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Orientador: Ana Carolina Migliorini Figueira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O receptor ativador da proliferação de peroxissomos gama (PPAR'gama') é altamente expresso em tecido adiposo e tem como função principal o controle do metabolismo de glicose e de lipídeos. Assim, este receptor está intrinsecamente relacionado ao desenvolvimento de Diabetes Mellitus tipo 2 e outras doenças associadas à Síndrome Metabólica, sendo o principal alvo de ligantes sintéticos provenientes da classe das Tiazolidinedionas que são usados para o tratamento dessas doenças. A ação desses fármacos ocorre principalmente através da inibição da fosforilação do sítio de serina 273 do PPAR'gama', pela quinase dependente de ciclina 5 (Cdk5), a qual resulta na desregulação da expressão de diversos genes gerando inclusive, a resistência à insulina. Apesar de ser responsável pela alteração da expressão gênica, a fosforilação não altera a ocupância do PPAR'gama' na cromatina, assim, sugere-se que outros mecanismos, como o recrutamento diferencial de correpressores, entre eles, o mediador silenciador para receptores de retinóides e de hormônios tireoidianos (SMRT) e o correpressor de receptores nucleares (NCoR), possam regular as diferenças na expressão gênica de maneira fosfo-dependente, induzindo ações antidiabéticas ou pró-adipogênicas. Contudo, a fim de elucidar a relação entre os mecanismos de repressão, incluindo a preferência por diferentes domínios de interação com o receptor (IDs), e a fosforilação de PPAR'gama' foi verificado que: (i) a fosforilação do receptor pode ser capaz de reduzir sua ativação; (ii) a fosforilação do receptor não altera o recrutamento de correpressores; (iii) o ID2 do SMRT e NCoR se mostra extremamente importante na interação com o PPAR'gama'; (iv) o ID1 pode estar envolvido na relação entre a fosforilação e o recrutamento de correpressores e (v) a presença da Cdk5 é capaz de reduzir a interação com NCoR, indicando um sistema dinâmico de competição pelo sítio de S273, visto que o recrutamento se altera quando o ID1 é modificado. Também foi avaliado o perfil de expressão gênica de alvos de PPAR?, que possuem expressão regulada pela fosforilação de S273 ou que estão envolvidos no processo de adipogênese, na tentativa de melhor entender a existência de outros aspectos que possam resultar em uma expressão diferenciada desses genes. Por exemplo, uma relação de crosstalk com LXR'alfa', parceiro de PPAR'gama' em casos de inflamação e controle metabólico, o qual também sofre modulação através da fosforilação, neste caso, do sítio de S196. Neste contexto, foi observado quatro genes, sendo eles Selenbp1, Gk, Cd36 e Apod, que apresentam expressão diferenciada tanto quando ocorre a inibição da fosforilação de LXR'alfa' quanto a de PPAR'gama', indicando uma relação de crosstalk entre os receptores. Através deste trabalho foi possível gerar conhecimento sobre os mecanismos moleculares de modulação de PPAR'gama', gerando possibilidades de tratamentos mais específicos para as doenças metabólicas Abstract: Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR'gamma') is the master regulator of adipogenesis and plays an important role in the regulation of glucose homeostasis and lipid metabolism. However, PPAR'gamma' is the target of thiazolidinediones (TZDs), a set of antidiabetic drugs for type 2 Diabetes Mellitus treatment, being associated with many undesirable side effects. TZDs are PPAR'gamma' full agonists and are able to block the phosphorylation at the S273 site of nuclear receptor through the cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5). The phosphorylation results in expression deregulation of a large number of genes leading to insulin resistance. Although this modification of PPAR'gamma' does not alter its adipogenic capacity, it is suggested that other mechanisms, such as the differential recruitment of corepressors (among them, the silencing mediator of retinoic acid and thyroid hormone receptor (SMRT) and nuclear receptor corepressor (NCoR)), may alter gene expression in a phospho-dependent manner, inducing anti-diabetic or pro-adipogenic actions. Therefore, in order to clarify the relationship between repression mechanisms and their preferences for receptor interaction domains (IDs) related to PPAR'gamma' phosphorylation, we found that: (i) receptor phosphorylation may be able to reduce its activity; (ii) receptor phosphorylation does not alter corepressors recruitment; (iii) ID2 of SMRT and NCoR is extremely relevant for the interaction with PPAR'gamma'; (iv) ID1 may be involved with phosphorylation and corepressors recruitment; and (v) the presence of Cdk5 may be able to reduce receptor interaction with NCoR, indicating a dynamic system of competition for the S273 site, since recruitment is altered when ID1 is modified. In addition, we evaluated the gene expression profile of PPAR'gamma' targets. Expression of some of these genes is specifically regulated by S273 phosphorylation or is involved in the adipogenesis process. In an attempt to better understand the existence of other aspects that may result in a differentiated expression of these genes, we explored a crosstalk relationship with LXR'alpha'. LXR'alpha' is a PPAR'gamma' partner in conditions of inflammation and metabolic control, which is also phosphorylated at the S196 site. It was observed that four genes as Selenbp1, Gk, Cd36 and Apod showed differential expression when inhibition of LXR'alpha' and PPAR'gamma' phosphorylation occurs. Through this work, it was possible to generate knowledge about the molecular mechanisms of PPAR'gamma' modulation, creating new possibilities of more specific treatments for metabolic diseases Mestrado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Mestre em Ciências FAPESP 2016/13480-9, 2017/12314-0

Orientador: Mario Jose Abdalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A insulina, ao se ligar à subunidade a de seu receptor heterotetramérico, dá início a uma série de ações imediatas e tardias, metabólicas e promotoras de crescimento. Tais eventos ocorrem através da estimulação da subunidade 13 transmembrana do receptor, que se autofosforila e ativa a fosforilação de substratos endógenos intracelulares, dos quais o mais estudado é o IRS-l. Esta proteína de peso molecular _160 kDa pode ser bem caracterizada como um substrato direto do receptor de insulina e quando se fosforila associa-se a proteínas com porção SH2, PI-3 quinase e SHP2 ativando-as. Uma etapa distal a estas associações/ativações é a fosforilação em serina da AKT/PKB. Utilizando-se técnicas de "immunoblotting" com anticorpos anti-IRS-l, antifosfotirosina, anti-SHP2 e antiAKT/PKB é possível analisar o grau de fosforilação do IRS-l e AKT/PKB, a concentração protéica da SHP2 e a associação do IRS-l com SHP2, ou seja, as ações iniciais da insulina. Neste estudo investigamos a quantidade protéica da SHP2, o grau de fosforilação do IRS-l e associação com SHP2 e a fosforilação do AKT /PKB no tecido muscular e hepático de ratos normais e em cinco modelos de resistência à insulina: o jejum prolongado, o envelhecimento, o uso agudo de adrenalina, o uso crônico de dexametasona e ratos com diabetes induzido por STZ. Em experimentos com ratos normais para avaliação do efeito tempo após infusão de insulina no grau de fosforilação do IRS-l e associação com SHP2, verificou-se que o pico de fosforilação do IRS-l e associação IRS-l/SHP2 foi aos 30" para o tecido hepático e aos 90" para o tecido muscular, após a infusão de insulina, na veia porta. Nos animais que receberam estreptozotocina, em tecido hepático não houve alteração no nível protéico da SHP2. Observamos um aumento significativo no grau de fosforilação do IRS-l para 141 :!: 12%, p < 0,05, quando comparados aos animais controle. Não houve alteração na associação IRS-l/SHP2 quando comparados com o controle. Houve uma redução para 65 :!: 6%, p< 0,035, no grau de fosforilação do AKT/PKB. Em tecido muscular destes animais tratados com estreptozotocina, não houve alteração no nível protéico da SHP2, ocorrendo um aumento para 191 :!: 14%, p< 0,036 no grau de fosforilação do IRS-l quando comparados com o controle, sem alteração na associação IRS-l/SHP2 quando comparados com o controle. O grau de fosforilação do AKT IPKB foi reduzido para 70 :t 7%, p< 0,04, nos animais tratados com STZ quando comparados com o controle. Animais submetidos ao tratamento agudo de adrenalina não apresentaram alteração no nível protéico da SHP2 tanto para o tecido hepático como para o muscular. Houve uma redução significativa no grau de fosforilação do IRS-l para 37 :t 3%, (p< 0,019), e para 37 :t 7%, (p< 0,003) em tecido hepático e muscular respectivamente, acompanhado de uma diminuição da associação IRS/SHP2 para 52 :t 3%, (p< 0,002), e para 20 :t 7%, (p< 0,041), em tecido hepático e muscular, respectivamente. A fosforilação do AKTIPKB foi reduzida para 60 :t 5%, (p< 0,045), e para 70 :t 6%, (p< 0,030), em tecido hepático e muscular, respectivamente O envelhecimento não alterou o nível protéico da SHP2 em tecido hepático. A fosforilação do IRS-l foi reduzida para 64 :t 7%, (p< 0,029), ocorrendo um aumento na associação IRS-lISHP2 para 155 :t 9%, (p< 0,012) em tecido hepático dos animais senis. O grau de fosforilação do AKTIPKB dos animais senis não apresentou alteração. Em tecido muscular dos animais com 20 meses de idade observamos que não houve alteração do nível protéico da SHP2. O grau de fosforilacão do IRS-l foi reduzido para 50 :t 7%, (p

Orientador: Paulo Arruda Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia Doutorado

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No. of bitstreams: 1 de-souza_cl_me_rcla.pdf: 5093749 bytes, checksum: 176ac74e8147054013874643422ceec0 (MD5) Previous issue date: 2021-06-07 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Apesar do grande interesse pelas propriedades mecânico-elásticas das fibras da seda produzida pelas aranhas, visando o seu uso em aplicações biomédicas e biotecnológicas devido as suas propriedades de resistência, elasticidade e biocompatibilidade, pouco se conhece sobre os detalhes das glândulas produtoras de seda e o processo de fiação que ocorre para a produção das fibras. Dessa forma, alguns estudos têm demonstrado que as glândulas produtoras de seda apresentam diversas proteínas relacionadas com o envolvimento na secreção das proteínas da seda, transporte, regulação de atividades proteolíticas e preservação das proteínas da seda contra o estresse oxidativo e degradação, durante todo o processo de fiação; além disso, estudos também já demonstraram nas fibras de seda da teia, a presença de toxinas de ação geral e de neurotoxinas, comuns em venenos animais, sugerindo que essas toxinas/neurotoxinas contribuem para a paralisia e captura de presas. Porém, esses estudos não têm considerado a possível presença de modificações pós-traducionais (PTMs) que podem atuar sobre a atividade biológica e função dessas moléculas. A determinação de PTMs é fundamental para a elucidação de processos que controlam os eventos celulares, como crescimento, divisão e diferenciação celular, incluindo a interação entre proteínas. Portanto, no presente estudo adotamos o uso da cromatografia de afinidade com TiO2 como método de enriquecimento de fosforilação, combinados com a abordagem proteômica livre de gel - shotgun, utilizando ténicas avançadas de espectrometria de massas in tandem (µLC-ESI-micrOTOF-Q-III-CID) a fim de identificar o perfil fosfoproteômico das glândulas que secretam a seda da aranha Trichonephila clavipes. Os resultados obtidos com a análise fosfoproteômica do conjunto de glândulas produtoras de seda da ranha T. clavipes, mostrou a identificação de 1316 proteínas fosforiladas sendo que 155 foram identificadas na glândula agregada, 580 na ampulada maior, 143 na flageliforme e 438 na ampulada menor. Estas fosfoproteínas foram classificadas de acordo com a sua função geral e subdividas em sete diferentes grupos de proteínas: (i) proteínas estruturais que compõem as fibras da seda – as espidroínas; ii) proteínas relacionadas com o transporte de íons e oxigênio nas glândulas para manter a estabilidade das espidroína; (iii) proteínas relacionadas com o dobramento/conformação e modificação das espidroínas; (iv) proteínas relacionadas com a preservação das espidroínas contra o estresse oxidativo; (v) proteínas relacionadas com a preservação das características fibrilares das espidroínas no meio ambiente; (vi) proteínas housekeeping e (vii) proteínas relacionadas com a captura e pré-digestão de presas. Para o último grupo, foram identificadas 284 proteínas semelhantes a toxinas, neurotoxinas, enzimas proteolíticas, e defensinas em sua forma fosforilada. O enriquecimento funcional destas proteínas nos permitiu avaliar a contribuição de suas funções às caracteríticas fisico-químicas das proteínas estruturais da seda, bem como a interação entre os grupos funcionais das proteínas listadas envolvidas com o processo de fiação da seda; assim como também a influência sobre a atividade tóxica das toxinas. Os resultados também permitiram identificar uma série de sequências peptídicas fosforiladas que não apresentaram resultados de Identificação com proteínas depositadas nos bancos de dado e foram obtidas utilizando da abordagem de sequenciamento de novo e submetidas a um alinhamento de sequencias utilizando a ferramenta BLASTP. O ensaio de inseto-toxicidade realizado ao final do estudo, nos permitiu verificar a toxicidade do extrato bruto fosforilado das glândulas ampulada maior e agregada, que apresentaram os valores de dose letal, DL50=28,40 ng/mg de inseto (A. mellifera) para a glândula ampulada maior e DL50=23,07 ng/mg de inseto (A. mellifera) para a glândula agregada. Dessa forma, demonstramos que a combinação do uso de métodos baseados em cromatografia de afinidade, como a estratégia de enriquecimento de proteínas/peptídeos fosforilados, e o uso de uma abordagem proteômica com estudos de PTMs se mostrou uma estratégia eficiente na investigação de amostras complexas, como as glândulas produtoras de seda da teia de aranhas. Um estudo com modificações pós-traducionais das proteínas presentes nas glândulas produtoras de seda da aranha T. clavipes, como demonstrado no presente trabalho, nos possibilitou obtermos informações biológicas e químicas das características dessas moléculas, contribuindo para uma melhor compreensão sobre o perfil fosfoproteômico das glândulas analisadas. Despite the great interest in the mechanical-elastic properties of the silk fibers produced by spiders, aiming their use in biomedical and biotechnological applications due to their properties of resistance, elasticity and biocompatibility, little is known about the details of the silk-producing glands and the spinning process that takes place for the production of the fibers. Studies have shown that the silk producing glands, present several proteins related to the involvement in the secretion of silk proteins, transport, regulation of proteolytic activities and preservation of silk proteins, against oxidative stress and degradation, throughout the spinning process; in addition, studies have also demonstrated in the silk web fibers, of general action toxins-like and neurotoxins-like common in animal venom, suggesting that these proteins contribute to paralysis and prey capture. However, these studies have not considered the possible presence of post-translational modifications (PTMs) that can act over biological activity and function of these molecules. The determination of PTMs is fundamental for the processes elucidation that control cellular events, such as cell growth, division and differentiation, including the interaction between proteins. Therefore, in the present study we adopted the use of TiO2 affinity chromatography as a phosphorylation enrichment method, combined with the gel-free proteomic approach - shotgun, using advanced techniques of in-tandem mass spectrometry (µLC-ESI-micrOTOF-Q -III-CID) in order to identify the phosphoproteomic of glands profile that secrete the spider silk Trichonephila clavipes. The results obtained with the phosphoproteomic analysis of the set of silk producing glands of the T. clavipes spider, demonstrateded the identification of 1316 phosphorylated proteins, of which 155 were identified in the aggregated gland, 580 in the major ampulate, 143 in the flagelliform and 438 in the minor ampulate. These phosphoproteins were classified according to their general function and subdivided into seven different groups of proteins: (I) structural proteins that make up the fibers of silk - the spidroins; (II) proteins related to the transport of ions and oxygen in the glands to keep the spidroins stability; (III) proteins related to the folding/shaping and modification of spidroins; (IV) proteins related to the preservation of spidroins against oxidative stress; (V) proteins related to the preservation of the fibrillar characteristics of spidroins in the environment; (VI) housekeeping proteins and (vii) proteins related to prey capture and pre-digestion. For the last group, 284 toxin, neurotoxins, proteolytic enzymes, and defensins-like proteins, in their phosphorylated form were identified. The functional enrichment of these proteins allowed us to evaluate the contribution of their functions to the physicochemical characteristics of structural silk proteins, as well as the interaction between the functional groups of the listed proteins involved with the silk spinning process; And also the influence on the toxic activity of the toxins. The results also made it possible to identify a series of phosphorylated peptide sequences that did not present identification results with proteins deposited in the data banks and were obtained using the sequencing approach de novo and subjected to a sequence alignment using the BLASTP tool. The insect-toxicity assay carried out at the end of the study allowed us to verify the toxicity of the crude phosphorylated extract of the major ampulate and aggregated glands, which showed the lethal dose values LD50 = 28.40 ng/mg of insect (A. mellifera) for the major ampulate gland and LD50 = 23.07 ng/mg of insect (A. mellifera) for the aggregated gland. Thus, we demonstrate that the combination of using methods based on affinity chromatography, such as the strategy of enriching proteins / phosphorylated peptides, and the use of a proteomic approach with studies of PTMs proved to be an efficient strategy in the investigation of complex samples, like the silk-producing glands in the spider web. A study with post-translational modifications of proteins present in the spider producing glands of the spider T. clavipes, as demonstrated in the present work, enabled us to obtain biological and chemical information on the characteristics of these molecules, contributing to a better understanding of the phosphoproteomic profile of the glands analyzed FAPESP: 2019/04538-1 CAPES: 001

Orientador: Fernando Moreira Simabuco Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas Resumo: Introdução: A via de sinalização da mTOR vem sendo relacionada a várias doenças e desordens metabólicas em humanos, incluindo obesidade, diabetes, vários tipos de câncer e neurodegeneração. As proteínas S6Ks têm mostrado importante papel na sinalização da mTOR, funcionando como efetoras dessa via. A família das S6Ks é composta por dois genes, RPS6KB1 e RPS6KB2, sendo que o primeiro codifica as isoformas p85- e p70-S6K1, enquanto que o segundo codifica as isoformas denominadas p56- e p54-S6K2. Este estudo investigou as parceiras de interação das isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2 em células HEK293, com objetivo de diferenciar essas proteínas de acordo com seus envolvimentos em processos biológicos. Além disso, foi investigada mais detalhadamente a interação das isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2 com as proteínas eIF2? e PARP1. Justificativa: Acreditava-se que as isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2 apresentavam funções biológicas redundantes, uma vez que possuem um elevado grau de similaridade entre si. Dessa forma, poucos estudos têm como objetivo identificar diferentes funções e envolvimentos dessas isoformas em processos biológicos. Entretanto, descobrir as diferentes funções dessas proteínas pode ter grande importância para estudos que investigam novas estratégias para desenvolver terapias para certos tipos de doenças, como o câncer. De forma geral, esse trabalho contribui para um melhor entendimento da via mTOR/S6Ks. Resultados: Nos primeiros dados obtidos desse estudo, que geraram um artigo científico publicado na revista Proteomics em 2016 (Anexo I), foi observado, por espectrometria de massas, que as isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2 possuem diferentes proteínas de interação e que atuam em diferentes processos biológicos, indicando que tais isoformas possuem funções biológicas distintas. Algumas parceiras de interação, eIF2?, PARP1, PPM1B, FXR1, FMRP, PRMT5 e WDR77, foram escolhidas para que suas relações com as isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2 fossem estudadas de forma mais detalhada. Alguns experimentos de imunoprecipitação foram realizados mostrando evidências da interação entre p70-S6K1 e p54-S6K2 com a proteína eIF2?, e somente p54-S6K2 com a proteína PARP1. Em uma situação de estresse celular, eIF2? é fosforilada no seu resíduo serina 52 (S52), acarretando na inibição da síntese protéica global e no estimulo da autofagia e apoptose. Identificamos que eIF2? apresenta um sítio de fosforilação predito das S6Ks (RXRXXT/S) em serina 58 (S58), sendo este conservado em uma variedade de espécies. Ensaios de imunoprecipitação revelaram que eIF2? é fosforilada em um sítio RXXT/S na presença de insulina. Além disso, foi visto que a ativação das S6K1 e S6K2 através de insulina e somente S6K2 através de FGF2 está diretamente relacionada com a redução na fosforilação de eIF2? em serina 52. Por outro lado, inibidores farmacológicos de mTOR e S6Ks, como a rapamicina e o PF4708671, respectivamente, estão associados com o aumento dos níveis de fosforilação de eIF2? (S52). Também foi realizada a superexpressão de p70-S6K1 e p54-S6K2 constitutivamente ativas e foi visto redução da fosforilação de eIF2? (S52). Por fim, foi realizado um ensaio de mutação sítio dirigida em eIF2?, mimetizando uma fosforilação no resíduo 58 de eIF2?. Como resultado, observamos que a fosforilação constante no resíduo 58 está acompanhado de uma redução da fosforilação do resíduo S52. Conclusões: Este estudo mostrou que diferentes isoformas de S6Ks possuem distintas proteínas de interação, indicando que tais isoformas possuem funções biológicas distintas na célula. Os resultados ainda sugerem que as S6Ks podem fosforilar eIF2? em serina 58, e devido a proximidade dos sítios, possa haver uma inibição da fosforilação em serina 52, regulando assim a atividade de eIF2á Abstract: Introduction: The mTOR signaling pathway has been related to several diseases and metabolic disorders in humans, including obesity, diabetes, several types of cancer and neurodegeneration. The S6Ks proteins have shown an important role in mTOR signaling, acting as effectors of this pathway. The S6Ks family is composed of two genes, RPS6KB1 and RPS6KB2. RPS6KB1 encodes two isoforms: p85- and p70-S6K1, while RPS6KB2 encodes two other isoforms, known as p56 and p54-S6K2. This study investigated the interaction partners of p70-S6K1 and p54-S6K2 isoforms in HEK293 cells, in order to differentiate these proteins according to their involvement in biological processes. Furthermore, it was investigated in more detail the interaction of p70-S6K1 and p54-S6K2 isoforms with eIF2? and PARP1 proteins. Justification: It was believed that S6K1 and S6K2 exhibited redundant biological functions, since they have a high degree of similarity. Thus, few studies aim to identify different roles and implications of these isoforms in biological processes. However, discovering different functions of these proteins may have great importance for the investigation of new strategies to develop therapies for certain types of diseases such as cancer. In general, this work contributes to a better understanding of the mTOR / S6Ks pathway. Results: The first data obtained from this study, which generated a scientific article published in the journal Proteomics in 2016 (Annex I), it was observed, by mass spectrometry, that the p70-S6K1 and p54-S6K2 isoforms have different interaction proteins and act in different biological processes, indicating that such isoforms have distinct biological functions. Some partner interaction, as eIF2?, PARP1, PPM1B, FXR1, FMRP, PRMT5 and WDR77, were chosen for its relations with the p70-S6K1 and p54-S6K2 isoforms were studied in more detail. Some immunoprecipitation experiments were performed showing evidence of the interaction between p70-S6K1 and p54-S6K2 with the eIF2? protein, and only p54-S6K2 with the PARP1 protein. In a situation of cellular stress, eIF2? is phosphorylated at its serine residue 52 (S52), leading to the inhibition of global protein synthesis and the stimulation of autophagy and apoptosis. We have identified that eIF2? has a predicted phosphorylation site of S6Ks (RXRXXT/S) at serine 58 (S58), which is conserved in a variety of species. Immunoprecipitation assays revealed that eIF2? is phosphorylated at RXXT/S site in the presence of insulin. In addition, it was shown that the activation of S6K1 and S6K2 through insulin and only S6K2 through FGF2 is directly related to the reduction in eIF2? phosphorylation in serine 52. Conversely, pharmacological inhibitors of mTOR and S6Ks, such as rapamycin and PF4708671, respectively, are associated with increased of eIF2? phosphorylation levels at S52. The overexpression of constitutively active p70-S6K1 and p54-S6K2 was also performed and reduction of the phosphorylation of eIF2? (S52) was seen. Finally, a site-directed mutation assay was performed on eIF2?, mimicking a phosphorylated residue 58 of eIF2?. As a result, we observed that constant phosphorylation at residue 58 is accompanied by a reduction of phosphorylation of residue S52. Conclusions: This study demonstrated that S6Ks isoforms present different interacting proteins, indicating that those isofroms present distinct biological functions in the cell. The results also suggest that S6Ks can phosphorylate eIF2? in serine 58, and due to the proximity of the sites may be an inhibition of the phosphorylation of serine 52, thereby regulating the activity eIF2á Mestrado Metabolismo e Biologia Molecular Mestra em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo FAPESP 2015-00311-1

Schistosomiasis, a neglected tropical disease caused by trematodes of the Schistosoma genus, affects over 250 million people around the world. This disease has been associated with learning and memory deficits in children, whereas reduced attention levels, impaired work capacity, and cognitive deficits have been observed in adults. Strongly correlated with poverty and lack of basic sanitary conditions, this chronic endemic infection is common in Africa, South America, and parts of Asia and contributes to inhibition of social development and low quality of life in affected areas. Nonetheless, studies on the mechanisms involved in the neurological impairment caused by schistosomiasis are scarce. Here, we used a murine model of infection with Schistosoma mansoni in which parasites do not invade the central nervous system to evaluate the consequences of systemic infection on neurologic function. We observed that systemic infection with S. mansoni led to astrocyte and microglia activation, expression of oxidative stress-induced transcription factor Nrf2, oxidative damage, Tau phosphorylation, and amyloid-β peptide accumulation in the prefrontal cortex of infected animals. We also found impairment in spatial learning and memory as evaluated by the Morris water maze task. Administration of anthelmintic (praziquantel) and antioxidant (N-acetylcysteine plus deferoxamine) treatments was effective in inhibiting most of these phenotypes, and the combination of both treatments had a synergistic effect to prevent such changes. These data demonstrate new perspectives toward the understanding of the pathology and possible therapeutic approaches to counteract long-term effects of systemic schistosomiasis on brain function.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Trypanosoma cruzi is a flagellated protozoan that causes Chagas disease. During its biological cycle, it has a high capacity for environmental adaptation, as it lives in different hosts at each stage of its life cycle. However, the mechanisms that control these adaptations are not yet well known and it is postulated that they depend on the availability of nutrients, which results in different signaling mechanisms leading to energy production in states of nutritional deficiency. Adenosine monophosphate kinase (AMPK) is a heterotrimer formed by two subunits (β and γ) and a catalytic subunit (α). It has been shown that AMPK activation of Trypanosoma brucei is capable of inducing differentiation of replicative forms. Genes encoding proteins homologous to AMPK are also present in T. cruzi, and their role is still poorly characterized in this parasite. In this work, we investigated the role of AMPK in T. cruzi by examining its phosphorylation under different situation. We performed in silico tests to estimate the structural conservation and amino acid composition of the TcAMPK subunits with other organisms. T. cruzi were found to contain two catalytic subunits, TcAMPK α1 and α2 with a high degree of conservation in the catalytic loop. Only TcAMPKα1 showed a typical phosphorylatable serine (Ser 172). In contrast, TcAMPKα2 has at the same position a serine residue. In parasites maintained in rich medium both chains were found phosphorylated. We observed that glucose levels did not affect TcAMPKα1 and α2 phosphorylation. A band recognized by the same anti-phospho-172 was recognized with the expected size when the α-1 chain was tagged with mNeonGreen-Myc protein. The presence of Compound C (Dorsomorphin), an inhibitor of AMPK of different organisms, inhibited growth of epimastigotes but did not cause dephosphorylation of TcAMPK. However, we noticed that the parasites in a nutrient-poor environment, in which ATP levels decreased, the presence of this inhibitor, did not recover the phosphorylation of TcAMPKα and the parasites underwent morphological changes, exhibiting a spherical and flagella-free format becoming like intracellular amastigotes. Addition of nutrients in poor medium in the presence of Compound C restored partially the ATP levels favoring the survival of epimastigotes. Several attempts to generated parasites lacking either the α1 or α2 chains were unsuccessful, suggesting it’s essential role for the parasite. O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado, causador da doença de Chagas. Durante o seu ciclo biológico o T. cruzi apresenta uma alta capacidade de adaptação ambiental, pois vive em diferentes hospedeiros em cada etapa do seu ciclo de vida. Entretanto os mecanismos que medeiam estas adaptações ainda não são bem conhecidos e se postula que dependem da disponibilidade de nutrientes e da presença de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Um dos principais mecanismos envolvidos no controle do estado energético de células eucariotas ocorre por meio da proteína quinase ativada pelo aumento de AMP (AMPK), que fosforila diferentes substratos modificando o metabolismo para produzir energia em estados de carência nutricional. A AMPK é um heterotrímero formado por duas subunidades reguladoras (β e γ) e uma subunidade catalítica (α). Já foi mostrado que a ativação da AMPK de Trypanosoma brucei é capaz de induzir a diferenciação da forma replicativa à forma quiescente e que esta ativação está relacionada à indução de autofagia. Genes que codificam proteínas homólogas a AMPK estão presentes em T. cruzi, mas o seu papel ainda não é conhecido neste parasita. Neste trabalho investigamos o papel da TcAMPK em T. cruzi enquanto proteína sinalizadora como já descrito em outros eucariotos. Ensaios in silico mostraram conservação estrutural e de composição de aminoácidos das subunidades da TcAMPK com outros organismos. A alça catalítica das subunidades α1 e α2 são conservadas, porém a TcAMPKα1 exibe uma treonina na posição correspondente a serina 172, aminoácido fosforilável responsável pela ativação da proteína em eucariotos superiores. Utilizando um anticorpo específico para estas fosforilações verificamos que a enzima nas formas epimastigotas se fosforila gradativamente nas primeiras 24 horas quando os parasitas são inoculados em meio rico onde a concentração de ATP intracelular não variou. A fosforilação também foi detectada na subunidade α1 em fusão com mNeonGreen confirmando se tratar da AMPK. A fosforilação mostrou ser dependente da presença de espécies reativas de oxigênio e independente da presença de glicose no meio. Em meio privado de todos os nutrientes, ocorreu fosforilação simultaneamente ao decréscimo de ATP. Neste caso a fosforilação foi inibida pelo Composto C (Dosomorfina), potente inibidor da AMPK de diversos organismos. Em meio pobre a dosomorfina causou perda de viabilidade e os parasitas sofreram uma mudança morfológica, exibindo um formato esférico e sem flagelo similar à forma amastigota. A adição de nutrientes como glicose, prolina e ácido glutâmico diminuíram o decréscimo de ATP mesmo na presença do Composto C favorecendo a sobrevivência dos epimastigotas e não afetaram a fosforilação da AMPK. Várias tentativas de se obter parasitas depletados tanto na subunidade α1 como α2 foram infrutíferas sugerindo que a atividade da AMPK seja essencial para o crescimento do parasita. Assim, concluímos que a AMPK em T. cruzi é ativada continuamente e essa fosforilação é modulada pelos níveis de ATP e em diferentes condições de crescimento. 2018/12886-7

Orientadores: Ana Carolina Migliorini Figueira, Paulo Sérgio Lopes de Oliveira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O receptor ativador da proliferação de peroxissomas-'gama' (PPAR'gama') está envolvido no desenvolvimento do Diabetes Mellitus tipo 2 (DMT2) e Síndrome Metabólica. Estudos recentes comprovam sua participação na relação entre resistência à insulina e DMT2, através do processo de fosforilação da S245 mediado pela CDK5. Esse processo, que afeta a expressão gênica, é ainda pouco entendido e sua modulação por ligantes de PPAR'gama' pode representar uma promissora estratégia farmacológica antidiabética. Além disso, um melhor entendimento sobre a interação do PPAR'gama' com sequências de reconhecimento do DNA, no processo de regulação gênica, podem esclarecer suas ações no contexto do DMT2. Dessa forma, os propósitos do presente trabalho são (i) estudar estruturalmente a interação entre a CDK5 e o domínio de ligação ao ligante (LBD) do PPAR'gama', a fim de melhor compreender os mecanismos de modulação deste processo; (ii) elucidar o mecanismo de inibição da fosforilação do PPAR? mediada pela CDK5 e (iii) analisar a interação do domínio de ligação ao DNA (DBD) de receptores nucleares com sequências de DNA, objetivando o desenvolvimento de um modelo preditor de sítios de ligação no DNA para receptores nucleares. Na primeira etapa do trabalho, são apresentados detalhes sobre a interação CDK5-PPAR'gama', com proposição de um modelo computacional do complexo. O modelo permitiu a identificação de r esíduos-chave para a interação, validados por anisotropia de fluorescência e para a fosforilação do PPAR'gama' pela CDK5, validados por ensaios enzimáticos. Na segunda etapa, foi realizada uma avaliação estrutural, baseada em resultados experimentais, do mecanismo de inibição, por ligantes, da fosforilação do PPAR'gama'. Nessa etapa, foi proposto um possível mecanismo para a inibição da fosforilação. Por fim, na terceira etapa do trabalho, foi construído e avaliado um preditor de sítios de ligação no DNA para receptores nucleares Abstract: Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR'gamma') is a nuclear receptor related to Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) and Metabolic Syndrome. Recent studies have supported its role as a link between insulin resistance and T2DM, through the S245 phosphorylation mediated by CDK5. This process is not clearly understood and its modulation by PPAR'gamma' ligands represents a promising antidiabetic approach. Moreover, a full comprehension of the interaction between PPAR'gamma' and DNA sequences in gene regulation can help to understand its actions in the context of T2DM. Thus, the objectives of this work are (i) study the interaction between CDK5 and the ligand binding domain (LBD) of PPAR'gamma', in order to understand its modulation mechanisms; (ii) elucidate the mechanism of the PPAR'gamma' phosphorylation inhibition and (iii) analyze the interaction between Nuclear Receptors DNA binding domain (DBD) and DNA sequences aiming to predict DNA binding sites for nuclear receptors. Firstly, it was proposed an interaction model of CDK5-PPAR'gamma' by computational approaches. The model allowed to identify PPAR? key residues related to this interaction and to S245 phosphorylation, all of them validated by fluorescence anisotropy experiments or phosphorylation assays. Secondly, it was performed a structural examination, based on experimental data, of the mechanism of S245 phosphorylation inhibition. Here, it was proposed the mechanism of such inhibition. Finally, in the third step, a DNA binding sites predictor for nuclear receptors was built and evaluated Doutorado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Doutor em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos CAPES 23038.006737/2012-56

Intestinal ischemia reperfusion injury (iIRI) is a severe clinical condition presenting high morbidity and mortality worldwide. Some of the systemic consequences of IRI can be prevented by applying ischemic preconditioning (IPC), a series of short ischemia/reperfusion events preceding the major ischemia. Although neutrophils are key players in the pathophysiology of ischemic injuries, neither the dysregulation presented by these cells in iIRI nor the protective effect of iIPC have their regulation mechanisms fully understood. Protein phosphorylation, as well as the regulation of the respective phosphatases and kinases are responsible for regulating a large number of cellular functions in the inflammatory response. Moreover, in previous work we found hydrolases and transferases to be modulated in iIR and iIPC, suggesting the possible involvement of phosphatases and kinases in the process. Therefore, in the present study, we analyzed the phosphoproteome of neutrophils from rats submitted to mesenteric ischemia and reperfusion, either submitted or not to IPC, compared to quiescent controls and sham laparotomy. Proteomic analysis was performed by multi-step enrichment of phosphopeptides, isobaric labeling, and LC-MS/MS analysis. Bioinformatics was used to determine phosphosite and phosphopeptide abundance and clustering, as well as kinases and phosphatases sites and domains. We found that most of the phosphorylation-regulated proteins are involved in apoptosis and migration, and most of the regulatory kinases belong to CAMK and CMGC families. An interesting finding revealed groups of proteins that are modulated by iIR, but such modulation can be prevented by iIPC. Among the regulated proteins related to the iIPC protective effect, Vamp8 and Inpp5d/Ship are discussed as possible candidates for control of the iIR damage.

Orientador: Andrea Balan Fernandes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A tuberculose, é uma doença infecciosa que geralmente afeta os pulmões e é causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Sua complexidade, duração do tratamento e o surgimento de cepas resistentes e multirresistentes, destacam a importância dos estudos sobre os mecanismos de resistência da bactéria, alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos e inibidores de crescimento e infecção mais eficazes. Transportadores do tipo ABC (do inglês ATP-Binding Cassette) apresentam papel fundamental durante a infecção pois, estão relacionados aos mecanismos de aquisição de nutrientes (importadores) como também à extrusão de drogas (exportadores ou bombas de efluxo). O transportador ABC Rv1747 deMtb não tem função conhecida, mas sua presença é requerida para o crescimento da bactéria in vivo. Estudos prévios sugerem seu papel na reciclagem de compostos hidrofóbicos, como drogas e lipídios. Adicionalmente, sua estrutura apresenta dois domínios do tipo Forkhead Associated (FHA-1 e FHA-2), fosforilados pela proteína PknF, uma serina/treonina quinase, possível reguladora da atividade do transportador. Neste contexto, esta pesquisa teve como objetivo caracterizar estruturalmente o transportador ABC Rv1747, especificamente, a sua interação com a proteína PknF (cPknF) e avaliar os possíveis efeitos estruturais e funcionais da fosforilação nos domínios FHA. Nesse sentido, produzimos o domínio FHA e três mutantes fosfomiméticos (FHA_T152E, e FHA_T210E e FHA_T152E/T210E) e o domínio catalítico de PknF (cPknF) na forma solúvel e estável. As alterações estruturais induzidas no domínio FHA como consequência da emulação da fosforilação, bem como da mistura FHA-cPknF, foram avaliadas por modelagem molecular, docking molecular, dicroísmo circular (CD), fluorimetria de varredura diferencial (DFS), fluorêscencia intrínseca de triptofanos, espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS), cristalografia de raios-X e calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Os resultados mostraram que os mutantes fosfomiméticos não sofrem alterações no conteúdo de estrutura secundária, mas diminuição (quenching) da fluorescência intrínseca dos triptofanos, similarmente ao que ocorreu com cPknF fosforilada (cPknF*). Tais alterações foram corroboradas pelas medidas de SAXS, que evidenciaram compactação do domínio FHA nos estados fosfomiméticos, tanto nos mutantes quanto na presença de cPknF*. As mutações nos domínios FHA também afetaram a afinidade pela cPknF, a qual exibiu maior afinidade pelo domínio selvagem (Kd = 0,4 µM) e menor pelo duplo mutante FHA_T152E/T210E (Kd = 9,4 µM).Finalmente, foi possível determinar a estrutura tridimensional de cPknF em complexo com o inibidor de quinases humanas IKK16 a 2.6 Å de resolução, a qual é caracterizada por arquitetura e topologia das quinases do tipo Hanks com os lobos amino (N) e carboxi (C) terminais, entre os quais forma-se a fenda que contém o sítio ativo. As análises de docking molecular com o ATP e a estrutura com o inibidor mostraram conservação em relação àsoutras quinases. O conjunto dos resultados permitiu-nos estabelecer um modelo para aativação do transportador pela quinase. Neste modelo, cPknF* teria como primeiro alvo a T152 próxima ao domínio FHA-1, desencadeando alterações estruturais que levariam à aproximação dos domínios FHA-1 e FHA-2 e, consequente fosforilação da T210. As mudanças conformacionais nos domínios FHA teriam como consequência, alterações nas ATPases, permeases e ativação do transportador. A estrutura da quinase e sua relevância na ativação do transportador abre perspectivas muito interessantes para o estudo destas proteínas comoalvos para o desenvolvimento de inibidores e papel funcional do transportador. Abstract: Tuberculosis is an infectious disease that usually affects the lungs and is caused by the bacillus Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Its complexity, duration of treatment and the emergence of resistant and multiresistant strains, highlight the importance of studies on the bacteria'sresistance mechanisms, targets for the development of new drugs and more effective growth and infection inhibitors. ATP-Binding Cassette (ABC) transporters play a fundamental role during infection because they are related to the mechanisms of nutrient acquisition (importers) as well as to the extrusion of drugs (exporters or efflux pumps). The ABC Rv1747transporter from Mtb has no known function, but its presence is required for the growth of the bacteria in vivo. Previous studies suggest its role in recycling hydrophobic compounds, such as drugs and lipids. Additionally, its structure presents two Forkhead-Associated domains (FHA-1 and FHA-2), phosphorylated by the protein PknF, a serine/threonine kinase, a possible regulator of the activity of the transporter. In this context, this research aimed to structurally characterize the ABC transporter Rv1747, specifically, its interaction with the PknF protein and to evaluate the possible structural and functional effects of phosphorylation in the FHA domains. In this sense, we produced the FHA domain and three phosphomimetic mutants (FHA_T152E, and FHA_T210E and FHA_T152E / T210E) and the catalytic PknF domain (cPknF) in soluble and stable form. The structural changes induced in the FHA domain as a consequence of the emulation of phosphorylation, as well as the FHA-cPknF mixture, were evaluated by molecular modeling, molecular docking, circular dichroism (CD), differential scanning fluorimetry (DFS), intrinsic tryptophan fluoroscopy, scattering of X-rays at low angle (SAXS), X-ray crystallography and isothermal titration calorimetry (ITC). The results showed that the phosphomimetic mutants do not undergo changes in the content of secondary structure but decrease (quenching) of the intrinsic fluorescence of tryptophan, similarly to what occurred with phosphorylated cPknF (cPknF *). Such changes were corroborated by the SAXS measurements, which showed compaction of the FHA domain in phosphomimetic states and an increase in stiffness, both in the mutants and in the presence of cPknF*. Mutations in the FHA domains also affected the affinity for cPknF, which exhibited greater affinity for the wild domain (Kd = 0.4 µM) and lower for the double mutant FHA_T152E / T210E (Kd = 9.4 µM). Finally, it was possible to determine the three-dimensional structure of cPknF in complex with the human kinase inhibitor IKK16 at 2.6 Å resolution, which is characterized by the architecture and topology of Hanks-type kinases with the amino (N) and carboxy (C) lobe termini, including the cleft that contains the active site. The molecular docking analyzes with ATP and the structure with the inhibitor showed conservation in relation to other kinases. The set of results allowed us to establish a model for the activation of the transporter by the kinase. In this model, cPknF* would first target T152 close to the FHA-1 domain, triggering structural changes that would lead to the approximation of the FHA-1 domains of FHA-2 and, consequently, phosphorylation of T210. Conformational changes in the FHA domains would result in changes in ATPases, permeases and transporter activation. The structure of the kinase and its relevance in the activation of the transporter opens very interesting perspectives for the study of these proteins as targets for the development of inhibitors and the functional role of the transporter Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular COLCIENCIAS 678

Orientador: Maria Marluce dos Santos Vilela Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Os erros inatos da imunidade (EII) ou imunodeficiência primária (IDPs) são distúrbios genéticos que se manifestam com susceptibilidade aumentada para doenças infecciosas, autoimunes, autoinflamatórias, linfoproliferativas com ou sem malignidade. Causados por mutações monogênicas da linha germinativa, dominantes ou recessivas, autossômicas ou ligadas ao X. Entre esses distúrbios está o ganho de função de STAT3 (STAT3-GOF). STAT3 é um fator de transcrição para sinalização de citocinas, crítico para a regulação de genes. Variantes STAT3-GOF levam a um fenótipo de linfoproliferação, citopenias autoimunes, maior suscetibilidade à infecção, autoimunidade de órgãos específicos de início precoce, baixa estatura e eczema. O objetivo desse estudo foi identificar, através do Sequenciamento Total do Exoma, o diagnóstico molecular em uma coorte de 18 pacientes com fenótipo de linfoproliferação, autoimunidade e hipogamaglobulinemia em acompanhamento no Ambulatório de Imunodeficiência Pediátrica do Hospital de Clínicas da Universidade de Campinas - São Paulo - Brasil. Nos pacientes com variantes em STAT3 analisamos a cinética de fosforilação e a translocação nuclear da STAT3 por citometria de fluxo, a expressão gênica da via de sinalização JAK/STAT através de um arranjo gênico (array) de 92 genes, por PCR em tempo real (qPCR) e o perfil de citocinas. Além de ampliar o estudo para os familiares dos pacientes. Com isso, visamos melhorar a compreensão do fenótipo diverso atribuído às variantes STAT3-GOF e encontrar possíveis marcadores para auxiliar no entendimento da evolução clínica desta variante. Observamos translocação nuclear normal de STAT3 em linfócitos TCD3+ primários ativados por IL-6, no entanto todos os pacientes apresentaram fosforilação prolongada da STAT3 ao comparar com indivíduos controles, mas sem diferença significativa. A análise do array mostrou que em 86,9% dos genes a expressão estava normal, ao utilizar um ponto de corte de ± 2,0 vezes e observamos que os genes CXCL8, KIT e IL2RA foram marcadamente hipoexpressos e junto com SOCS3 foram selecionados para serem validados no ensaio de expressão gênica única. O CXCL8 foi marcadamente reduzido para todos os pacientes, enquanto o KIT e IL2RA foram hipoexpressos em pacientes com maior penetrância clínica. Diferente da literatura, não encontramos regulação positiva do SOCS3 em nossos pacientes. O impacto das variantes do STAT3-GOF no desencadeamento dos eixos regulatórios negativos como CXCL8/STAT3, KIT/STAT3 e IL2/CD25/Treg são consequências moleculares importantes que têm potencial para influenciar o desenvolvimento de sinais clínicos, como neutropenia, falha na melanogênese, células Treg reduzidas, autoimunidade e hipogamaglobulinemia nesses pacientes Abstract: Inborn Errors of Immunity (IEI) or primary immunodeficiency diseases (PIDs) are genetic disorders that manifest with increased susceptibility to infectious, autoimmune, autoinflammatory, lymphoproliferative diseases with or without malignancy. They are caused by monogenic germline mutations, dominant or recessive, autosomal or X-linked. Among these disorders is the gain-of-function of STAT3 (STAT3-GOF). STAT3 is a cytokine-signaling transcription factor critical for gene regulation. STAT3-GOF variants lead to a phenotype of lymphoproliferation, autoimmune cytopenias, increased susceptibility to infection, autoimmunity of specific organs of early onset, short stature and eczema. The aim of this study was to identify, through Whole Exome Sequencing (WES), the molecular diagnosis in a cohort of 18 patients with a phenotype of lymphoproliferation, autoimmunity and hypogammaglobulinemia followed up at the Pediatric Immunodeficiency Outpatient Clinic of the Hospital de Clínicas, University of Campinas - São Paulo - Brazil. In patients with STAT3 variants, we analyzed the phosphorylation kinetics and nuclear translocation of STAT3 by flow cytometry, gene expression of the JAK/STAT signaling pathway through a gene array of 92 genes, by real-time PCR (qPCR) and cytokine profile to improve the understanding of the diverse phenotype attributed to the STAT3-GOF variants and to find possible markers to assist in understanding the clinical evolution of this variant. We showed normal nuclear translocation of STAT3 in primary TCD3+ lymphocytes activated by IL-6, however all patients presented prolonged phosphorylation of STAT3 when compared with control individuals, but without significant difference. The analysis of the array showed normal expression in 86.9% of the genes, when using a cutoff point of ± 2.0 fold and we observed that the CXCL8, KIT and IL2RA genes were markedly hypoexpressed and together with SOCS3 were selected to be validated in the unique gene expression assay. CXCL8 was markedly downregulated for all patients, while KIT and IL2RA were hypoexpressed in patients with the highest clinical penetrance. Unlike the literature, we did not find SOCS3 upregulated in our patients. In addition, we showed low levels of IL-2 for all patient, except for P01-F and also low numbers of Tregs cells. The impact of STAT3-GOF variants in triggering a down regulatory axes CXCL8/STAT3, KIT/STAT3 and IL2/CD25/Treg are important molecular consequence that have potential to influence the development of clinical signs such as neutropenia, failure in melanogenesis, reduced Treg cells, autoimmunity and hypogammaglobulinemia in these patients Doutorado Saúde da Criança e do Adolescente Doutora em Ciências CAPES 88882.434596/2019-01 FAPESP 2016/25615-6

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Prevê-se que a população mundial aumente, aproximadamente 34% em relação a 2009, até 2050. Para lidar com este aumento, é necessário aumentar o rendimento da agricultura. Um aumento no rendimento da agricultura requer plantas com a capacidade de resistir mais às condições de stress. Como elas são organismos sésseis, elas devem suportar e superar o stress biótico e abiótico. Frequentemente, a presença de stresses resulta na privação de energia, que é promovida pela redução da fotossíntese e pode levar à morte celular. A Sucrose non-fermenting1 protein kinase 1 (SnRK1) é responsável pelo restabelecimento da homeostasia energética e ao mesmo tempo intervém na regulação de processos de crescimento e desenvolvimento vegetais. Nesses mecanismos de regulação têm particular importância as fito-hormonas, tais como Ácido Abscísico (ABA) e as Giberelinas (GAs). As GAs são hormonas relacionadas com processos de desenvolvimento e de crescimento em plantas, envolvendo o alongamento das células, de que resulta um alongamento do hipocótilo e do tronco. As proteínas DELLA atuam como reguladores negativos dos efeitos de GA, na via de sinalização. Anteriormente, a interação entre as subunidades SnRK1 e as proteínas DELLA foi observada através de um ensaio de interação de proteínas, o Yeast Two-Hybrid. Neste estudo, a interação do complexo SnRK1 e das proteínas DELLA foi confirmada através de um teste de interação in vitro, o pull-down, o que sugere que as proteínas DELLA são substratos da SnRK1. Os resultados obtidos no presente trabalho mostram igualmente que a sobre expressão de SnRK1.1 origina um fenótipo de insensibilidade a GA. Globalmente, estes resultados sugerem que SnRK1 tem um papel importante na via de sinalização das giberelinas atuando como um regulador negativo.

Orientadores: Ângela Maria Moraes, Diego Mantovani Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: O periósteo é uma importante estrutura do tecido ósseo e se mostra fundamental no processo de cura de lesões ósseas, fornecendo compostos celulares e biológicos essenciais para sua regeneração. Scaffolds, capazes de mimetizar o periósteo são particularmente atraentes, pois podem melhorar significativamente a regeneração óssea em lesões graves. Estes dispositivos servem como suporte para a proliferação de células capazes de se diferenciar em linhagens ósseas e podem ser constituídos de polímeros naturais. A quitosana é um polímero biocompatível e biodegradável, que facilita a proliferação celular, e por isso é muito utilizada na produção de scaffolds. Para melhorar sua osteoindutividade, a introdução de grupos fosfato em sua estrutura, ou fosforilação, pode ser realizada. A xantana é um polissacarídeo capaz de interagir com a quitosana, resultando em complexos com propriedades superiores às dos polímeros isolados. Neste trabalho, scaffolds de quitosana (fosforilada ou não modificada) combinada com xantana foram produzidos, na presença ou ausência de um agente porogênico, o tensoativo Kolliphor® P188, e do gel de silicone Silpuran® 2130 A/B. A caracterização dos materiais produzidos foi realizada para validação de sua potencial aplicação como substitutos do periósteo. Materiais altamente porosos foram obtidos e a presença do silicone reforçou mecanicamente as matrizes, não impactando negativamente em suas propriedades físicas, físico-químicas e biológicas. A fosforilação da quitosana levou à obtenção de scaffolds com propriedades similares às dos materiais produzidos com o polímero não modificado, com potencial para concentrar proteínas morfogenéticas ósseas nativas in vivo, o que foi inferido pela maior adsorção de citocromo C apresentada por essas formulações. Além disso, não foram observados efeitos citotóxicos dos scaffolds, que mostraram, como vantagem adicional, cinética de degradação apropriada para a aplicação proposta. A análise do cultivo in vitro de células tronco derivadas do tecido adiposo nos scaffolds e de sua diferenciação em osteoblastos mostraram que modificações ou tratamentos adicionais na superfície dos materiais podem trazer benefícios quanto ao desempenho celular nos mesmos. Além disso, elevada deposição de minerais e formação de matriz extracelular foram observadas. Ensaios complementares são necessários para investigar de forma mais aprofundada a resposta gerada pelos materiais in vivo. Como conclusão geral, os resultados obtidos fornecem indícios de que as formulações propostas neste trabalho são promissoras para a aplicação na engenharia de tecido periosteal e reparo ósseo Abstract: The periosteum is an important structure of the bone tissue and is fundamental in the healing process of bone lesions, providing cellular and biological compounds essential for tissue repair. Tissue engineered scaffolds able to mimic the periosteum are particularly attractive because they can significantly improve bone regeneration in severely injured tissues. These devices function as support for cells that are able to proliferate and differentiate into bone cells and can be constituted of natural polymers, such as xanthan gum and chitosan. Xanthan gum is a polysaccharide that may interact with chitosan, a biocompatible and biodegradable polymer, resulting in complexes with improved properties in comparison to those of matrices produced with each polysaccharide alone. Chemical modifications, such as the phosphorylation of chitosan, can be performed to enhance the osteoinductivity of the resulting scaffold. In this work, chitosan (phosphorylated or chemically unmodified) scaffolds combined with xanthan were produced, in the presence or not of a porogenic agent, the surfactant Kolliphor® P188, and the silicone rubber Silpuran® 2130 A/B. The scaffolds were characterized to validate their potential application as periosteum substitutes. Highly porous materials were obtained and the presence of silicon mechanically reinforced the matrices, not negatively impacting their physical, physicochemical and biological properties. Formulations produced using phosphorylated chitosan presented similar properties to formulations produced with the unmodified polymer, with potential to concentrate native bone morphogenetic proteins in vivo, which was inferred by the higher adsorption of cytochrome C presented by these formulations. In addition, no cytotoxic effects of the scaffolds were observed, and they presented, as an additional advantage, degradation kinetics appropriate for the proposed application. The analysis of adipose derived stem cells culture n vitro on the scaffolds produced and of cell differentiation into osteoblasts showed that additional scaffold surface treatment or modification procedures may contribute to improve cell performance on the materials. Moreover, high deposition of minerals and formation of extracellular matrix were observed. Complementary studies are required to further investigate the in vivo response generated by these materials. As a general conclusion, the obtained results indicate that the formulations proposed in this work are promising for the application in periosteal tissue engineering and bone repair Doutorado Engenharia Química Doutora em Engenharia Química CAPES 33003017034P8 CNPQ

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Florianópolis, 2018. O medo é um estado consciente causado pela exposição a ameaças reais ou imaginárias que desencadeiam respostas de estresse, afetando o corpo e o cérebro, particularmente as estruturas límbicas. Um subgrupo de pacientes com epilepsia do lobo temporal mesial relacionada à esclerose do hipocampo (ELTM-EH) apresentam uma sensação de medo, chamado de medo ictal, semelhante a ataques do tipo pânico, relacionado ao efeito direto ou indireto da atividade epiléptica circuitos cerebrais relacionados à defesa e sobrevivência. Os transtornos psiquiátricos, como distúrbios de ansiedade e humor, são altamente prevalentes em pacientes com epilepsia do lobo temporal mesial relacionada à esclerose do hipocampo (ELTM-EH). A eficácia da transmissão sináptica pode ser modificada bidirecionalmente por meio de potencialização (LTP, potencialização a longo prazo) ou depotenciação (LTD, depressão de longo prazo) e através do estado de fosforilação dos sítios Ser831 e Ser845, na subunidade GluA1 dos receptores AMPA de glutamato, caracterizando um evento crítico para a plasticidade sináptica. Na primeira parte desta tese (Capítulo 1) comparamos os níveis de GluA1 e sua fosforilação na Ser-845 e Ser-831 medidos por Western blot na amígdala (AMI), hipocampo (HIP) e giro médio do neocórtex temporal (CX) coletados durante a cirurgia para epilepsia em pacientes com ELTM-EH que apresentavam (n=6) ou não medo ictal (n=25). Os pacientes que apresentavam medo ictal tiveram uma diminuição de 11% nos níveis da subunidade GluA1 na AMY (p=0,05) e uma diminuição de 21,5% nos níveis de P-GluA1-Ser845 no HIP (p=0,009) em comparação aos pacientes que não apresentavam medo ictal. As associações observadas não puderam ser atribuídas às variações na distribuição de outros tipos de auras bem como variáveis demográficas, clínicas e neurocirúrgicas. Os níveis mais baixos de P-GluA1-Ser845 no HIP de pacientes com medo ictal não estiveram associados aos níveis da subunidade catalítica PP1-alfa da proteína fosfatase serina/treonina ou atividade da proteína quinase A. Tomados em conjunto, os níveis de subunidade GluA1 na AMY e P-GluA1-Ser845 no HIP mostram uma acurácia global de 89,3% (especificidade 95,5% e sensibilidade 66,7%) para predizer a presença de medo ictal. Tanto a ocorrência de medo ictal, como os níveis da GluA1-Ser845 no HIP e dos receptores GluA1na AMI não estiveram associados ao diagnóstico e aos níveis de sintomas psiquiátricos dos pacientes. Como esta análise de associação entre medo ictal e transtornos psiquiátricos descrita acima o tamanho da amostra foi reduzido, nós realizamos um segundo estudo incluindo maior número de pacientes e que compôs a segunda parte desta tese (Capítulo 2). Analisamos a associação entre a ocorrência de medo ictal e os escores da Escala de Depressão Hospitalar de ansiedade (HADS-A) e depressão (HADS-D) e diagnóstico psiquiátrico em 116 pacientes adultos com ELTM-EH resistentes ao tratamento farmacológico. Os pacientes com medo ictal (n = 15) apresentaram maiores níveis de sintomas de ansiedade, mas não de depressão. Não houve associação entre a ocorrência de medo ictal e o diagnóstico de transtornos de ansiedade ou depressão. Foi encontrada uma associação forte e independente entre a ocorrência de medo ictal e o diagnóstico de transtorno disfórico interictal (OR, IC 95% = 7,6, 1,3 - 43,2, p = 0,02). A associação observada não pode ser atribuída às variações observadas na distribuição de outros tipos de auras bem como variáveis demográficas e clinicas. Este é o primeiro estudo da literatura abordando marcadores de neuroplasticidade em estruturas límbicas conectadas a circuitos de defesa em seres humanos, e que apresentam implicações para a compreensão de doenças psiquiátricas prevalentes e seus sintomas. Abstract : Fear is a conscious state caused by exposure to real or imagined threats that trigger stress responses that affect the body and brain, particularly limbic structures. A sub-group of patients with mesial temporal lobe epilepsy related to hippocampus sclerosis (MTLE-HS) have seizures with fear, which is called ictal fear (IF), due to epileptic activity within the brain defensive survival circuits structures. Psychiatric disorders such as, anxiety and mood disorders, are highly prevalent in patients with mesial temporal lobe epilepsy related to hippocampus sclerosis (MTLE-HS). Synaptic transmission efficacy can be bi-directionally modified through potentiation (LTP, long-term potentiation) or depression (LTD, long-term depression) as well as the phosphorylation state of Ser831 and Ser845 sites at the GluA1 subunit of the glutamate AMPA receptors, which has been characterized as a critical event for this synaptic plasticity. In the first chapter, GluA1 levels and the phosphorylation at Ser845 and Ser831 in the amygdala (AMY), anterior hippocampus (aHIP) and middle gyrus of temporal neocortex (CX) were determined with Western blots and compared between MTLE-HS patients who were showing (n = 06) or not showing (n = 25) IF. Patients with IF had an 11% decrease of AMY levels of the GluA1 subunit (p = 0.05) and a 21.5% decrease of aHIP levels of P-GluA1-Ser845 (p = 0.009) compared to patients not showing IF. The observed associations were not related to imbalances in the distribution of other concomitant types of aura, demographic, clinical or neurosurgical variables. The lower levels of P-GluA1-Ser845 in the aHIP of patients with IF were not related to changes in the levels of the serine/threonine-protein phosphatase PP1-alpha catalytic subunit or protein kinase A activation. Taken together, the GluA1 subunit levels in AMY and P-GluA1-Ser845 levels in the aHIP show an overall accuracy of 89.3% (specificity 95.5% and sensitivity 66.7%) to predict the presence of IF. AMY levels of the GluA1 subunit and aHIP levels of P-GluA1-Ser845 were not associated with the psychiatric diagnosis and symptoms of patients. As in the first analysis os association between ictal fear and psiquiatric disorders described above the sample size was small, we performed a second study including a larger number of patients and that composed the second part this thesis (Chapter2). Thus, we investigated if the occurrence of ictal fear was independently associated with anxiety and depression diagnosis or symptoms in patients with drug-resistant MTLE-HS. We analyzed the association between the occurrence of ictal fear and Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS) scores and psychiatric diagnosis in 116 consecutive adult drug-resistant MTLE-HS patients. Patients with ictal fear (n = 15) presented higher levels of anxiety, but not depressive symptoms. There were no association between of ictal fear and the diagnosis of anxiety disorders or depression. A strong and independent association between the ictal fear and the diagnosis of interictal dysphoric disorder (OR, IC 95% = 7.6, 1.3 43.2, p = 0.02) was found. The association could not be attributed to other concomitant auras or imbalances of demographic and clinical variables distribution. This is the first report to address neuroplasticity features in human limbic structures connected to the defensive survival circuits, which has implications for the comprehension of highly prevalent psychiatric disorders and symptoms.

Orientador: Sandra Martha Gomes Dias Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Glutaminases (GLS) são enzimas envolvidas no crescimento e progressão tumoral dado seu papel na manutenção da homeostase redox, produção de energia e aumento de biomassa celular. Assim, as GLS têm sido caracterizadas como importantes para os processos de migração e invasão. A via da PI3K/mTOR está intimamente relacionada ao aumento de biomassa e crescimento tumoral, estando com sua função desregulada em tumores. mTOR regula glutaminases em nível de estabilidade de RNA em mecanismo envolvendo aumento traducional de c-MYC que, por sua vez, inibe a expressão de um miRNA, impactando nos níveis proteicos de GLS. Neste trabalho, interferimos na via da mTOR através da sua inibição com rapamicina ou pelo knockdown do regulador negativo TSC2, assim como a estimulamos pela expressão da RagB selvagem ou de um mutante constitutivamente ativo. Em todos os casos, observamos uma relação positiva entre a atividade de mTOR e a atividade de GLS, o que, entretanto, não envolveu alteração no nível proteico da enzima. Intrigados sobre qual poderia ser o mecanismo por trás da regulação, investigamos via espectrometria de massas se a glutaminase C (GAC, uma das isoforma do gene GLS) sofria modificações pós-traducionais ou ligação a parceiros de interação, dependentes da ação de mTOR. Como possíveis candidatos, identificamos a proteína Sec13 (componente de GATOR2), HNRNP H1 (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1), EEFD (Eukaryotic elongation factor delta) e ASS1 (Argininosuccinate synthase). Por outro lado, também identificamos uma fosforilação em serina 95 (S95) e acetilação na lisina 197 (K197), os quais, entretanto, não responderam diferencialmente ao tratamento com rapamicina. Verificamos que a expressão do fosfomimético S95D levou a diminuição na atividade de glutaminase de lisado celular. Em acordo, a expressão de GAC.S95D levou a diminuição nos fenótipos de proliferação e migração celular. Curiosamente, o mutante S95A, com pouco impacto na atividade de glutaminase, levou a um aumento proeminente de proliferação, migração e dos níveis de marcadores de transição epitélio-mesênquima (EMT). Tomados em conjunto nossos resultados apontam que GAC tem o potencial de ser regulada por mTOR via interação proteica. Além disto, mostramos que o N-terminal de GAC sofre fosforilação no resíduo S95 e, através do uso de mutantes, identificamos que esta modificação tem o potencial de afetar a função da enzima glutaminase endógena e parâmetros celulares tais como proliferação e migração Abstract: Glutaminases (GLS) are enzymes involved in tumor growth and progression due to their role in maintaining redox homeostasis, energy production and increased cellular biomass. In this sense, GLS have been characterized as important for migration and invasion processes. The PI3K / mTOR pathway is closely related to increased biomass and tumor growth and is frequently dysregulated in tumors. mTOR regulates glutaminases in RNA stability in a mechanism involving c-MYC translational control, which in its turn, inhibits miRNA expression, impacting on increased GLS protein levels. In this work, the mTOR pathway was disturbed using a chemical inhibitor, rapamycin, through the knockdown of TSC2 and the expression of wild-type RagB and the constitutively active mutant. In all cases, we observed a positive regulation of mTOR on GLS activity without changes in glutaminase protein levels. Intrigued by the mechanism by which mTOR was regulating glutaminases, we investigated, using mass spectrometry, whether glutaminase C (one of the GLS isoforms) underwent post-translational modifications or binding to interaction partners, dependent on the action of mTOR. As a possible candidate, we have identified Sec13 (GATOR2 component), HNRNP H1 (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1), EEFD (Ekaryotic elongation factor delta) and ASS1 (Argininosuccinate synthase) proteins. On the other hand, we also identified a phosphorylation in serine 95 (S95) and acetylation in lysine 197 (K197), which, however, is not under mTOR control. We have found that expression of phosphomimetic S95D led to a decrease in glutamine activity. Accordingly, an expression of GAC.S95D led to a slight decrease in proliferation and cell migration phenotypes. Interestingly, the mutant S95A, which had little impact on glutaminase activity, led to a prominent increase in proliferation, migration, and levels of epithelial-mesenchymal transition markers (EMT). Taken together, our results show that GAC has the potential to be regulated by mTOR through protein interaction. In addition, we show that the N-terminal of GAC undergoes phosphorylation in residue S95 and, through the use of mutants, it was identified that this modification has the potential to affect an endogenous glutaminase enzyme function and cellular parameters such as proliferation and migration Doutorado Genética Animal e Evolução Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2013/23510-4 CNPQ 140545/2014-0

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Alzheimer’s disease (AD) is the most common type of dementia worldwide. It is molecularly characterized by deposition of extracellular senile plaques (SPs) composed by aggregated amyloid beta (Aβ) peptide, the formation of neurofibrillary tangles (NFTs) derived from hyperphosphorylation of the microtubule-associated protein Tau, synaptic dysfunction due to the deposits of SPs and NFTs and oxidative stress induced by impaired metabolic pathways. The insulin signalling pathway can play a major role in diverse AD related pathways, such as APP cleavage, Tau hyperphosphorylation, Apolipoprotein E (ApoE) influence in insulin signalling efficiency and the insulin degrading enzyme, which is also the major Aβ degrading enzyme. Growing evidence links AD with type 2 diabetes (T2D) due to impaired insulin signalling (IS) and brain insulin resistance. In a cohort based study in the Aveiro region, a correlation between diabetes and poor cognitive scores in the Mini Mental State Examination (MMSE) test were observed, with a p-value of 0.072. Additionally, carriers of the allele ApoE-ɛ2 appeared to be protective against diabetes, in the literature the same allele appears to be protective for AD. Posteriorly, the analysis of protein interactions, via the development of interactome networks, identified several proteins involved in both AD and the IS pathways. Also, by correlating these pathways with the synapse proteome, a very high overlap was observed (88% for AD, 79% for IS and 96% for AD and IS coincident proteins), enforcing the importance of both pathways in synaptic signalling and plasticity. From gene ontology studies, it was possible to assess the principal biological processes and molecular functions of the dataset of proteins. For AD, response to stimulus, cellular component organization, cell communication, signalling, protein binding, receptor binding and kinase binding were categories with elevated representation. Regarding coincident proteins between AD and IS pathways, an increase in all categories was observed, meaning that insulin plays a pivotal role in many AD events. Finally, the analysis of SH-SY5Y differentiated cells treated with 0, 1, 10 and 100 nM of insulin for 0, 10 and 60 minutes, showed a decrease on the intracellular total levels of protein Tau and an increase in the phosphorylation at serine 396. Regarding the amyloid precursor protein (APP), increases in intracellular levels were observed, when treated with insulin for 10 minutes, followed by a decrease for 60 minutes exposure. The phosphorylation of APP at threonine 668, has previously been related to increased production of Aβ, by promoting APP cleavage via the amyloidogenic pathway. In cells treated with insulin, a clear increase was detected at the 10-minute time point. At 60 minutes, the levels of phosphorylation were low probably due to low total APP levels. A doença de Alzheimer (DA) é o tipo mais comum de demência no mundo. É caracterizada molecularmente pela deposição extracelular de placas senis (PS) compostas por agregados do péptido amiloide beta (Aβ), pela formação de emaranhados neurofibrilares (EN) derivados da hiperfosforilação da proteína Tau, pela disfunção sináptica devido aos depósitos de PS e EN e também pelo stress oxidativo induzido pelo enfraquecimento das vias metabólicas. A via de sinalização da insulina desempenha um papel principal em diversas vias da DA, tal como na clivagem da APP, hiperfosforilação da proteína Tau, eficiência da sinalização da insulina influenciada pela Apolipoproteína E (ApoE) e pela enzima envolvida na degradação de insulina que também é a enzima principal na degradação de Aβ. Crescente evidência relaciona a DA com a diabetes de tipo 2 (T2D) devido ao mau funcionamento da sinalização pela insulina e da resistência cerebral à mesma. Num estudo baseado num cohort da região de Aveiro, foi observada uma correlação entre a diabetes e um mau resultado no teste do ‘Mini Mental State Examination’. Adicionalmente, também foi observada uma correlação entre os portadores do alelo ApoE-ɛ2 e um estado protetor contra a T2D. Este alelo também foi observado na literatura como sendo protetor contra a DA. Posteriormente, uma análise de interações entre proteínas, identificou várias proteínas envolvidas tanto na DA como na sinalização da insulina. Correlacionando estes dados com o proteoma da sinapse, foi possível observar que existe uma grande representação das duas condições e também das proteínas coincidentes às duas (88% para a DA, 79% para a sinalização da insulina e 96% para as proteínas relacionadas com ambas), reforçando o papel de ambas as vias na sinalização e plasticidade sináptica. Do estudo de ontologia genética para a DA, foi possível identificar diversas vias importantes, tais como, resposta a um estímulo, organização de componentes celulares, comunicação celular, ligação proteica e ligação a uma cinase. Em relação à sinalização da insulina, as mesmas categorias apareciam com maior representação, significando que a insulina tem um papel importante em muitos eventos da DA. Por fim, o tratamento de SH-SY5Y diferenciadas com 0, 1, 10 e 100 nM de insulina por 0, 10 e 60 minutos mostraram uma diminuição nos níveis intracelulares da proteína Tau e um aumento na sua fosforilação na serina 396. Em relação à proteína percursora amiloide (APP), o tratamento de insulina levou a um aumento nos níveis intracelulares, quando exposta por 10 minutos seguido por uma diminuição aos 60 minutos. Quanto à fosforilação da treonina 668 da APP, foi previamente demonstrado que um aumento na fosforilação desse resíduo, promove a clivagem pela via amiloidogénica, levando à produção de Aβ. Nas células tratadas com insulina, um aumento claro da fosforilação desse resíduo da APP foi observado aos 10 minutos. Aos 60 minutos, os níveis da fosforilação eram baixos provavelmente devido aos baixos níveis de APP total.

As plantas, sendo organismos sésseis, não conseguem escapar a condições de stress biótico e abiótico por mais severas que estas possam ser. Essas condições de stress resultam tipicamente em défice energético afetando o crescimento e desenvolvimento da planta. Assim, para uma resposta eficiente ao stress é crucial que esta seja acompanhada pela ativação de mecanismos que assegurem a reposição da homeostasia energética. SnRK1 (sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 1) deteta condições de stress energético devidas a escassez de nutrientes, stress ambiental ou escuridão repentina, e atua controlando o metabolismo e a transcrição de genes para garantir a homeostasia. São cada vez mais os estudos que tem vindo a demonstrar a ligação entre a SnRK1 e os mecanismos de sinalização de hormonas, como o Ácido Abscísico (ABA) e Giberelinas (GA). As GAs são hormonas vegetais que controlam vários processos de desenvolvimento, sendo o alongamento celular e o consequente alongamento do hipocótilo ou do caule um dos seus efeitos mais óbvios. Neste trabalho a interação entre as proteínas DELLA, um dos componentes principais da via de sinalização de GA, e SnRK1.1, anteriormente identificada através de um rastreio de Y2H, foi confirmada. Os resultados obtidos evidenciam que as DELLA interagem também com outras proteínas do complexo SnRK1 indicando que as DELLA são um substrato de SnRK1. A análise fenotípica de mutantes sobre-expressores e de expressão reduzida de SnRK1.1 revelam que SnRK1 é um regulador negativo da sinalização de GA. No seu global, os resultados obtidos sugerem que SnRK1 fosforila e estabiliza as proteínas DELLA, tendo assim um papel crucial na regulação do crescimento e desenvolvimento das plantas e constitui um mecanismo molecular de ligação entre a regulação do stress energético e a sinalização de giberelinas.

Doutoramento em Biomedicina Gαo is the most abundant Gα subunit present in the brain, however, its specific functions are still far from clear. Studies of the signaling pathways modulated by Gαo have uncovered potential roles for Gαo in the development of the nervous system, especially in neuritogenesis. The characterization of Gαo interactome has also been crucial for the better understanding of this protein’s functions. One of the Gαo interacting proteins is the amyloid precursor protein (APP), a protein that is involved in several physiological functions, such as cell survival, neuronal migration, and neuronal differentiation. APP is also best known for its involvement in Alzheimer’s Disease (AD). APP binds and activates Gαo, an interplay that was associated with neuronal migration and AD. However, so far, no published study has investigated the effects of the APP-Gαo interaction on neuritogenesis. The main goal of this work was thus to characterize Gαo role on neuritogenesis by focusing the research on the neuritogenic effects of the Gαo-APP complex. First, by using SH-SY5Y neuroblastoma cells, we studied the impact of APP serine 655 (S655) phosphorylation on the APP-Gαo interaction. Through the use of two APP mutants mimicking the phosphorylated and dephosphorylated state of S655, SE and SA APP respectively, we have demonstrated that S655 phosphorylation increases APP efficiency to bind and activate Gαo. Moreover, we present evidence that APP modulates Gαo neuritogenic effects in a phosphodependent mechanism. STAT3 and ERK1/2 signaling displayed a sequential activation on this neuritogenic mechanism, with STAT3 being mainly involved in the formation of new processes, while ERK1/2 was more involved in neuritic elongation. We also present data supporting a role for the APP-Gαo complex on dendritogenesis in rat primary neuronal cultures. The second part of this work focused on unraveling the mechanisms involved in the control of APP and Gαo cellular protein levels. We identified the lysosome as a new pathway by which Gαo is degraded, as an effect of SA APP overexpression. We also provide evidence that this degradation mechanism might be part of chaperone-mediated autophagy, through which APP-Gαo signaling might be regulated. Finally, due to our interest in studying neuronal differentiation and a lack of reliable tools to analyze phase contrast images, we developed NeuronRead, an ImageJ macro capable of semi-automated analysis of both phase contrast and fluorescence neuronal images. NeuronRead was extensively validated and used to monitor SH-SY5Y differentiation upon modulation of Gαo activity. With this work, we delivered new data that advances knowledge on the function and regulation of the Gαo-APP complex in a neuronal context, and provided the scientific community with a new tool for the study of neuronal differentiation. Gαo é a subunidade Gα mais abundante no cérebro, no entanto, as suas funções especificas ainda estão longe de serem claras. Estudos das vias de sinalização moduladas pela Gαo têm exposto potenciais papéis para a Gαo no desenvolvimento do sistema nervoso, especialmente em neuritogénese. A caracterização do interactoma da Gαo também tem sido crucial para uma melhor compreensão das funções desta proteína. Uma das proteínas interatoras da Gαo é a proteina precursora de amiloide (APP), uma proteina que se encontra envolvida em várias funções fisiológicas, como sobrevivência celular, migração neuronal, e diferenciação neuronal. APP também é mais conhecida pelo seu envolvimento da Doença de Alzheimer (AD). APP liga-se e ativa a Gαo, uma interação que tem sido associada com migração neuronal e AD. No entanto, até agora, não existem estudos publicados que investiguem a interação APP-Gαo na neuritogénese. O principal objetivo deste trabalho foi então caracterizar o papel da Gαo na neuritogénese através do foco na investigação dos efeitos neuritogénico do complexo Gαo-APP. Primeiro, através do uso de células de neuroblastoma SH-SY5Y, estudámos o impacto da fosforilação da serina 655 (S655) da APP na interação APP-Gαo. Através do uso de dois mutantes da APP que mimetizam o estado fosforilado e desfosforilado da S655, SE e SA APP respetivamente, demonstrámos que a fosforilação da S655 aumenta a eficiência da APP em ligar e ativar a Gαo. Além disso, apresentamos provas de que a APP modula os efeitos neuritogénicos da Gαo num mecanismo fosfo-dependente. Neste mecanismo neuritogénico, a sinalização da STAT3 e ERK1/2 exibiram uma ativação sequencial, com a STAT3 participando na formação de novos processos e a ERK1/2 na elongação dos mesmos. Apresentamos ainda dados que suportam um papel da APP-Gαo na dendritogénese em culturas neuronais primárias. A segunda parte deste trabalho focou-se na investigação de mecanismos envolvidos no controlo dos níveis proteicos celulares da APP e Gαo. Identificámos o lisossoma como um novo processo pelo qual a Gαo é degradada em consequência da sobre expressão da SA APP. Também mostramos provas de que este mecanismo pode fazer parte de autofagia mediada por chaperonas, através do qual a sinalização da APP-Gαo poderá estar a ser regulada. Finalmente, devido ao nosso interesse em estudar diferenciação neuronal e à falta de ferramentas para este estudo em imagens de contraste de fase, criámos o NeuronRead, uma macro do ImageJ capaz de analisar de forma semiautomática imagens neuronais de contraste de fase e fluorescência. NeuronRead foi extensivamente validado, e usado para monitorizar a diferenciação de células SH-SY5Y após modulação da atividade da Gαo. Com este trabalho contribuímos com novos dados que ajudam na compreensão da função e regulação do complexo Gαo-APP, e disponibilizamos para a comunidade cientifica uma nova ferramenta para o estudo da diferenciação neuronal

Mestrado em Bioquímica - Bioquímica Clínica c-FLIP é uma proteína conhecida pela sua capacidade de se ligar ao DISC, onde compete com a procaspase-8 pela interação com FADD. No entanto, existem evidências que a sua isoforma longa consegue regular também o ciclo celular e mecanismos de proliferação. Para além disso, a atividade de c-FLIPL pode ser controlada por fosforilação. Assim, o objetivo deste estudo é perceber como a fosforilação no resíduo de serina 227 nesta proteína afeta a proliferação e ciclo celular. Neste estudo, observamos que a sobre-expressão de c-FLIPL com uma mutação de serina para alanina no resíduo 227 levou a uma diminuição da capacidade proliferativa dessas células. O uso de citometria de fluxo permitiu verificar este decréscimo na capacidade proliferativa, assim como uma acumulação de células na fase G1 do ciclo celular aquando da sobre-expressão de S227A c-FLIPL. Os resultados obtidos sugerem que a sobre-expressão de c-FLIPL controla a população celular através da transição G1/S, através da sua fosforilação no resíduo 227. No entanto, mais estudos são necessários para se perceber a partir de qual mecanismo esta transição é afetada c-FLIP is a protein known for its capacity to bind to the DISC and compete with procaspase-8 for FADD interaction. However, published studies have shown that c-FLIPL can regulate cell cycle and proliferation. Similarly to many other proteins, c-FLIP can be regulated by phosphorylation. Therefore, the aim of this work was to understand how the phosphorylation of S227 residue on c-FLIPL affects cell cycle and cell proliferation. We observed that overexpression of phosphodeficient mutant c-FLIPL lead to a decrease in cell proliferation. Flow cytometric analysis confirmed this decrease, as well as an accumulation of cell at G1 phase of cell cycle, when overexpressing S227A c-FLIPL. Our results suggest that c-FLIPL overexpression controls cell population size by controlling the G1/S transition, via its phosphorylation. Nonetheless, further studies need to be done to understand which mechanism affects this transition.

NIK1 (NSP Interacting kinase I) é um receptor cinase da família das LRRII-RLKs (leucine rich repeat II – receptor like kinase), identificado como alvo de virulência da proteína NSP (Nuclear Shuttle Protein), sendo o principal mediador de uma via de resposta imune contra esse grupo de vírus de DNA. Aufosforilação, de NIK1 em um resíduo de treonina 474 aciona a via de resposta antiviral que culmina com a repressão da expressão de proteínas ribossomais levando à redução da síntese de proteínas da célula vegetal e virais. Apesar de sua atividade antiviral, o transcriptoma de plantas nocautes de nik1 indicam um possível envolvimento de NIK1 como regulador negativo na resposta imune contra bactérias. Com a finalidade de esclarecer o envolvimento de NIK1 na imunidade inata antibacteriana, foram conduzidos ensaios de fosforilação in vitro de NIK1, utilizando os receptores, que intermedeiam PTI (Pamp-triggered immunity), BAK1 ( Brassinosteroid insensitive 1- associated kinase) e FLS2 (Flagellin sensitive – 2). Os resultados de espectrometria de massas demonstraram que BAK1 é um possível regulador da fosforilação de NIK1, uma vez que foi capaz de fosforilar um peptídeo sintético em uma treonina correspondente à posição 474 de NIK1 e de modificar a taxa de autofosforilação desse receptor em um ensaio contendo o domínio cinase intacto de NIK1. Além disso, foi demonstrado por BiFC (complementação de fluorescência bimolecular) que NIK1 e NIK1-T474D interagem tanto com BAK1 quanto com FLS2 na membrana plasmática. Ensaios de co-imunoprecipitação (Co-IP) demonstraram que flagelina promove a dissociação de NIK1 dos receptores para formar o complexo imune ativo BAK1-FLS2. Finalmente, ensaios de Co-IP com linhagens transgênicas de Arabidopsis superexpressando NIK1 e nocautes de nik1 indicaram que NIK1 interfere com a formação do complexo BAK1/FLS2 na resposta antibacteriana, já que a superexpressão de NIK1 diminui a eficiência de formação do complexo imune na presença de flagelina, enquanto que a inativação de NIK1 resulta em efeito oposto. Coletivamente, estes resultados substanciam o argumento de que NIK1 atua regulando negativamente PTI em plantas. NIK1 (NSP Interacting kinase I), which was first identified as a virulence target of NSP (Nuclear Shuttle Protein), is a receptor-like kinase belonging to the LRRII-RLKs (leucine rich repeat II – receptor like kinase) family and the major mediator of an immune response against this group of DNA virus. NIK1 autophosphorylation at Thr 474 triggers an antiviral response which culminates with the repression of ribosomal protein gene expression leading to suppression of host and viral protein synthesis. Despite its antiviral activity, the transcriptome of nik1 knockouts implicates NIK1 as a possible negative regulator of the immune response against bacteria. To examine the NIK1 involvement in antibacterial innate immunity, in vitro phosphorylation assays were carried out on NIK1, using the PTI (Pamp-triggered immunity)-mediated receptors, BAK1 ( Brassinosteroid insensitive 1- associated kinase) and FLS2 (Flagellin sensitive – 2). The results from mass spectrometry demonstrated that BAK1 may be a regulator of NIK1 phosphorylation, as it was capable of phosphorylating a Thr residue of a synthetic peptide corresponding to the position 474 of NIK1 and modifying the autophosphorylation rate of the NIK1 Kinase domain. Furthermore, BiFC (bimolecular fluorescence complementation) assays demonstrated that NIK1 and NIK1-T474D interact with BAK1 and FLS2 in the plasma membrane. Co-immunoprecipitation (Co-IP) assays showed that flagellin promoted the NIK1 dissociation from BAK1 and FLS2 to form an active BAK1-FLS2 immune complex. Finally, Co-IPs using NIK1- overexpressing transgenic lines and nik1 knockouts indicated that NIK1 interferes with BAK1-FLS2 complex formation in the antibacterial response, as NIK1 overexpression decreased the efficiency of the immune complex formation in the presence of flagellin, whereas NIK1 inactivation resulted in opposing effects. Collectively, these results substantiate the argument that NIK1 regulates negatively plant PTI.

Doutoramento em Biomedicina Submitted by Carla Jesus (cjesus@ua.pt) on 2018-02-19T14:16:33Z No. of bitstreams: 1 TeseDoutor_JoanaRocha.pdf: 43815298 bytes, checksum: 78f4672175a773f3c6f7299b1da51924 (MD5) Made available in DSpace on 2018-02-19T14:16:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseDoutor_JoanaRocha.pdf: 43815298 bytes, checksum: 78f4672175a773f3c6f7299b1da51924 (MD5) Previous issue date: 2017-06-21

Doutoramento em Biomedicina A BRI2 e a BRI3 são proteínas transmembranares de tipo II cujas funções fisiológicas ainda não se encontram bem caracterizadas. Duas mutações autossómicas dominantes no gene BRI2 estão na origem de duas formas de demência rara: Demência Familiar Britânica e Demência Familiar Dinamarquesa. Estas partilham características clinicas e neuropatológicas com a doença de Alzheimer, nomeadamente deposição de proteínas anormais no cérebro. Apesar de nunca ter sido associada a qualquer doença, a BRI3 está enriquecida no sistema nervoso central o que sugere que possa ter uma função neuronal. Interações proteína-proteína têm adquirido uma importância crescente no estudo de funções de proteínas e vias de sinalização subjacentes. Neste trabalho, foram identificadas novas interações entre a BRI2 e a proteína fosfatase 1 (PP1), bem como entre a BRI3 com a PP1. A PP1 é a uma importante fosfatase serina/treonina presente em organismos eucariotas, onde se estima que seja capaz de catalisar a maioria dos eventos de defosforilação. Adicionalmente, determinámos a BRI2 e BRI3 como substratos da PP1, e identificámos os motivos RVxF presentes nos seus N-terminais como responsáveis pela ligação à PP1. A relevância fisiológica do complexo BRI2:PP1 foi investigada, e demonstrámos pela primeira vez que a fosforilação da BRI2, nomeadamente a defosforilação pela PP1, é um mecanismo de regulação do seu processamento proteolítico. Estabelecemos ainda uma relação entre os níveis de fosforilação da BRI2 com a diferenciação de processos neuronais, onde a fosforilação da proteína total parece estar envolvida no surgimento de processos neuronais, enquanto o fragmento Nterminal resultante do seu processamento parece estar relacionado com o elongamento e estabilização dos processos neuronais. No decorrer do trabalho, identificámos e caracterizámos os interactomas das proteínas BRI2 e BRI3 em cérebro, recorrendo a co-imunoprecipitações e identificação das proteínas por espectrometria de massa. Análise in silico do interactome da BRI2 reforçou os nossos resultados sugerindo um papel para esta proteína na diferenciação neuronal, e vários mecanismos subjacentes foram evidenciados. Adicionalmente, a análise dos interactomas localiza ambas proteínas na sinapse (pré e pós-sinapse). Esta evidência juntamente com a descoberta de interações com proteínas estruturais destes compartimentos celulares, nomeadamente a PSD-95, sugere um papel importante para ambas as proteínas em sinalização e transmissão sináptica. Assim, os nossos resultados compreendem informação importante para estudos futuros acerca da biologia das proteínas BRI2 e BRI3, e mecanismos celulares envolvidos, bem como na sua associação com o desenvolvimento de neuropatologias. BRI2 and BRI3 are type II transmembrane protein family members whose physiological functions are poorly understood. Two different autosomal dominant mutations in the BRI2 gene are responsible for the development of two rare early-onset forms of dementia: Familial British and Familial Danish dementias that share clinical and neuropathological characteristics with Alzheimer´s disease, involving abnormal proteins’ deposition in the brain. For BRI3 no disease association has been established so far, nevertheless, its enriched expression in the central nervous system strongly suggests a role for BRI3 in neuronal function. Protein-protein interactions are becoming increasingly important in the study of protein function and underlying signaling pathways. In this work, both BRI2 and BRI3 were identified as novel protein phosphatase 1 (PP1) interacting proteins. PP1 is the major Ser/Thr protein phosphatase present in eukaryotic organisms, which catalyses the majority of protein dephosphorylation events. Moreover, we were able to determine BRI2 and BRI3 as PP1 substrates, which bind to the latter through an RVxF-like motif located in their N-terminal part. The physiological relevance of BRI2:PP1 complex was pursued, and we provide for the first time evidence suggesting that BRI2 phosphorylation, namely via PP1 dephosphorylation, is a regulatory mechanism for its proteolytic processing. Further, a correlation between BRI2 phosphorylation and neurite outgrowth was established. The phosphorylation of full-length protein seems to promote the emergence of neurites whereas the increased BRI2 N-terminal processing fragment plays a role in neurites’ elongation and stabilization. Herein, we also identified and characterized the interactome of both BRI2 and BRI3 in the brain using co-immunoprecipitation followed by mass spectrometry analysis. In silico analysis of the BRI2 interactome strengthened our results suggesting a role in neuronal differentiation and some underlying mechanisms were pointed out. Moreover, interactomes’ analysis suggested the presence of both BRI2 and BRI3 at synapses (pre- and post-synapse). This finding together with their ability to form complexes with structural constituents of these compartments, namely PSD-95 suggested an important role for both proteins in synaptic signaling and synaptic transmission. Thus, our results provide valuable information for further studies on BRI2 and BRI3 biology, and potential underlying molecular mechanisms, as well as associations with neuropathologies.

Na modificação do amido pelo processo oxidativo foi utilizada uma solução de periodato de sódio (APOX), enquanto na fosforilação foi utilizada tripolifosfato de sódio variando-se a sua concentração em relação ao tempo com o intuito de estabelecer limites de fósforo adequados para uso em alimentos. A obtenção e modificação química do amido da Palma Forrageira (Opuntia ficus indica) é o objeto de estudo deste trabalho. Os resultados demonstraram um aumento do teor de fósforo obtendo-se o máximo de acordo com a Portaria Nº 42/98 de 2005 no tempo de 40 minutos com 7% de tripolifosfato de sódio. Os resultados indicaram ainda que ambos os fatores estudados (tempo e concentração) influenciam na fosfatação do amido (APF) devido a interação destas variáveis independentes. Das propriedades avaliadas do amido nativo (APNM), amido liofilizado (APL) e os modificados foram determinados a composição centesimal, teor de fósforo, teor de amido, amilose e a forma e tamanho dos grânulos de amido. As propriedades físico-quimicas foram analisadas nas amostras do amido nativo, liofilizado e modificado sendo determinada a densidade, poder de intumescimento, índice de solubilidade, caracterização do gel, turbidez, sinérese, viscosidade de pasta, análise calorimétrica. O amido nativo da palma forrageira apresentou densidade 1,67 g.mL-1 e a modificação diminuI a densidade do amido nativo. O poder de inchamento e o índice de solubilidade do amido nativo, liofilizado e modificados apresentaram diferenças significativas. A modificação, também, diminuiu a absorbância porque facilita a passagem da luz, enquanto a sinérese foi influenciada pela modificação, ocorrendo um aumento com o número do ciclo de armazenamento, e uma diminuição com a modificação química. O amido fosfatado apresentou maior viscosidade de pasta do que o amido nativo devido os mesmos possuírem maior poder de intumescimento e índice de solubilidade em água. O amido nativo extraído da palma forrageira apresentou pureza 99,30%. Obtaining and chemical modification of starch from forage Palma (Opuntia ficus indica) is the object of study of this work. The starch was extracted from cactus pear presented purity 99.30% and modified routes this starch were oxidation and phosphorylation with the assessment of the effects of this change. The starch was modified by sodium periodate to the oxidation process, while for the phosphorylation process was varied the concentration of sodium tripolyphosphate compared to reaction times in order to establish phosphorus limits suitable for use in foods based on Codex Alimentarius . The results showed an increase in phosphorus content to give maximum accordance with the rules in time 40 minutes with 7% sodium tripolyphosphate. The results further indicated that both factors studied (time, concentration) influence the starch phosphate treatment due to the interaction of these independent variables. Of the properties evaluated the native and modified starch were determined chemical composition, phosphorus, starch, amylose and the shape and size of the starch granules. Chemical modification of starch caused higher phosphorus and ash and decreased levels of starch and amylose, achieving experimentally most phosphating according to the legislation in time from 40 minutes to 7% of sodium tripolyphosphate after going through a process dialysis. The functional properties of the samples were analyzed on native starch and modified and determined density, swelling power, solubility index characterizing the gel turbidity, syneresis, paste viscosity, calorimetric analysis. The native starch from cactus pear density showed 1.67 g.mL-1 and the modification decreased the density of native starch. The swelling power and solubility index of the native and modified starch showed significant differences. The modification also decreased the absorbance because it facilitates the passage of light, while syneresis was influenced by modifying, with an increase in the storage cycle number, and a decrease in chemical modification. The phosphate starch showed higher viscosity slurry than native starch because they possess greater power of swelling and solubility rate in water.

CAPES Polissacarídeos são muito estudados e aplicados a processos industriais e biotecnológicos, devido à grande variedade e versatilidade. As β-glucanas, polissacarídeos à base de glicose, por sua vez podem apresentar diversas aplicações biológicas interessantes tais como, atividade antitumoral, antioxidante e imonomoduladora e têm sido obtidas em vários estudos, por meio de fungos na forma de exopolissacarídeos. Todavia algumas β-glucanas fúngicas apresentam limitações nas aplicações biológicas devido à baixa solubilidade em água. Para melhorar este aspecto e ainda possibilitar aumento das atividades biológicas são sugeridas derivatizações químicas, a exemplo da fosforilação, que possibilitam obtenção de materiais mais solúveis em água e com aumento das atividades e do potencial tecnológico. Assim, este trabalho teve como objetivo a obtenção e caracterização de derivados fosforilados da (1→6)-β-D-glucana (lasiodiplodana) produzida pelo fungo Lasiodiplodia theobromae MMPI, visando macromoléculas mais solúveis em relação à lasiodiplodana nativa e ainda apontar outras modificações passíveis de ampliação de potenciais tecnológicos. A determinação da modificação estrutural por fosforilação foi obtida por meio das técnicas espectroscópicas FTIR e RMN (¹³C e ³¹P) sobretudo ³¹P RMN que possibilitou identificar sinais atribuídos a ésteres de fosfato. As amostras fosforiladas apresentaram DS baixos entre 0,0251 e 0,0499, com indicação de relação inversa entre DS e concentração dos derivatizantes TMFS e TPFS utilizados para fosforilação. Com processo de fosforilação foram alcançados aumentos na solubilidade em água para todas amostras em relação a lasiodiplodana nativa. Também foram alcançados maiores valores de potencial zeta relacionados ao caráter mais aniônico dos derivados fosforilados, bem como redução dos tamanhos médios de partícula, de 1002 para até 252,5 nm. Os padrões de difração das amostras de lasiodiplodana nativa e das fosforiladas evidenciaram característica de materiais parcialmente cristalinos. A macroestrutura das amostras fosforiladas, apresentou formações de fibrilas como resultado da inserção dos grupamentos fosfato. Tanto a lasiodiplodana nativa, quanto as amostras fosforiladas, apresentaram boa estabilidade térmica, com etapas de perda de massa associadas à perda de água, degradação térmica e carbonização, com pequenas diferenças entre as amostras. De acordo com os resultados, a fosforilação da lasiodiplodana contribuiu para ampliação dos potenciais de aplicação biológica e tecnológica. Polysaccharides have been extensively studied and applied to industrial and biotechnological processes, due to the great variety and versatility. β-glucans, glucose-based polysaccharides, in turn may present several interesting biological applications such as antitumor, antioxidant and imonomodulatory activity and have been obtained in several studies, through fungi in the form of exopolysaccharides. However, some fungal β-glucans have limitations in biological applications due to the low solubility in water. In order to improve this aspect and to increase the biological activities, chemical derivations are suggested, such as phosphorylation, which make it possible to obtain more soluble materials in water and with increased activities and technological potential. Thus, this work had the objective of obtaining and characterizing phosphorylated derivatives of (1→6)-β-D-glucan (lasiodiplodan) produced by the fungus Lasiodiplodia theobromae MMPI, aiming at more soluble macromolecules in relation to the native lasiodiplodana and to point out other modifications technological potential. The determination of the structural modification by phosphorylation was obtained by FTIR and RMN (¹³C and ³¹P) spectroscopic techniques, especially ³¹P RMN, which enabled the identification of signals attributed to phosphate esters. Phosphorylated samples showed low DS between 0.0251 and 0.0499, indicating the inverse relationship between DS and concentration of the derivatives TMFS and TPFS used for phosphorylation. Phosphorylation process increased the water solubility for all samples compared to native lasiodiplodana. Higher zeta potential values related to the more anionic character of the phosphorylated derivatives were also achieved, as well as reduction of the average particle sizes from 1002 to 252,8 nm. The diffraction patterns of native and phosphorylated lasiodiplodana samples showed the characteristic of partially crystalline materials. The macrostructure of the phosphorylated samples presented fibril formations as a result of the insertion of the phosphate groups. Both the native lasiodiplodana and the phosphorylated samples presented good thermal stability, with mass loss stages associated with loss of water, thermal degradation and carbonization, with small differences between the samples. According to the results, the phosphorylation of lasiodiplodana contributed to the amplification of biological and technological application potentials.

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017 Submitted by Teresa Boa (tdboa@fc.ul.pt) on 2017-05-02T10:49:56Z No. of bitstreams: 1 ulfc121659_tm_Carolina_Madaleno.pdf: 4532288 bytes, checksum: e4baab9f33071c2a7d183328892c386c (MD5) Made available in DSpace on 2017-05-02T10:50:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc121659_tm_Carolina_Madaleno.pdf: 4532288 bytes, checksum: e4baab9f33071c2a7d183328892c386c (MD5) Previous issue date: 2017

A doença de Alzheimer (DA) é a principal causa de demência nos idosos e caracterizase por défices de memória e declínio cognitivo consequentes da perda sináptica e neuronal que afeta inicialmente o hipocampo. Histologicamente, a DA caracteriza-se pela acumulação extracelular de placas compostas pelo peptídeo beta-amilóide (Aβ) e a acumulação intracelular de tranças neurofibrilares compostas pela proteína tau hiperfosforilada. A forma oligomérica do peptídeo Aβ1-42 é considerada como a mais tóxica a nível sináptico, sendo responsável pelas alterações cognitivas verificadas nas fases iniciais da DA. O peptídeo Aβ induz, entre outros, a formação de espécies reativas de oxigénio (ERO) e a desregulação da homeostasia do Ca2+ i, efeitos comumente associados à disfunção neuronal nos estádios iniciais da DA. Além disso, o peróxido de hidrogénio (H2O2) pode modular a atividade da tirosina cinase Src e do fator de transcrição Nrf2 (do inglês “nuclear factor erythroid derived 2-related”) que regula a resposta antioxidante. Assim, neste trabalho avaliámos o efeito de oligómeros de Aβ1-42 na fosforilação/ativação de Src e Nrf2, através da produção de H2O2, e o retro-controlo da Src na regulação do stresse oxidativo utilizando culturas primárias de neurónios maduros de hipocampo. Estudámos também o papel da Src na dinâmica mitocondrial, assim como a sua relação com a localização subcelular de Nrf2, usando a linha celular de hipocampo HT22. Os nossos resultados demonstraram que, em neurónios hipocampo, a exposição a oligómeros de Aβ1-42 induziu um aumento do Ca2+ i através da ativação dos recetores Nmetil- D-aspartato (NMDA), e aumento da produção de H2O2 pela mitocôndria. Além disso, todos estes efeitos foram modulados após inibição da Src, provavelmente devido ao seu efeito na regulação dos receptores NMDA. É importante salientar que a produção de ERO associada ao Aβ levou, por si só, ao aumento da fosforilação da Src. Além disso, a produção de ERO associada ao Aβ induziu a fosforilação do Nrf2 em neurónios do hipocampo. Adicionalmente, tanto em neurónios primários de hipocampo como na linha HT22, observámos a fosforilação da Src e do Nrf2 após tratamento com H2O2; de forma interessante, a fosforilação do Nrf2 na Ser40 ocorreu de forma dependente da Src. Em extratos nucleares das células HT22 expostas a H2O2 não se verificaram alterações nos níveis totais de Nrf2, contudo observou-se uma diminuição dos níveis nucleares de Src e um aumento da sua fosforilação/ativação, sugerindo um possível papel da Src no núcleo, independente do Nrf2. Em extratos mitocondriais de células HT22, a exposição a H2O2 induziu um aumento dos níveis de fosforilação da Src e do Nrf2. Adicionalmente, a ativação da Src associada ao tratamento com H2O2 parece ter um efeito preventivo na fissão mitocondrial. Estes resultados evidenciam, em neurónios primários maduros de hipocampo, a ativação da Src e do Nrf2 por Aβ de forma dependente dos recetores NMDA e dos ERO, fornecendo assim novas perspetivas sobre a caracterização de mecanismos celulares potencialmente envolvidos na DA. Além disso, nas células HT22, o nosso estudo evidencia a fosforilação da Src e do Nrf2 por H2O2 na mitocôndria, assim como a fosforilação da Src no núcleo, sugerindo a ocorrência de mecanismos subcelulares que poderão estar envolvidos na regulação de alterações redox. Palavras-Chave: Doença de Alzheimer, peptídeo beta-amilóide, peróxido de hidrogénio, Src cinase, fator de transcrição Nrf2.

Mestrado em Biomedicina Molecular Specific domains can determine protein structural functional relationships. For the Alzheimer’s Amyloid Precursor Protein (APP) several domains have been described, both in its intracellular and extracellular fragments. Many functions have been attributed to APP including an important role in cell adhesion and cell to cell recognition. This places APP at key biological responses, including synaptic transmission. To fulfil these functions, extracellular domains take on added significance. The APP extracellular domain RERMS is in fact a likely candidate to be involved in the aforementioned physiological processes. A multidisciplinary approach was employed to address the role of RERMS. The peptide RERMS was crosslinked to PEG (Polyethylene glycol) and the reaction validated by FTIR (Fourier transform infrared spectrometry). FTIR proved to be the most efficient at validating this reaction because it requires only a drop of sample, and it gives information about the reactions occurred in a mixture. The data obtained consist in an infrared spectra of the sample, where peaks positions give information about the structure of the molecules, and the intensity of peaks is related to the concentration of the molecules. Subsequently substrates of PEG impregnated with RERMS were prepared and SH-SY5Y (human neuroblastoma cell line) cells were plated and differentiated on the latter. Several morphological alterations were clearly evident. The RERMS peptide provoked cells to take on a flatter appearance and the cytoskeletal architecture changed, with the appearance of stress fibres, a clear indicator of actin reorganization. Given that focal adhesions play a key role in determining cellular structure the latter were directly investigated. Focal adhesion kinase (FAK) is one of the most highly expressed proteins in the CNS (central nervous system) during development. It has been described to be crucial for radial migration of neurons. FAK can be localized in growth cones and mediated the response to attractive and repulsive cues during migration. One of the mechanisms by which FAK becomes active is by auto phosphorylation at tyrosine 397. It became clearly evident that in the presence of the RERMS peptide pFAK staining at focal adhesions intensified and more focal adhesions became apparent. Furthermore speckled structures in the nucleus, putatively corresponding to increased expression activity, also increased with RERMS. Taken together these results indicate that the RERMS domain in APP plays a critical role in determining cellular physiological responses. Here is suggested a model by which RERMS domain is recognized by integrins and mediate intracellular responses involving FAK, talin, actin filaments and vinculin. This mechanism probably is responsible for mediating cell adhesion and neurite outgrowth on neurons. Nas proteínas domínios específicos podem determinar as suas relações funcionais e estruturais. Na Proteína Precursora da Doença de Alzheimer (APP) já foram descritos vários domínios presentes em ambas as porções intra e extracelulares. Várias funções têm sido atribuídas à APP incluindo na adesão celular e no reconhecimento célula-célula. Isto coloca a APP em respostas biológicas chave como a transmissão sináptica. Tendo em conta estas funções, os domínios extracelulares merecem uma maior atenção. O domínio extracelular RERMS da APP é de facto um candidato provável para estar envolvidos nos processos fisiológicos acima referidos Para investigar o papel do RERMS foi utilizada uma abordagem multidisciplinar. O péptido RERMS ligado ao PEG (polietileno glicol) através de uma reação de crosslinking, validada por FTIR (Fourier transform infrared spectrometry). A FTIR provou ser a técnica mais eficiente para a validação desta reação porque apenas necessita de uma gota de amostra, e providencia informação acerca das reações ocorridas numa mistura. O resultado obtido consiste num espectro de radiação infravermelha da amostra, onde as posições dos picos dão informação acerca da estrutura das moléculas, e a intensidade dos picos está relacionada com a concentração das moléculas. Subsequentemente foram preparados substratos com PEG e RERMS, plaqueadas células SH-SY5Y (células de neuroblastoma humano) e induzida a sua diferenciação. Foram claramente evidentes várias alterações morfológicas. O péptido RERMS causou uma morfologia mais achatada e a arquitetura do citoesqueleto ficou alterada, com o aparecimento de fibras de stress, um indicador da reorganização da actina. Dadas as adesões focais desempenharem um papel chave na determinação da estrutura celular, foram investigadas diretamente. A Cinase de adesão focal (FAK) é uma das proteínas mais expressas no sistema nervoso central (CNS) durante o desenvolvimento. Esta proteína foi descrita como crucial para a migração radial dos neurónios. A FAK pode ser localizada nos cones de crescimento e medeia a resposta a sinais atrativos e repulsivos durante a migração. Um dos mecanismos através do qual a FAK fica ativa é a auto-fosforilação no resíduo tirosina 397. Tornou-se evidente que na presença do péptido RERMS houve um aumento da marcação da pFAK (FAK fosforilada) nas adesões focais e mais adesões se tornaram evidentes. Além disso também aumentaram as estruturas arredondadas de pFAK no núcleo na presença do RERMS. Estes resultados indicam que o domínio RERMS da APP tem um papel critico na determinação de respostas fisiológicas celulares. Aqui é sugerido um modelo onde o domínio RERMS da APP é reconhecido pelas integrinas e medeia desta forma respostas intracelulares que envolvem a FAK, a talina, a vinculina e filamentos de actina. Este mecanismo é uma provavelmente é responsável pela mediação da adesão celular e crescimento de neurites em neurónios.

Mestrado em Biomedicina Molecular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-09-15T17:33:02Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 2000061 bytes, checksum: 1e2f0635789fff505bbd468edf5d97d7 (MD5) Made available in DSpace on 2016-09-15T17:33:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 2000061 bytes, checksum: 1e2f0635789fff505bbd468edf5d97d7 (MD5) Previous issue date: 2016-01-06

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Biologia Celular e Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017 Submitted by Amelia Janeiro (ajaneiro@reitoria.ul.pt) on 2018-07-11T12:30:34Z No. of bitstreams: 1 ulsd731883_td_Sree_Sridhara.pdf: 18830530 bytes, checksum: b194d0b9e7f5a1a9ec45ed37abdbed13 (MD5) Made available in DSpace on 2018-07-11T12:46:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulsd731883_td_Sree_Sridhara.pdf: 18830530 bytes, checksum: b194d0b9e7f5a1a9ec45ed37abdbed13 (MD5) Previous issue date: 2017 Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT); Marie Skłodowska-Curie actions (MSCA)

As plantas, como todos os organismos, têm de enfrentar uma grande variedade de stresses bióticos e abióticos, mas sendo organismos sésseis elas não são capazes de escapar a estas condições adversas. Portanto, a sua sobrevivência é criticamente depende da sua resposta eficiente às mudanças ambientais. Direta ou indiretamente, o stress geralmente leva a um défice de energia. Se a homeostasia energética não for restabelecida, o crescimento e o desenvolvimento da planta são drasticamente comprometidos. SNF1 (sucrose non-fermenting 1) -related protein kinase 1.1 (SnRK1.1) desempenha um papel importante na coordenação das respostas de energia e stress. Esta kinase deteta e sinaliza condições de stress, tais como escuridão inesperada, baixo teor de açúcar e outros stresses, atuando em genes que controlam uma rede de genes de transcrição. Nas últimas décadas, vários estudos têm revelado um cruzamento entre as vias de sinalização do açúcar e das hormonas. Um estudo recente identificou as proteínas DELLA como um interator de SnRK1 na presença de NDF4, utilizando o sistema Y2H. As proteínas DELLA são reguladoras negativas da via de sinalização da giberelina. As giberelinas são hormonas vegetais que controlam vários processos de desenvolvimento, como a germinação e o alongamento do caule. Neste trabalho, nós confirmámos in vivo e in vitro a interação entre SnRK1.1 e as proteínas DELLA e demonstrámos que esta interação é independente da presença de NDF4. As análises fenotípicas de mutantes sobre-expressores de SnRK1.1 revelaram que este mutante é insensível a giberelinas e hipersensível a paclobrutazol. Estes resultados podem sugerir que SnRK1 interage e fosforila as proteínas DELLA e que esta fosforilação aumenta a sua estabilidade e consequentemente diminui a resposta a giberelinas.

Resumo O rápido desenvolvimento da química de polímeros nos últimos anos tem acompanhado a introdução dos materiais poliméricos no campo da medicina. Polímeros com aplicações médicas podem ser subdivididos em dois grandes grupos: materiais usados em próteses e a produção de polímeros biologicamente ativos. Neste trabalho foram sintetizados copolímeros possuindo cadeia principal de poli (metacrilato de metila) e cadeias enxertadas de polietilenoglicol (COP GRAFT). A partir da síntese do copolímero enxertado inicial foram realizadas modificações em suas cadeias de modo a aumentar a possibilidade de incorporação de um fármaco que será utilizado em sistema de liberação controlada de medicamentos. Os novos compostos foram obtidos através de duas rotas sintéticas e os produtos formados ao final de cada etapa foram purificados e caracterizados. Através da técnica de infravermelho (FITIR) foi possível observar as bandas de absorções características das ligações P-H, P=O e P-O, que foram inseridas na cadeia do COP GRAFT durante a fosforilação, além das bandas de absorções características do copolímero, antes da fosforilação, como C=O e C-O. A caracterização térmica das amostras utilizando termogravimetria (TGA) e calorimetria diferencial de varredura (DSC) mostrou que apenas o copolímero de diisobutila apresentou temperatura de transição endotérmica e comportamentos de degradação compatíveis a de um polímero. Através da técnica de difração de raios X (XRD) foi possível observar uma modificação da cristalinidade das amostras, provavelmente devido a uma variação da conformação das cadeias após a inserção de novos grupos químicos. Nos cromatogramas obtidos pela técnica de cromatografia de permeação em gel (GPC) percebeu-se aumento de massa após a fosforilação com o grupo diisobutila no COPGRAFT. A reação de fosforilação foi eficiente na obtenção do copolímero de diisobutila e as técnicas aplicadas demonstraram que houve a modificação no copolímero enxertado. Abstract The rapid development in polymer chemistry has, in recent years, led to the introduction of polymeric materials in the field of medicine. Two major groups of polymers are used for medical applications: prosthetic and biologically active materials. We synthesized copolymers with the main chain consisting of poly (methyl methacrylate) and graft chains of poly(ethylene glycol) (COP GRAFT). Changes were made in the graft copolymer chains for a possible incorporation of a drug, such that it may be used for the controlled release of drugs. The synthesis of these new compounds is based on two synthetic routes and FTIR, differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry (TGA) and X-ray diffraction (XRD) characterized the products formed at the end of each stage. Through FTIR we observed absorption bands characteristic of P-H, P=O and P-O bonds that were inserted into the polymer chain during phosphorylation of the COP GRAFT, beyond the absorption bands characteristic of the copolymer before phosphorylation, such as C=O and C-O. By TGA and DSC we observed that only the diisobutyl copolymer has endothermic transition temperature and degradation behavior consistent with a polymer. XRD results showed a structural and conformational change in crystallinity of modified chains. Molecular weight and polydispersity of COPGRAFT obtained by GPC increased after phosphorylation with diisobutyl group. The phosphorylation reaction was efficient in obtaining diisobutyl copolymer and the applied techniques confirmed the modification of the COPGRAFT chains.

Doutoramento em Bioquímica Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-12-13T19:02:09Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 60609397 bytes, checksum: ff2982d6543d748ad70343917c7bcac7 (MD5) Made available in DSpace on 2016-12-13T19:02:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 60609397 bytes, checksum: ff2982d6543d748ad70343917c7bcac7 (MD5) Previous issue date: 2015-11-30

Doutoramento em Bioquímica Peroxisomes are multifunctional organelles involved in various metabolic processes. The numerous severe disorders lead by peroxisomal malfunction in addition to the increasing evidences of the involvement of peroxisomes in several pathologies, from neurodegeneration to cancer and viral infection, renders this organelle an essential role for human health and development. Furthermore, peroxisomes are highly dynamic, adjusting their protein content, morphology and number in response to cellular needs. Peroxisome dynamics and their proper regulation are closely linked to organelle function and thus, human well-being. So that the study of the mechanisms that regulate peroxisomal biogenesis and proliferation is primordial. Being reversible phosphorylation a major intracellular control mechanism in eukaryotes with PP1 as the prominent player in dephosphorylation events, it is very likely that it represents an important regulation mechanism also in peroxisomes. As a matter of fact, some evidences in that direction have emerged, although they are still very scarce and mostly not for human cells. Interestingly, a large-scale blot screen on rat peroxisomes revealed the presence of several kinases and phosphatases, being PP1 one of them. The main goal of this thesis was to study the role of reversible phosphorylation in human peroxisomes through a very likely PP1 regulator, Pex16p, and a putative phosphorylated protein, Pex11pβ. Pex16p and Pex11pβ are essential players in the peroxisome biogenesis, elongation and division. Our studies were not able to verify a putative interaction between PP1 and Pex16p. S11 and S38 residues of Pex11pβ have also been demonstrated to not be involved in its regulation by putative phosphorylation. The regulation by key cysteines in Pex11pβ was also investigated, revealing that C18, C25 and C85 are apparently not involved in such mechanism. A possible role for an intriguing glycine-rich stretch in the intraperoxisomal region of Pex11pβ was also studied, with inconclusive results, being that it appears to be dispensable for Pex11pβ-driven peroxisomal growth and division. Our study also focused on the Pex11pβ N-terminally located amphipathic helices, reveling Helix 2 as essential for peroxisomal membrane elongation, with a probable involvement in the Pex11pβ dimerization process. Although with several negative results, our study opened some doors towards a better understanding of the mechanisms that regulate peroxisome biogenesis and proliferation. New protein-protein interaction methods which developed meanwhile may be useful to verify the likely transient PP1-Pex16p interaction. Moreover, we verified that other peroxins have putative PP1-binding motifs, representing possible further interconnectors between intracellular signal transduction and peroxisomes. Concerning Pex11pβ mechanisms of action and regulation, our study raised the hypothesis that other domains are involved in the elongation function since we demonstrated that N-terminal region in not sufficient to promote peroxisomal membrane elongation. We also propose that the inter-transmembrane domains area may be at least partially embedded within the lipid bilayer, defying the preconceived topology of this region of Pex11pβ. We further propose that other phosphorylation- and key cysteinesdriven Pex11pβ regulation is still an open field since that other residues present as potentially active in such processes. Our study brought valuable insights in the mysterious regulation mechanisms of peroxisomes, essential organelles for cellular function, with serious consequences for human health. Os peroxissomas são organelos multifuncionais e estão envolvidos em diversos processos metabólicos. As várias doenças graves provocadas por mau funcionamento dos peroxissomas e as crescentes evidências do seu envolvimento em várias patologias, desde a neurodegeneração, ao cancro e infeção viral, confere a este organelo um papel fundamental na saúde e desenvolvimento humanos. Os peroxissomas são extremamente dinâmicos, ajustando o seu número, morfologia e conteúdo proteico em resposta às necessidades da célula. A dinâmica peroxissomal, associada à sua devida regulação, está intimamente relacionada com a função deste organelo e, consequentemente, ao bem-estar humano. Assim sendo, o estudo dos mecanismos que regulam a biogénese e a proliferação dos peroxissomas é de extrema importância. Sendo a fosforilação reversível um dos principais mecanismos de controlo intracelular em eucariontes, tendo a PP1 um papel proeminente em eventos desfosforilativos, é altamente provável que seja um mecanismo importante na regulação também dos peroxissomas. De facto, têm surgido algumas evidências nesse sentido, embora sejam ainda muito escassas e não em células humanas. Interessantemente, um estudo em peroxissomas de rato revelou a presença de várias cinases e fosfatases, entre elas a PP1. O principal objetivo desta tese foi estudar o papel da fosforilação reversível nos peroxissomas humanos, através de um provável regulador da PP1, a Pex16p, e uma proteína potencialmente fosforilada, a Pex11pβ. Estas peroxinas são peças fundamentais na biogénese, crescimento e divisão dos peroxissomas. Os nossos estudos não confirmaram a interação putativa PP1Pex16p e os resíduos S11 e S38 da Pex11pβ também não se revelaram envolvidos na sua regulação através de eventual fosforilação. Também investigámos uma possível regulação da Pex11pβ através de cisteínas-chave, sendo que C18, C25 e C85 não estão, aparentemente, envolvidas. Uma possível função para a intrigante zona rica em glicinas localizada na região intraperoxissomal também foi estuda, traduzindo resultados inconclusivos, sendo que esta parece ser dispensável ao crescimento e divisão dos peroxissomas induzidos por Pex11pβ. Também nos debruçámos sobre as hélices anfipáticas localizadas no N-terminal da Pex11pβ e verificámos que a hélice 2 é essencial para o alongamento da membrana peroxisomal, com provável envolvimento no processo de dimerização. Apesar de vários resultados serem negativos, o nosso estudo abriu alguns caminhos em direção a uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam a biogénese e proliferação dos peroxissomas. Novos métodos de deteção de interações proteína-proteína desenvolvidos recentemente poderão ser úteis para verificar a interação PP1-Pex16p que, provavelmente será transiente. Além disso, constatámos que existem outras peroxinas com motivos de ligação à PP1, representando assim possíveis novos elos entre mecanismos de transdução de sinais intracelulares e peroxissomas. Também propomos a existência de outros domínios na Pex11pβ envolvidos na função de alongamento, uma vez que a região N-terminal, por si só, não é suficiente para promover o alongamento da membrana do peroxissoma. Também propomos que a zona inter-domínios transmembranares da Pex11pβ está, pelo menos parcialmente, embebida na bi-camada lipídica, desafiando a topologia pré-concebida. Mecanismos de regulação da Pex11pβ dirigidos por cisteínas e fosforilação continuam também a ser hipóteses em aberto, pois outros resíduos podem tomar parte nesses processos. O nosso trabalho trouxe dados importantes para o estudo dos enigmáticos mecanismos de regulação dos peroxissomas, organelos essenciais à função celular, com sérias consequências na saúde humana.

Made available in DSpace on 2016-03-07T19:20:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-11-05. Added 1 bitstream(s) on 2016-03-07T19:24:50Z : No. of bitstreams: 1 000859360.pdf: 1034814 bytes, checksum: c0a4def8be0c2f45d09cbd7c089d88da (MD5) Bitstreams deleted on 2016-03-28T13:37:51Z: 000859360.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-03-28T13:38:52Z : No. of bitstreams: 1 000859360.pdf: 1034815 bytes, checksum: 0e2a44e2cca5e564a6825b47d8322e41 (MD5) O fipronil é um inseticida amplamente utilizado para controlar pragas nas plantações e em animais. Existem relatos de intoxicação devido à exposição de fipronil em mamíferos e o fígado é um alvo potencial. No presente estudo, foram avaliados os efeitos dos metabólitos do fipronil, fipronil dessulfinil e fipronil sulfona sobre a bioenergética, produção de espécies reativas de oxigênio e efluxo de cálcio em mitocôndrias isoladas de fígado de rato. O fipronil dessulfinil (5 a 25 μM) inibiu o estado 3 da respiração em mitocôndrias energizadas com glutamato mais malato, substratos do complexo I da cadeia respiratória, e diminuiu o potencial de membrana mitocondrial, resultando em inibição da síntese de adenosina trifosfato. O metabólito dessulfinil também causou desacoplamento nas mitocôndrias energizadas com succinato e estimulou o efluxo de cálcio. O metabólito sulfona também atuou como inibidor e desacoplador mitocondrial e estimulou o efluxo de cálcio, porém em menores concentrações (0,5 a 5 μM). Os efeitos dos metabólitos do fipronil na bioenergética mitocondrial e homeostase do cálcio podem estar relacionados com os efeitos tóxicos do inseticida no fígado Fipronil is an insecticide extensively used to control pests in crops and animals. There are relates of poisoning due to exposure of fipronil in mammals and the liver is a potential target. In this study, we evaluated the effects of metabolites of fipronil, fipronildesulfinyl and fipronilsulfone on the bioenergetics, reactive oxygen species production and calcium efflux from mitochondria isolated from rat liver. Desulfinyl (5 to 25 μM) inhibited state-3 respiration in mitochondria energized with glutamate plus malate, substrates of complex I of the respiratory chain, and decreased the mitochondrial membrane potential resulting in inhibition of. Synthesis. Desulfinyl also caused uncoupling in succinate-energized mitochondria and calcium efflux. The metabolitesulfone also acted as mitochondrial inhibitors and uncouplers and caused calcium efflux, but inlower concentrations (0.5 to 5 μM). These effects of metabolites of fipronil on mitochondrial bioenergetics and calcium homeostasis may be related to toxic effects of the insecticide in the liver

Os amidos de trigo e milho foram fosforilados com tripolifosfato de sódio (TPS) em 4 diferentes níveis de adição. As viscosidades máximas da pasta de trigo aumentaram e as temperaturas de pasta diminuíram à medida que cresceram os graus de substituição de grupos fosfato, enquanto que, para o amido de milho, as viscosidades máximas aumentaram e as temperaturas de pasta mantiveram-se constantes. Os amidos fosforilados (amido/água 1:10) foram submetidos à cocção (100,0 ºC/1,0 minuto), secagem (40,0 ºC/~4,0% de umidade) e moagem (diâmetro de partícula, Φ = 0,149 mm) para determinar o teor de amido resistente (AR). Para o menor grau de substituição de grupos fosfato no amido de trigo (0,0029), foi encontrado um teor de amido resistente de 30,46% e no amido de milho de 24,36%. Para o maior grau de substituição no amido de trigo (0,0127), foi encontrado um teor de AR de 46,69%, enquanto para o amido de milho, 28,40%. O aumento do grau de substituição, em ambos os casos, parece induzir um aumento no teor de amido resistente, e a fosforilação com TPS mostrou ser um excelente método para produzir quantidades significativas de amido resistente tanto no amido de trigo como no amido de milho.Wheat and maize starches were phosphorylated with sodium tripolyphosphate (TPS) at 4 different levels of addition. The maximum viscosities of the wheat doughs formed were increased and the dough temperatures decreased as the degrees of substitution of phosphate groups were increased; while for the maize starch the viscosities were increased and the dough temperatures remained constant. The phosphorylated starches (starch/water, 1:10) were subjected to cooking (100 ºC/1 minute), followed by drying (40 ºC/~ 4.0 per cent moisture) and milling (particle diameter, Φ = 0.149 mm) to determine the resistant starch (RS) content. For the lowest degree of substitution of phosphate groups in wheat starch (0.0029), resistant starch content of 30.46 per cent was found, while for maize starch RS content of 24.36 per cent was found. For the highest degree of substitution in wheat starch (0.0127) 46.69 per cent of RS content was found; while for maize starch, RS content of 28.40 per cent was found. According to the results, the increase in the degree of substitution in both cases seems to induce an increase in the resistant starch content, and phosphorylation with TPS was shown to be an excellent method for producing significant quantities of resistant starch in both wheat and maize starch.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica da América Latina causada pelas espécies englobadas no gênero Paracoccidioides. Esta micose atinge principalmente moradores rurais do sexo masculino em idade economicamente ativa. A PCM pode causar sequelas severas, podendo ser altamente incapacitante e esta doença figura entre uma das doenças negligenciadas por levantamentos da Organização Mundial da Saúde (OMS). Quando em um ambiente hostil, com privação de fontes de carbono (6C), os fungos tendem a utilizar estratégias alternativas para auxiliar no metabolismo energético. Uma destas estratégias é a utilização do ciclo do glioxilato que consiste em 5 etapas, sendo 3 delas comuns ao ciclo do ácido tricarboxílico e 2 exclusivas do ciclo que são catalisadas pela isocitrato liase (ICL) e malato sintase. Existem relatos na literatura que sugerem que a fosforilação de ICL seja um possível mecanismo de regulação da enzima. A fosforilação é uma modificação pós-traducional ubíqua e conhecida por modular a atividade/ação de inúmeras moléculas dos mais diversos organismos. Neste trabalho, por meio da realização de ensaios de interações moleculares (pull down) utilizando ICL de Paracoccidioides lutzii em seu estado fosforilado e não fosforilado. Encontramos evidências que sugerem o acionamento da biossíntese de purinas como uma estratégia acessória para a geração de energia no organismo. Detectamos que, aparentemente, a fosforilação serve para marcar a ICL para ser fosforilada e consequentemente degradada. Esta observação pode abrir um novo campo de investigação para elaboração de novos fármacos voltados para o tratamento de PCM com o emprego de inibidores de fosfatases. Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis endemic from Latin America caused by the species encompassed in Paracoccidioides genus. This mycosis affects mainly economically active men, who live in rural areas. PCM may cause severe wounds to individuals and is highly incapacitating. This disease is considered a neglected disease by World Health Organization (WHO). When in a hostile environment, like deprivation of carbon sources (6C), fungi tend to use alternative strategies to assist the energetic metabolism. One strategy is using the glyoxylate cycle, which consists in 5 steps, 3 of them being common to the tricarboxylic acid cycle and the other 2 steps are catalyzed by exclusive enzymes from the glyoxylate cycle: isocitrate lyase (ICL) and malate synthase. There are reports in the literature suggesting that phosphorylation of ICL ofis a possible mechanism of enzyme regulation. Phosphorylation is a post-translational ubiquitous ubiquitous and known to modulate the activity / action of many molecules of diverse organisms. In this work, through the use of molecular interactions assays (pull down) using ICL of Paracoccidioides lutzii in its phosphorylated state and non-phosphorylated We found evidence, which suggest that the purine biosynthesis pathway is being used as an alternative way to produce energy to the organism and a high involvement of ICL with amino acids biosynthesis on its non-phosphorylated state. Apparently, phosphorylation works marking ICL to become degraded. This observation may open a new research field through the elaboration of new drugs for PCM treatment using phosphatase inhibitors. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Mestrado em Biomedicina Molecular The Amyloid precursor protein (APP) and Tau protein are related to histopathological hallmarks of Alzheimer’s disease, a progressive and complex neurodegenerative disease. APP is a type 1 integral transmembrane glycoprotein. There are two predominant proteolytic processing pathways of APP, the nonamyloidogenic pathway, and the amyloidogenic pathway. Tau is one of the microtubule-associated proteins, and its binding affinity for microtubules is regulated by phosphorylation of serine and threonine residues. APP and Tau protein expression has also been reported in the testis. However, their function and posttranslational modifications in the testis have not been established. Thus, we analyzed the expression of these two proteins and their phosphorylation patterns during spermatogenesis using wild-type mice and rats as models. Through immunohistochemistry we revealed that APP, Tau protein, Serine/Threonine Protein Phosphatase (PP) 1α and PP1γ are expressed throughout spermatogenesis. APP and Tau are phosphorylated during meiosis. In contrast to total-APP localization, phosphorylated APP at Thr668 was specially localized in spermatocyte nuclei. These results suggest that phosphorylation of APP and Tau protein contribute to spermatogenesis, especially in meiosis. However, further research is required to validate our results and unravel the specific function of APP and Tau protein during spermatogenesis and meiosis. A proteína precursora de amilóide (PPA) e a proteína Tau estão relacionadas com os marcos histológicos da doença de Alzheimer, uma doença neurodegenerativa progressiva e complexa. A PPA é uma glicoproteína integral transmembranar que tem duas predominantes vias de processamento proteolítico, a via não-amiloidogénica e a via amiloidogénica. A proteína Tau encontra-se associada aos microtúbulos, sendo a afinidade dessa ligação regulada pela fosforilação de resíduos de serina e treonina. A expressão da PPA e da proteína Tau também já foi reportada no testículo. No entanto, ainda não foram estabelecidas as suas funções e modificações pós-traducionais neste tecido. Assim, analisamos a expressão destas duas proteínas e o seu padrão de fosforilação durante a espermatogénese usando como modelos murganhos e ratos wild-type. Através de imuno-histoquímica revelamos que a PPA, a proteína Tau, a proteína serina/treonina fosfatase (PP) 1α e a PP1γ são expressas em toda a espermatogénese. Fosforilação da PPA e da proteína Tau foi detetada durante a meiose. Em contraste com a localização da PPA-total, a PPA fosforilada na treonina 668 está especialmente localizada no núcleo dos espermatócitos. Estes resultados sugerem que a fosforilação da PPA e da proteína Tau contribui para a espermatogénese, especialmente na meiose. No entanto, são necessários estudos futuros para validar os nossos resultados e desvendar a função específica da PPA e da proteína Tau durante a espermatogénese e na meiose.

Enquanto as raízes laterais (RL) se desenvolvem a partir da raiz primária, as raízes adventícias (RA) são geralmente formadas em órgãos da parte aérea da planta. As RA podem ser formadas como uma resposta adaptativa a estresses, como ferimentos ou alagamentos e a sua formação também é importante para a propagação vegetativa de espécies economicamente relevantes, que frequentemente dependem da propagação clonal de genótipos elite. A aplicação de hormônios pode estimular o desenvolvimento das RA (DRA), e as auxinas são consideradas os principais hormônios envolvidos nesse processo. Neste estudo, o sistema de plântulas estioladas foi usado em Arabidopsis thaliana para analisar diversos aspectos do DRA. Diferentes tipos de auxinas, naturais ou sintéticas, foram testadas e verificou-se que AIA causou um aumento no número de raízes sem afetar seu comprimento, ANA foi efetivo para o DRA, mas as raízes ficaram pequenas, e altas concentrações de 2,4-D causaram a formação de calos. Através de imunolocalização, um nível elevado de AIA foi detectado nos tecidos do hipocótilo que deram origem ao primórdio radicular. O padrão de expressão de genes potencialmente envolvidos com o enraizamento adventício foi testado por PCR em Tempo Real. O DRA foi marcado essencialmente por aumento na expressão de PIN1, SUR2, GH3.3, GH3.6, ARF8 e IAA28. A expressão dos genes induzidos foi mais estimulada por ANA, seguida de AIA. A expressão de IAA28 aumentou com o DRA, diferente do que foi observado no desenvolvimento de RL. Os receptores de auxinas TIR1/AFB e ABP1 iniciam a sinalização de auxinas na célula pelo controle da expressão gênica, proteólise seletiva e afrouxamento da parede celular. Verificou-se que TIR1 e as proteínas AFBs são importantes para o DRA, mas que estes receptores devem estar exercendo funções redundantes no processo e que ABP1 pode agir complementando a sua ação. Durante a organogênese das RA, TIR1 e AFB2 parecem exercer uma maior influência. As auxinas são transportadas de maneira polar, célula a célula e geralmente dependem de transportadores. Analisamos o DRA em diferentes mutantes deficientes no transporte de influxo e efluxo de auxinas juntamente com construções com genes repórteres, na presença ou ausência de auxina exógena. Uma função essencial foi estabelecida para AUX1 no enraizamento adventício e, embora LAX3 per se não tenha sido chave no processo, este parece agir em conjunto com AUX1. Também observamos que a formação eficiente de RA depende dos transportadores de efluxo PIN, principalmente PIN1, 3 e 7. A adequada fosforilação dos PINs pelas quinases PID, WAG1 e WAG2 e, consequentemente, a direção do transporte, foi igualmente essencial para o estabelecimento das RA. Lateral roots (LR) develop from the primary root, whereas adventitious roots (AR) are generally formed from above-ground organs. AR can be formed as an adaptive response to stresses, like wounding or flooding, and their formation is also important for efficient vegetative propagation of economically relevant species, which often depend on clonal propagation of elite genotypes. Hormonal application can stimulate AR development (ARD) and auxins are recognized as major hormones involved in this process. Here, the etiolated seedlings system was used in Arabidopsis thaliana to study several aspects of ARD. Different auxin types, natural or synthetic, were tested and it was found that IAA caused an increase in root number without affecting root length, NAA was effective for ARD, but roots remained short and higher levels of 2,4-D caused callus formation. Through immunolocalization, a higher level of IAA was detected in hypocotyl tissues from which the root primordia differentiated. The expression pattern of genes potentially involved in adventitious rooting was tested by Real-Time PCR. ARD was essentially marked by increased expression of PIN1, SUR2, GH3.3, GH3.6, ARF8 and IAA28. The magnitude of expression of induced genes was much stimulated by NAA, followed by IAA. IAA28 expression increased with ARD, differently from what is known for lateral root development. The auxin receptors TIR1/AFB and ABP1 initiate auxin signaling in the cell through changes in gene expression, selective proteolysis and cell wall loosening. We observed that TIR1/AFB are important in ARD but might be playing redundant roles in the process, whereas ABP1 could be complementing their action. During AR organogenesis, TIR1 and AFB2 seemed to exert greater influence. Auxins are transported in a polar, cell to cell way and depend on several transporters. We analyzed ARD in different mutants affected in auxin influx and efflux transporters, coupled with reporter gene constructs, in presence or absence of exogenous auxin. An essential role was established for AUX1 in AR. Although LAX3 per se was not a key player in the process, it seemed to act in conjunction with AUX1. We also observed that efficient formation of AR depends on the PIN efflux transporters, mainly PIN1, 3 and 7. The proper phosphorylation of PINs by the kinases PID, WAG1 and WAG2, and hence the direction of auxin transport, was equally essential for AR establishment.

A fenilcetonúria (PKU) é o erro inato do metabolismo dos aminoácidos mais comum. Ela é uma doença autossômica recessiva causada por mutações no gene da fenilalanina hidroxilase (Pah) que é responsável por converter a fenilalanina (Phe) em tirosina (Tyr), que acaba elevando os níveis de Phe e seus metabólitos no sangue e tecidos. Se não tratada, a PKU pode desenvolver problemas neurológicos como convulsões, distúrbios motores e retardo mental. O objetivo deste estudo é investigar os efeitos da Phe em alguns parâmetros do metabolismo, estresse oxidativo e viabilidade celular em cultura de astrócitos de ratos Wistar. Os astrócitos foram cultivados sob quatro condições: controle (com 0,4 mM de Phe no meio de cultura) e outros três grupos com concentrações finais de Phe de 0,5, 1,0 e 1,5 mM. Após 72 horas, os astrócitos foram coletados para análises bioquímicas. Nós observamos que os teste de brometo de tetrazolium (MTT) e lactato desidrogenase mostraram alterações na viabilidade celular em todas as doses testadas. Também foram notadas alterações em parâmetros de estresse oxidativo, indicando que a Phe pode induzir a produção de radicais livres, mas não encontramos diferenças significaticas nos parâmetros do metabolismo como a creatina-cinase, piruvato-cinase e adenilato-cinase. Estes resultados sugerem que a fenilalanina nas concentrações encontradas na PKU pode induzir estresse oxidativo e consequente morte celular em cultura de astrócitos. Considerando a importâncias dessas células para a manutenção da homeostase cerebral, é possível que estas alterações estejam relacionadas com os problemas neurológicos encontrados em pacientes com PKU. Phenylketonuria (PKU) is the most common inborn error of amino acid metabolism. It is an autosomal recessive disease caused by mutations in the gene that expresses phenylalanine hydroxylase enzyme (Pah) that converts phenylalanine (Phe) into tyrosine (Tyr), that leads to high levels of Pheand its metabolites in blood and tissues. If left untreated, PKU can develop neurological problems as seizures, motor disturbances and severe mental retardation. The aim of this study is to investigate the effects of Phe on oxidative stress, some metabolic parameters and cell viability in astrocytes culture of Wistar rats.Astrocytes were cultures under four conditions: control (0.4 mMPhe in the medium), and other three groups with final Phe concentration of 0.5, 1.0 and 1.5 mM. After 72 hours, astrocytes were collected for biochemical measurements. We observed that tetrazolium bromide (MTT) and lactate dehydrogenase (LDH) assays indicated that Phedecreased cell viability at all tested doses. Alterations on oxidative stress parameters indicated that Phecould induce free radicals production, but we didn’t find significative differences on metabolic parameters as creatine, pyruvate and adenylate kinases. Those results suggest that phenylalanine at concentrations found in PKU can induce oxidative stress and consequently cell death in astrocytes cultures. Considering the importance of astrocytes in brain homeostasis, it is possible that these changes may be related to neurological problems seen in PKU patients.

Orientadora : Profª Drª Glaucia Regina Martinez Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 03/03/2015 Inclui referências Resumo: O câncer de pele do tipo melanoma apresenta alta taxa de mortalidade e baixa resposta frente aos tratamentos atualmente disponíveis. Desta forma, estudos procuram compreender melhor os mecanismos celulares envolvidos na resistência e na elevada agressividade das células de melanoma para desenvolver novas estratégias terapêuticas. A terapia fotodinâmica (PDT) envolve a geração de oxigênio molecular singlete (1O2) por um fotossensibilizador (PS) irradiado com luz em um comprimento de onda específico, desencadeando respostas celulares que podem levar à destruição do tumor. Entretanto, a efetividade da PDT em melanomas é baixa. Anteriormente, foi mostrado usando análise proteômica, que os níveis de vimentina eram alterados em melanócitos e células de melanoma tratadas com 1O2. A vimentina é uma proteína do citoesqueleto que é geralmente superexpressa em carcinomas e parece estar relacionada com o crescimento e a metástase de tumores. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi melhor entender a influência da vimentina no processo de morte celular em melanócitos (Melan-A) e células de melanoma (B16-F10) após o tratamento com 1O2 gerado pela PDT, usando como PS o Rosa Bengala Acetato (RBAc). A viabilidade foi avaliada pela metabolização do MTT, pela marcação com cristal violeta (CVS) e pela captação de vermelho neutro (NRU). Os resultados mostraram que ambas as linhagens apresentaram uma diminuição da viabilidade (MTT e CVS) com 5,0 ?g.mL-1 de RBAc, 18 horas após terem sido irradiadas com LED (526 nm; 1,5 J/cm2). A análise pelo método NRU mostrou um efeito inverso aos resultados do CVS e MTT; esse padrão é um forte indicativo de morte das células por autofagia. Para confirmar, foi analisada a expressão de proteínas relacionadas ao processo autofágico, Beclin-1 e LC3 por western blotting. Em ambas as linhagens celulares, a PDT promoveu diminuição dos níveis de Beclin-1 e da relação LC3 II/LC3 I na análise feita imediatamente ao término da irradiação. Após 18 horas, o nível de Beclin-1 foi restaurado e houve um aumento na relação LC3 II/LC3 I em ambas as linhagens. Em B16-F10, o efeito da PDT ocasionou aumento na relação vimentina fosforilada na serina 56/vimentina, 18 horas após a PDT. No caso das células Melan-a, não tivemos variação na relação vimentina fosforilada serina 56/vimentina, mostrando que essas duas linhagens tem alterações diferentes no citoesqueleto após a PDT. No presente estudo, nós demonstramos a indução de autofagia após 18h de RBAc-PDT em melanoma e melanócitos. Mostramos ainda que ambas as linhagens celulares têm diferentes alterações na expressão de proteínas relacionadas à autofagia e citoesqueleto e que existem diferenças quando a análise é feita imediatamente após a PDT ou 18h depois. Desta forma, este estudo proporciona uma melhor compreensão da relação da morte celular com alterações de proteínas do citoesqueleto após PDT em melanócitos e células de melanoma. Palavras-chave: melanoma, fosforilação, rosa bengala, terapia fotodinâmica e vimentina. Abstract: Melanoma is a type of skin cancer with high mortality rate and low response to the currently available treatments. Thus, studies look for a better understanding about the cellular mechanisms involved in resistance and high aggressiveness of melanoma cells in order to develop new therapeutic strategies. Photodynamic therapy (PDT) involves the generation of singlet molecular oxygen (1O2) when a photosensitizer (PS) is irradiated with light in a specific wavelength which triggers cellular responses that can lead to tumor destruction. However, the effectiveness of PDT in melanomas is low. Previously, proteomic analysis, showed that vimentin levels were altered in melanocytes and melanoma cells treated with 1O2. Vimentin is a cytoskeletal protein that is overexpressed in cancers and generally appears to be related to the growth and metastasis of tumors. Thus, the main objective of this study is the investigation about the influence of vimentin in the process of cell death in melanocytes (Melan-a) and melanoma cells (B16-F10) after treatment with 1O2 generated by PDT, using Rose Bengal Acetate (RBAc) as PS. The viability was assessed by MTT metabolism, by crystal violet (CVS) labeling and neutral red uptake (NRU). The results showed that both cell lines showed reduced viability (MTT and CVS) with 5.0 ?g.mL-1 RBAc, 18 hours after being irradiated with LED (526 nm, 1.5 J/cm2). The NRU analysis showed an inverse effect to the CVS and MTT results; this pattern is a strong indicator of cell death by autophagy. To confirm, we analyzed the expression of proteins related to autophagic process, beclin-1 and LC3 by western blotting. In both cell lines, PDT caused a reduction of beclin-1 levels and in the relation LC3 II/ LC3 I in the analysis performed immediately at the end of irradiation. After 18 hours, the level of beclin-1 was restored and an increase in the relation LC3 II/LC3 I was observed in both cell lines. To B16-F10, the effect of PDT resulted in an increase in the relation vimentin phosphorylated at serine 56/vimentin, 18 hours after PDT. For Melan-a cells, no variation in the relation vimentin phosphorylated serine 56/vimentin was observed, indicating that these two cell lines have different alterations in the cytoskeleton after PDT. In the present study, we demonstrated the induction of autophagy after 18h of RBAc-PDT in melanoma and melanocytes. We also show that both cell lines have different changes in protein expression related to autophagy and cytoskeleton and that there are differences when the analysis is done immediately after PDT or 18h later. Thus, this study provides a better understanding of cell death related proteins cytoskeletal changes after PDT in melanocytes and melanoma cells. Keywords: melanoma, phosphorylation, photodynamic therapy, rose bengal, vimentin.

Uma elevação da concentração de amônia no sangue é tóxica e pode levar a convulsões, coma e morte. A suscetibilidade do cérebro em desenvolvimento a alterações neurológicas é maior do que no adulto. O citoesqueleto e, em particular, os filamentos intermediários (FIs) são um alvo de neurotoxinas e metabólitos tóxicos. No SNC temos os FIs neuronais, representados pelos neurofilamentos de alto, médio e baixo peso molecular (NF-H, NF-M, NF-L), e os astrocitários, proteína glial fibrilar ácida e vimentina (GFAP e VIM), entre outros. A fosforilação é uma modificação pós-traducional bem descrita como um dos principais mecanismos de regulação da dinâmica dos FIs. No presente trabalho, estudamos os efeitos de concentrações tóxicas de amônia sobre o citoesqueleto, com ênfase na homeostase do sistema fosforilante direcionado para os FIs e alguns mecanismos moleculares envolvidos nesses efeitos. Para tanto, utilizamos dois modelos experimentais de hiperamonemia aguda em animais de 10 e 21 dias de idade: in vivo e in vitro. No modelo in vivo, os animais foram injetados intraperitonealmente com acetato de amônio (7 mmol/Kg) e o nível de fosforilação das proteínas do citoesqueleto foi analisado no córtex cerebral e no hipocampo. No modelo in vitro, fatias de córtex cerebral e hipocampo de ratos nas mesmas idades foram incubadas com diferentes concentrações de NH4Cl. Nos dois modelos experimentais utilizados as alterações no sistema fosforilante foram dependentes da idade e da estrutura cerebral. A injeção de acetato de amônio não alterou o nível de fosforilação dos FIs no córtex cerebral de ratos de 10 dias, 30 e 60 min após a injeção. No entanto, observamos hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) e neuronais (NF-L, NF-M e NF-H) 30 min após a injeção, sendo que esse efeito foi revertido 60 min após a injeção. O sistema fosforilante associado aos FIs das células neurais de hipocampo não foi alterado com relação aos controles nas duas idades e nos dois tempos estudados. No modelo in vitro a resposta ao NH4Cl foi estrutura-dependente e dose-dependente para as concentrações de 0,5, 1 e 5 mM. Fatias de hipocampo de ratos de 10 dias de idade apresentaram hipofosforilação de GFAP, VIM e NFL em resposta à incubação com 5 mM de NH4Cl, sem alteração na homeostase do citoesqueleto nas células neurais de córtex cerebral. Por outro lado, fatias de córtex cerebral de ratos de 21 dias de idade apresentaram hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) sem alteração no sistema fosforilante direcionado aos FIs de hipocampo. A hipofosforilação em resposta a sinais celulares está frequentemente associada à ativação de proteínas fosfatases. Portanto, em uma tentativa de estudar as vias de sinalização buscamos identificar as fosfatases envolvidas no efeito do NH4Cl, utilizando fatias de córtex cerebral. As proteínas fosfatases 1 (PP1) e 2B (PP2B) foram ativadas em resposta a 5 mM de NH4Cl aos 30 min e esse evento envolveu alterações nos níveis intra e extracelulares de Ca2+ via ativação do sistema glutamatérgico por receptores N-metil-D-aspartato (NMDA). O conjunto dos nossos dados evidenciam a neurotoxicidade da amônia por meio de um desequilíbrio no sistema fosforilante direcionado para os FIs tanto neuronais quanto astrocitários e de uma desregulação nos mecanismos de sinalização celular envolvidos na homeostase do citoesqueleto de astrócitos. Essas alterações podem ser parte integrante dos danos neurológicos associados à hiperamonemia aguda, principalmente no cérebro em desenvolvimento, como retardo mental e paralisia cerebral. Acreditamos que esses resultados são relevantes para a compreensão das bases moleculares envolvidas com a toxicidade da amônia no SNC. High ammonia levels in the blood are toxic to brain and can lead to seizures, coma and death. The susceptibility of the developing brain to neurological abnormalities is greater than in adults. The cytoskeleton and, in particular, the intermediate filaments (IFs) are a target of neurotoxins and toxic metabolites. The intermediate dilaments (IFs) in the CNS are mainly represented by neurofilaments of high, medium and light molecular weight (NF-H, NF-M, NF-L) in neurons, glial fibrillary acidic protein and vimentin (GFAP and VIM), in astrocytes. Phosphorylation is a post-translational modification described as one of the major mechanisms regulating the dynamics of IFs. In the present work, we studied the effects of toxic concentrations of ammonia on the cytoskeleton, with emphasis in the homeostasis of the phosphorylating system directed to the IFs and we focused in some molecular mechanisms involved in these effects. For this, we use two experimental models of acute hyperammonemia in animals of 10 and 21 days of age: in vivo and in vitro models. In the in vivo model, animals were injected intraperitoneally with ammonium acetate (7 mmol/Kg) and the phosphorylation level of the cytoskeletal proteins was analyzed in the cerebral cortex and hippocampus.The injected acetate did not alter the phosphorylation level of IFs in the cerebral cortex of 10 day-old rats, 30 and 60 min after injection. However, we noted hypophosphorylation of the astrocytic (GFAP and VIM) as well as neuronal IFs (NF-L, NF-M and NF-H) 30 min after injection, and this effect was reversed 60 min after injection. The phosphorylating system associated with IFs of neural cells of the hippocampus was not altered as compared with controls at both ages and in the two studied times. In the in vitro model, the response to NH4Cl was structure-dependent and dose-dependent at the concentrations of 0.5, 1 and 5 mM. Hippocampal slices of 10-day-old rats showed hypophosphorylation of GFAP VIM and NFL in response to incubation with 5 mM NH4Cl, and unaltered homeostasis of the phosphorylating system directed to the cytoskeleton in the neural cells of the cerebral cortex. On the other hand, slices of cerebral cortex of 21-day-old rats showed hypophosphorylation of astrocytic IFs (GFAP and VIM) without altering the phosphorylating system directed to hippocampal IFs. The hypophosphorylation in response to cellular signals is often associated with activation of protein phosphatases. Therefore, in an attempt to study the signaling pathways we seek identify phosphatases involved in the effect of NH4Cl, using cerebral cortex slices. The protein phosphatases 1 (PP1) and 2B (PP2B) were activated in response to 5 mM NH4Cl 30 min after injection and this event was associated with in intra and extracellular Ca2+ levels via activation of glutamate N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. Taken together, our data show that the neurotoxicity of ammonia is directed to the phosphorylating imbalance of both neuronal as astrocytic IFs through disruption of the homeostasis of the NMDA-mediated signaling mechanisms of cortical astrocytes of 21-day-old rats. These changes may be part of the neurological damage associated with acute hyperammonemia, in the developing brain, as mental retardation and cerebral palsy. We believe that these results are relevant for understanding the molecular basis involved in the toxicity of ammonia in the CNS.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Helicobacter pylori coloniza a mucosa gástrica de seres humanos e a infecção por amostras cagA-positivas aumenta o risco de doenças graves como adenocarcinoma gástrico. O cagA codifica uma proteína denominada CagA, que é injetada no interior das células epiteliais gástricas através de um sistema de secreção do tipo IV. No citoplasma, a proteína CagA é fosforilada por cinases do hospedeiro nos sítios EPIYA C e interage com a fosfatase SHP-2. O complexo CagA/SHP-2 desencadeia diversos eventos intracelulares, principalmente ligados às vias de sinalização SHP-2/MAPK/ERK1/2 e JAK/STAT3. Desequilíbrios nessas vias de sinalização, como podem ocorrer na infecção pelo H. pylori, têm sido considerados relevantes na carcinogênese, visto que participam no controle de atividades e funções celulares vitais, como apoptose, proliferação, morfogênese e motilidade celular. Entretanto, não há estudos avaliando o efeito do número de sítios EPIYA C na produção de citocinas também consideradas relevantes na carcinogênese gástrica. Portanto, nesse estudo, foi avaliado o efeito do número de sítios de fosforilação EPIYA C da proteína CagA na produção de citocinas representativas da resposta Th17 (IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-23 e TGF-β), bem como de IL-8 e IL-11 em células mononucleares do sangue periférico de doadores saudáveis H. pylori-negativos (qRT-PCR e ELISA) e células AGS (ELISA) estimuladas por amostras isogênicas de H. pylori com diferentes números de sítios de fosforilação EPIYA C. As vias de sinalização envolvidas foram avaliadas por “imunoblot” e os resultados confirmados com inibidores específicos das vias. Os resultados foram analisados com o programa estatístico SPSS e valores de p ≤ 0,05 foram considerados significativos. Foi demonstrado que a proteína CagA é injetada, clivada e fosforilada no citoplasma das células mononucleares do sangue periférico. A proteína CagA fosforilada, especialmente as amostras com dois e três sítios de fosforilação EPIYA C, interagiram com a fosfatase SHP-2 induzindo a ativação da via MAPK/ERK1/2. Por outro lado, a via JAK/STAT3 foi ativada principalmente pela amostra contendo um sítio EPIYA C. Em decorrência da ativação dessas vias de sinalização foi observado aumento na secreção das citocinas IL-6, IL-11, IL-17A, IL-23 e TGF-β por células mononucleares do sangue periférico e IL-11 por células AGS estimuladas com amostras isogênicas de H. pylori, proporcionalmente ao número de sítios de fosforilação EPIYA C da amostra. Por outro lado, foi visto que a secreção de IL-1β e IL-8 pelas células mononucleares e de IL-1β, IL-8 e TGF-β pelas células AGS não depende do número de sítios de fosforilação EPIYA C das amostras usadas como estímulo “in vitro”. Concluindo, demonstrou-se pela primeira vez que a proteína CagA de H. pylori com diferentes números de sítios de fosforilação EPIYA C foi injetada no citoplasma de células da resposta imunológica, clivada e fosforilada ativando as vias de sinalização SHP-2/MAPK/ERK1/2. A via JAK/STAT3 também foi ativada, mas de forma inversamente proporcional ao número de sítios de fosforilação EPIYA C. O resultado final foi o aumento de produção de citocinas associadas à carcinogênese. Subjects infected with cagA-positive H. pylori strains are at increased risk for gastric carcinoma. cagA (cytotoxin associated gene A) encodes the CagA protein that is injected into host gastric epithelial cells via a type 4 secretion system (T4SS) where it undergoes tyrosine phosphrorylation by Src family protein kinases and binds SHP-2 (Src Homology 2 Domain-Containing Tyrosine Phosphatase-2) phosphatase at several repeated sites in the C-terminal region containing EPIYA C motifs. The complex CagA/SHP-2 leads to sustained activation of several intracellular events, mainly linked to the signalling pathways, SHP-2/MAPK/ERK1/2 and JAK/STAT3, which alters host cell activities and functions including apoptosis, proliferation, morphogenesis and motility, considered relevant in the carcinogenesis. However, up to now there are no studies evaluating the effect of the number of CagA EPIYA C motifs on the production of cytokines, also considered relevant in carcinogenesis. Therefore, in the present study, we evaluated the effect of the number of CagA EPIYA C motifs on the production of cytokines related to Th17 cell commitment (IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-23 and TGF-β), as well as IL-8 and IL-11, in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy H. pylori-negative subjects (qRT-PCR and ELISA) and AGS cells (ELISA) stimulated by isogenic H. pylori strains with different number of EPIYA C motifs. Signalling pathways involved in CagA interaction were evaluated by immunoblot and the results were confirmed by using specific inhibitors of each pathway. Statistical analyses were performed by using SPSS and the differences were considered significant when p values were ≤ 0.05. We demonstrated that CagA protein is injected, broken down and phosphorylated in the cytosol of PBMC after stimulation. CagA, most prominently the strain with two and three EPIYA C motifs, bound to SHP-2 leading to activation of MAPK/ERK1/2 signalling pathway. Otherwise, JAK/STAT3 signalling pathway was mainly activated by cagA-positive strain with one EPIYA C motif. As consequence of the activation of these signalling pathways, an increased secretion of IL-6, IL-11, IL-17A, IL-23 and TGF-β by PBMC and IL-11 by AGS cell was observed. Cytokine secretion was proportional to the number of EPIYA C. By contrast, the IL-1β and IL-8 secretion by PBMC and AGS cells was independent of the number of EPIYA C motifs. In conclusion, we demonstrated, for the first time, that H. pylori CagA strains with different number of EPIYA C motifs were injected into cytosol of the immune response cells, where it was broken down and phosphorylated leading to activation of SHP-2/MAPK/ERK1/2 signalling pathway. JAK/STAT3 signalling pathway was also activated, but inversely proportional to the number of EPIYA C motifs. Altogether the alterations resulted in heightened production of cytokine related to carcinogenesis.

A superfície dos esporos bacterianos é constituída por uma estrutura multi-proteica, denominada manto, com funções de proteção e de interação com o meio circundante. CotB é um componente abundante do manto do esporo de Bacillus subtilis. Durante a formação do manto, a proteína CotB, de 46 kDa (CotB-46), sofre uma modificação pós-traducional, que a converte numa espécie com uma mobilidade eletroforética de 66 kDa (CotB-66). Outras duas proteínas do manto, CotH e CotG, são necessárias para a formação de CotB-66. CotH é uma proteína morfogenética essencial para a montagem do manto, e um homólogo estrutural de cinases Ser/Thr de tipo eucariota. CotB, por seu lado, possui quatro repetições de uma sequência rica em serinas/lisinas/argininas na sua metade Cterminal, enquanto que a metade N-terminal contém dois domínios Sm-like, associados normalmente a interações RNA-RNA e RNA-proteína. A super-expressão de cotB em E. coli resulta numa proteína de 46 kDa, mas a co-expressão de cotB com cotG e cotH leva à produção de uma forma de CotB de 66kDa. Na ausência de CotG ou de CotH ou na presença de uma forma inativa de CotH, com a substituição D228Q no seu centro ativo putativo, não se verifica a formação de CotB-66. CotH sofre auto-fosforilação e é insensível ao inibidor de largo espectro staurosporina. Além disso, mostramos que CotB-46 é fosforilado diretamente por CotH in vitro. Descobrimos que a substituição D228Q resulta em alterações na composição, estrutura e propriedades do manto que se aproximam daquelas causadas por uma mutação de eliminação do gene. Mostramos que a modificação de CotB in vivo é dependente de CotG e da atividade de cinase de CotH. Sugerimos que durante a formação do manto de B. subtilis CotH fosforila CotB na sua metade C-terminal, usando CotG como co-fator.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2015-04-08T18:54:30Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 4654266 bytes, checksum: e8863d04fff205c6cfefd42d7a4bd7ff (MD5) Made available in DSpace on 2015-04-08T18:54:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 4654266 bytes, checksum: e8863d04fff205c6cfefd42d7a4bd7ff (MD5) Previous issue date: 2014-07-10