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Objetivo: Avaliar a viabilidade celular de produtos descongelados por citometria de fluxo, utilizando corante 7-AAD, por comparação interlaboratorial. Material e método: Metodologia por citometria de fluxo, com equipamento DxFLEX, reagentes 7-AAD e CD45-FITC/ CD34-PE, da Beckman Coulter. Validação por comparação interlaboratorial (Laboratório de Terapia Celular da BP vs. laboratório de apoio) utilizando a mesma técnica, “lise das hemácias e lavagem das células” entre 11/2023 e 05/2024. Foram avaliadas 12 amostras descongeladas de células progenitoras hematopoiéticas coletadas por aférese (CPH), previamente criopreservadas com DSMO 5%/HES 6%, armazenadas em freezer a -80°C. A criopreservação dos produtos coletados foi realizada pelo laboratório de apoio, e a viabilidade de uma alíquota descongelada foi realizada por citometria, pelo laboratório de apoio, e pelo Laboratório de Terapia Celular da BP. A alíquota foi descongelada em temperatura ambiente. Em um tubo foram colocados 10 μL de CD34+CD45 e 10 μL de corante 7-AAD, na sequência, adicionado 100 μL da amostra diluída em PBS. Após 20 minutos de incubação em câmara escura, foi adicionado solução de lise, com nova incubação em câmara escura, adição de PBS seguindo centrifugação por 5 minutos a 3000 rpm. O sobrenadante foi retirado e ressuspendido com 1 mL de BPS. A amostra foi homogeneizada e filtrada com tela de poliamida, agitada em vórtex e adquirida no citômetro de fluxo, em painel previamente estruturado. Resultado: Os testes foram satisfatórios, com um coeficiente de variação inferior a 20%, em acordo com o guideline de validação ‒ CLSI H62. Viabilidade para CD34+ no laboratório BP (%): Mediana 95,77 (92,59–98,04), desvio padrão (dp) 2,13; e para laboratório Apoio: Mediana 96,80 (85,40–99,60), dp = 4,89. O Coeficiente de Variação (CV) para viabilidade CD34+ entre os resultados interlaboratorial foi de 3,03% e para a viabilidade total, foi de 3,63%. Destas 12 amostras, os resultados de 8 delas foram analisadas pela consultoria FlowMentor, que identificou reprodutibilidade da técnica empregada. A sua análise apresentou um coeficiente de variação para viabilidade CD34+ de 2,2% e 2,7% respectivamente para laboratório BP e de apoio, e um coeficiente de variação para viabilidade total de 4,1% e 4,6% respectivamente para laboratório BP e de apoio. Discussão: Uma das metodologias para investigação da viabilidade celular após o descongelamento de células criopreservadas é por citometria, pelo corante 7-AAD. Células não viáveis são coradas pelo 7-AAD, enquanto as células de membrana íntegra, são impermeáveis ao 7-AAD. É uma técnica pouco utilizada devido à dificuldade na sua padronização, levando muitos centros a utilizar método por microscopia, com uso de azul de trypan. A viabilidade é uma variável clinicamente importante para o sucesso do enxerto, a criopreservação por si implica riscos na viabilidade, e nem todas as células respondem igualmente aos protocolos de criopreservação, levando a diferenças na viabilidade. A técnica por citometria é mais indicada para produtos descongelados, pois quantifica especificamente células de interesse, enquanto a microscopia dá uma visão global da viabilidade leucocitária. Conclusão: Os resultados foram satisfatórios, com um CV muito inferior a 20%, o que torna a técnica “com lise e lavagem das células”segura, na rotina para células descongeladas.

Objetivo: O objetivo do trabalho foi validar a técnica para quantificação de células CD34+ no citômetro de fluxo da marca Beckman Coulter, modelo DxFLEX. A citometria de fluxo é uma técnica versátil usada para analisar as propriedades físico-químicas das células e partículas em suspensão. É possível quantificar e caracterizar células individuais com base em várias propriedades, como tamanho, forma e marcadores de superfície ou intracelulares. A principal função da citometria de fluxo é permitir a análise simultânea de milhares de células em alta velocidade. Material e método: O protocolo utilizado foi de plataforma única, estabelecido pelo ISHAGE (International Society of Hematotherapy and Graf Enginnering) com beads magnéticas para identificação da população alvo, no período de 02/05 à 21/06/2023, feito por comparação interlaboratorial (DxFLEX versus laboratório apoio). Foram utilizadas 20 amostras de sangue periférico de doador de sangue total (doador normal), 15 amostras de sangue periférico de doador mobilizado para coleta de CPH, 5 amostras de produtos de Células Progenitoras Hematopoiéticas (CPH) coletadas por aférese e 5 coletadas da medula óssea, 10 amostras de plasma de sangue total e 2 amostras comerciais, para controle, com contagem de células CD34+ conhecidas. Resultado: Precisão com R2 próximo de 1, variando até 10%, sendo em amostra de sangue periférico de doador normal um R2 = 0,90, amostra de sangue periférico de doador mobilizado um R2 = 0,94, e amostra de produto CPH coletado por aférese e de medula óssea com R2 = 0,99; repetibilidade das amostras variando até 2 desvios padrões; um valor de carryover definido em 1,52%; todos os testes branco foram realizados com plasma de doador normal e apresentaram resultados iguais a zero; sensibilidade analítica com coeficiente de variação médio de 14,6%, sendo o preconizado de até 20%; intervalo de referência do equipamento de acordo com o estabelecido pelo fabricante com valor de 0,06; e estabilidade das amostras por período de 24 horas quando mantidas em temperatura de 2°a 8°C. Discussão: As células CD34+ são células progenitoras hematopoiéticas encontradas na medula óssea e em outras fontes, como sangue periférico e cordão umbilical, e têm a capacidade de se diferenciarem em vários tipos de componentes sanguíneos, como hemácias, leucócitos e plaquetas. A quantificação das células CD34+ é de extrema importância para os transplantes de medula óssea desde a identificação do momento ideal para o início da coleta dos produtos por aférese, até a mensuração da quantidade de células CD34+ nos produtos provenientes de coletas por aférese ou da medula óssea para um transplante eficaz. A validação demonstrou precisão próxima de 100%, sem carreamento dos resultados entre a aquisição de amostras de valores altos e baixos, repetibilidade adequada com valores até 2 desvios padrões, sensibilidade analítica com coeficiente de variação dentro do preconizado (20%) e boa estabilidade das amostras quando armazenadas em temperatura de 2° a 8°C. Conclusão: Os resultados foram bastante satisfatórios o que torna segura a técnica da quantificação de CD34+ pelo equipamento DxFlex no serviço.