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Structural differences between conformers sustain protein biological function. Here, we studied in a large dataset of 745 intrinsically disordered proteins, how ordered-disordered transitions modulate structural differences between conformers as derived from crystallographic data. We found that almost 50% of the proteins studied show no transitions and have low conformational diversity while the rest show transitions and a higher conformational diversity. In this last subset, 60% of the proteins become more ordered after ligand binding, while 40% more disordered. As protein conformational diversity is inherently connected with protein function our analysis suggests differences in structure-function relationships related to order-disorder transitions. Fil: Zea, Diego Javier. Universidad Nacional de Quilmes; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentina Fil: Monzón, Alexander. Universidad Nacional de Quilmes; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Gonzalez, Claudia. Universidad Nacional de Quilmes; Argentina Fil: Fornasari, Maria Silvina. Universidad Nacional de Quilmes; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Tosatto, Silvio C. E.. Università di Padova; Italia Fil: Parisi, Gustavo Daniel. Universidad Nacional de Quilmes; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Somatic sequence variants in the epidermal growth factor receptor (EGFR) kinase domain are associated with sensitivity to tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in patients with nonsmall cell lung cancer (NSCLC). Patients exhibiting sequence variants in this domain that produce kinase activity enhancement, are more likely to benefit from TKIs than patients with EGFR wild-type disease. Although most NSCLC EGFR-related alleles are concentrated in a few positions, established protocols recommend sequencing EGFR exons 18?21. In this study, 21 novel somatic variants belonging to such exons in adult Argentinean patients affected with NSCLC are reported. Of these, 18 were single amino acid substitutions (SASs), occurring alone or in combination with another genetic alteration (complex cases), one was a short deletion, one was a short deletion-short insertion combination, and one was a duplication. New variants and different combinations of previously reported variants were also found. Moreover, two of the reported SASs occurred in previously unreported positions of the EGFR kinase domain. In order to characterize the new sequence variants, physicochemical, sequence and conformational analyses were also performed. A better understanding of sequence variants in NSCLC may facilitate the most appropriate treatment choice for this complex disease. Fil: Hasenahuer, Marcia Anahí. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología; Argentina Fil: Parisi, Gustavo Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología; Argentina Fil: Gautier, Marien. Fundación Investigar; Argentina Fil: Lazarowski, Alberto Jorge. Fundación Investigar; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina Fil: Bramuglia, Guillermo Federico. Fundación Investigar; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina Fil: Fornasari, Maria Silvina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología; Argentina

El concepto de estado nativo ha evolucionado en el tiempo junto a las técnicas de caracterización de proteínas. Hoy en día el estado nativo se describe por lo que denominamos ensamble, el cual está compuesto por confórmeros que se encuentran en equilibrio dinámico. Los cambios conformacionales que experimenta una proteína en su estado nativo es lo que se conoce como diversidad conformacional, y es un concepto clave para la comprensión de procesos como el cooperativismo y el alosterismo, la función biológica, el reconocimiento molecular, la catálisis enzimática y el origen de nuevas funciones entre otros tantos ejemplos. De esta forma, creemos firmemente que la relación estructura-función de las proteínas debiera reformularse en términos dinámicos, esto es, que se considere la diversidad conformacional para llegar a conclusiones biológicas más relevantes.El presente trabajo se centra en comprender y explorar la diversidad conformacional de proteínas y su estrecha relación con la función biológica. Para este propósito hemos desarrollado una base de datos de diversidad conformacional denominada CoDNaS (extit{"Conformational Diversity of the Native State"}) la cual permite estudiar la diversidad conformacional a partir de las estructuras de proteínas redundantes depositadas en PDB y que han sido obtenidas en distintas condiciones experimentales. Utilizando los varios miles de proteínas depositadas y anotadas en CoDNaS, derivamos en distintos estudios conceptos generales sobre el comportamiento de la diversidad conformacional en función de distintos aspectos biológicos, fisicoquímicos y biofísicos. Así, hemos podido explicar la distribución global de diversidad conformacional, identificando al menos cuatro relaciones estructura-dinámica-función que emergen del análisis del ensamble conformacional que posee cada proteína. Estas características compartidas entre los diferentes grupos podrían representar mecanismos conformacionales relacionados con sus funciones biológicas. Además, re-examinamos la muy bien establecida relación entre entre divergencia estructural y divergencia secuencial a la luz de la diversidad conformacional. Encontramos que la consideración de la diversidad conformacional impacta fuertemente en la correlación de la relación secuencia-estructura lo que repercute directamente en la confiabilidad de los métodos de modelado por homología.Nuestro resultados ofrecen nuevas perspectivas dentro de la bioinformática y biología estructural de proteínas. Esperamos que los mismos redunden en una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes a la función proteica como así también en la generación de herramientas bioinformáticas más precisas. Fil: Monzón, Alexander. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología; Argentina

Fil: Defain Tesoriero, María Victoria. Universidad Nacional de San Martín; Argentina. Defain Tesoriero, M. V. (2016). Nanoadyuvantes para ruta mucosa a partir de fuentes sustentables de lípidos. (Tesis de doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina Este trabajo de Tesis Doctoral describe el diseño y caracterización de liposomas preparados con lípidos aislados de arquebacterias (ARQ) para generar respuestas inmunes antígeno-dependientes por la ruta oral en modelos animales de laboratorio. Para ello, se comenzó con el aislamiento y la amplificación en medio salino (3,5 M) de arquebacterias a partir de muestras de suelo de Salina Chica (Península de Valdez, Chubut, Argentina). Las mismas se identificaron como H. tebenquichense. Los lípidos polares totales (LPT) se extrajeron y caracterizaron por cromatografía en capa delgada mono y bidimensional (TLC-1D y 2D) y espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS). La mezcla de LPT estaba compuesta por: los fosfolípidos arqueales 2,3-di-O-fitanil-sn-fosfatidilglicerofosfato metil éster (PGP-Me) y 2,3-di-O- fitanil-sn-fosfatidilglicerol (PG); la cardiolipina sn-2,3-di-O-fitanil-1-fosfoglicerol-3-fosfo-sn-di-O-fitanilglicerol (BPG); el sulfoglicolípido, 1-O-[α-D-manosa-(2’-SO3H)-1’→2’)-α-D-glucosa]-2,3-di-O-fitanil-sn-glicerol (S-DGD-5) y la cardiolipina glicosilada (S-DGD-5-PA). Con los LPT aislados se planteó una primera aproximación para evaluar la factibilidad de obtención de arqueosomas (ARQ) empleando homogeneización de alta presión (HPH) aplicando un DoE multivariado. Los resultados demostraron que los ARQ ofrecieron una gran resistencia a la disminución del tamaño por HPH. Esto podría deberse a la hidrofobicidad de los arqueolípidos y la presencia de cardiolipinas arqueales que conferirían una mayor rigidez a la membrana. Y por último, se prepararon ARQ con ovoalbúmina (OVA), como proteína modelo, a escala laboratorio para evaluar métodos de caracterización estructural de las vesículas obtenidas utilizando propilenglicol (Pg) para aumentar la incorporación de la proteína. Los ARQ obtenidos tuvieron un tamaño menor a 200 nm (ZAve) y su PdI fue menor a 0,300. El potencial Z fue menor a -30 mV, lo que justificaría la estabilidad física en suspensión de estas vesículas. En todos los casos las Tm y pre-Tm fueron menores a -20°C. La incorporación de proteína no mejoró con el uso de Pg y la relación proteína/lípido fue de ≈0,100 mg/mg. Luego, se utilizaron técnicas para el análisis de la captura y tráfico intracelular de ARQ, en células J774A.1, como modelo de macrófago y en células Caco-2, como modelo de enterocito. Para lo cual se utilizaron inhibidores de las diferentes rutas endocíticas y se cuantificó la internalización de los ARQ fluorescentes a través de la citometría de flujo. Estos estudios fueron complementados por microscopía confocal láser de barrido (MCLB) para determinar la co-localización con Lysotracker®, marcador de organelas ácidas. Los resultados revelaron que aparentemente, las células Caco-2 capturarían ARQ mediante endocitosis mediada por caveolina y macropinocitosis. Además, se halló que las células J774A.1, capturaron ARQ no sólo mediante la clásica fagocitosis, sino también por endocitosis mediada por clatrina y por caveolina. Los LPT utilizados para la preparación de estos ARQ no poseen arquetidilserina en su composición pero fueron ávidamente capturados por las células J774A.1. De un modo alternativo se podría postular la manosa terminal de los arqueolípidos SDGD-5 y SDGD-5-PA que interactuaría con receptores específicos presentes en APC para favorecer su captura. Este trabajo es el primero que muestra estudios in vitro sistemáticos sobre las vías de internalización y tráfico intracelular de ARQ en líneas celulares no fagocíticas. También se realizó un estudio comparativo de la capacidad de unión a células M de los ARQ preparados exclusivamente con arqueoles aislados de H. tebenquichense, respecto a liposomas de fosfatidilcolina de soja/colesterol, mediante un modelo in vitro de barrera epitelial mucosa utilizando dispositivos Transwell®. La fluorescencia, luego de 1 y 2 horas de incubación con ARQ marcados en el interior acuoso con un colorante piranínico fluorescente (HPTS) y la bicapa lipídica con RhPE, fue 4 veces mayor que la observada con liposomas marcados del mismo modo. Además, con muestras de ARQ, el 15% de RhPE y 13% de HPTS se encontraron en el compartimiento basolateral de los Transwell®, espacio equivalente al bolsillo basolateral de las células M. Por el contrario, no se detectó fluorescencia con los liposomas. Estos hallazgos revelarían una mayor velocidad de transcitosis de los ARQ comparado con los liposomas. Los resultados in vitro fueron sustentados por los hallazgos in vivo, donde se determinó la biodistribución del radiofármaco hidrosoluble 99mTc-DTPA incorporado a ARQ versus liposomas después de la administración oral en ratas Wistar. Luego de 4 horas, los ARQ fueron los responsables del 22,3 % (3,5 veces mayor que los liposomas) del 99mTc-DTPA, hallado en circulación. Esta importante cantidad de marcador radiactivo en sangre podría ser consecuencia de la gran captura de los ARQ por las células M in vivo, probablemente favorecida por las características hidrofóbicas de estas vesículas. En suma, estos resultados sugerirían que los ARQ, con una capacidad adyuvante probada por vía parenteral y biocompatibilidad demostrada, podrían ser un adecuado material nanoparticulado para utilizarse como adyuvante por la ruta oral. Y por último, se propuso la incorporación de antígenos solubles de T. cruzi a ARQ (ARQ-Tc) con el objeto de realizar ensayos de inmunización por ruta oral en un modelo de animales de laboratorio. Ratones hembra C3H/HeN se inmunizaron vía oral con una dosis de aproximadamente 200 μg de proteína y/o 2 mg de lípidos en un volumen máximo de 200 μl. El esquema de inmunización fue 0-14-21-63 días. La respuesta humoral se determinó a través del dosaje de anticuerpos clase IgG anti-T cruzi por ensayo inmunoenzimático (ELISA, del inglés Enzyme-linked immunosorbent assay) en fase sólida en muestras de suero. Para evaluar la respuesta inmune a nivel de mucosas se tomaron muestras de saliva y materia fecal y se cuantificó el título de IgA por ELISA. Las vesículas obtenidas (ARQ-Tc y ARQ) tuvieron un tamaño menor a 200 nm y el PdI fue menor a 0,400. El potencial Z fue menor a -30 mV. En los experimentos de digestión in vitro desarrollados se demostró que los ARQ protegerían la proteína incorporada. Además, a través del análisis por ESI-MS, los arqueolípidos evidenciaron una resistencia estructural al ambiente hostil del tracto gastrointestinal en experimentos in vitro, con lo cual los restos de manosa, a quienes se asigna la capacidad adyuvante, no se perderían. Sin embargo, los resultados del ensayo de inmunización mostraron solamente un ratón, perteneciente al grupo que recibió ARQ-Tc, con títulos elevados de IgG sérica (>6400) a partir de la quinta semana (14 dpi). Este título se mantuvo luego de 14 días de la cuarta dosis. En ningún caso se detectaron títulos de IgA en muestras de saliva. En este contexto, se discuten estrategias para encarar futuros abordajes experimentales.