polvosa de la papa. Esta enfermedad tiene una amplia distribución en las regiones cultivadoras de papa alrededor del mundo. La posibilidad de obtener anticuerpos específicos contra cepas de este virus, puede incrementar la sensibilidad y la utilización de pruebas serológicas en programas de certificación de semilla, mejoramiento genético y regulaciones cuarentenarias que eviten su diseminación a zonas libres de la enfermedad. En esta investigación, se presenta un procedimiento alternativo para la producción de anticuerpos específicos para PMTV de utilidad en pruebas serológicas como ELISA y flujo lateral. A diferencia de los métodos estándar que requieren del aislamiento de partículas virales o de la expresión de cápside recombinante, este sistema utiliza un péptido que simula la región N-terminal de la proteína de la cápside de PMTV, como antígeno para la producción de anticuerpos policlonales. Dichos anticuerpos fueron evaluados en plantas señuelo sembradas en suelos infestados con quistosoros de Sss, así como en plantas de papa obtenidas de suelos de Colombia con infección natural de Sss. La utilización de estos anticuerpos permitió la detección del PMTV en 9/14 y 24/28 muestras foliares de N. benthamiana y S. phureja, respectivamente. Para el caso de plantas de papa obtenidas del campo, las pruebas detectaron el virus en ocho de 12 raíces evaluadas. La concentración mínima detectada del péptido por ELISA fue de 0,1 nM.

Potato mop-top virus (PMTV) causes an important re-emerging disease in potato crops in Colombia due to the increased incidence of its protozoan vector Spongospora subterranea f.sp. subterranea (Sss), the causing agent of Powdery scab disease. For an accurate detection of PMTV it is recommended to combine different diagnostic tests and evaluate multiple samples per plant or tissue. In order to increase the number of available tools for detection of PMTV, antibodies targeting the RT domain of the CP-RT protein were developed in this work. Sequencing of the RT domain from the colombian strain R25 was achieved and using bioinformatic analysis, a potential antigenic region was identified. A peptide mimicking the antigenic region was inoculated in rabbits for the production of polyclonal antibodies. The antibodies were tested by ELISA using Nicotiana benthamiana bait-plants infected with Sss cystosori and potato plants collected in La Unión (Antioquia). The validity of serological tests was confirmed by RT-PCR. A complete sequence of the RT domain and 441 nt of the CP gene were obtained. Phylogenetic analysis identified strain R25 as closely associated to the PMTV lineage distributed worldwide. A total of 19.26 mg of anti-CP-RT polyclonal antibodies useful in detecting PMTV in infected plants were obtained. As CP-RT is involved in transmission of PMTV by Sss, these antibodies will be useful for supporting not only diagnostic programs but also basic and epidemiologic studies aimed at understanding interactions between PMTV and Sss. Resumen. El Potato mop-top virus (PMTV) es uno de los virus re-emergentes en los cultivos de papa de Colombia, como resultado del aumento de la incidencia de su vector natural, el protozoo Spongospora subterranea f.sp.mamarinm@unal.edu.co (Sss), agente causal de la Sarna polvosa de la papa. Para la detección del virus se recomienda la realización simultánea de diferentes pruebas, así como la evaluación de múltiples submuestras por tejido bajo análisis. Con el fin de ampliar el rango de herramientas para la detección de PMTV, se obtuvieron anticuerpos dirigidos al dominio RT de la proteína CP-RT. Se secuenció dicho dominio en el aislamiento colombiano R25 de PMTV y se realizaron análisis bioinformáticos para ubicar regiones peptídicas con alto potencial inmunogénico. El péptido seleccionado fue inoculado en conejos para obtener anticuerpos, cuya utilidad fue evaluada a partir de pruebas de ELISA indirecto en plantas señuelo de Nicotiana benthamiana inoculadas con quistosoros de Sss y en plantas de papa obtenidas en La Unión (Antioquia). Estas pruebas estuvieron acompañadas con evaluaciones de RT-PCR. Se obtuvo la totalidad del dominio RT, así como 441 nt del gen CP. Los análisis filogenéticos identificaron la cepa R25 como asociada al linaje de PMTV mundialmente distribuido. Se obtuvieron 19,26 mg de anticuerpos, los que resultaron efectivos para detectar PMTV. Ya que CP-RT es responsable de la transmisión del PMTV por Sss, estos anticuerpos permitirán no sólo apoyar los programas de diagnóstico, sino también estudios básicos y epidemiológicos tendientes a evaluar las interacciones del PMTV y Sss.

Potato mop-top virus (PMTV) causes an important re-emerging disease in potato crops in Colombia due to the increased incidence of its protozoan vector Spongospora subterranea f.sp. subterranea (Sss), the causing agent of Powdery scab disease. For an accurate detection of PMTV it is recommended to combine different diagnostic tests and evaluate multiple samples per plant or tissue. In order to increase the number of available tools for detection of PMTV, antibodies targeting the RT domain of the CP-RT protein were developed in this work. Sequencing of the RT domain from the colombian strain R25 was achieved and using bioinformatic analysis, a potential antigenic region was identified. A peptide mimicking the antigenic region was inoculated in rabbits for the production of polyclonal antibodies. The antibodies were tested by ELISA using Nicotiana benthamiana bait-plants infected with Sss cystosori and potato plants collected in La Unión (Antioquia). The validity of serological tests was confirmed by RT-PCR. A complete sequence of the RT domain and 441 nt of the CP gene were obtained. Phylogenetic analysis identified strain R25 as closely associated to the PMTV lineage distributed worldwide. A total of 19.26 mg of anti-CP-RT polyclonal antibodies useful in detecting PMTV in infected plants were obtained. As CP-RT is involved in transmission of PMTV by Sss, these antibodies will be useful for supporting not only diagnostic programs but also basic and epidemiologic studies aimed at understanding interactions between PMTV and Sss.Resumen. El Potato mop-top virus (PMTV) es uno de los virus re-emergentes en los cultivos de papa de Colombia, como resultado del aumento de la incidencia de su vector natural, el protozoo Spongospora subterranea f.sp. mamarinm@unal.edu.co (Sss), agente causal de la Sarna polvosa de la papa. Para la detección del virus se recomienda la realización simultánea de diferentes pruebas, así como la evaluación de múltiples submuestras por tejido bajo análisis. Con el fin de ampliar el rango de herramientas para la detección de PMTV, se obtuvieron anticuerpos dirigidos al dominio RT de la proteína CP-RT. Se secuenció dicho dominio en el aislamiento colombiano R25 de PMTV y se realizaron análisis bioinformáticos para ubicar regiones peptídicas con alto potencial inmunogénico. El péptido seleccionado fue inoculado en conejos para obtener anticuerpos, cuya utilidad fue evaluada a partir de pruebas de ELISA indirecto en plantas señuelo de Nicotiana benthamiana inoculadas con quistosoros de Sss y en plantas de papa obtenidas en La Unión (Antioquia). Estas pruebas estuvieron acompañadas con evaluaciones de RT-PCR. Se obtuvo la totalidad del dominio RT, así como 441 nt del gen CP. Los análisis filogenéticos identificaron la cepa R25 como asociada al linaje de PMTV mundialmente distribuido. Se obtuvieron 19,26 mg de anticuerpos, los que resultaron efectivos para detectar PMTV. Ya que CP-RT es responsable de la transmisión del PMTV por Sss, estos anticuerpos permitirán no sólo apoyar los programas de diagnóstico, sino también estudios básicos y epidemiológicos tendientes a evaluar las interacciones del PMTV y Sss.