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Iron-sulfur clusters biogenesis is a process involving numerous proteins and the defects of one of them lead to severe diseases such as anaemia, neurodegenerative process, diabetes, cardiac hypertrophy and cancers. Iron-sulfur (Fe-S) clusters are critical prosthetic groups of proteins involved in redox processes such as ATP production, enzymatic catalysis, protein synthesis and maintenance of genome integrity. Therapeutic strategies based on the development of drugs mimicking the function of the proteins that perform the synthesis of these clusters are still in their infancy due to the lack of understanding of the exact molecular and biochemical mechanisms of their synthesis. The PhD project has mainly focused on the mechanism of Fe-S cluster biosynthesis by the ISC machinery and the functional role of frataxine in this process, a key regulator of the whole process, for which a defective expression leads to Friedreich's ataxia, a severe neurodegenerative and cardiac disease. Indeed, the assembly sequence of these Fe-S clusters was poorly defined, especially on the coordination of the insertion of iron and sulfur to form a polynuclear Fe-S cluster. Moreover, the nature of the final product of this ISC machinery was subject to debate: [2Fe2S] or [4Fe4S]. The global aim of the PhD project was to reconstitute the Fe-S cluster assembly machinery, eukaryote and prokaryote, with purified proteins to determine the structural basis of the assembly process using a panel of biochemical (kinetics, alkylation assay) and biophysical (Mössbauer, NMR, circular dichroism and EPR spectroscopies and native mass spectrometry) techniques, in order to understand how Fe-S clusters are synthesized and how frataxin regulates this process.; La biosynthèse des centres Fe-S est un processus impliquant un très grand nombre de protéines et la déficience de l’une de ces protéines conduit à des pathologies sévères : anémie, processus neurodégénératif, diabètes, hypertrophie cardiaque et même cancers. Ces centres Fe-S sont des groupements prosthétiques de protéines impliquées dans une multitude de processus redox tels que la production d'ATP, la catalyse enzymatique, la synthèse protéique ou encore la maintenance de l'intégrité du génome. Les stratégies thérapeutiques basées sur le développement de composés capable de mimer la fonction des protéines assurant la synthèse des centres Fe-S sont peu développées en raison du manque d'information sur les mécanismes moléculaires et biochimiques de synthèse de ces cofacteurs métalliques particulièrement versatiles. Le projet de thèse s’est principalement intéressé à l’élucidation du mécanisme de biosynthèse des centres Fe-S par la machinerie ISC et au rôle fonctionnel de la frataxine dans ce processus qui est une protéine centrale dont le défaut d'expression conduit à l'ataxie de Friedreich, une maladie neurodégénérative et cardiaque. En effet, la séquence d’assemblage de ces centres Fe-S était mal défini notamment sur la coordination de l’insertion du fer et du soufre pour former un centre polynucléaire Fe-S. De plus, la nature du produit final de cette machinerie ISC était sujette à débat : [2Fe2S] ou [4Fe4S]. L'objectif principal de ce projet de thèse était de reconstituer in vitro la machinerie d'assemblage des centres Fe-S, eucaryote et procaryote, à partir des protéines purifiées afin de déterminer les bases biochimiques et structurales du processus d'assemblage en utilisant un panel de techniques biochimiques (cinétique d’assemblage, test d’alkylation) et biophysiques (spectroscopies Mössbauer, RMN, RPE, spectrométrie de masse native et dichroïsme circulaire), dans le but de comprendre comment les centres Fe-S sont synthétisés et comment la frataxine régule ce processus.

Friedreich ataxia is a severe neurodegenerative disease caused by reduced expression of frataxin (FXN), a small mitochondrial protein involved in iron-sulfur (Fe/S) cluster biogenesis which are prostetic groups with essential cellular functions. It has been shown in vitro that mammalian FXN activates Fe/S cluster synthesis on the scaffold protein ISCU, by rising up suflide ion production by NFS1-ISD11-ISCU complex. However, the mechanism by which frataxin stimulates Fe/S cluster biogenesis has not been yet defined. We have studied the effect of FXN on the kinetics of formation and reduction of persulfides that are key intermediates of sulfide ion production generated by NFS1, using mass spectrometry and a new detection assay for persulfide based on gel-mobility shift following alkylation by maleimide-peptide compounds. We demonstrate that frataxin activates two similar reactions : sulfur transfer from cysteine desulfurase NFS1 to ISCU leading to accumulation of a persulfide on ISCUcysteine C104 and reduction of NFS1 persulfide by thiol reducers such as DTT, L-cysteine and glutathion. We have observed that FXN does not stimulate the rate of ISCU persulfide reduction by thiols and that this persulfide is reduced much more slowly than NFS1 persulfide. We have then correlated the reduction of NFS1 persulfide with Fe/S cluster assembly. Under our experimental conditions, the sulfur from ISCU persulfide is not incorporated into the Fe/S cluster. However, we cannot exclude that an as yet not identfiied reductase could reduces ISCU persulfide and trigger Fe/S cluster assembly. Overall, our data point to a regulatory function of FXN as an enhancer of persulfide reduction, stimulating the rates of sulfur transfer to ISCU and NFS1 persulfide.; L’ataxie de Friedreich est une maladie neurodégénérative sévère causée par un défaut d’expression de la frataxine (FXN), une petite protéine mitochondriale impliquée dans la biogenèse des centres fer-soufre (Fe/S), des groupement prosthétiques aux fonctions cellulaires essentielles. Chez les mammifères, il a été montré que la frataxine stimule la synthèse in vitro de centres Fe/S sur la protéine d’échaffaudage ISCU, grâce à l’augmentation de la production d’ions sulfures par le complexe NFS1-ISD11-ISCU. Cependant, le mécanisme par lequel la frataxine active la biogenèse des centres Fe/S n’a pas encore été défini. Nous avons étudié les effets de FXN sur les cinétiques de formation et de réduction des persulfures, des intermédiaires clés de la production d’ions sulfures, générés par la cystéiene désulfurase NFS1, à l’aide d’un test de détection des persulfures basé sur l’utilisation de composés synthétiques peptide-maléimide et de la spectrométrie de masse. Nous avons montré que FXN active deux réactions très similaires : la réduction du persulfure de NFS1 par des réducteurs à thiols comme le DTT, la L-cystéine et le glutathion et le transfert de soufre de NFS1 vers ISCU, conduisant à l’accumulation de persulfure sur la cystéine C104 d’ISCU. Nous avons constaté que la vitesse de réduction du persulfure d’ISCU par les thiols n’est pas affectée en présence de FXN et que ce persulfure est réduit plus lentement que celui de NFS1. Nous avons corrélé l’activation par FXN de la réduction du persulfure de NFS1 par les thiols à une stimulation de l’assemblage d’un centre Fe/S sur ISCU. Dans nos conditions expérimentales, l’atome de soufre du persulfure d’ISCU n’est pas incorporé dans le centre Fe/S synthétisé, mais nos résultats ne permettent pas d’exclure que ce persulfure puisse être réduit par une réductase dédiée, encore non identifiée. L’ensemble de nos données indiquent que le rôle de la frataxine est de contrôler la réduction du persulfure de NFS1, en augmentant les vitesses de transfert de soufre vers ISCU et de réduction du persulfure de NFS1 par les thiols.

Friedreich’s ataxia (FA) is a recessive neurodegenerative disorder due to a deficit of frataxin, a highly conserved mitochondrial protein. It is commonly associated with a hypertrophic cardiomyopathy. The main pathophysiological consequences are a decrease of Fe-S enzyme activities and mitochondrial iron accumulation. The recent technical advances in the generation of induced pluripotent stem cells (iPS) from somatic cells provide a powerful tool to create disease specific cellular models. Cardiomyocytes derived from FA-iPS present altered mitochondria after 1 month in culture. After four months in culture, iron deposits can be found in degenerating mitochondria, indicating a progression in the pathophysiology of the disease. Our study illustrates the ability of iPS-derived cardiomyocytes to model the cardiac phenotype associated with FA, and offers new opportunities to further investigate pathological mechanisms linked to frataxin deficiency.; L’ataxie de Friedreich (AF) est une maladie neurodégénérative récessive due à un déficit en frataxine, une protéine mitochondriale très conservée. Elle est souvent associée à une atteinte cardiaque. Le déficit en frataxine est responsable d’une diminution de l’activité des enzymes Fe-Set d’une accumulation mitochondriale de fer. Les cellules pluripotentes induites (iPS) générées par reprogrammation de cellules somatiques constituent un outil puissant pour le développement de modèles de maladies monogéniques. Les cardiomyocytes obtenus par différenciation des iPS de patients AF développent une atteinte mitochondriale après 1 mois en culture. Celle-ci se complète par l’apparition secondaire de dépôts de fer, visibles après 4 mois en culture, indiquant une progression dans la physiopathologie de la maladie. Notre étude montre la capacité de ces cardiomyocytes à modéliser le phénotype cardiaque de l’AF, offrant ainsi l’opportunité d’approfondir leur caractérisation physiopathologique.

Friedreich Ataxia (FA) is the most prevalent form of autosomal recessive ataxia in the Caucasian population. Frataxin is implicated in the biosynthesis of iron-sulfur (FeS). The first axis of my work was to better characterize the function of Frataxin in the “early” complex of FeS clusters biosynthesis (NFS1/ISD11/ISCU). I was able to show the crucial involvement of Frataxin in the control of iron entry in this complex, on the enzymatic activity of NFS1 and on the transfert of FeS cluster to apo-proteins. Thesecond axis was the development of a bio-informatic software (PredISC) that is able to predict potential iron-sulfur containing proteins. The software allows us to generate a list of candidates that will be compiled in a database. In the future transversal approaches have to be associated in order to reduced the number of candidates, and increase their interest.; L’Ataxie de Friedreich est une maladie génétique récessive neurodégénérative. Elle est due à un déficit dans l’expression d’une protéine mitochondriale, la frataxine. Cette protéine est impliquée dans l’assemblage des protéines fer-soufre (FeS). Le premier axe de ma thèse a consisté à mieux caractériser le rôle de la frataxine au sein du complexe précoce de biosynthèse des clusters FeS (NFS1/ISD11/ISCU). Mes résultats m’ont permis de mettre en évidence l’importance de la frataxine dans le contrôle de l’entrée du fer au sein du complexe de biosynthèse, sur l’activité enzymatique de NFS1 et sur le transfert des clusters FeS vers les apo-protéines. Le second axe a été le développement du programme de bioinformatique (PredISC) nous permettant des candidats de protéines FeS. Ce programme a permis de générer une liste de candidat qui pourra être compilée sous la forme d’une base de données. Par la suite, des approches transversales y seront associées à afin d’affiner les listes de candidats.