Search

Fil: Santillan, Julia Yanina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Biotransformaciones; Argentina. Santillan, J. Y. (2023). Fosfohidrolasas aplicadas en biocatálisis y biorremediación. (Tesis de posgrado). Bernal, Argentina: Universidad Nacional de Quilmes. Las fosfotriesterasas son esterasas capaces de escindir el enlace P-O y han sido halladas en mamíferos, peces, aves, moluscos y bacterias. Estas enzimas demostraron ser biocatalizadores útiles en la degradación de compuestos organofosforados, siendo estos ampliamente utilizados en la actualidad como pesticidas en agricultura, en jardines y en la industria veterinaria. En particular, en nuestro país el organofosforado clorpirifós es el segundo pesticida más utilizado. Si bien estos pesticidas son muy eficientes, son también altamente tóxicos para mamíferos. Así, la intoxicación por organofosforados se ha convertido en un problema importante en todo el mundo. Considerando lo antes dicho, en el presente trabajo de tesis doctoral se propuso como primer objetivo el desarrollo de un sistema para la biorremediación de aguas contaminadas con pesticidas organofosforados empleando catalizadores con actividad fosfotriesterasa. Por otra parte y desde el punto de vista de la biocatálisis, como las enzimas no están limitadas a su actividad natural, es posible utilizarlas empleando una variedad de sustratos, pudiendo además catalizar las reacciones en ambas direcciones de su equilibrio termodinámico. Es por ello que las fosfotriesterasas pueden ser aplicadas en el sentido sintético para la obtención de fosfotriesteres, siendo de particular importancia los correspondientes derivados de nucleósidos y análogos. Estos compuestos, conocidos como pronucleótidos, son productos farmacológicamente útiles como antivirales y anticancerígenos ya que inhiben enzimas específicas (transcriptasa reversa, ARN replicasa, ADN polimerasa, IMP deshidrogenasa) o actúan como terminadores de cadena en la biosíntesis de ARN o ADN. En este marco, se propuso como segundo objetivo efectuar una primer aproximación a la síntesis de pronucleótidos a través de reacciones biocatalizadas. A continuación se hará un breve resumen de lo desarrollado a lo largo de cada capítulo del presente trabajo de tesis doctoral: En el capítulo 1, se presenta una introducción sobre biocatálisis y biorremediación. Ambas tecnologías tienen en común el empleo de sistemas biológicos para llevar a cabo una biotransformación. En este marco también se describen las fosfotriesterasas, enzimas de interés y objeto de estudio del presente trabajo, como así también los compuestos organofosforados (usos y tipos) y los análogos de nucleósidos. En el capítulo 2, se describen las metodologías desarrolladas para llevar a cabo la búsqueda, estudio e implementación en los procesos biocataliticos de fuentes microbianas con actividad fosfotriesterásica. Adicionalmente, se detallan los métodos de detección, análisis y cuantificación de los sustratos y productos de cada reacción biocatalizada estudiada. En el capítulo 3, se exponen los resultados obtenidos a partir del estudio de la actividad hidrolítica de seis fuentes bacterianas wild type frente a metil paraoxón. También se muestran los resultados de la optimización de las condiciones de reacción de dichos biocatalizadores, a partir de las cuales se evaluó la actividad fosfotriesterásica frente a diferentes sustratos, seleccionando un biocatalizador capaz de degradar cada uno de los compuestos organofosforados propuestos. En el capítulo 4, se presenta un trabajo realizado en colaboración con el laboratorio de LIGBCM-AVI de la Universidad Nacional de Quilmes que permitió la identificación de dos bacterias aisladas de suelo. Posteriormente, aplicando una metodología rápida y sencilla, se describe el estudio y la optimización de las condiciones de reacción, obteniéndose biocatalizadores capaces de degradar eficientemente sustratos más voluminosos como coroxón, cumafós y clorpirifós, para los que las fosfotriesterasas wild type reportadas suelen tener baja actividad hidrolítica. En el capítulo 5, se presentan los resultados del estudio de los extractos enzimáticos provenientes de los microorganismos estudiados en los capítulos 3 y 4. Adicionalmente tanto las células enteras como dichos extractos fueron inmovilizados por atrapamiento en perlas de alginato de calcio. Tras su ensayo en la hidrólisis de compuestos organofosforados, se seleccionó una forma de biocatalizador inmovilizado que fuera capaz de degradar con mayor eficiencia cada uno de dichos compuestos. Asimismo, se emplearon los biocatalizadores seleccionados para la degradación de paraoxón y clorpirifós en un biorreactor del tipo lecho empacado con los que se alcanzó la degradación completa de dichos compuestos en 56 y 17 h respectivamente. Se caracterizaron los biocatalizadores determinado la posible existencia de problemas de transferencia de masa, como así también su reutilización. En cuanto al biorreactor, se determinó la distribución de los tiempos de residencia y tipo de flujo. En el capítulo 6, con la finalidad de hallar nuevas fuentes de fosfotriesterasas, se presenta el estudio de cuatro hongos, los que fueron capaces de degradar metil paraoxón llevando a cabo la reacción en growing. Además, se determinó que las enzimas responsables de dicha hidrólisis eran extracelulares, por lo que se obtuvieron los respectivos extractos enzimáticos, que se concentraron y finalmente liofilizaron, analizándose su actividad. Se optimizaron también las condiciones de reacción en cuanto a la cantidad de biocatalizador y pH del medio. Finalmente, en el capítulo 7, se describe la búsqueda de alternativas para mejorar los rendimientos obtenidos previamente en nuestro laboratorio en la reacción de transesterificación para la síntesis de 5´-dimetilfosfato de inosina usando como biocatalizador la fosfotriesterasa de Brevundimonas diminuta. Se exploró la actividad sintética de Streptomyces setonii (microorganismo wild type) y de los microorganismos fúngicos estudiados en el capítulo 6, utilizando las condiciones puestas a punto en la reacción de hidrólisis.

A eficiência de utilização de um nutriente, expressa pela relação entre a biomassa produzida e a quantidade absorvida, é uma importante característica adaptativa das plantas, particularmente daquelas cultivadas em solos com baixa disponibilidade desse nutriente. Maior eficiência de utilização de P (EUP) é conferida pela maior taxa de remobilização de P, que consiste na translocação desse nutriente para regiões de maior demanda metabólica na planta. Maiores taxas de remobilização têm sido associadas a maiores atividades das enzimas: fosfatase ácida (APase) e ribonuclease (RNase). Neste trabalho, avaliou-se a atividade dessas enzimas em plantas de Brachiaria decumbens, pouco exigente, e de Panicum maximum cv. Tanzânia, mais exigente em P, cultivadas em solos que receberam diferentes doses desse nutriente e submetidas a diferentes alturas de corte. O ensaio foi realizado em casa de vegetação, utilizando amostra do horizonte B de um Latossolo Vermelho-Amarelo argiloso. Os tratamentos resultaram da combinação fatorial das duas gramíneas, das doses de 100, 200 e 500 mg dm^-3 de P e das três alturas de corte: sem corte e corte a 15 e 30 cm a partir da superfície do solo para Brachiaria; e sem corte e corte a 20 e 40 cm para Panicum. As unidades experimentais consistiram de vasos com 10 dm^3 de solo, com 10 plantas. Os resultados indicaram que não houve diferença significativa na produção de biomassa das duas gramíneas, mas a adição de P propiciou maior produção e maior teor desse nutriente na parte aérea de ambas. As plantas submetidas a cortes mais severos apresentaram menor produção e maiores teores de P na parte aérea. Ocorreu efeito negativo das doses de P na atividade da APase e da RNase nas duas forrageiras. As plantas cultivadas com a menor dose de P apresentaram maior atividade dessas enzimas e maior EUP. A atividade de ambas as fosfatases decresceu com a idade das plantas. No tratamento com o corte mais intenso, independentemente da dose de P, tanto Brachiaria quanto Panicum apresentaram menor EUP. Isso ocorreu associado à maior atividade das enzimas APase e RNase, indicando que outros mecanismos relacionados com a adaptação das plantas a baixas disponibilidades de P podem estar envolvidos. The nutrient use efficiency, expressed by the ratio between the produced biomass and nutrient content, is an important adaptive characteristic of plants, particularly of those cultivated in low-fertility soils. A high P-use efficiency (PUE) is conferred by high P remobilization rates, i.e., P transport to regions of greater metabolic demand in the plant. High P remobilization rates have been associated with high acid phosphatase (APase) and ribonuclease (RNase) enzyme activities. In our study, we evaluated the activity of these enzymes in Brachiaria decumbens, with a low, and Panicum maximum cv Tanzânia, with a high P demand, cultivated in soil treated with different P rates and cut at different heights. The experiment was carried out in a greenhouse, using B-horizon samples of a clayey Yellow-Red Latosol. The treatments consisted of a factorial combination of two grasses, three P rates (100, 200 and 500 mg dm^-3) and three cutting heights: no cutting, 15 and 30 cm above the soil surface for Brachiaria, and no cutting, 20 and 40 cm for Panicum. The experimental units consisted of pots with 10 dm^3 soil, with 10 plants each. Results indicated that there was no significant difference between biomass production of the two grasses, but the P application resulted in a higher biomass yield and P shoot concentration. The biomass production of plants cut at a lower height was smaller and P concentrations in shoots were higher. A significant effect of P rates on the APase and the RNase activities was observed in both forages. In plants grown at the lowest P rate enzyme activities and PUE were the highest. The activity of both phosphatases decreased with plant aging. In the treatment with the lowest cutting height, the PUE in both Brachiaria and Panicum plants was lower, independent of the P rate. At the same time, a higher APase and RNase activity was observed, indicating that other mechanisms may be involved in the plant adaptation to low P availability.

A eficiência de utilização de um nutriente, expressa pela relação entre a biomassa produzida e a quantidade absorvida, é uma importante característica adaptativa das plantas, particularmente daquelas cultivadas em solos com baixa disponibilidade desse nutriente. Maior eficiência de utilização de P (EUP) é conferida pela maior taxa de remobilização de P, que consiste na translocação desse nutriente para regiões de maior demanda metabólica na planta. Maiores taxas de remobilização têm sido associadas a maiores atividades das enzimas: fosfatase ácida (APase) e ribonuclease (RNase). Neste trabalho, avaliou-se a atividade dessas enzimas em plantas de Brachiaria decumbens, pouco exigente, e de Panicum maximum cv. Tanzânia, mais exigente em P, cultivadas em solos que receberam diferentes doses desse nutriente e submetidas a diferentes alturas de corte. O ensaio foi realizado em casa de vegetação, utilizando amostra do horizonte B de um Latossolo Vermelho-Amarelo argiloso. Os tratamentos resultaram da combinação fatorial das duas gramíneas, das doses de 100, 200 e 500 mg dm-3 de P e das três alturas de corte: sem corte e corte a 15 e 30 cm a partir da superfície do solo para Brachiaria; e sem corte e corte a 20 e 40 cm para Panicum. As unidades experimentais consistiram de vasos com 10 dm³ de solo, com 10 plantas. Os resultados indicaram que não houve diferença significativa na produção de biomassa das duas gramíneas, mas a adição de P propiciou maior produção e maior teor desse nutriente na parte aérea de ambas. As plantas submetidas a cortes mais severos apresentaram menor produção e maiores teores de P na parte aérea. Ocorreu efeito negativo das doses de P na atividade da APase e da RNase nas duas forrageiras. As plantas cultivadas com a menor dose de P apresentaram maior atividade dessas enzimas e maior EUP. A atividade de ambas as fosfatases decresceu com a idade das plantas. No tratamento com o corte mais intenso, independentemente da dose de P, tanto Brachiaria quanto Panicum apresentaram menor EUP. Isso ocorreu associado à maior atividade das enzimas APase e RNase, indicando que outros mecanismos relacionados com a adaptação das plantas a baixas disponibilidades de P podem estar envolvidos. The nutrient use efficiency, expressed by the ratio between the produced biomass and nutrient content, is an important adaptive characteristic of plants, particularly of those cultivated in low-fertility soils. A high P-use efficiency (PUE) is conferred by high P remobilization rates, i.e., P transport to regions of greater metabolic demand in the plant. High P remobilization rates have been associated with high acid phosphatase (APase) and ribonuclease (RNase) enzyme activities. In our study, we evaluated the activity of these enzymes in Brachiaria decumbens, with a low, and Panicum maximum cv Tanzânia, with a high P demand, cultivated in soil treated with different P rates and cut at different heights. The experiment was carried out in a greenhouse, using B-horizon samples of a clayey Yellow-Red Latosol. The treatments consisted of a factorial combination of two grasses, three P rates (100, 200 and 500 mg dm-3) and three cutting heights: no cutting, 15 and 30 cm above the soil surface for Brachiaria, and no cutting, 20 and 40 cm for Panicum. The experimental units consisted of pots with 10 dm³ soil, with 10 plants each. Results indicated that there was no significant difference between biomass production of the two grasses, but the P application resulted in a higher biomass yield and P shoot concentration. The biomass production of plants cut at a lower height was smaller and P concentrations in shoots were higher. A significant effect of P rates on the APase and the RNase activities was observed in both forages. In plants grown at the lowest P rate enzyme activities and PUE were the highest. The activity of both phosphatases decreased with plant aging. In the treatment with the lowest cutting height, the PUE in both Brachiaria and Panicum plants was lower, independent of the P rate. At the same time, a higher APase and RNase activity was observed, indicating that other mechanisms may be involved in the plant adaptation to low P availability.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A baixa disponibilidade de P é um dos principais limitantes da produtividade nos solos tropicais. No Brasil, uma grande proporção das pastagens está degradada, embora as gramíneas forrageiras tropicais sejam adaptadas às condições de baixa fertilidade. As formas orgânicas de P constituem um grande reservatório deste nutriente nos solos; assim, espera-se que o Po contribua para manter a disponibilidade de P no solo, necessária à manutenção da produtividade das gramíneas forrageiras. Sob condições de deficiência em P, a remobilização deste nutriente na planta é outro fator que pode contribuir para a produtividade das forrageiras e, conseqüentemente, para a sustentabilidade dos pastos. Assim, alterações nos teores das formas orgânicas de P no solo e na sua remobilização na planta poderão sinalizar o início do processo de degradação dos pastos. Um dos objetivos deste trabalho foi relacionar os teores de P de diferentes frações inorgânicas (Pi) e orgânicas (Po) com a produtividade dos pastos. Outro objetivo foi avaliar a atividade da fosfatase ácida (APase) e da ribonuclease (RNase) em forrageiras crescidas sob diferentes disponibilidades de P e mantidas sob diferentes intensidades de corte. Para atender ao primeiro objetivo foram coletadas amostras de solo de seis pastos de Brachiaria brizantha cv. Marandú com diferentes idades e produtividades, cultivados em um Latossolo Vermelho-Amarelo arenoso, em Brasilândia de Minas, região noroeste de Minas Gerais. Determinaram-se os teores de Pi e Po das frações mais lábeis, extraídas por resina e NaHCO 3 , Pi e Po extraídos com NaOH e Pi extraído com H 2 SO 4 , sendo estas ultimas frações, consideradas pouco lábeis. Também foram coletadas amostras de folha, coleto e raiz da forrageira para determinar a atividade da APase e RNase. Para avaliar relação entre a atividade das enzimas e a remobilização de P, plantas de B. decumbens e de Panicum maximum cv. Tanzânia foram cultivadas em casa de vegetação, em amostras de um Latossolo Vermelho- Amarelo argiloso, que receberam as doses de 100, 200 e 500 mg dm -3 de P, e mantidas sem corte e sob duas alturas de corte específicas para cada forrageira. As atividades da APase e RNase foram determinadas em amostras de folha, base do caule (coleto) e raiz coletadas até 45 dias após o início dos cortes. A maior produtividade dos pastos foi associada a maiores teores de Pi e Po extraídos pela resina de troca aniônica e pelo NaHCO 3, 0,5 mol L -1 , que se caracterizam por serem mais lábeis. Assim, os teores destas frações podem ser indicadores sensíveis para diagnosticar o processo de degradação dos pastos. Os teores foliares de P relacionaram positivamente com os teores de Pi e Po das frações extraídas pela resina e pelo NaHCO 3 , e foram significativamente maiores na forrageira dos pastos mais produtivos. A atividade da APase e da RNase não se relacionou com os teores foliares de P e com os teores desse elemento no solo, nas frações mais lábeis (P-resina e P- NaHCO 3 ), mas houve maior atividade dessas enzimas nos pastos mais produtivos. Não houve diferença significativa entre a produção de biomassa da Brachiaria e do Panicum, mas a adição de P propiciou maior produção e maior teor deste nutriente na parte aérea destas forrageiras. As plantas com menor altura de corte apresentaram menor produção e maiores teores de P na parte aérea. Ocorreu efeito significativo das doses de P sobre a atividade da APase e da RNase nas duas forrageiras. As plantas cultivadas com a menor dose de P apresentaram as maiores atividades dessas enzimas e maior eficiência de utilização de P (EUP). Independentemente da altura de corte, a Brachiaria apresentou maior teor de P e maior eficiência de aquisição deste nutriente, fato suportado pela maior atividade da APase nas raízes dessa forrageira. A atividade de ambas as fosfatases decresceu com a idade das plantas. No tratamento com a menor altura de corte, independentemente da dose de P, tanto a Brachiaria quanto o Panicum apresentaram menor EUP. Isso ocorreu associado à maior atividade das enzimas APase e RNase, indicando que outros mecanismos relacionados à adaptação das plantas a baixas disponibilidades de P podem estar envolvidos. The low P availability is one of the main constraints to crop productivity in tropical soils. In Brazil, a great proportion of pastures is degraded, even though the tropical grasses are adapted to the low fertility conditions. The organic P forms constitute a large reservoir of this nutrient on soils; thus, it is expected that Po contributes to maintain the availability of P in the soil, which is necessary to the maintenance of the forrage grasses productivity. Under deficient P conditions, the remobilization of this nutrient in the plant is another factor that can contribute for the forrages productivity and, consequently, for the pastures sustainability. Thus, alterations in concentration of Poforms in the soil and their remobilization in the plant may indicate the beginning of pastures degradation process. One of the objectives of this work was to relate the P concentration of different inorganic (Pi) and organic (Po) fractions with the pasture productivity. Another objective was to evaluate acid phosphatase (APase) and ribonuclease (RNase) activities in forrages grown under different P availabilities and kept under different cut intensities. In order to accomplish the first objective soil samples from six pastures of Brachiaria brizantha cv. Marandú with different ages and productivities cultivated in a loamy-sand Red Latosol, were collected in Brasilândia de Minas, northwestern Minas Gerais state. In these soil samples it was quantified the concentrations of Pi and Po of the more labile fractions, extracted with resin and NaHCO 3 , and the less labile Pi and Po fractions were extracted with NaOH, and Pi extracted with H 2 SO 4 . Also, leaf, crown and roots samples were collected to determine the APase and RNase activity. To evaluate the relation between the enzymes activity and P remobilization, B. decumbens and Panicum maximum cv. Tanzânia plants were cultivated in a greenhouse, in pots filled with a clayey Yellow Red Latosol. The soil was fertilized with 100, 200 and 500 mg dm -3 of P, and plants were kept without cut ting, or under two specific cut heights for each. The APase and RNase activities were ixdetermined in samples of leaf, base crown and root collected up to 45 days after beginning the cutting treatments. The higthest pastures productivity was associated to the biggest Pi and Po concentrations extracted with the anion exchange-resin and NaHCO 3 , 0,5 mol L -1 , which are more labile. Thus, the concentration of these fractions can be more sensitive to early diagnosis the pasture degradation process. The leaf P concentration related positively with Pi and Po concentrations of the fractions extracted with resin and the NaHCO 3 , and were significantly higher in plants from the most productive pasture. The APase and the RNase activity did not relate with leaf P concentration and the concentration of this element in soil labile fractions (resin-P and NaHCO 3 -P), but greater activity of these enzymes was observed in the most productive pasture. There was no significant difference between the biomass production of the Brachiaria and the Panicum, but the P addition led to greater production and greater concentration of this nutrient in shoots of these. The plants wiht shorter cut height presented smaller production and greater P concentration in shoots. A significant effect of P rates occurred on the APase and the RNase activity in the two forrages. The plants cultivated with the smaller P rate presented the highest activity of these enzymes and greater P use efficiency (PUE). Independently of the cut height, the Brachiaria presented greater P concentration and greater acquisition efficiency of this nutrient, apparently due to the high root APase activity in this forrage. The activity of both phosphatases decreased with the age of the plants. In the treatment with smaller cut height, independently of the P rate, not only the Brachiaria, but also the Panicum presented smaller PUE. This occurred associated to the highest APase and RNase activities, indicating that other mechanisms may be contribute to the adaptation of these species to low P availability. .