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Introdução: A participação dos neutrófilos como mediadores de infecção, trombose e neoplasia tem sido descrita em vários cenários. Além de seu papel na imunidade inata, sabe-se que os neutrófilos contribuem para ativação de inflamação, coagulação, imunossupressão através da formação de redes extracelulares de neutrófilos (NETs -neutrophil extracellular traps) em resposta a estímulos antigênicos e de ácidos nucleicos. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel da NETose no cenário do transplante hepático, situação em que há um estado inflamatório persistente, exacerbado por vários eventos, inclusive transfusão de hemocomponentes. Ainda, sabe-se que os pacientes hepatopatas são bastante complexos do ponto de vista hemostático e a identificação de possíveis marcadores preditores de transfusão e hemoderivados potencialmente auxiliaria no manejo clínico destes pacientes. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel de NETs como preditores de transfusão de hemocomponentes, bem como estabelecer uma correlação entre NETs e complicações em transplante hepático. Materiais e métodos: Foram quantificados DNA livre pela técnica de PicoGreen (dsDNAAssay Kit (ThermoFisherScientific, EUA) e H3 citrulinado por ELISA (clone 11D3, ELISA, Cayman), marcadores de remanescentes de NETs, no pré-operatório, intraoperatório e pós-operatório de 93 pacientes submetidos a transplante hepático em um hospital terciário em São Paulo-SP. Os pacientes foram seguidos desde a internação até a alta hospitalar e foram avaliados os seguintes desfechos clínicos: transfusão de hemocomponentes, uso de hemoderivados e antifibrinolíticos, rejeição, trombose, infecção e disfunção de órgãos. Resultados: Observamos uma ascensão dos níveis de H3 citrulinado e DNA livre do pré-operatório para o intraoperatório, com posterior declínio pré-alta hospitalar, de maneira estatisticamente significativa, (p < 0.0001), confirmando a ocorrência de NETOse exacerbada no intraoperatório do transplante hepático. Ainda, demonstramos que a liberação de NETs no intraoperatório foi preditora de óbito intra-hospitalar (OR = 1,168, CI 95% = 1,021-1,336, p = 0,024). Não se observou nenhuma associação entre NETose e transfusão, nem uso de hemoderivados. Entretanto, observou-se que a liberação de H3 citrulinado foi associada a menor uso de ácido tranexâmico durante o transplante (OR:0,824, CI95%0,705-0,964, p:0,016). Não foram observadas outras associações entre NETose no intraoperatório e demais desfechos clínicos negativos (rejeição, trombose, infecção ou disfunção de órgãos). Conclusão: Não foi possível estabelecer correlação entre NETose e necessidades transfusionais nos pacientes submetidos a transplante hepático. Entretanto, o presente estudo evidenciou uma associação significativa entre NETose e óbito intra-hospitalar. Dada a relevância da associação entre NETose e óbito e o papel central dos NETs na inflamação do transplante hepático, consideramos que NETs podem ser potenciais biomarcadores de inflamação nestes pacientes. Ainda, o desenvolvimento de terapêuticas focando na inibição de NETose poderia ser uma estratégia plausível para redução de efeitos deletérios da inflamação exacerbada inerente ao transplante. Mais estudos são necessários a fim de confirmar esta hipótese.

Introduction: Whether different manifestations of thrombotic antiphospholipid syndrome (APS) share pathological mechanisms has not been established. Transcriptome analysis may constitute a new approach to evaluate the mechanisms behind thrombotic manifestations in APS. Aim: To determine in patients with primary thrombotic APS (t-PAPS) the expression of genes already related to venous and arterial thrombosis in the general population. Method: mRNA was obtained from total leucocyte; gene expression was measured by qPCR and the results were analyzed by QuantStudio™Software. Results: 83 t-PAPS and 85 controls were included. The median age on the enrollment day was 40 years old (IQR 31 - 51) in patients and 38 (IQR 29 - 53) in controls, 66% of patients and controls were women and cardiovascular risk factors were more prevalent among t-PAPS than in controls (37% vs 11%). TXK (p < 0.001), BACH2 (p = 0.005), and SERPINB2 (p = 0.003) mRNA expressions were down-regulated while TNFAIP6 mRNA expression was up-regulated (p = 0.003) in t-PAPS compared to controls. A slightly increased gene expression of ANXA3 was observed in t-PAPS patients compared to controls, but it was not statistically significant. In subgroups analysis, patients were divided according to different manifestations of t-PAPS. TXK, BACH2, SERPINB2 and TNFAIP6 mRNA expressions were more pronounced in some subgroups. TXK mRNA expression was decreased mainly among patients with triple aPL positivity (p < 0.0001); BACH2 and SERPINB2 mRNA expressions were decreased in patients with a single thrombotic event (p = 0.002 and p = 003, respectively); and TNFAIP6 mRNA expression was particularly elevated in patients who had multiple thrombosis (p = 0.01). Discussion: The results showed a distinct pattern of gene expression between APS patients and controls. TXK regulates the development, function, and differentiation of T-cells and NKT-cells of the adaptive immune response. BACH2 is crucial for the maintenance of regulatory T-cell function and B-cell maturation. Both genes were down-regulated in t-PAPS, suggesting that the regulation of adaptative immune response is impaired in the disease. TNFAIP6, which is involved in cell-cell and cell-matrix interactions during inflammation, was up-regulated in t-PAPS, suggesting an increased pro-inflammatory response. Finally, SERPINB2, which inhibits the monocyte-derived urokinase-type plasminogen activator and is responsible for platelet and coagulation cascades activation, was down-regulated in t-PAPS patients. Although down-regulation of SERPINB2 appears to be a contradictory result, it may be evidence of an imbalance in the coagulation process, such as hypocoagulability. Therefore, we observed that innate immunity and hemostasis pathways are involved in the pathogenesis of thrombotic manifestations in t-PAPS at a transcriptome level. However, more study is needed to evaluate the pathways related to these genes, especially at cellular and biochemical levels. Conclusion: In this study, the expression of genes previously associated with thrombosis in the general population was validated in patients with t-PAPS. The main difference in gene expression was related to the regulation of cellular and humoral immunity. These genes were also associated with t-PAPS severity such as multiple thrombosis and triple antibody positivity. Our findings suggest that the deregulation of innate immunity and hemostasis is associated with the pathogenesis of t-PAPS at a molecular level.

As células dendríticas plasmocitóides (pDCs) produzem grandes quantidades de interferon (IFN)-1, mediando a resposta imune. O papel das pDCs nos mecanismos patológicos associados aos anticorpos antifosfolipídes (aPL) não está elucidado. Esse estudo caso-controle determinou a frequência e atividade das pDCs em diferentes formas de síndrome antifosfolipíde (SAF), e avaliou a expressão relativa de cinco genes indutores de INF-1: ISG15, OASL, LY6E, MX1 e OAS1. Foram utilizadas amostras de 50 pacientes com SAF trombótica primária, 47 pacientes com SAF trombótica secundária, 19 portadores de aPL assintomáticos e 50 indivíduos sem trombose (controles). As pDCs e a expressão intracelular de IFN-α (com e sem estímulo de oligodesoxinucleotídeos [CPG]) foram quantificadas por citometria de fluxo. A expressão relativa em monócitos dos genes indutores de INF-1 foi quantificada por qPCR. A frequência de pDCs foi semelhante entre controles (mediana 0,2%, intervalo interquartil [IQR] 0,1-0,2), aPL+ assintomático (0,2%; 0,1-0,3) e SAF primária (0,1%; 0,1-0,2); porém, as pDCs estavam diminuídas na SAF secundária (0,1%; 0,1-0,1, p = < 0,0001). A expressão basal de IFN-α intracelular esteve aumentada na SAF secundária (3,0%; 2,6-3,6) em relação a SAF primária (2,6%; 2,0-3,4), aPL+ (2,3%; 2,1-2,9), controles (2,5; 2,1-3,2; p = 0,008). Após estímulo com CPG, a mudança na expressão de IFN-α intracelular foi maior na SAF primária (0,9%, 0,5-1,2), secundária (1,5%; 1,0-2,0), em comparação com aPL+ assintomático (0,6%; 0,4-0,8), controles (0,4%; 0,2-0,7; p = < 0,0001). A expressão relativa dos genes indutores de INF-1 foi maior nos pacientes com SAF secundária, em relação aos outros grupos. A expressão relativa de ISG15 foi: 0,8% (0,3-4,6) em controles, 1,5% (0,5-9,7) em aPL+, 0,5% (0,4-2,9) na SAF primária, 4,8% (1,6-14,5) na SAF secundária; p < 0,0001. A expressão relativa de OASL foi: 0,5% (0,2-1,8) em controles, 0,9% (0,4-4,7) em aPL+, 0,4% (0,3-1,5) na SAF primária, 2,5% (0,8-7,8) na SAF secundária; p < 0,0001. O LY6E 0,7% (0,5-0,9) para controles, 1,1% (0,7- 2,6) para portadores de aPL, 0,8% (0,6-1,1) em SAF primária e 3,3% (0,9-6,6) para SAF secundária; p < 0,0001. O MX1 0,7% (0,4-1,0) para controles 0,9% (0,5-2,5) para portadores de aPL, 0,6% (0,4-1,0) para SAF primária e 3,1% (1,1-8,2) para SAF primária; p < 0,0001. O OAS1 0,6% (0,3-4,2) nos controles, 1,3% (0,4-17,9) em aPL positivos, 0,6% (0,3-4,7) SAF primária, 2,2% (0,8-6,9) na SAF secundária; P = 0,005. Neste estudo, observamos aumento da expressão intracelular de INF-α e dos genes indutores de INF-1 nos pacientes com SAF secundária, e maior reativação da via do INF-α após estímulo em pacientes com SAF primária. Esses resultados confirmam a participação do sistema imune inato (SII) no processo patológico tanto nas doenças autoimunes sistêmicas, quanto nos casos primários. Entretanto, tal estímulo da imunidade inata parece não estar relacionado a presença isolada dos anticorpos, uma vez que a expressão do INF não estava aumentada nos aPL+ assintomáticos. O SII parece participar da patogênese da SAF por estímulos adicionais a presença de aPL. Os mecanismos que levam indivíduos aPL+ a desenvolverem SAF são pouco elucidados, e esses resultados sugerem que a atividade do SII pode ser um fator determinante nas manifestações clínicas de SAF nesses indivíduos.

As vesículas extracelulares (VEs) estão presentes em todo o organismo, em geral nos fluidos corporais, e são transmissores intracelulares de sinais biológicos em condições fisiológicas e patológicas. São liberadas por células e carregam os mesmos componentes das mesmas. Suas ações patogênicas se dão principalmente em processos inflamatórios, trombose, doenças degenerativas, e câncer. No transplante ortotópico de fígado (TOF) há um estado inflamatório persistente chamado de lesão de isquemia-reperfusão, que é determinado por vários parâmetros, como as condições clínicas dos pacientes e condições do órgão transplantado, podendo levar ao óbito. A associação entre VEs e inflamação durante o TOF não foi investigada em estudos clínicos em humanos até o momento. Desta forma, o objetivo desse estudo é avaliar a associação entre o TOF e a formação de VEs em pacientes submetidos a esse tratamento. Para tal, 90 pacientes submetidos a TOF foram incluídos no estudo. Amostras de sangue foram coletadas no pré-transplante (T1), após a reperfusão (T2), e na alta hospitalar (T3). Foram quantificados nessas amostras os seguintes marcadores de VEs por citometria de fluxo: CD14 (monócitos), CD41A (plaquetas), CD62P (P-selectina), CD162 (glicoproteína-1 ligante de p-selectina ou PSGL-1), CD31 (adesão celular endotelial-plaquetária), CD9 e CD81 (tetraspaninas presentes em exossomos). Nas análises estatísticas, o nível de significância foi estabelecido em P < 0.05. As variações dos níveis de VEs nos 3 tempos de coleta foram avaliadas por análise de variância (ANOVA) com medidas repetidas e os seguintes marcadores apresentaram aumento no T2 (fase de reperfusão) com significância estatística: CD162 (P < 0,0001), CD31 (P < 0,0001), CD41A (P < 0,0001), CD9 (P < 0,0001), e CD81 (P < 0,0001). Avaliamos também a associação entre os níveis de VEs ao final do período cirúrgico e a ocorrência de desfechos adversos (infecção, trombose, rejeição do enxerto, retransplante e óbito). Nesses, o óbito foi o desfecho mais recorrente com relação aos marcadores em T2, sendo significante em CD162 (P = 0,003), CD31 (P = 0,01) e CD9 (P=0,05). Neste estudo, identificamos o aumento dos níveis de VEs associadas a ativação de plaquetas e células endoteliais, mas não de monócitos, em pacientes durante o TOF. Além disso, a liberação de VEs associadas a ativação de células endoteliais esteve relacionada ao risco de óbito. Estudos prévios sugerem importante papel das VEs na regulação da resposta imune e da atividade de celular. Nossos resultados apontam para a participação de VEs provenientes de plaquetas e células endoteliais no processo de inflamação e nos desfechos adversos do TOF. Esses achados contribuem não apenas para o entendimento da fisiopatologia das complicações do TOF, mas também podem representar uma alternativa diagnóstica para a identificação precoce do risco de complicações pós-transplante.

Inflammatory phenomena have a direct impact on the prognosis of orthotopic liver transplantation (OLT). Neutrophil extracellular traps (NETs) contribute to OLT inflammation and hemostasis imbalance in OLT. The association between NETosis, clinical outcomes and transfusion requirements is not determined. To evaluate NETs release during OLT and the effect of NETosis ontransfusion requirements and adverse outcomes in a prospective cohort of patients submitted to OLT. We quantified citrullinated histones (cit-H3) and circulating-free-DNA (cf-DNA) in ninety-three patients submitted to OLT in three periods: pre-transplant, after graft reperfusion and before discharge. NETs markers were compared between these periods using ANOVA test. The association of NETosis and adverse outcomes was evaluated using regression models adjusted for age, sex and corrected MELD. We observed a peak of circulating NETs following reperfusion, evidenced by a 2.4-fold increase in cit-H3 levels in the post-graft reperfusion period (median levels of cit-H3 pre transplant: 0.5 ng/mL, after reperfusion: 1.2 ng/mL and at discharge 0.5 ng/mL, p < 0.0001). We observed an association between increased levels of cit-H3 and in-hospital death (OR = 1.168, 95% CI 1.021-1.336, p = 0.024). No association was found between NETs markers and transfusion requirements. There is a prompt release of NETs after reperfusion that is associated with poorer outcomes and death. Intraoperative NETs release seems to be independent of transfusion requirements. These findings highlight the relevance of inflammation promoted by NETS and its impact on OLT adverse clinical outcomes., (© 2023. The Author(s), under exclusive licence to Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature.)

Antiphospholipid antibodies induce a pro-inflammatory and hypercoagulable state that lead to increased risk of thrombosis. Whether oxidative damage contributes thrombosis risk is a matter of debate. We evaluated the association between oxidative stress and thrombosis in primary antiphospholipid syndrome (t-PAPS). Plasma total antioxidant capacity and the levels of malondialdehyde (TBARs), carbonyl protein, and 8-isoprostane in plasma were determined in a group of patients with t-PAPS and in individuals without a history of thrombosis (controls) using commercial ELISA assays. The levels of these plasma markers of oxidative stress were compared between t-PAPS and controls using Mann-Whitney test. A total of 70 patients with t-PAPS and 74 controls were included. Overall, measurements of all plasma oxidative stress markers were similar between t-PAPS patients and controls. In a subgroup analysis, patients with t-PAPS and arterial thrombosis had a higher antioxidant capacity as compared to controls. Thrombotic PAPS was not associated with increased levels of oxidative stress markers, in comparison with individuals without thrombosis. Even though it is not possible to rule out that a mild oxidative damage, not detected by plasma markers, occurs in t-PAPS, our results suggest that measuring plasma oxidative stress markers has limited clinical relevance in t-PAPS., (© 2021. The Author(s).)