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Bambusa oldhamii Munro is a fast-growing species of woody bamboo with strong commercial appeal. In Brazil, the use of this species is limited, mainly due to the low availability of seedlings for commercial plantations. Micropropagation is a technique used for the large scale production of seedlings, but protocols for the establishment of aseptic cultures are hampered by the presence of endophytic contamination. This study aimed to develop an in vitro establishment protocol for B. oldhamii, as well as to make the molecular identification of fungi associated with the explants used. Nodal segments of adult plants grown in the field were used as explants. This material was submitted to two experiments carried out to evaluate the effect of 6-benzylaminopurine (BAP) on multiplication and of Plant Preservative Mixture (PPMTM) as a disinfectant. In the first one, 10 µM, 15 µM or 20 µM of BAP were combined with 1 mL L-1, 2 mL L-1 or 3 mL L-1 of PPMTM; while the second one used 0 µM, 2.5 µM, 5 µM or 7.5 µM of BAP with 4 mL L-1 of PPMTM, both added to MS culture medium. After 21 days of culture, the use of 4 mL L-1 of PPMTM inhibited the bacterial growth and reduced fungal contamination. The addition of BAP to the culture medium above 10 µM inhibited the formation and growth of new shoots, while additions of less than 7,5 µM had no effect. The molecular identification of the endophytic fungi isolated during the in vitro culture indicated the presence of numerous fungal species, increasing the current knowledge about the diversity of fungi associated with bamboo. RESUMO Bambusa oldhamii Munro é uma espécie de bambu lenhoso de crescimento rápido e com forte apelo comercial. No Brasil, o uso dessa espécie é limitado, devido, principalmente, à baixa disponibilidade de mudas para plantios comerciais. A micropropagação é uma técnica de produção de mudas em larga escala, porém, protocolos de estabelecimento de culturas assépticas são dificultados pela presença de contaminação endofítica. Objetivou-se desenvolver um protocolo de estabelecimento in vitro de B. oldhamii, bem como efetuar a identificação molecular de fungos associados aos explantes utilizados. Segmentos nodais de plantas adultas cultivadas a campo foram utilizados como explantes. Esse material foi submetido a dois experimentos, avaliando-se o efeito de 6-benzylaminopurine (BAP) na multiplicação e de Plant Preservative Mixture (PPMTM) na desinfestação. No primeiro, foram utilizadas concentrações de BAP de 10 µM, 15 µM ou 20 µM, combinadas com 1 mL L-1, 2 mL L-1 ou 3 mL L-1 de PPMTM, e, no segundo, 0 µM, 2,5 µM, 5 µM ou 7,5 µM de BAP, com 4 mL L-1 de PPMTM, ambos adicionados a meio de cultura MS. Após 21 dias de cultivo, o uso de 4 mL L-1 de PPMTM inibiu o crescimento bacteriano e reduziu a contaminação fúngica. A presença de BAP no meio de cultura acima de 10 µM inibiu a formação e o crescimento de brotos novos, enquanto as concentrações inferiores a 7,5 µM não tiveram efeito. A identificação molecular dos fungos endofíticos isolados durante a cultura in vitro indicou a presença de inúmeras espécies fúngicas, ampliando o conhecimento sobre a diversidade de fungos associados ao bambu.

The present study intended to investigate the effects of different glutathione (GSH) levels (0, 0.1, 0.5 and 1 mM) on the somatic embryogenesis (SE) induction of Acca sellowiana. Besides, we evaluated the effect of different carbon sources (sucrose and maltose) on the somatic embryos conversion. GSH-supplemented treatments resulted in improved SE induction rates (~70%) as compared to the control GSH-free (~35%) after 50 days of culture. The total number of somatic embryos obtained did not differ between treatments, but significant differences were observed for the embryonic stages after 80 days of culture. After 80 days of culture, 0.5 and 1 mM GSH-supplemented treatments showed the largest amount of torpedo-staged somatic embryos. In contrast, treatments supplemented with 0 and 0.1 mM GSH showed equal amounts of somatic embryos at all embryonic stages. These results indicate that GSH accelerates the SE induction process and increases the synchrony of the somatic embryo formation of A. sellowiana. The use of maltose for the somatic embryos conversion, as compared to sucrose, did not influence the conversion rate of normal chlorophyllous somatic embryos, but increased the formation of normal achlorophyllous somatic plantlets. This finding can be attributed to the rapid hydrolysis of sucrose, contributing to an enhanced chlorophyll synthesis.

Somatic embryogenesis (SE) is an analogous process to zygotic embryogenesis (ZE); both complex processes are influenced by a significant number of genetic and environmental factors. Amino acids are considered important regulators of morphogenesis in several plant species, therefore the aim of this study was to determine the role of amino acids in embryo ontogeny in Acca sellowiana. Endogenous levels of amino acids were quantified at different stages of development during both direct and indirect somatic embryogenesis (DSE and ISE) and during ZE. During ZE, there was an increase in total amino acids between 18 and 27 days after pollination. During ISE and DSE, the highest contents were detected from 3 to 15 days after inoculation, coinciding with the induction of somatic embryos. In ZE, glutamine and asparagine appeared to be fundamental to the process of induction of zygotic embryos. On the other hand, the induction of somatic embryos that appeared require glutamine, gamma-aminobutyric acid (GABA) and glutamic acid. The results suggest the involvement of amino acids in the ontogenesis of zygotic and somatic embryogenesis directly and indirectly in A. sellowiana, indicating requirements for specific amino acids for each event of development.Keywords: Acca sellowiana, somatic embryogenesis, zygotic embryogenesis, glutamine, asparagine, amino acidsAfrican Journal of Biotechnology Vol. 12(22), pp. 3455-3465

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2015. A conífera brasileira Araucaria angustifolia encontra-se dispersa no bioma Mata Atlântica e é conhecida popularmente como araucária ou pinheiro-brasileiro. Segundo a IUCN, a A. angustifolia encontra-se em perigo crítico de extinção, reforçando a necessidade de mais estudos que visem sua conservação e propagação. A cultura de tecidos vegetais engloba um conjunto de ferramentas biotecnológicas que possibilitam a conservação e melhoramento genético de plantas. A rota morfogenética in vitro de embriogênese somática (ES) pode ser empregada para a propagação massal clonal de genótipos de interesse, para a conservação de espécies ameaçadas de extinção ou para o estudo de processos fisiológicos, genéticos e bioquímicos envolvidos no desenvolvimento embrionário. O protocolo de ES para a A. angustifolia tem sido extensivamente estudado ao longo dos anos e encontra-se parcialmente desenvolvido, sendo seu principal limitante o processo de diferenciação e maturação das culturas embriogênicas (CE). Por outro lado, estudos envolvendo a criopreservação de CE desta espécie são ainda incipientes, apesar de toda sua importância estratégica na conservação de germoplasma in vitro de espécies recalcitrantes. Paralelamente, o cultivo in vitro e a suplementação do meio de cultura com reguladores de crescimento de plantas são conhecidos por afetar a metilação do DNA e os perfis de expressão de proteínas, modulando o fenótipo e/ou o potencial embriogênico. Neste contexto, o objetivo geral deste trabalho foi aprofundar os conhecimentos a respeito da ES e da criopreservação de CE de A. angustifolia visando à identificação e elucidação dos seus pontos de controle, por meio de estudos ultraestruturais e bioquímicos. Os resultados alcançados permitiram: a obtenção de um mapa de destino da ES de A. angustifolia através da técnica de time-lapse cell tracking, fornecendo informações relevantes a respeito da morfologia das CE durante as etapas de micropropagação e análises ultraestruturais dos tipos celulares que as compõem; a obtenção de um protocolo de criopreservação eficiente para as CE de A. angustifolia, aliado a análises morfológicas e ultraestruturais durante as etapas do protocolo; a análise dos níveis de metilação do DNA global das CE de A. angustifolia durante sucessivos ciclos de multiplicação em presença ou ausência de fitorreguladores, bem como a identificação de uma vasta gama de proteínas expressas diferencialmente nesses tratamentos através da técnica de proteômica shotgun revelou diferenças relevantes nos perfis de expressão protéica. Um maior detalhamento destes resultados e suas implicações encontra-se nos capítulos desta tese. Abstract : The Brazilian conifer Araucaria angustifolia naturally occurs in the Atlantic Forest Biome, and is popularly known as araucaria or Brazilian-pine. According to the IUCN, this species is critically endangered, reinforcing the need for further studies aimed at their preservation and propagation. Plant tissue culture encompasses a range of biotechnology tools that enable the conservation and plant breeding. The somatic embryogenesis (SE) morphogenetic route can be employed for mass clonal propagation of elite genotypes, conservation of endangered species, and for the study of physiological, genetic and biochemical processes involved in embryonic development. The SE protocol for A. angustifolia has been extensively studied over the past years and is partially developed. The differentiation process and embryogenic cultures (EC) maturation is this protocol limiting fator. Otherwise, studies involving the EC cryopreservation of this species are still incipient, in spite of its strategic importance in the in vitro germplasm conservation of recalcitrant species. In addition, in vitro tissue culture and culture médium supplementation with plant growth regulators are known to affect DNA methylation and protein expression profiles, modulating the phenotype and/or the embryogenic potential. In this context, the aim of this study was to deepen the knowledge about SE and EC cryopreservation of A. angustifolia, aiming at the identification and elucidation of its control points by means of ultrastructural and biochemical studies. The results achieved allow: obtaining a SE fate map of A. angustifolia by time-lapse cell tracking technique, providing relevant information about the EC morphology during the micropropagation stages and ultrastructural charaterization of cell types which constitute them; obtaining an efficient protocol for A. angustifolia EC cryopreservation, combined with morphological and ultrastructural analyses during steps of the protocol; analysis of global DNA methylation of A. angustifolia EC during successive multiplication cycles in the presence or absence of plant growth regulators as well as the identification of a wide range of proteins differentially expressed in these treatments by shotgun proteomics technique, revealing significant differences in protein expression profiles. More detailed results and their implicatins are presented in the specific section of this thesis.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais. O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito do inibidor da metilação do DNA 5-Azacitidina (AzaC) na embriogênese somática em Acca sellowiana por meio de análises morfológicas e microscopia óptica, além de estudar os padrões de metilação do DNA global por meio da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Embriões zigóticos de dois acessos de A. sellowiana (101X458 e 85) foram submetidos a quatro diferentes pulsos de 1h (200 µM de 2,4-D; 200 µM de 2,4-D e 10 µM de 5-AzaC; 10 µM de AzaC; e 100 µM de AzaC), seguidos da inoculação em meio de cultura LPm suplementado com maltose (30 g.L-1), vitamina de Morel, ácido glutâmico (8 mM) e Phytagel® (2 g.L-1), com diferentes concentrações de AzaC (0, 10 e 50 µM). Os embriões somáticos obtidos foram, após 50 dias de cultivo, inoculados em meio de conversão LPm suplementado com vitaminas de Morel, sacarose (30 g.L-1), BAP (0,5 µM), AG3 (1,0 µM) e carvão ativado (1,5 g.L-1). Paras as análises por HPLC amostras obtidas aos 10, 20 e 30 dias de cultivo foram submetidas à extração de DNA e posterior digestão de ácidos nucleicos, sendo detectados por meio de dois tipos de detecção diferentes: detector UV e espectrometria de massas (MS/MS). Os tratamentos isentos de 2,4-D apresentaram inibição da formação de embriões somáticos em ambos os acessos testados. O tratamento com suplementação de 10 µM de AzaC no meio de cultura e pulso de 2,4-D resultou na maior formação de embriões para o acesso 101X458, indicando médias de 19.6, 60 e 110.4 embriões somáticos, aos 20, 30 e 45 dias, respectivamente. Para o acesso 85, o tratamento com 50 µM de AzaC com pulso de 2,4-D resultou no maior número de embriões somáticos formados, indicando médias de 14.4, 364.4 e 484 embriões somáticos, aos 20, 30 e 45 dias, respectivamente. Para a conversão, foram obtidas taxas médias de conversão para plântulas de 35% para o acesso 101X458 e 30,2% para o acesso 85, e para o tratamento com pulso 200 uM 2,4-D/50 uM AzaC 16,6% e 8,9%, respectivamente. As análises dos nucleosídeos por HPLC/MS/MS se mostraram mais precisas e mais rápidas, realizando a separação dos compostos em 8 min, comparado a 25 min por HPLC/UV. Os dados obtidos por HPLC/MS/MS indicaram para as amostras do acesso 101X458 no tratamento com pulso 200 µM 2,4-D/0 uM AzaC um aumento crescente na metilação dos 10 aos 30 dias (34,7%, 40,9% e 44,3%, respectivamente). No tratamento com pulso 200 µM 2,4-D/50 µM AzaC observou-se uma queda nos níveis de metilação entre os 10 e 20 dias, seguido de uma alta (39,5%, 36,2% e 41,6%, respectivamente). Para o tratamento com pulso 100 µM AzaC/50 µM AzaC, observou-se uma queda nos três períodos de avaliação (36,8%, 28,8% e 20,8%, respectivamente). Para o acesso 85 o tratamento controle apresentou valores de 22,6%, 35,2% e 41% e o que continha AzaC e 2,4-D valores de 29,9%, 38,9% e 42,6%, sendo estes os tratamentos que estiveram associados à indução da ES. Por outro lado, o tratamento com AzaC, que não resultou na indução da ES, apresentou um padrão bastante distinto, com queda gradual nos níveis de metilação dos 10 aos 30 dias (37,6%, 24,7% e 21,5%). Os resultados obtidos indicam que o AzaC influencia positivamente a indução de embriões somáticos nesta espécie, contudo, o pulso de 2,4-D se mostrou essencial para este processo. Além disso, foi observado que a presença do AzaC no meio de cultura de indução parece prejudicar as taxas de conversão dos embriões somáticos a plântulas. Já os níveis de metilação parecem exercer um papel preponderante no processo de indução da ES em A. sellowiana.

Orientador: Prof. Dr. Hugo Pacheco de Freitas Fraga Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Botânica. Defesa : Curitiba, 29/06/2022 Inclui referências Resumo: Araucaria angustifolia é a principal componente da Floresta de Araucária, que foi explorada indiscriminadamente e ainda se encontra altamente ameaçada, em perigo crítico de extinção. Para além da sua madeira de alta qualidade, essa espécie fornece subprodutos e alimentação para populações humanas e fauna nativa, além de promover microhabitats adequados para o desenvolvimento de outras espécies. Dessa forma, tendo em vista a atuação que A. angustifolia possui nas relações ecológicas, etnoecológicas e econômicas das regiões onde habita, torna-se de interesse o desenvolvimento de técnicas voltadas à conservação e propagação dessa espécie ameaçada. A embriogênese somática (ES) é uma rota morfogenética da micropropagação que tem mostrado resultados promissores quando avaliada a quantidade de propágulos gerados a partir de uma única planta, e a qualidade genética conferida a eles. No entanto, os conhecimentos que regem os processos moleculares e bioquímicos da ES ainda são bastante fragmentados, gerando um gargalo para a ampla aplicação dessa técnica em A. angustifolia e outras coníferas. Além disso, os embriões zigóticos, tradicionalmente utilizados como explantes iniciais para o estabelecimento das culturas embriogênicas, são retirados das sementes da Araucaria, que se encontram disponíveis para coleta apenas em determinada época do ano, além de apresentarem curta longevidade natural. Neste contexto, o objetivo geral deste trabalho foi viabilizar culturas embriogênicas de A. angustifolia a partir da utilização de ápices ortotrópicos e plagiotrópicos como explante inicial e aprofundar os conhecimentos a respeito dos processos moleculares que ocorrem na fase de indução da embriogênese somática a partir dessas culturas através de estudos proteômicos. Os resultados alcançados permitiram estabelecer culturas embriogênicas viáveis a partir dos ápices avaliados; identificar processos morfológicos e fisiológicos que ocorrem nas células de cada tipo de calo; identificar e quantificar as proteínas presentes em ambas as culturas; entender os diferentes mecanismos moleculares e biquímicos que ocorrem em cada tipo de calo e; mapear marcadores moleculares do processo de indução da embriogênese somática em A. angustifolia. Abstract: Araucaria angustifolia is the main component of the Araucaria Forest, which has been indiscriminately exploited and is still highly threatened, in critical danger of extinction. In addition to its high-quality wood, this species provides by-products and food for human populations and native fauna and promotes suitable microhabitats for the development of other species. Thus, given the role that A. angustifolia has in the ecological, ethnoecological, and economic relationships of the regions where it inhabits, the development of techniques aimed at conserving and propagating this endangered species becomes of interest. Somatic embryogenesis (SE) is a morphogenetic route of micropropagation that has shown promising results when evaluating the amount of propagules generated from a single plant and the genetic quality. However, the knowledge that governs the molecular and biochemical processes of SE is still quite fragmented, creating a bottleneck for the broad application of this technique in A. angustifolia and other conifers. Furthermore, zygotic embryos, traditionally used as initial explants for the establishment of embryogenic cultures, are taken from Araucaria seeds, which are available for collection only at a specific time of the year and have short natural longevity. In this context, the general objective of this work was to enable embryogenic cultures of A. angustifolia from the use of orthotropic and plagiotropic apexes as initial explants and to deepen the knowledge about the molecular processes that occur in the induction phase of somatic embryogenesis from these cultures through proteomic studies. The results achieved allowed establishing viable embryogenic cultures from the evaluated apexes; identifying morphological and physiological processes that occur in the cells of each type of callus; identifying and quantifying the proteins present in both cultures; understand the different molecular and biochemical mechanisms that occur in each type of callus and to map molecular markers of the process of induction of somatic embryogenesis in A. angustifolia.

Orientador: Prof. Dr. Hugo Pacheco de Freitas Fraga Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Botânica. Defesa : Curitiba, 30/06/2022 Inclui referências: p. 49-69 Resumo: Embriogênse somática (ES) é definida como um processo no qual uma estrutura bipolar semelhante a um embrião zigótico se desenvolve a partir de uma célula não zigótica sem conexão vascular com o tecido de origem. Os embriões somáticos são utilizados para estudar a regulação e o desenvolvimento embrionário, e também como ferramenta para a propagação vegetativa em larga escala. ES é um processo de regeneração de várias etapas que se inicia com a formação de massas pro-embriogênicas (PEMS) seguida pela formação de embriões somáticos, maturação, e regeneração da planta. Desde o primeiro relato de formação de embriões somáticos in vitro em 1958, o potencial de ES tem sido demonstrado em uma ampla variedade de espécies de plantas. Considerando a diversidade de plantas, mesmo dentro de uma espécie, nem todas as plantas são capazes de passar por esse processo. A ES nas gimnospermas foi relatada pela primeira vez em P. abies, e desde então tem sido obtida para uma grande parcela de espécies como dos gêneros Abies, Araucaria, Larix, Picea, Pinus, Pseudotsuga e Sequoia, todas 'coníferas', um grupo de espécies muito antigo e bem conhecido de gimnospermas que são em sua maioria árvores de grande porte. A maioria dos estudos de ES em gimnospermas pertencem à família Pinaceae, deixando de lado as outras famílias (Cupressaceae, Taxaceae, Cephalotaxaceae e Aaraucariaceae). Dentro da família Pinaceae, a maioria das espécies para as quais protocolos foram estabelecidos são dos gêneros Pinus e Abies. Este fato pode ser constatado pela observação dos inúmeros estudos realizados desde a primeira descrição do SE em gimnospermas, utilizando o abeto norueguês (Picea abies). De fato, a ES é uma via morfogênica complexa na qual várias variantes influenciam o processo para alcançar um resultado satisfatório, algo que também depende da espécie alvo. Por esta razão, esta revisão aborda o progresso dos protocolos de ES nessas famílias de gimnospermas negligenciadas, as espécies não-Pináceas discutindo o que já é conhecido e destacando os gargalos atuais. Abstract: Somatic embryogenesis (SE) is defined as a process in which a bipolar structure resembling a zygotic embryo develops from a non-zygotic cell without vascular connection to the original tissue. Somatic embryos are used to study the regulation of embryonic development, but also as a tool for large-scale vegetative propagation. SE is a multistep regeneration process that begins with the formation of proembryogenic masses (PEMs), followed by somatic embryo formation, maturation, desiccation, and plant regeneration. Since the first report of in vitro somatic embryo formation in 1958, the SE potential has been demonstrated in a wide variety of plant species. Considering the diversity of plants, even within the same species, not all plants are capable of undergoing this process. SE in the gymnosperms was first reported for P. abies, and since then it has been obtained in a large number of species such as Abies, Araucaria, Larix, Picea, Pinus, Pseudotsuga, and Sequoia, all of which are "conifers', a very ancient and well-known group of gymnosperms that are mostly large trees. The majority of SE studies reported on gymnosperms belong to the Pinaceae family, leaving aside the other families (Cupressaceae, Taxaceae, Cephalotaxaceae, and Araucariaceae). Within the family Pinaceae, most species for which protocols have been established are from the genera Pinus and Abies. This fact can be stated by observing the numerous studies performed since the first description of SE in gymnosperms, using Norway spruce (Picea abies). Indeed, SE is a complex morphogenetic pathway in which several variants influence the process to achieve a successful outcome, which also depends on the target plant species. Nevertheless, this type of detachment may result in the "remaining" families of gymnosperms, a large monophyletic group of plants both living and fossil, being unknown and potential discoveries being lost. For this reason, in this review we address the progress of the SE protocols on these neglected gymnosperm families, particularly the non-Pinaceae species, discussing what is already known and highlighting current bottlenecks.

Orientador: Prof. Dr. Hugo Pacheco de Freitas Fraga Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Botânica. Defesa : Curitiba, 18/12/2020 Inclui referências: p. 46-51 Resumo: As orquídeas tendem a produzir uma grande quantidade de sementes, mas apresentam baixas taxas de germinação na natureza devido à ausência de tecido de reserva e a necessidade de interação com fungos micorrízicos para estabelecer uma germinação efetiva. O cultivo in vitro de plantas é uma biotecnologia que permite a propagação e conservação ex situ de espécies vegetais, e tem sido extensivamente empregado para diversas espécies de orquídeas. No entanto, existem poucos relatos do seu uso para orquídeas da Subtribo Pleurothallidinae. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi estabelecer caracterização na fase inicial de desenvolvimento in vitro e avaliar os efeitos de diferentes concentrações de 6- benzilaminopurina durante a organogênese de Dryadella zebrina. Sementes de D. zebrina foram germinadas in vitro e as plântulas obtidas através do experimento de alongamento com 1 ?M ácido 1-naftalenoacético, foram submetidas a diferentes concentrações de BAP em meio de cultura WPM. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com seis tratamentos e sete repetições, sendo avaliados após 60 dias os parâmetros: porcentagem de oxidação e sobrevivência, comprimento dos brotos, porcentagem de enraizamento, número médio e comprimento das raízes e número médio de novos brotos, as análises anatômicas foram realizadas para complementar a fase de avaliação. A germinação das sementes de Dryadella zebrina em meio WPM ocorreu eficientemente, gerando protocormos bem formados. O uso de auxina ANA mostrou resultados positivos na fase de alongamento e enraizamento in vitro, permitindo a formação de plântulas sadias. O BAP aumentou a formação de novos brotos de Dryadella zebrina, sendo indicado seu uso para fase de multiplicação in vitro. As análises anatômicas das raízes e folhas permitiram visualizar o comportamento e arranjos de células de acordo com a concentração de BAP em que as plântulas estavam submetidas. Nas raízes, foi observada uma menor organização da região meristemática e a confirmação de acúmulo de compostos fenólicos, especialmente na região do câmbio vascular. Neste sentido, foi possível estabelecer uma concentração ideal para favorecer a formação de novos brotos de Dryadella zebrina, representando o primeiro relato bem-sucedido de propagação in vitro de uma espécie do gênero Dryadella. Os dados aqui obtidos poderão servir como base para novos estudos de propagação in vitro de espécies filogeneticamente próximas. Palavras-chave: Micropropagação. Orquídeas. Orchidaceae. Pleurothallidinae. Cultivo in vitro. Abstract: Orchids tend to produce a large amount of seeds, but they have low germination rates in nature due to the absence of reserve tissue and the need to interact with mycorrhizal fungi to establish an effective germination. In vitro plant cultivation is a biotechnology that allows the ex situ propagation and conservation of plant species, and has been used extensively for several species of orchids. However, there are few reports of its use for orchids of the Subtribo Pleurothallidinae. In this context, the objective of the present work was to establish characterization in the initial stage of development in vitro and to evaluate the effects of different concentrations of 6-benzylaminopurine during the organogenesis of Dryadella zebrina. D. zebrina seeds were germinated in vitro and the seedlings obtained through the elongation experiment with 1 ?M 1-naphthalenoacetic acid, were submitted to different concentrations of BAP in WPM culture medium. The experimental design was completely randomized, with six treatments and seven replicates, after which the parameters were evaluated after 60 days: percentage of oxidation and survival, length of shoots, percentage of rooting, average number and length of roots and average number of new shoots, the anatomical analyzes were performed to complement the assessment phase. The germination of Dryadella zebrina seeds in WPM medium occurred efficiently, generating well-formed protocols. The use of ANA showed positive results in the elongation and rooting phase in vitro, allowing the formation of healthy seedlings. BAP increased the formation of new Dryadella zebrina shoots, and its use is indicated for the in vitro multiplication phase. The anatomical analyzes of the roots and leaves allowed to visualize the behavior and arrangements of cells according to the concentration of BAP in which the seedlings were submitted. In the roots, it was observed a less organization of the meristematic region and confirmation of accumulation of phenolic compounds, especially in the region of the vascular exchange. In this sense, it was possible to establish an ideal concentration to favor the formation of new Dryadella zebrina shoots, representing the first successfully report for in vitro propagation for the genus Dryadella. The data obtained here may serve as a basis for further studies of in vitro propagation of phylogenetically close species. Keywords: Micropropagation. Orchids. Orchidaceae. Pleurothallidinae. In vitro culture

Orientadora: Profª Drª Marguerite Quoirin. Coorientadores: Dr. Luiz Antonio Biasi e Dr. Hugo Pacheco de Freitas Fraga. Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal (Agronomia). Defesa : Curitiba, 12/03/2019. Inclui referências: p. 78-88. Área de concentração: Produção vegetal. Resumo: Bambusa oldhamii Munro é uma espécie promissora de bambu, que apresenta diversas aplicações na indústria madeireira e alimentícia, porém seu uso como matéria-prima no Brasil tem sido limitado pela falta de mudas que deem suporte a plantios comerciais. Sendo assim, a micropropagação a partir de segmentos nodais mostra-se como uma alternativa propícia na obtenção de mudas sadias, de alta qualidade, em um curto espaço de tempo. Entretanto, a aplicação dessa técnica de propagação vegetativa é dificultada pela incidência de microrganismos endofíticos, especialmente quando se utiliza como fonte de explantes, matrizes cultivadas no campo. Neste sentido, os objetivos desse trabalho foram micropropagar, identificar contaminantes associados e caracterizar estruturas morfoanatômicas desenvolvidas a partir de segmentos nodais de brotações laterais de matrizes de B. oldhamii cultivadas no campo. Os estudos realizados permitiram desenvolver uma técnica de desinfestação de brotos maduros de B. oldhamii originados do campo, utilizando imersão em tiofanato-metílico, álcool 70%, cloreto de mercúrio, hipoclorito de sódio e cultivo submerso em meio Murashige e Skoog líquido, acrescido de 4 mL L-1 de Plant Preservative Mixture (PPMTM). As análises moleculares de microrganismos isolados de segmentos nodais cultivados in vitro possibilitaram identificar a presença de bactéria endofítica agrupada filogeneticamente com Ralstonia pickettii e fungos associados, com sequencias similares a Wojnowiciella leptocarpi, Diaporthe sp., Diaporthe novem, Phaeosphariaceae sp., Leptosphaeria sp., Phoma herbarum, Fusarium sp., Fusarium graminearum, Arthrinium kogelbergense e Arthrinium. Os estudos de organogênese mostraram que o maior número de brotos por segmento nodal é obtido em explantes de 2 cm de comprimento e 5-7 mm de diâmetro, após cinco subcultivos na presença de 4,4 yM de TDZ e que o uso do BAP no meio de cultura reduz o desenvolvimento de brotos. As análises morfoanatômicas dos explantes possibilitaram caracterizar o sistema de revestimento, córtex, feixes vasculares e medula e também a presença de zonas meristemáticas, com brotos pré-formados potencialmente aptos ao desenvolvimento. Deste modo, os resultados obtidos fornecem subsídios para o estabelecimento in vitro de B. oldhamii a partir de segmentos nodais de matrizes cultivadas no campo. Abstract: Bambusa oldhamii Munro is a promising species of bamboo, presenting several applications for timber and food industry. However, in Brazil, its use as a raw material has been limited by the lack of seedlings for commercial plantations. The micropropagation through nodal segments is a promising alternative in obtaining healthy seedlings of high quality, in a short time. However, the application of this vegetative propagation technique is hindered by the incidence of endophytic microorganisms, especially when using explants from matrices cultivated in the field. The aims of this study were to micropropagate, identify associate contaminants and characterize morphoanatomic structures developed from nodal segments of lateral shoots of B. oldhamii matrices grown in the field. The studies carried out allowed the development of a disinfestation technique of mature shoots of B. oldhamii from the field using thiophanate methyl, 70% ethanol, sodium hypochlorite, mercuric chloride and immersion in Murashige e Skoog liquid culture medium, plus 4 mL.L-1 of Plant Preservative Mixture (PPMTM). The molecular analyzes of microorganisms isolated from nodal segments cultured in vitro allowed to identify the presence of endophytic bacteria phylogenetically grouped with Ralstonia pickettii and several fungi with sequences similar to Wojnowiciella leptocarpi, Diaporthe sp., Diaporthe novem, Phaeosphariaceae sp., Leptosphaeria sp., Phoma herbarum, Fusarium sp., Fusarium graminearum, Arthrinium kogelbergense and Arthrinium arundinis. Organogenesis studies showed that the highest number of shoots per nodal segment is obtained in explants of 2 cm in length and 5-7 mm in diameter in the presence of 4.4 yM of TDZ after five subcultures and that the use of BAP in the culture medium reduces shoot development. The morpho-anatomical analysis of the explants allowed to characterize the coating system, cortex, vascular bundles and pith, as well as the presence of meristematic zones with preformed buds potentially suitable for development. The results obtained provide support for the in vitro establishment of B. oldhamii from nodal segments of matrices cultivated in the field.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2018. Guadua chacoensis é um espécie de bambu com colmos lignificados, da família Poaceae, nativo do bioma Mata Atlântica, que apresenta restrições quanto a sua propagação vegetativa, sendo a propagação in vitro uma alternativa promissora para a obtenção de mudas desta espécie. Este processo pode ser influenciado por vários fatores, tais como a luz, e ausência dela - estiolamento, uma vez que a luz esta diretamente relacionada com a morfogênese das plantas. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do estiolamento in vitro em plantas micropropagadas de G.chacoensis, por meio de análises morfoanatômicas, ultraestruturais e bioquímicas. Estas análises foram realizadas em materiais vegetais coletados aos 0, 10, 20 e 30 dias de cultivo tanto de plantas mantidas no escuro quanto de plantas mantidas sob luz do tipo LED branca (controle). Os resultados obtidos na caracterização morfológica de colmos de G. chacoensis demonstraram uma promoção no número de brotos gerados por explante induzida pela luz, e ainda, que a altura dos colmos não diferiu estatisticamente entre os dois tratamentos, provavelmente em função do aparecimento de características de material estiolado nos colmos verdes somente aos 20 dias de cultivo no escuro. O período de indução ao estiolamento avaliado afetou o conteúdo de poliaminas livres em colmos de G. chacoensis, visto que foram observadas variações nos conteúdos endógenos de poliaminas totais, putrescina, espermidina e espermina. Os conteúdos endógenos dos hormônios ácido abscíssico (ABA), giberelina (GA) e ácido jasmônico (JA) reduziram em colmos estiolados, indicando que a luz pode estar envolvida no mecanismo de síntese destes fitormônio. Por sua vez, a zeatina (Z) manteve seus conteúdos similares na luz e no escuro. Pela análise histológica, por microscopia óptica não foram observadas alterações drásticas entre os colmos mantidos na luz e escuro. Já na análise de microscopia eletrônica de transmissão (MET) foi notado um acúmulo de amido em diferentes tempos de desenvolvimento na luz e no escuro e ainda, a presença de etioplastos não foi observada. Com base nos resultados obtidos, pode-se concluir que o crescimento e desenvolvimento de plantas, bem como a biossíntese de poliaminas e hormônios, foram afetados pelo estiolamento, com reduções em suas concentrações, demonstrando a importância da luz na promoção de respostas fisiológicas in vitro em colmos de G. chacoensis. Abstract : Guadua chacoensis is woody bamboo species, from the family Poaceae, native from Atlantic forest biome, which presented restrictions in it vegetative propagation, being the in vitro propagation a valuable tool to obtain propagative material. This process can be influenced by a variety of factors, including light or the absence of them - etiolation, as light is direct correlated with plant morphogenesis. In this sense, the objective of this study was to evaluate the influence of in vitro etiolation in micropropagated plants of G. chacoensis through morphoanatomical, ultrastrutural and biochemistry analysis. Plant material were collected at 0, 10, 20 e 30 days of culture in light and darkness treatments, and the control used was white LED light. The results obtained in morphological characterization of G. chacoensis culms showed an improved number of shoots generated per explant in light, and the culms height did not differs statistically between the two treatments, probably as a result of the later starting of conversion of green culms in etiolated culms, which started only at 20 days in darkness. The content of free polyamines in G. chacoensis culms was affected by in vitro etiolation during the time of evaluation, as the endogenous contents of total free polyamines, putrescine, spermidine and spermine indicated variation. Reduction in the endogenous levels of the phytohormones abscisic acid (ABA), gibberellin (GA), jasmonic acid (JA) was observed in plants kept in darkness, showing that light is involved in its biosynthesis pathways. Differently, zeatin (Z) showed similar contents in light and darkness conditions. Histological analysis through light microscopy did not shows significant alteration in culms under light and darkness conditions. Transmission electron microscopy analysis showed starch accumulation in different stages of development in light and darkness conditions, and, the presence of etioplast was not observed. Our results showed that etiolation affects plant growth and development, as well as polyamines and hormone biosynthesis, with reduction in its contents during etiolation, showing the importance of light in the promotion of in vitro physiological response in culms of G. chacoensis.