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[spa] La abrazadera deslizante eucariota (PCNA), juega un papel esencial como componente del replisoma. PCNA, de forma toroidal, rodea el DNA y ata las polimerasas y otros factores a la plantilla genómica para una síntesis rápida y procesiva. PCNA puede deslizar bidireccionalmente a lo largo del dúplex de DNA rastreando su columna vertebral mediante un mecanismo de «rueda dentada» basado en interacciones polares efímeras que mantienen la orientación de la pinza invariante en relación con la doble hélice. La mutación de residuos en esta interfaz de interacción PCNA-DNA hace desfavorable el inicio de la síntesis de DNA por Pol δ, por lo tanto, es necesaria una pinza orientada correctamente en el DNA para el ensamblaje de una holoenzima pol δ-PCNA competente en replicación. La cara del interior del anillo de PCNA, además de ser crucial para la función de PCNA como factor de procesividad durante la replicación, está altamente regulada para controlar la resistencia al daño en el DNA. Se puede modular (i) a través de la acetilación de su lisina 20, lo que estimula la reparación por recombinación homóloga, o (ii) mediante la unión de p15PAF, lo que desactiva el baipás de lesión en el DNA. p15PAF es una proteína intrínsecamente desordenada que atraviesa el canal del anillo de PCNA, uniendo su dominio PIP-box al bolsillo hidrofóbico de la cara frontal de la pinza y estableciendo contactos también con la superficie deslizante de la abrazadera para asomar su cola N-terminal por la cara trasera. Cuando dos moléculas de p15PAF ocupan dos subunidades del homotrímero de PCNA, el DNA dentro del canal del anillo se une a la subunidad que queda desocupada y no desplaza a p15PAF de la pared del anillo interno de PCNA. Cuando p15PAF está unida a PCNA, se reduce la superficie deslizante disponible de la abrazadera, así que p15PAF puede estar funcionando como un cinturón que abrocha el DNA a PCNA durante la síntesis por la polimerasa replicativa Pol δ. Esta restricción de la superficie deslizante, sin embargo, necesita ser eliminada para un baipás eficaz de la lesión del DNA por parte de la polimerasa de síntesis translesión Pol η. PCNA es estable en forma de anillo cerrado y, por lo tanto, debe cargarse activamente en las uniones cebador/plantilla del DNA, colocándose exactamente en el lugar y posición correctas para una replicación procesiva. La apertura y carga de PCNA la lleva a cabo el cargador de la pinza RFC. Una vez en el DNA, PCNA se vuelve a sellar alrededor del DNA y entonces el cargador de la pinza es expulsado. Cuando PCNA ya no es necesaria anclada en el DNA, el complejo RFC es el encargado de retirarla abriéndola y soltándola fuera de la doble hebra. Pero la flexibilidad intrínseca de PCNA hace que tenga cierta predisposición a estar en estado abierto separando dos de sus subunidades a través de su interfaz. Esto, que favorece la apertura del anillo por parte de RFC para lograr el ensamblado alrededor del DNA, puede ser un problema para mantenerla cerrada en la unión cebador/plantilla. De hecho, la estabilidad de las interfaces entre subunidades de PCNA disminuye cuando se une al DNA después de ser cargada por RFC, y dicha estabilidad solo la ve recuperada cuando p15PAF se ancla por su dominio PIP-box a sus bolsillos hidrofóbicos, grapando así las subunidades de la pinza e impidiendo su salida prematura del complejo con el DNA. Además de estabilizar la forma cerrada del anillo de PCNA, cuando p15PAF está anclada a su cara frontal, impide que RFC se aproxime, se una a ella y la desenganche de la unión cebador/plantilla., [eng] The eukaryotic sliding clamp (PCNA) is an essential replisome's component. PCNA, with a toroidal shape, surrounds DNA and binds polymerases and other factors to the genomic template for rapid and processive synthesis. PCNA can slide bi-directionally along the DNA duplex using a "cogwheel" mechanism based on ephemeral polar interactions that maintain the orientation of the clamp invariant relative to the double helix. However, mutations in the PCNA-DNA interaction interface render unfavourable the initiation of DNA synthesis by Pol δ. Therefore, a correctly oriented clamp on the DNA is necessary to assemble a competent pol δ-PCNA holoenzyme. Tight regulation of the inner face of PCNA, which is crucial for PCNA function as a processivity factor during replication, controls the DNA damage resistance. The inner PCNA ring face can be regulated (i) through acetylation of its lysine 20, which stimulates repair by homologous recombination, or (ii) by p15PAF binding, which deactivates the bypass of DNA damage. p15PAF is an intrinsically disordered protein that crosses the channel of the PCNA ring, attaching its PIP-box domain to the hydrophobic pocket on the front face of the clamp and establishing contacts with the sliding surface to show its N-terminal tail through the rear face. When two p15PAF molecules occupy two subunits of the PCNA homotrimer, the DNA within the ring channel binds to the unoccupied subunit and does not displace p15PAF from the inner ring wall of PCNA. When p15PAF is bound to PCNA, the available slip surface of the clamp is reduced, so p15PAF may be functioning as a belt that binds DNA to PCNA during synthesis by the replicative polymerase Pol δ. This sliding surface restriction, however, needs to be removed for efficient bypass of DNA damage by the translesion synthesis polymerase Pol η. PCNA is a stable closed ring and must be actively loaded onto the primer/template junctions of DNA, getting precisely in the right place and position for processive replication. RFC clamp loader opens and loads PCNA onto the DNA. Once in the DNA, PCNA reseals around the DNA and RFC is then ejected. When PCNA is no longer needed around the DNA, the RFC complex opens and unloads it. But the local flexibility of PCNA's subunits interfaces makes it have a certain predisposition to be in the open state. This local flexibility, which favours the RFC opening of the ring to achieve assembly around the DNA, can be a problem in keeping it closed at the primer/template junction. Furthermore, the stability of the interfaces between PCNA subunits decreases further when it binds to DNA. Interestingly, the PCNA homotrimer interfaces stability recovers when p15PAF is anchored by its PIP-box domain to PCNA's hydrophobic pockets, thus stapling the clamp subunits and preventing their premature exit from the complex with DNA. In addition, when p15PAF is anchored to PCNA front face, it prevents RFC from approaching, binding to, and unloading PCNA from the primer/template junction.

Orientador: Maria Beatriz Puzzi Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Introdução: Nos últimos anos, tem-se observado o aumento no número de estudos relacionados ao processo de envelhecimento da pele, devido principalmente ao interesse da população em prevenir ou retardar o aparecimento dos sinais do tempo. O envelhecimento da pele é decorrente de um processo natural do corpo humano e sofre influência direta do background genético do indivíduo. Também pode sofrer com ação do ambiente externo, intensificando as dermatoses comuns do envelhecimento. Objetivo: Neste presente trabalho analisamos a expressão gênica de fibroblastos humanos originários de indivíduos jovens e idosos, mantidos em cultura celular de monocamada, a fim de se determinar um padrão gênico de envelhecimento da pele. Metodologias e métodos: Utilizando fibroblastos humanos primários, comparamos três modelos in vitro de envelhecimento, através da técnica de proliferação celular acelerada, radiação UVB e células provenientes de doadores idosos, com relação ao seu comportamento celular e gênico considerando 29 genes: CASP3, SIRT1, LMNA, COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL4A1, COL7A1, MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP12, MMP13, MMP14, TIMP1, TIMP2, TIMP3, TIMP4, IL1B, IL1A, IL6, IL8, IL10, TP53, PTGS2 relacionados ao processo de envelhecimento da pele. Resultados e discussão: Foi possível observar redução na velocidade de proliferação celular nos modelos de envelhecimento quando comparados ao controle jovem sem tratamento. Os resultados de expressão gênica foram analisados através da plataforma Ingenuity Pathway Analysis e 12 genes foram identificados como potenciais biomarcadores para o processo de envelhecimento da pele. Os genes COL1A1 e COL1A2, relacionados à síntese de colágeno tipo I, demonstraram inibição de expressão enquanto os genes MMP1 e MMP3, relacionados à degradação de matriz extracelular, apresentaram aumento, corroborando sua importância no processo de envelhecimento da pele. Os genes responsáveis pela síntese de citocinas pró- inflamatórias IL6, IL1A, IL1B e PTGS2 apresentaram inibição da expressão ao mesmo tempo em que o IL10, gene que codifica uma citocina anti-inflamatória, apresentou aumento, sugerindo que estas citocinas atuam no dano e recuperação da pele envelhecida. Além disso, os genes CXCL8, TP53 e LMNA também foram positivamente modulados, sugerindo possuir papel importante no processo de envelhecimento celular. Conclusão: Os modelos in vitro de envelhecimento de pele, quando analisados isoladamente, não apresentaram marcadores gênicos exclusivos porém, quando analisados conjuntamente, foi possível identificar 12 genes como biomarcadores comuns entre os modelos de envelhecimento, sendo eles COL1A1, COL1A2, CXCL8, IL6, IL10, IL1A, IL1B, LMNA, MMP1, MMP3, PTGS2, TP53. Deste modo, podemos concluir que é possível definir um padrão gênico de envelhecimento da pele em modelos de cultura celular in vitro, nas condições testadas Abstract: Introduction: In recent years, it has been observed an increase in the number of works related to skin aging, due mainly to the interest of the population on prevent or delay the signs of elderly on skin. Skin aging is the result of a natural process of human body and it is influenced by genetic background. It also can be influenced by external environment, intensifying regular dermatoses of elderly. Objective: In this present work, we analyzed the gene expression of human fibroblasts from young and elderly donors, maintained in monolayer cell culture, in order to determine genetic pattern of skin aging. Materials and Methodology: Using human primary fibroblasts, we compared three in vitro skin aging models - cell proliferation technique, UVB radiation and cells from elderly donors - regarding cellular and genetic behavior, using 29 genes: CASP3, SIRT1, LMNA, COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL4A1, COL7A1, MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP12, MMP13, MMP14, TIMP1, TIMP2, TIMP3, TIMP4, IL1B, IL1A, IL6, IL8, IL10, TP53, PTGS2 related to skin aging process. Results and discussion: It was possible to observe a decrease of cellular proliferation rate on aging models when compared with young cell control, without treatment. The results of gene expression were analyzed through Ingenuity Pathway Analysis platform and 12 genes were identified as common biomarkers of skin aging. The genes COL1A1 and COL1A2, related to collagen type 1 synthesis, demonstrated inhibition of expression while MMP1 and MMP3, related to extracellular matrix degradation, demonstrated increase, corroborating their importance in the skin aging. The genes responsible for pro inflammatory cytokines synthesis IL6, IL1A, IL1B and PTGS2 showed inhibition of expression at the same time that IL10 gene, which encode an anti-inflammatory cytokine, demonstrated increase suggesting that these cytokines can act on damage and recovery of aged skin. Furthermore, the genes CXCL8, TP53 and LMNA were also positively modulated, suggesting an important role on skin aging process. Conclusion: In vitro skin aging models, when individually analyzed, did not identify unique biomarkers however, when analyzed together, it was possible to identify 12 genes as common biomarkers for skin aging, COL1A1, COL1A2, CXCL8, IL6, IL10, IL1A, IL1B, LMNA, MMP1, MMP3, PTGS2, TP53. Thus, we can conclude that is possible to determine a genetic pattern of skin aging in cell culture in vitro models, regarding established conditions Doutorado Clínica Médica Doutora em Ciências

“Los fibroblastos cardíacos representan cerca del 70% de la población celular en el corazón y desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la función cardíaca como la síntesis y secreción de la matriz extracelular y la comunicación con otras células como los cardiomiocitos. La matriz extracelular es una red de proteínas que mantiene la integridad estructural del corazón, siendo el colágeno tipo I una de las principales proteínas que componen esta matriz. El cultivo celular es una técnica indispensable para la investigación in vitro y su aplicación ha permitido comprender múltiples aspectos de la fisiología celular, sin embargo, la mayoría de los estudios se han realizado utilizando el cultivo de células en monocapa sobre un sustrato rígido y, una de las desventajas de este tipo de cultivos es que en ellos se pierde la organización tridimensional que presentan los tejidos in vivo así como la pérdida de interacciones entre las células y la matriz extracelular. Un avance importante en las técnicas de cultivo celular ha sido la introducción de los sistemas de cultivo tridimensionales que permiten un acercamiento más fiel al tejido invivo que el cultivo en monocapa”.

Cholesterol is an important component of cell plasma membrane. Due to its chemical composition (long rigid hydrophobic chain and a small polar hydroxyl group), it fits most of its structure into the lipid bilayer, where its steroid rings are in close proximity and attracted to the hydrocarbon chains of neighboring lipids. This gives a condensing effect on the packing of lipids in cell membranes creating cholesterol-enriched regions called membrane rafts, which also congregate a lot of specific proteins. Membrane rafts have been shown to work as platforms involved with signaling in diverse cellular processes, such as immune regulation, cell cycle control, membrane trafficking and fusion events. A series of studies in the last two decades have linked many of these functions with the effects of membrane cholesterol content and rafts integrity on actin cytoskeleton organization, as well as its consequences in cellular biomechanics. This was possible by using microscopy techniques before and after manipulation of cholesterol content from cell plasma membrane, using agents that are able to sequester these molecules, such as cyclodextrins. In this review we’ll give a personal perspective on these studies and how microscopy techniques were important to unravel the effects of cholesterol on actin and cellular mechanics. We will also discuss how actin and cholesterol contributes to control cell secretion and vesicular trafficking. O colesterol é um componente importante da membrana plasmática da célula. Devido à sua composição química (longa cadeia hidrofóbica rígida e um pequeno grupo hidroxila polar), ele se encaixa a maior parte de sua estrutura na bicamada lipídica, onde estão seus anéis esteróides em estreita proximidade e atraídos para as cadeias de hidrocarbonetos de lipídios vizinhos. Isso dá um efeito de condensação na embalagem de lipídios nas membranas celulares, criando regiões enriquecidas com colesterol chamadas jangadas de membrana, que também reúnem uma grande quantidade de proteínas. Já foi demonstrado que jangadas de membrana funcionam como plataformas envolvidas com a sinalização em diversos processos celulares, como regulação imunológica, controle do ciclo celular, tráfego de membrana e eventos de fusão. Uma série de estudos nas últimas duas décadas têm relacionou muitas dessas funções com os efeitos do conteúdo de colesterol da membrana e integridade das jangadas na organização do citoesqueleto de actina, bem como suas consequências na biomecânica celular. Isso foi possível usando técnicas de microscopia antes e após a manipulação do conteúdo de colesterol da membrana plasmática da célula, usando agentes que são capazes de sequestrar essas moléculas, como ciclodextrinas. Nesta revisão, daremos uma perspectiva pessoal sobre esses estudos e como as técnicas de microscopia eram importante para desvendar os efeitos do colesterol na actina e na mecânica celular. Também discutiremos como a actina e o colesterol contribui para o controle da secreção celular e do tráfico vesicular. Mais sobre o texto originalÉ necessário fornecer o texto original para ver mais informações sobre a tradução Enviar feedback Painéis laterais

Programa de Doctorado en Biotecnología, Ingeniería y Tecnología Química, Línea de Investigación: Modelos Animales en Biotecnología y Biomedicina, Clave Programa: DBI, Código Línea: 22, The nuclear envelope (NE) is a hallmark of eukaryotic cells. It is composed by four major components: the inner and outer nuclear membranes (INM and ONM respectively), the nuclear lamina (NL) and the nuclear pore complexes (NPCs; Hetzer, 2010). Apart from the regulation of macromolecules transport between the nucleus and the cytoplasm, it is becoming increasingly clear that the NE plays a crucial role in nuclear organization and gene expression. Specific chromatin domains are anchored to the NE, which generally is associated with formation of heterochromatin and transcriptional silencing. Reflecting the importance of NE functions, alterations in its structure are associated with a broad range of human diseases, often referred to as laminopathies, and include cardiomyopathy, muscular dystrophy, neurological disorders, lipodystrophy and premature ageing. An example is Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD), which was initially linked to mutations in the EMD gene encoding the inner nuclear membrane protein emerin, but can also be caused by mutations in the nuclear lamina protein LMNA, SUN1, SUN2, SYNE1, SYNE2 and TMEM43. Since most NE proteins are ubiquitously expressed, a main challenge is to understand how laminopathy mutations result in tissue-specific phenotypes. It is hypothesized that tissue-specific alteration in nuclear organization might be responsible for particular symptoms of laminopathies. This thesis is focused on the INM protein EMR-1, the Caenorhabditis elegans ortholog of emerin. Recently, we found that EMR-1 is enriched in contractile tissues and is required for correct neuromuscular junction activity as shown by hypersensitivity to the cholinesterase inhibitor aldicarb (Gonzalez-Aguilera et al., 2014). DamID experiments demonstrated that emerin is enriched at genes involved in muscle and neuronal function and deletion of emerin causes local changes in nuclear architecture. Moreover, transcriptome analyses revealed that emerin is associated with gene repression, particularly of genes implicated in muscle and nervous system function (Gonzalez-Aguilera et al., 2014). Based on these results, we suggested that emerin might regulate nuclear organization in a tissue-specific manner. Analyses of tissue-specific interaction profiles between chromatin and NE proteins (EMR-1 and LMN-1) are relevant to understand the role of EMR-1 in the NMJ activity, but it has not been explored so far in intact organisms due to technical limitations. To characterize the role of emerin in nuclear organization during development in a tissue-specific way we developed a FLP-Frt recombination-based DamID system in the nematode Caenorhabditis elegans, which enables the identification of global NE-chromatin contacts in specific ectodermal, mesodermal and endodermal tissues in the physiological context of an intact animal. On a different topic, it has been reported that NE morphology is prone to suffer from changes during normal aging and in progeria patients. Again, we proposed that alterations in nuclear organization through development and aging may have an impact on the aging-associated disorders. To characterize the changes in chromatin organization during aging, the already optimized FLP-Frt system has been used to perform temporal DamID in young vs. old animals. Finally, Susan Gasser¿s laboratory showed that the chromodomain protein CEC-4 bound to the INM is required for peripheral anchoring of heterochromatin in embryonic cells via H3K9me. However, during differentiation, a second heterochromatin-sequestering pathway is induced. An RNA interference screen in the cec-4 background identified the chromodomain protein MRG-1 as a broadly expressed factor responsible of heterochromatin positioning during differentiation of intestinal cells via H3K36me. Since MRG-1 is exclusively bound to euchromatin, these results suggest that MRG-1 acts indirectly. Again, analyses of nuclear organization in WT, single and double mutants are relevant to understand the role of CEC-4 and MRG-1 in heterochromatin positioning during differentiation. Thus, the main goal of this thesis is to explore the association between EMR-1 and chromatin during development in a tissue-specific manner as well as during aging, using the novel FLP-Frt based toolkit developed in this study., Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímica, Postprint

En las células animales, la membrana citoplasmática es la única estructura que se encuentra en contacto directo con el espacio extracelular. Esta membrana actúa como un límite efectivo que permite la coexistencia de dos espacios adyacentes de diferente composición: el líquido intracelular y el líquido extracelular. Los procesos celulares consumen sustratos y generan desechos constantemente, por lo que el mantenimiento de la constancia de la composición química del medio intracelular requiere un continuo intercambio de materia con el medio extracelular. Además, muchos de estos procesos celulares son regulados por señales que llegan desde el exterior celular. Es a través de la membrana citoplasmática que se produce el intercambio de materia e información con el medio circundante. La capacidad de la membrana citoplasmática de actuar como barrera efectiva entre dos compartimentos acuosos está dada principalmente por su componente mayoritario, una doble capa de fosfolípidos que limita el pasaje de sustancias polares desde un compartimento hacia el otro. Fil: Mobili, Pablo. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; Argentina Fil: Enrique, Nicolás Jorge. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata; Argentina

Programa de Doctorado en Biotecnología, Ingeniería y Tecnología, Línea de Investigación: Biología Celular, Molecular e Ingeniería Genética, Clave Programa: DBI, Código Línea: 8, MERRF (del inglés, Myoclonic Epilepsy with Ragged-Red Fibers) es una de las enfermedades mitocondriales más comunes, principalmente causada por la mutación m.8344A>G en el ADN mitocondrial. Esta mutación afecta a la traducción de proteínas codificadas por el ADN mitocondrial; por lo tanto, el ensamblaje de los complejos de la cadena de transporte de electrones está alterado, provocando una disminución de la función respiratoria mitocondrial. En esta tesis se estudia cómo el flujo autofágico y la degradación selectiva de mitocondrias disfuncionales (mitofagia) son mecanismos esenciales para el balance entre supervivencia y muerte celular en esta enfermedad. Evaluamos los flujos autofágico y mitofágico en cíbridos transmitocondriales y fibroblastos dérmicos procedentes de pacientes con síndrome MERRF, observando que la mitofagia mediada por Parkina está aumentada en los cultivos celulares MERRF con la mutación m.8344A>G. Nuestros resultados sugieren que el tratamiento con coenzima Q10 (CoQ) previene la translocación de Parkina a la mitocondria. Además, la CoQ actúa como un acelerador del flujo autofágico y mitofágico, mejorando la fisiopatología celular. Nuestros hallazgos respaldan la hipótesis de que una autofagia y mitofagia mediada por Parkina reguladas actúan como un mecanismo de supervivencia celular en un contexto de disfunción mitocondrial. Sin embargo, el uso de cíbridos y fibroblastos dérmicos como modelos celulares del síndrome MERRF presenta desventajas, ya que no son las células más afectadas en los pacientes y no son demasiado vulnerables a defectos dependientes de la falta de energía provocada por la disfunción mitocondrial. Por esta razón, en esta tesis se presenta la generación de neuronas inducidas mediante reprogramación celular directa a partir de fibroblastos dérmicos de pacientes con la mutación m.8344A>G. La caracterización fisiopatológica de las neuronas inducidas MERRF indica que éstas pueden constituir un excelente modelo para dilucidar los mecanismos moleculares de la enfermedad, así como una plataforma de cribado para el estudio de moléculas que puedan corregir su fenotipo., Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. Departamento de Fisiología, Anatomía y Biología Celular, Postprint

La capacidad de las células de recibir, procesar y enviar información entre ellas, les permite a los organismos multicelulares responder eficientemente a cambios en el medio externo o en el medio interno, de manera tal de mantener la homeostasis. En un organismo multicelular las células pueden comunicarse entre sí de diversas maneras, que podemos agrupar en dos categorías principales: señales químicas y señales eléctricas. Fil: Leon, Ignacio Esteban. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Química Inorgánica "Dr. Pedro J. Aymonino". Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Química Inorgánica "Dr. Pedro J. Aymonino"; Argentina Fil: Tolosa, María José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Mobili, Pablo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Tesis Univ. Granada. Departamento de Ciencias Morfológicas. Leída el 6 de abril del 2011

[eng] Vesicle trafficking is fundamental to distribute correctly lipids and proteins among cellular compartments. A complex network of interconnected pathways transport vesicles between organelles to satisfy the cellular demand. Multisubunit Tethering Complexes (MTCs) form a group of 9 protein assemblies that are conserved from yeast to human and that are essential for intracellular trafficking: Exocyst, Dsl1, COG, GARP, HOPS, Corvet, TRAPPI, TRAPPII and TRAPPIII. Each MTC recognizes a specific type of vesicle and tether it to the appropriate acceptor membrane, providing specificity and directionality to the trafficking. My research aimed to do a comparative analysis among all MTCs to shed light on the mechanism of action of these complexes. In my group we have developed PICT (Protein interaction from Imaging of Complexes after Translocation), a high sensitivity technique that allows us to study interactions between two proteins using live-cell imaging. We first conducted an in silico genome-wide screen to identify those proteins that could be functionally related to MTCs. We then used PICT for the protein interactions screen with the proteins selected in the in silico analysis. Given the high sensitivity of the assay and that the experiments were done directly in living cells, this method was prompt to detect interactions that have been overlooked by previous analysis, such as indirect, transient or low abundant interactions. I found that MTCs establish a network of interactions with P4-ATPases, lipid flippases that translocate phospholipids to the cytosolic leaflet of the membranes. P4-ATPases maintain the asymmetric distribution of phospholipids and they also play essential roles in vesicle trafficking. In yeast, there are 5 different P4-ATPases: Dnf1, Dnf2, Dnf2, Drs2 and NeoI. Dnf1 and Drs2 are the ones that concentrate most of the interactions with MTCs, mainly GARP and the TRAPPs. Up to date, no study had observed that MTCs and P4-ATPases might function together. In this Thesis I investigated the molecular mechanism that mediates the interplay in this network of essential components for the trafficking machinery. I found that GARP is responsible to transport Dnf1 from late endosomes to trans-Golgi network during the recycling of Dnf1 to the plasma membrane, a transport step that is essential to maintain the correct distribution of PE in the plasma membrane. Furthermore, I have found that Drs2 is required for the proper functioning of the Cytoplasm-to-Vacuole Targeting (Cvt) pathway, a model historically used to study selective autophagy. When the Cvt pathway is triggered, both TRAPIII and a transmembrane protein named Atg9 reach the phagophore assembly site (PAS) to start the process. The results of my thesis show that, in response to a temperature decrease, the cell induces the binding between TRAPPIII and Drs2 and that this interaction is required to sustain the adequate transport of Atg9 to the PAS. In line with this, I have seen Drs2 is fundamental for the biogenesis of vesicles loaded with Atg9 from endocytic compartments. Altogether, this data evidences a new function of this flippase in the Cvt pathway that might have important implications in other types of autophagy. Additionally, I identified a short motif in the N-terminal tail of Drs2 that is required for the interaction TRAPPIII-Drs2. This is a motif highly conserved among P4-ATPases and other proteins that bind MTCs, what suggests that it might have a more general role in regulating the trafficking of vesicles that remains to be elucidated.

[eng] Transportome alterations have been associated with oncogenesis. The loss of human Concentrative Nucleoside Transporter 1 (hCNT1) during carcinogenesis seems to be a relatively common event in tumors and might by itself contributing to oncogenesis. In fact, hCNT1 can play a dual role in cell biology being a nucleoside and nucleoside-derived drug transporter but also an important player in the modulation of a variety of cellular functions. Accordingly, we have previously reported that hCNT1 function is able to induce physiological changes that are relevant to tumor biology in a transport independent-manner. These observations argued in favor of hCNT1 being a transceptor protein. Thus, in this thesis we focused our study on the role of hCNT1 in cell physiology beyond the mere nucleoside salvage. We found that hCNT1 is able to induce antiproliferative effects in different tumor backgrounds, and its restitution in Hepatocellular carcinoma (HCC) derived cell lines alters several different signaling cascades that are important to many physiological functions of the cell, including cell survival and cell migration. Moreover, hCNT1-induced cell death seems to be triggered by an increase in intracellular Ca2+ levels, which might be related to the interaction of the Ca2+-binding protein S100A11 with hCNT1.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Com o presente estudo, buscamos compreender como ocorre o ensino de Biologia Celular nas escolas públicas de ensino médio nos estados de Goiás e Minas Gerais. Sendo assim, realizamos pesquisa de natureza qualitativa estruturada em etapas contínuas e interligadas. Foram realizadas as seguintes etapas: aplicação de questionários a alunos/as de ensino médio de escolas públicas de um município de Goiás; curso de formação de professores/as, executado em duas edições, sendo uma em Goiás e outra em Minas Gerais, nos quais obtivemos a colaboração de sete e onze professores/as, respectivamente; e acompanhamento, durante um ano letivo, da prática pedagógica de um professor de escola pública de Goiás, em turma de 1ª série de ensino médio. Analisamos os questionários e as falas de professores/as e alunos/as, triangulando as informações obtidas em todas as etapas da pesquisa com as informações do grupo focal, dos livros didáticos utilizados por esses/as docentes e traçamos a discussão em face à produção acadêmica na área de ensino de Biologia Celular e de Biologia. Os frutos desta pesquisa revelaram que a maior parte dos/as alunos/as concebia célula como estrutura redonda, plana, constituída por membrana, citoplasma, núcleo e com algumas organelas, sob um enfoque meramente utilitário. Também verificamos que esses/as discentes tinham dificuldade na diferenciação entre célula vegetal e animal, alegando padrões de complexidade, presença ou ausência de componentes como fatores dessa diferença, como os materiais genéticos DNA e RNA. Outra constatação foi o tipo de linguagem utilizada pelos/as professores/as ou livros didáticos, a qual é baseada no emprego de analogias, simplificações e reducionismos como forma de auxílio à aprendizagem, ocasionando o surgimento de conceitos distorcidos e/ou errôneos sobre os conteúdos de Biologia Celular. Durante os cursos de formação e na pesquisa de campo junto às escolas de ensino médio, tivemos períodos proveitosos de discussão sobre a prática pedagógica, a reflexão sobre a ação e na ação, que proporcionaram momentos valorosos ao desenvolvimento profissional. Portanto, enfatizamos a necessidade de sistematização dos conteúdos de Biologia Celular de forma integrada e a importância da formação continuada como recursos imprescindíveis para a qualidade do processo de ensino-aprendizagem de Biologia Celular. This study analyzes how Cell Biology is taught in public high schools in the Brazilian states of Goiás and Minas Gerais. We conducted a qualitative research study consisted of continuous, connected stages: first we applied questionnaires to students at public high schools of a municipality of the state of Goiás; next we promoted a teacher training course in two editions, one in Goiás and the other in Minas Gerais, with the collaboration of seven and eleven teachers, respectively; also, we followed up the teaching practice of a teacher at a public school in Goiás for one year, in the first year of high school. We analyzed the questionnaires and the students’ and teachers’ testimonies, and we triangulated the data collected in all the survey stages with the information from the focal group and the textbooks used by teachers. Then we outlined a discussion on the academic production in the field of teaching Cell Biology and Biology. The results indicated that most students understood cells as circular, flat structures, consisted of membrane, cytoplasm, nucleus, and some organelles with particular functions. We also noticed that these students had difficulties to differ vegetal and animal cells; they pointed out complexities determined by the presence or absence of some components in each cell type, such as the genetic materials DNA and RNA. Another finding approached the language register used by teachers or textbooks, which employed analogies, simplifications and reductionism to help students learn the subject; however, this language resulted in distorted and/or wrong concepts about Cell Biology. During the training courses and the field research at high schools, we had profitable discussions on the teaching practice: reflections on action and in action promoted valuable moments for professional development. Therefore, we emphasize the necessity to systematize subjects on Cell Biology as a whole and to invest on continuous training for teachers by providing indispensable resources to improve the teaching-learning process on Cell Biology. Tese (Doutorado)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. A cromatina é uma estrutura fundamental para a fisiologia celular e pode ser regulada através de uma variedade de pequenas moléculas e proteínas que, em sua maioria, atuam em nível nucleossomal. A competição entre diferentes Proteínas Ligantes de Nucleossomo (NBPs) ajudam a definir o estado final da cromatina. Embora toda a superfície do nucleossomo seja alvo de diferentes NBPs, uma região conhecida como patch acídico é o alvo preferêncial dessas moléculas. A fim de compreender como o impacto que NBPs tem sob o nucleossomo o ensaio de thermal shift foi feito para desvendar como diferentes NBPs afetam a estabilidade desse complexo. Foram utilizadas peptídeos baseados nas NBPs identificadas que se ligam aos nucleossomos conhecidos como Nucleosome Biding Molecules (NBMs). Foi observado que diferentes sítios de ligação que NBMs fazem com o patch acídico induzem diferentes desfechos na desnaturação do nucleossomo. Assim, foi possível criar um mapa das regiões vitais da superfície do nucleossomo responsável pela estabilidade do complexo utilizando os dados estruturais (PDB) do nucleossomo:NBPs, que futuramente pode será utilizado para o desenho racional de fármacos. The chromatin is a fundamental structure for the cell physiology. It can be regulated trough a variety of small molecules and proteins, most of which acting at a nucleosomal level. The competition among Nucleosome Binding Proteins (NBPs) binding help to define the final chromatin architecture. Although the entire nucleosome surface has been explored by several NBPs, a region known as the acidic patch is at the preferable target. In order to understand how the NBPs impact the nucleosome, thermal shift assay was conducted to understand how different NBPs influence over the stability fo the complex. We used peptides based on the structure of NBPs known as Nucleosome Biding Molecules (NBMs). We were able to identify biding sites that NBMs interact with the acidic patch and induce several denaturation outcomes of the nucleosome. Herein it was possible to create a map of the vital regions of the surface of the nucleosome responsable for the stability of the complex, using structural data (PDB) of the nucleosome:NBPs, that in the future can be used in rational drug design.

[spa] La adherencia a la Dieta Mediterránea se ha asociado a una disminución de enfermedades de alta prevalencia como el cáncer colorrectal, y este hecho se ha relacionado con el consumo moderado de vino y aceite de oliva, que son dos alimentos característicos de la Dieta Mediterránea. Ambos alimentos son una mezcla compleja de numerosos componentes con estructura y características fisicoquímicas diversas, entre los que destacan los polifenoles. Los estilbenos y los tirosoles son polifenoles que se encuentran presentes en pocos alimentos, entre los que se incluyen el vino y el aceite de oliva. El objetivo de este trabajo ha sido estudiar el papel de componentes bioactivos del vino y el aceite de oliva en el control del crecimiento de células epiteliales intestinales. Para ello, como modelo experimental se utilizó una línea celular procedente de un adenocarcinoma humano denominada Caco-2. El resveratrol (RV), que es un polifenol representativo del vino, es capaz de regular el crecimiento de las células epiteliales intestinales in vitro a concentraciones que no se alcanzan en plasma tras un consumo moderado de vino, dado que esta molécula se metaboliza muy rápidamente. En este sentido, los resultados muestran que los metabolitos sulfatados y glucuronidados del RV mantienen la capacidad antioxidante de este, así como la de inhibir el crecimiento y de inducir apoptosis. El trans-piceido, que es el glucósido del RV presente en concentraciones elevadas en el vino, presenta un efecto antioxidante, una actividad antimitogénica y pro-apoptótica sobre las células Caco-2 similar a la del RV. Además se observó que la capacidad antioxidante del RV está relacionada con la presencia de grupos hidroxilo en posición 3, 5 y 4’. Aunque es este último hidroxilo el determinante de dicha actividad antioxidante. La sustitución de estos hidroxilos por grupos cloro o metoxi, a pesar de reducir su actividad antioxidante, conserva sus efectos biológicos sobre el crecimiento de las células Caco-2. Los ácidos grasos monoinsaturados, y en especial el ácido oleico, que es el ácido graso mayoritario del aceite de oliva, inducen el crecimiento de las Caco-2, probablemente a través de la síntesis de metabolitos por la vía de las lipoxigenasas. Algunos ácidos grasos poliinsaturados, como el eicosapentaenoico y el docosahexaenoico, presentaron un efecto dual, ya que a baja concentración indujeron la proliferación celular, pudiendo estar implicados en este efecto las prostaglandinas y los ácidos hidroxieicosapentaenoicos. Mientras que una concentración alta de estos ácidos grasos poliinsaturados tuvo un efecto opuesto sobre el crecimiento celular e indujo apoptosis. Es interesante señalar que el efecto mitogénico del ácido oleico fue revertido por diversos componentes minoritarios del aceite de oliva como el hidroxitirosol, la oleuropeina, el escualeno, el ácido maslínico y el pinoresinol. Algunos de los cuales inhibieron la liberación de ácido araquidónico y la síntesis de eicosanoides, elementos implicados en el control del crecimiento de las células epiteliales intestinales. En conclusión, la cantidad y el tipo de ácidos grasos consumidos junto con los componentes minoritarios del vino y del aceite de oliva, así como sus metabolitos, pueden tener un importante papel en el control de la cascada del ácido araquidónico y de la proliferación de células epiteliales intestinales Caco-2., [eng] Adherence to Mediterranean Diet has been associated with colorectal cancer prevention, this fact has been linked to moderate consumption of wine and olive oil, two characteristic foods of Mediterranean Diet. Both are a complex mixture of components among which polyphenols stand out. Stilbenes and tyrosols are polyphenols present in wine and olive oil. The objective of this work was to study the effect of bioactive components of wine and olive oil on intestinal epithelial cell growth. For this purpose, Caco-2 cells ware used as experimental model. Resveratrol (RV), a polyphenol representative of wine, is able to regulate intestinal epithelial cells growth in vitro and sulphated and glucuronidated RV metabolites maintain their antioxidant, antiproliferative and apoptotic activity. Trans-piceid is the RV aglycone more present in wine, has antioxidant, anti-mitotic and pro-apoptotic effect similar to that of RV. The antioxidant capacity of RV is related to the presence of hydroxyl groups in 3, 5 and 4 'position, been the last determinant for this activity. The substitution of these hydroxyls for chloro or methoxy groups, despite reducing their antioxidant activity, retains its biological effects on Caco-2 cells growth. Monounsaturated fatty acids, and especially oleic acid, which is the major fatty acid in olive oil, induce Caco-2 cell growth, probably through the synthesis of metabolites from lipoxygenase pathway. Some polyunsaturated fatty acids (PUFA), such as eicosapentaenoic and docosahexaenoic, had a dual effect, since at low concentration they induced cell proliferation, while at high concentration these PUFA had an opposite effect on cell growth and induced apoptosis. Is interesting to note that the mitogenic effect of oleic acid was reversed by some minor components of olive oil such as hydroxytyrosol, oleuropein, squalene, maslinic acid and pinoresinol. Some of which inhibited the release of arachidonic acid and the synthesis of eicosanoids, elements involved in the control of intestinal epithelial cells growth. In conclusion, the amount and type of fatty acids consumed together with minor components of wine and olive oil, as well as their metabolites, may play an important role in arachidonic acid cascade regulation and intestinal epithelial Caco-2 cell proliferation.

Microalgae have been the focus of great interest for the biofuels production due to its enormous capacity to produce biomass, and because many species produce fatty acids in amounts many times the various oleaginous plants. Many microalgae also act as efficient bioremediators domestic and industrial residues, so integrated cultivation of promising microalgae for biofuels coupled to wastewater treatment systems can provide several benefits including cost reductions in effluents treatment and biomass microalgal production, cheapening the culture, promoting nutrient removal and minimizing environmental impacts. This research aimed to evaluate the effectiveness of regional microalgae act in the bioremediation of three types of effluents: biodiesel washing water, shrimp wastewater and agricultural drainage water using potentially promising species for the production of biodiesel that can grow in these effluents as a culture medium . Were used 12 isolated species of microalgae various aquatic environments in northeastern Brazil with 11 freshwater and 1 marine. The selection of species was made considering those which produce substantial amounts of fatty acids, with some even superior to soy. The experiments were performed in chambre culture (25 ± 1 ° C, photoperiod of 12h) in balloons 6L capacity with continuous aeration. The growth of the species under the conditions tested was accompanied by cell counts and measurement of fluorescence in vivo and the physiological responses by flow cytometry. In the effluent were determined NO3, NO2, PO4, pH, COD, turbidity, electrical conductivity and total solids using analytical procedures and/or multiparameter probe. In biodiesel washing water 11 species were tested, only two of which showed good growth. Of these, Monoraphidium contortum was selected for the bioremediation tests due to its higher capacity for growth and be the second species with a higher content of fatty acids. It was found that the species reduces the concentration of NO3, PO4, and COD in percentages of 25.8%, 7.2% and 31.2%, respectively. In shrimp farming water the genus Amphora sp. it showed considerable growth, but lower than the control, but with higher production lipids. Removal PO4, NO3 and NO2 in this species in this effluent was 73.357%, 72.572% and 66.667%, respectively. In agricultural drainage water were tested of which 11 species. Monoraphidium contortum was selected for the bioremediation test and biomass production and yield of the final number of cells in this experimental condition were lower than the control. In this kind effluent removed approximately 73% and 100% for respectively NO3 and PO4. Comparisons of physiological responses showed cell concentrations, florescence chlorophyll and activity of higher esterase in control and increased production of lipids in the drainage water The data show it is possible to use these effluents in the cultivation of microalgae important for biodiesel production with effective reduction of nutrients present in wastewater and that, depending on the species, the effluent may offer favorable conditions for increased production of lipids. However, microalgal cultures in these effluents can be double interest: to minimize environmental impact and producing microalgal biomass that can be used to produce biodiesel, or other byproducts of interest to the biotechnology, thereby reducing production costs in mass culture. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES As microalgas têm sido foco de grande interesse para a produção de biocombustíveis devido a sua enorme capacidade de produzir biomassa, e pelo fato de muitas espécies produzirem ácidos graxos em quantidades muitas vezes superiores à várias oleaginosas. Muitas microalgas também atuam como eficientes biorremediadores de resíduos domésticos e agroindustriais, de maneira que sistemas integrados de cultivo de microalgas promissoras para a produção de biocombustíveis acoplados ao tratamento de efluentes podem apresentar vários benefícios incluindo redução de custos no tratamento de águas residuais e produção de biomassa microalgal, barateando os cultivos, promovendo remoção de nutrientes e minimizando impactos ambientais. Esta pesquisa visou avaliar a efetividade de microalgas regionais atuarem na biorremediação de três tipos de efluentes: água de lavagem de biodiesel, efluente de carcinicultura e água de drenagem agrícola, utilizando espécies potencialmente promissoras à produção de biodiesel que podem crescer nesses efluentes como meio de cultura. Foram utilizadas 12 espécies de microalgas isoladas de vários ambientes aquáticos do Nordeste do Brasil sendo 11 dulcícolas e uma marinha. A seleção das espécies foi feita considerando-se aquelas que produzem substanciais quantidades de ácidos graxos, com algumas inclusive superiores à soja. Os experimentos foram realizados em câmara de cultura climatizada (25 ± 1 ºC, fotoperíodo de 12h) em balões de 6L de capacidade com aeração contínua. O crescimento das espécies nas condições testadas foi acompanhado por contagens celular e medidas da fluorescência in vivo e as respostas fisiológicas por citometria de fluxo. Nos efluentes foram determinados os teores de NO3, NO2, PO4, pH, DQO, turbidez, condutividade elétrica e sólidos totais usando procedimentos analíticos e/ou sonda multiparâmetros. Em água de lavagem de biodiesel foram testadas 11 espécies, das quais apenas duas apresentaram bom crescimento. Destas, Monoraphidium contortum foi selecionada para os testes de biorremediação por apresentar maior capacidade de crescimento e ser a segunda espécie com maior teor de ácidos graxos. Constatou-se que esta espécie reduz as concentrações de NO3, PO4, e DQO nas porcentagens de 25,8%, 7,2% e 31,2%, respectivamente. Em água de carcinicultura o gênero Amphora sp. mostrou crescimento considerável, porém inferior ao controle com produção de lipídeos superior. A remoção de PO4, NO3 e NO2 por esta espécie nesse efluente foi de 73,357%, 72,572% e 66,667%, respectivamente. Em água de drenagem agrícola foram testadas 11 espécies das quais M. contortum foi selecionada para o ensaio de biorremediação e sua produção de biomassa e o rendimento final em número de células nesta condição experimental foram inferiores ao controle. Neste efluente essa espécie removeu aproximadamente 73% de NO3 e 100% de PO4. As comparações das respostas fisiológicas demonstraram concentrações celulares, florescência da clorofila e atividade da esterase mais elevadas no controle e maior produção de lipídeos no efluente. Os dados mostram ser possível a utilização desses efluentes no cultivo de microalgas importantes à produção de biodiesel com reduções efetivas dos nutrientes presentes na água residual e que, dependendo da espécie, os efluentes podem oferecer condições favoráveis a uma maior produção de lipídeos. Contudo, os cultivos de microalgas nesses efluentes podem ter duplo interesse: minimizar impactos ambientais e produzir biomassa microalgal que pode ser usada para produção de biodiesel ou outros coprodutos de interesse à biotecnologia, reduzindo assim os custos de produção em cultivos em massa.

Voltage dependent potassium channels are a group of plasma membrane ion channels with a key role in the immune system as the predominant ion channels controlling the resting membrane potential and tuning intracellular Ca2+ signaling in lymphocytes, monocytes, macrophages, and dendritic cells. Leukocytes present a limited Kv repertoire, including Kv1.3 and Kv1.5 channel isoforms. Kv1.3 is expressed in the immune system, and the blockade of this channel is associated with selective inhibition of T cell activation and proliferation. A functional Kv channel is an oligomeric complex composed of pore-forming and ancillary subunits. The KCNE gene family (KCNE1-5) is a novel group of modulatory Kv channel elements expressed in several tissues including leukocytes. KCNE peptides are small single spanning membrane proteins known to modulate Kv channels trafficking and biophysical properties. The hypothesis of the present PhD thesis entitled “Kv1.3 and Kv1.5 channels in leukocytes” was that changes in the channelosome composition by modulating the heterooligomeric combinations of the Kv1.3 channelosome control physiological and neoplastic cell growth as well as leukocyte responses. Evidence suggests that Kv channels are involved in cell differentiation and cell cycle control (because non-specific drugs, such as 4-AP and TEA, impaire proliferation), and they are also known to be remodeled during carcinogenesis. Thus, we elucidated the role of Kv1.3 and Kv1.5 channels in cell growth and their relationship with cancer, in models such as B lymphocytes and lymphomas (non-Hodgkin lymphomas), pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) and glioblastomas. In spite of its significance, the mechanisms that regulate Kv1.3 and its role in the T cell activation are not well known. To that end, we analyzed the expression of KCNEs ancillary subunits upon different states of activation and proliferation of leukocytes (macrophages, T and B lymphocytes). In addition, recent data from our laboratory demonstrate that KCNE4, acting as a dominant negative ancillary subunit, physically interacts with Kv1.3 inhibiting K+ currents and retaining the channel intracellularly. Therefore, we studied the Kv1.3 modulation by the auxiliary subunit KCNE4 in leukocytes.

Programa de Doctorado en Biotecnología, Ingeniería y Tecnología Química, Línea de Investigación: Fundamentos y Aplicaciones de las Células Troncales, Clave Programa: DBI, Código Línea: 17, Nuestro laboratorio ha desarrollado un protocolo para la diferenciación hacia endodermo de las células madre embrionarias de ratón (CME), que consiste en exponer las células a altas concentraciones de un donador de óxido nítrico (NO) durante 19 horas. Este tratamiento suprime la expresión de genes de pluripotencia como Oct4 y Nanog, e induce la expresión de marcadores de endodermo definitivo como Pdx1. Se observó un aumento de Zic1, por lo que se decidió estudiar este gen en el proceso de diferenciación hacia endodermo. El objetivo de este estudio es determinar si Zic1 está regulado por el NO, y si este gen tiene un papel en la regulación de la vía Sonic hedgehog (Shh) en CME de ratón relacionados con el desarrollo de endodermo. Hemos demostrado que la expresión de Zic1 en presencia de NO aumentó. Además, hemos encontrado que el factor de transcripción Egr1 podría actuar como activador de la expresión de Zic1 después del tratamiento con NO. A continuación, hemos podido comprobar que Zic1 co-expresa con Pdx1 en las células tratadas con NO, en las células pancreáticas adultas y en el tejido del páncreas, lo que indica que puede estar involucrado en el proceso de diferenciación hacia endodermo en CME de ratón. Por último, se determinó que el tratamiento con NO suprime la vía de señalización de Shh, mediante la disminución de la expresión de los genes diana de la misma, lo cual fue confirmado mediante ensayos de ganancia de función de Zic1. Por otro lado, nuestro laboratorio proporcionan evidencia de un papel del NO a baja concentración en el control de la auto-renovación y diferenciación de células madre (JR Tejedo et al., 2010), que bloquea el proceso de diferenciación promovida por la ausencia de bFGF en CME humanas y disminuye la expresión de marcadores de diferenciación. Por lo tanto, el proyecto actual se centra específicamente en la descripción del desarrollo de un medio libre de suero con baja concentración de bFGF y suplementado con óxido nítrico para el cultivo de células madre mesenquimales humanas para aplicaciones terapéuticas. Hemos comprobado el mantenimiento de la morfología celular, la proliferación, la pluripotencia y la calidad de la célula. Se esta estudiando la posibilidad de escalar el cultivo celular con medios libre de suero a gran escala, para obtener el número de células necesario para los ensayos clínicos, apareciendo los biorreactores como una alternativa prometedora., Universidad Pablo de Olavide. Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímica

Tesis (Magíster en Biotecnología) El cobre es un micronutriente esencial para todos los seres vivos y es obtenido principalmente por medio de la dieta. Aunque el control homeostático del cobre es estrictamente regulado, existen varios factores que pueden llevar a su desbalance a nivel plasmático y celular produciendo una sobrecarga o una deficiencia de este mineral, las que no necesariamente están ligadas al consumo. Ejemplos extremos de ello son las enfermedades genéticas de Wilson y de Menkes, las cuales son producidas por mutaciones en los transportadores intracelulares de cobre generando una sobrecarga citotóxica en el hígado para el caso de la enfermedad de Wilson y una deficiencia sistémica, en la enfermedad de Menkes. Las alteraciones en la homeostasis de cobre también pueden ser adquiridas y si bien, no tan drásticas como las enfermedades genéticas, pueden causar alteraciones a nivel mitocondrial y metabólico los que han sido asociados a patologías cardiovasculares, neurológicas y hematopoyéticas que en casos extremos llegan incluso a la muerte. Ha sido observado que cambios en los niveles de cobre intracelular pueden influenciar los procesos de diferenciación y proliferación celular, lo que establece una relación directa con el cáncer y los procesos angiogénicos. En esta revisión se presenta el conocimiento actual sobre la regulación y transporte de este metal, y los efectos adversos que producen desregulaciones de éste.

Programa de Doctorado en Biotecnología, Ingeniería y Tecnología Química, Línea de Investigación: Biología del Desarrollo, Clave Programa: DBI, Código Línea: 9, Posiblemente la migración celular sea la función más conocida que se le asigna a la matriz extracelular (MEC) durante la embriogénesis. Sin embargo, poco se sabe de cómo la MEC regula la migración celular in vivo, ya que su estudio en el ambiente tridimensional de un organismo en desarrollo es complicado. Por ello, la mayoría del conocimiento que se tiene sobre el papel de la MEC en embriogénesis deriva de experimentos realizados con células u órganos en cultivo. Esta función de la MEC en migración celular durante la embriogénesis ha sido clásicamente atribuida a la MEC expuesta en el sustrato, matriz exógena. Sin embargo, experimentos realizados recientemente en células en cultivo, han revelado que las células al migrar también pueden usar una MEC endógena, secretada de manera autocrina. Sin embargo, se desconoce si esta capacidad de las células de usar su propia matriz para migrar se utiliza durante la embriogénesis. Por ello, en esta tesis doctoral se han usado los macrófagos de Drosophila melanogaster como sistema modelo para el estudio in vivo del papel de la MEC en migración celular durante la embriogénesis. En concreto, esta tesis se ha centrado en los siguientes aspectos. Por una parte, se ha estudiado el papel de las lamininas, principales componentes de la MEC, en la migración de los macrófagos in vivo. Por otra, se ha analizado la contribución de las lamininas endógenas y exógenas en este proceso de migración. Y finalmente, se han examinado los mecanismos moleculares y celulares por los cuales las lamininas regulan la migración de los macrófagos. Los resultados obtenidos demuestran que los macrófagos usan lamininas endógenas y exógenas para su migración a través del embrión. Si bien, se propone que estas dos fuentes de lamininas ejercen funciones distintas. Así, mientras que la Laminina endógena promovería la migración, la exógena tendría un papel más estructural, implicado en la correcta formación del espacio intersticial por el cual migran los macrófagos. También muestra que las lamininas regulan la direccionalidad y la estabilidad de las proyecciones de macrófagos al migrar. Además, se implica a las Rho GTPasas Rabs en la secreción de las lamininas. Así mismo, se plantea que uno de los mecanismos moleculares por el cual las lamininas regularían la migración de los macrófagos es mediante la modulación de la actividad de sus receptores las integrinas y el receptor de los factores guías, el PVR. Por último, se ha analizado el posible papel de otros componentes de la MEC, como Nidogen y Colágeno IV, en la migración de los macrófagos. Los resultados demuestran que si bien Colágeno IV se requiere, aunque en menor mediad que las lamininas, Nidogen es prescindible., Universidad Pablo de Olavide. Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímica

Fungal vacuoles are involved in a diverse range of cellular functions, participating in cellular homeostasis, degradation of intracellular components, and storage of ions and molecules. In recent years there has been a significant increase in the number of studies linking these organelles with the regulation of growth and control of cellular morphology, particularly in those fungal species able to undergo yeast-hypha morphogenetic transitions. This has contributed to the refinement of previously published protocols and the development of new techniques, particularly in the area of live-cell imaging of membrane trafficking events and vacuolar dynamics. The current review outlines recent advances in the imaging of fungal vacuoles and assays for characterization of trafficking pathways, and other physiological activities of this important cell organelle.

Tesis doctoral con la Mención de "Doctor Internacional", En la actualidad, existe en nuestra sociedad un interés creciente con respecto a los antioxidantes. En la presente Tesis examinaremos las acciones de diferentes antioxidantes, naturales y sintéticos, sobre la viabilidad y la funcionalidad en páncreas exocrino, astrocitos y células tumorales AR42J. Prestaremos especial atención a los cambios inducidos sobre la viabilidad celular, el ciclo celular, la homeostasis del ion Ca2+, la fisiología mitocondrial y los procesos secretores. Los antioxidantes elegidos han sido la melatonina y el ebselén. La melatonina no parece tener efectos negativos sobre la viabilidad celular, mientras que el ebselén la reduce en los modelos celulares en que se ha ensayado. Además, la melatonina y el ebselén presentan, a las concentraciones estudiadas y en los tipos celulares utilizados, efectos contrarios sobre la homeostasis del ion Ca2+. La melatonina, per se, no estimula la secreción de amilasa pancreática, pero reduce la secreción estimulada por el agonista pancreático CCK-8. No se han detectado cambios en los parámetros mitocondriales estudiados en las células acinares pancreáticas incubadas en presencia de melatonina. Por el contrario, el ebselén induce cambios importantes en la [Ca2+]m, en el potencial de membrana y en la integridad de la red mitocondrial, que podrían comprometer su función. A la vista de los resultados, creemos que no es posible generalizar y asumir que los antioxidantes, cualesquiera, tienen efectos positivos sobre el organismo., Nowadays, in our society an increasing interest on antioxidants exists. In this PhD thesis we will examine the effects of different antioxidants on cell viability and function, employing exocrine pancreatic cells, hippocampal astrocytes and AR42J tumor cells as cellular models. We will pay major attention to the changes induced by various antioxidants on cell viability, the cell cycle, Ca2+ homeostasis, mitochondrial physiology and the secretory processes.Melatonin and ebselen are the antioxidants chosen for this purpose. Melatonin does not exert deleterious effects on cell viability, whereas in the presence of ebselen a decrease in cell viability was observed in the cellular models in which it was tested. Moreover, melatonin and ebselen, at the concentrations evaluated and in the cellular models employed, depict opposite effects on Ca2+ homeostasis. Melatonin, itself, does not stimulate amylase release by pancreatic acinar cells, but reduces amylase secretion evoked by the pancreatic agonist CCK-8. No detectable changes in the mitochondrial parameters studied were observed in pancreatic acinar cells incubated with melatonin. Conversely, in astrocytes and AR42J cells, ebselen led to major changes in [Ca2+]m, in mitochondrial membrane potential, in mitochondrial membrane permeability and on mitochondrial network integrity, which could compromise their function. Therefore, we think that it is not possible by the moment to assume that antioxidants, any type, have beneficial effects on the body.

Programa de Doctorado en Biotecnología, Ingeniería y Tecnología Química, Línea de Investigación: Biología del Desarrollo, Clave Programa: DBI, Código Línea: 9, Las células eucarióticas presentan una distribución asimétrica de moléculas y orgánulos que genera diferentes regiones funcionales necesarias para la fisiología celular. La maquinaría de tráfico vesicular tiene un papel esencial en la formación de esta polaridad celular, estando ambos procesos regulados mutuamente para llevar a cabo los cambios en la morfología celular necesarios durante el desarrollo de un organismo. Dentro de la maquinaría de la polaridad celular, destaca la Proteína Quinasa C atípica (aPKC), una de las pocas quinasas implicada en el establecimiento y mantenimiento de la polaridad celular. aPKC participa en procesos como migración, división celular, supervivencia o proliferación; estando implicada además en diversos tipos de cáncer. La actividad de aPKC está regulada por interacción con otras proteínas que modifican su localización y/o regulan su actividad quinasa. Además, aPKC fosforila a multitud de substratos modificando su compartimiento. Estos interactores de aPKC son diferentes dependiendo del proceso celular, de modo que encontrar nuevas proteínas que interaccionen con aPKC resulta fundamental para entender mejor cómo funciona esta quinasa. En este trabajo he realizado una búsqueda bioquímica de nuevas proteínas que interaccionen con aPKC. Para ello he sobreexpresado en embriones de Drosophila la proteína aPKC fusionada a una serie de epítopos que me han permitido purificar complejos proteicos en condiciones nativas en los que aPKC participa. Usando esta metodología he aislado la proteína Nuclear fallout (Nuf) como un nuevo interactor de aPKC. Nuf es homólogo a Rab11-FIP3 de vertebrados y participa en el transporte de los endosomas de reciclaje (RE) a través de su interacción con Rab11 y las proteínas motoras Dineína y Kinesina. En esta tesis he demostrado que aPKC se une a Nuf directamente. Esta unión se produce entre la mitad N-terminal de Nuf y el dominio quinasa de aPKC, solo cuando aPKC está activa (autofosforilada). He identificado a Nuf como un nuevo substrato de aPKC. Dicha fosforilación se produce en la serina 155 y elimina la unión aPKC-Nuf, ya que la versión fosfomimética de Nuf (Nuf S155D) es incapaz de unirse a aPKC. En el disco imaginal de ala, cuyas células están altamente polarizadas en un eje apico-basal, he descubierto que la falta de función de aPKC produce una acumulación de Nuf y Rab11 en el córtex subapical, sugiriendo que aPKC afecta el tráfico de RE. Esto se debe al efecto de la fosforilación de aPKC en la localización subcelular de Nuf. La versión no fosforilable de Nuf (Nuf S155A) se acumula en la región subapical co-localizando con aPKC en la membrana plasmática, mientras que la versión fosfomimética Nuf S155D aparece en la región subapical pero evita el contacto con la membrana. También he observado que la sobreexpresión de Nuf S155A aumenta los niveles de aPKC en la membrana subapical, mientras que la falta de función de nuf produce una disminución aPKC en la membrana, lo que sugiere un transporte de aPKC vía Nuf. Esto lo he corroborado al eliminar la función de Sec5, Sec6 o Rab11, componentes de la ruta de reciclaje. En estas condiciones, aPKC se acumula intracelularmente y desaparece de las uniones celulares. Los resultados de este trabajo muestran la existencia de un reciclaje de aPKC en un tejido maduro, en el que aPKC es transportada hacia la membrana subapical vía Rab11-Nuf. Este reciclaje estaría regulado en una retroalimentación negativa por la propia aPKC, que fosforila a Nuf evitando su unión a la membrana., Universidad Pablo de Olavide. Escuela de Doctorado

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2015 La proteína StarD7 (START domain containing 7) pertenece a la superfamilia de proteínas con dominio START, que se caracteriza por unir y/o transportar moléculas lipofílicas, participando en el transporte, metabolismo y señalamiento intracelular lipídico. Mutaciones de alguno de los genes que codifican para estas proteínas con dominio START y/o modificaciones en la expresión están asociadas a procesos patológicos, desórdenes genéticos, enfermedades autoinmunes y tumores. En este trabajo de tesis se realizaron diferentes aproximaciones experimentales a los fines de comprender el rol de StarD7 en la fisiología celular. Se utilizaron modelos de líneas celulares trofoblásticas derivadas de coriocarcinoma (JEG-3 y BeWo), la línea HTR8/SVneo derivada de tejido placental de primer trimestre y otras líneas celulares epiteliales. Inicialmente se realizó en la línea celular JEG-3 un análisis global de la expresión de transcriptos evaluando el efecto del silenciamiento de StarD7. Los resultados demostraron expresión diferencial de un gran número de genes, entre estos: Cnx43, TWIST1, MBD2, TGFRII, ABCG2, THSD7A, SMURF2, KDELC1 y NID1 fueron validados mediante qRT-PCR. Estos hallazgos podrían conducir a identificar genes candidatos dependientes de StarD7 probablemente relacionados a su función celular. Se demostró, en todas las líneas celulares silenciadas con siRNA contra StarD7, una disminución en los niveles del transcripto y la proteína ABCG2 (ATP binding cassette subfamily G member 2) el cual codifica para un transportador de eflujo de lípidos/xenobióticos. Por el contrario se observó que la sobre-expresión de StarD7 aumenta los niveles proteicos de ABCG2, indicando una correlación positiva entre ambas proteínas. Además, las células deficientes de StarD7 presentaron una menor actividad del transportador y mayor susceptibilidad a la droga antineoplásica mitoxantrona. Ensayos de inmunofluorescencia y de microscopía electrónica en células silenciadas contra StarD7 revelaron fragmentación del aparato de Golgi con una marcada alteración en las estructuras subcelulares: con retículo endoplásmico (RE) dilatado, desorden en el sistema de endomembranas y numerosas mitocondrias con morfología anormal localizadas alrededor del núcleo. Estos resultados se acompañaron con una disminución en la biosíntesis de novo de fosfolípidos y cambios en la expresión de proteínas y genes involucrados en la respuesta de estrés del RE. Adicionalmente se demostró que las células silenciadas fueron más sensibles a una injuria estresora con una mayor producción de especies reactivas del oxígeno e incremento en los niveles de la enzima antioxidante hemo oxigenasa-1. Además, se observó que la depleción de StarD7 conduce a una disminución en la proliferación y migración celular, aumentando la adhesión celular. A su vez, en las líneas de origen trofoblástico JEG-3 y BeWo se observó un incremento en la diferenciación celular. Finalmente, ensayos de inmunoprecipitación de proteínas de células que sobre-expresan StarD7 y análisis de espectrometría de masa, permitieron identificar algunas proteínas que interactuarían con StarD7. Entre estas posibles moléculas se ubican ubiquitin ligasas tipo Cul3, proteínas adaptadoras de Cul3 (con dominios KLHL, BTB o KELCH, sugiriendo que StarD7 podría regular la actividad de Cul3. Adicionalmente StarD7 interactuaría con el complejo argonauta GW182 (TNRC6A y B). En resumen en este trabajo de tesis se ha demostrado que la proteína transportadora de lípidos StarD7 participa y contribuye a mantener tanto la homeostasis intracelular así como los procesos fisiológicos fundamentales de proliferación, migración y diferenciación celular. Estos hallazgos fueron confirmados en diferentes líneas epiteliales tanto de origen trofoblástico como no trofoblástico sugiriendo que StarD7 tiene un rol funcional conservado. Flores Martín, Jésica Belén. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Genti de Raimondi, Susana Del Valle. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Sánchez, María Cecilia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Borioli, Graciela A. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Caputto, Beatriz Leonor. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Jawerbaum, Alicia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos; Argentina.

Tesis Univ. Granada. Departamento de Biología Celular, Esta tesis doctoral ha sido realizada gracias a la beca predoctoral adscrita al Proyecto de Excelencia de la Junta de Andalucía CVI-3008 y el proyecto BFU2010-19981, de la Dirección General de Investigación Científica y Técnica, Ministerio de Economía y Competitividad.

Programa de Doctorado en Biotecnología y Tecnología Química, La apoptosis o muerte celular programada es un mecanismo fisiológico empleado por la mayoría de los organismos multicelulares para mantener la remodelación de tejidos durante el desarrollo, la homeostasis del tejido, la eliminación de células senescentes y la eliminación de células con alteraciones graves. La apoptosis se produce por vías complejas que implican señales bioquímicas que dependen en mayor o menor medida de la actividad de las caspasas y que conducen a la muerte celular programada a través de una serie de cambios celulares específicos y claramente diferenciados de la necrosis celular de tal modo que durante el desarrollo de la apoptosis todos los procesos de degradación celular se encuentran aislados del espacio extracelular por la membrana plasmática que permanecerá impermeable durante elproceso. Asi pues, la célula apoptótica sufre una serie de cambios morfológicos característicos que definen al proceso. La fase de ejecución se caracteriza por llevar asociadas una serie de características morfológicas y bioquímicas propias de la apoptosis tales como la contracción celular, la liberación de citocromo e, la activación de las caspasas, la condensación de la cromatina, la fragmentación del ADN y por supuesto una reorganización de los elementos del citoesqueleto entre los que se incluye la Red de Microtúbulos Apoptóticos también denominada RMA. De este modo, la RMA desempeña un papel fundamental en la preservación de la integridad de la membrana plasmática, una característica esencial en la fase de ejecución de la apoptosis de modo que la función principal de la RMA seria conseguir que la célula apoptótica se mantenga aislada para prevenir el daño a los tejidos circundantes. En este sentido y en el contexto de los organismos multicelulares, el aspecto más importante de la apoptosis implica que el proceso de muerte celularse de sin liberación de moléculas y elementos potencialmente patogénicos que puedan dañar a células vecinas evitando la activación de la respuesta inflamatoria. La formación de la RMA en la apoptosis durante el desarrollo y en el organismo adulto es un fenómeno esencial para la homeostasis tisular en los organismos pluricelulares. La RMA se forma en las células apoptóticas coordinadamente con la reorganización de los otros elementos del citoesqueleto. Los mecanismos de señalización de la formación y nucleación de estos microtúbulos apoptóticos son desconocidos e independientes de los típicos complejos de anillo de tubulina gamma (TuRC). En base a lo expuesto, esta tesis doctoral: 1.-Desarrolla y trata de explicar los aspectos que determinan la relación temporal y funcional de la RMA con los cambios en la organización del citoesqueleto (despolimerización temprana de los microtúbulos centrosómicos y la contracción de la actina) durante la fase de ejecución de la apoptosis. 2.-ldentifica las funciones de la RMA durante el proceso de apoptosis. 3.-Detenninar el mantenimiento y estabilidad de la RMA durante la fase de ejecución de la apoptosis y su relación con la potencial de membrana mitocondrial y toda la bioenergética celular. Concluyendo que: Bajo condiciones fisiológicas el citoesqueleto ayuda al mantenimiento de la integridad de la membrana plasmática. Los cambios que se producen durante la apoptosis en los principales componentes del citoesqueleto pueden contribuir a un incremento en la permeabilidad de la membrana plasmática. En la fase de ejecución de la apoptosis, los filamentos de actina y los microtúbulos son despolimerizados produciéndose posterionnente una reorganización de esos microtúbulos formando la RMA estableciéndose como elemento principal del citoesqueleto; presente y disponible para mantener la integridad de la membrana plasmática y la propia morfologla de la célula durante toda la apoptosis. De modo que el papel de los microtúbulos durante la fase de ejecución de la apoptosis en la que los filamentos de actina y los filamentos intennedios son despolimerizados, se esclarece dentro de este trabajo, apoyado por estudios recientementes que demuestran que los microtúbulos se reestructuran durante la fase de ejecución de la apoptosis adquiriendo un importante papel en los procesos apoptóticos, preservando la integridad del córtex celular e interviniendo de modo relevante con los procesos bioenergéticos celulares., Universidad Pablo de Olavide. Centro de Estudios de Postgrado, Postprint

Tesis Doctoral presentada por la licenciada Agnieszka Dobrzynska para optar al grado de Doctor por la Universidad Pablo de Olavide y realizada en el Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD), centro mixto del CSIC.-- Excepto si se señala otra cosa, la licencia del ítem se describe como Atribución-NoComercial-SinDerivadas 3.0 España., Caenorhabditis elegans es un nematodo pequeño que se alimenta de microorganismos, es transparente y fácil y barato para cultivar en el laboratorio. Además, su naturaleza hermafrodita, un ciclo de vida rápido, posibilidad de congelación y recuperación de los nematodos viables facilitan muchas manipulaciones genéticas. Por estas ventajas se utiliza como un sistema modelo en casi todas las áreas de la biología célullar, neurobiología y desarrollo. La elucidación de la organogénesis es importante para la comprensión del desarrollo de los organismos multicelulares. La vulva de un adulto hermafrodita sirve como un pasillo que conecta el útero con el ambiente externo y su desarrollo es un excelente modelo para estudiar los mecanismos que subyacen a la especificación del destino celular y las vías de señalización intercelular (Sternberg,2005). Durante el estadio larvario L3 una célula especializada de la gónada llamada célula ancla (AC), induce el desarrollo de la vulva mediante la secreción de la proteína LIN-3, un ligando del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a los precursores celulares de la vulva (VPC) subyacentes, llamados P3.p-P8.p para adoptar los destinos vulvares (Hill and Sternberg, 1992). El nivel mas alto de LIN-31o recibe P6.p para adoptar 1º destino celular y activar el LIN-12 (Notch) en PS.p y P7.p y adoptar el 2º destino celular (Sternberg, 1988). Los tres restantes VPCs (P3.p , P4.p y P8.p) que no reciben el señal inductiva ni las señales laterales adoptan el 3º destino celular, se dividen una vez y se fusionan con la hipodermis (hyp7). Después de tres rondas de divisiones celulares durante los estadios larvarios L3 y L4 se generan 22 células de la vulva de siete tipos diferentes que se invaginan y fusionan para formar siete anillos toroidales diferentes, se conectan al útero y emergen durante la última muda para formar la vulva madura del hermafrodita. La AC desempeña un papel crucial no sólo durante el desarrollo de la vulva, sino también en la morfogénesis uterina. Después de la inducción de tres VPCs para adoptar sus destinos vulvares, la AC señala, a través de LAG-2 y su receptor LIN-12, a seis de los doce descendientes de las células ventrales del útero (VU) a adoptar el destino celular π . Durante el estadio larvario L4, ocho células π fusionan con la AC y forman el sinsitio llamado utse. La fosforilación de proteínas por parte de quinasas es una modificación postraduccional que juega un papel importante en procesos biológicos numerosos. Se estima que aproximadamente el 30% de las proteínas intracelulares se fosforila de forma reversible (Cohen, 2000), lo que hace que las proteínas quinasas sean reguladores clave de procesos biológicos incluyendo la transducción de la señal, la transcripción, la progresión del ciclo celular, el crecimiento, la diferenciación y la apoptosis. La familia de quinasas humanas Vaccinia Related Kinases, VRKs, está constituida por tres miembros proteínas, VRK1 - 3, de los cuales sólo VRK1 y VRK2 son cataliticamente activos (Nichols and Traktman, 2004). En Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster hay sólo un ortólogo (VRK-1 y NHK-1, respectivamente). No hay ortólogos de las VRKs identificados en la levadura. VRK1 humana es el miembro más estudiado de la familia de VRK. Experimentos en diferentes organismos han demostrado que VRK1 fosforila varios factores de transcripción (p53, c-Jun y ATF2) y proteínas asociadas a la cromatina (histonas H2A y H3, BAF1) (Kierkx et al., 2009b). VRK1 regula la progresión del ciclo celular y juega un papel importante en la dinámica de la envoltura nuclear (Gorjanacz et al., 2007;Nichols et al., 2006). En los mamíferos, la pérdida de VRK1 conduce a la esterilidad y puede causar trastornos neurológicos (Renbaum et al., 2009; Wiebe et al., 2010). Además, la expresión de VRK1 se correlaciona con la progresión de ciertos tipos de cáncer (Santos et al., 2006). Los estudios realizados en nuestro laboratorio utilizando los nematodos C. elegans como organismo modelo han demostrado que VRK1 juega un papel critico en el desarrollo de órganos, así como en la proliferación de células germinales y divisiones mitóticas durante la embriogénesis temprana (Gorjanacz et al.,2007; Klerkx et al., 2009a). Sin embargo, poco se sabe acerca de la dinámica de VRK1, su regulación y sus sustratos durante el desarrollo. Los objetivos de mi tesis doctoral han sido situar a VRK-1 dentro del contexto del desarrollo de órganos de C. elegans, caracterizar la dinámica de la localización de VRK-1 tanto en C. elegans como en las células humanas e identificar nuevos sustratos de esta quinasa., La primera parte de mi tesis se concentra en la caracterización de la localización y la movilidad de VRK1 tanto en se centra C. elegans como en las células humanas. Con el fin de caracterizar la dinámica de VRK1 y garantizar los niveles de expresión uniformes hemos utilizado los sistemas MosSCI y Flp-ln para generar nuevas cepas transgénicas de C. elegans y líneas celulares humanas, que expresan solo una copia de los transgenes. Hemos observado que las nuevas cepas muestran la expresión de VRK-1 no sólo en las células previamente reportadas (neuronas, células hipodérmica y células precursoras de la vulva), sino también en las celulas del utero y la célula ancla. Ademas, hemos observado que VRK1 humano es nuclear durante la interfase y en mitosis se asocia con los cromosomas condensados, igual a lo descrito para los embriones de C. elegans (Gorjanacz et al., 2007). Por otra parte, una mutagénesis dirigida a tres argininas conservadas en la región carboxyl terminal identificó un nuevo motivo conservado, responsable de la localización de VRK1 en cromatina durante la mitosis. La recuperación de fluorescencia posterior al foto-blanqueamiento (FRAP) sugiere una asociación transitoria de VRK1 con la cromatina. Se observaron cinéticas idénticas en interfase y en la mitosis, lo que sugiere que VRK1 puede interactuar con las mismas proteínas de la cromatina durante todo el ciclo celular. La segunda parte de mi tesis se concentra en la relación entre VRK1 y las vías de señalización implicadas en el desarrollo de C. elegans. Durante el desarrollo de la vulva la AC se fusiona con células uterinas para formar el utse. Los defectos en la formación de utse producen un fenotipo conocido como vulva protuberante (Pvl). Hemos demostrado que la AC no se fusiona en los mutantes de vrk-1, muy probablemente debido a la pérdida de VRK-1 en el tejido uterino,lo cúal, esta perdida se caracteriza por defectos en la proliferación y la diferenciación en las células uterinas. La tercera parte de esta tesis, en la identificación de las proteínas que interaccionan con VRK1. Hemos expresado y purificado VRK1 de células humanas asincrónicas y mitóticas, seguido por espectrometría de masas de alta resolución. Algunos de los principales candidatos identificados fueron miembros del complejo de pasajeros cromosómica (CPC) - Aurora B, Borealin y survivin. Experimentos en curso servirán para confirmar la interacción de VRK1 con el CPC. En conclusión, en esta tesis hemos destapado nuevos dominios reguladores de la proteína quinasa VRK1 y proteínas que interaccionan con VRK1. Estos resultados son importantes para comprender las actividades moleculares de esta quinasa, que está vinculada a la organogénesis, así como a los cánceres humanos y a trastornos neurológicos.

Numerosos agentes internos y externos pueden causar alteraciones genéticas que activan diferentes mecanismos en la célula para detener la progresión del ciclo celular y permitir la reparación de estas lesiones. El correcto funcionamiento de estos mecanismos (llamados respuesta a daño en el ADN) es esencial para evitar la transmisión de un material genético dañado a las células hijas y el desarrollo de patologías asociadas a la inestabilidad genética, como el cáncer. En un rastreo realizado con el fin de identificar nuevas quinasas implicadas en el mantenimiento de la estabilidad genómica, eliminamos individualmente todas las quinasas humanas conocidas mediante ARN interferente en células U2OS y estudiamos cuál de estos tratamientos causaba la activación de la respuesta a daño, medida por inmunofluorescencia a través de la fosforilación de la histona H2AX (gamma-H2AX), un marcador común a la activación de las dos vías de esta respuesta: las vías de ATR y ATM. La eliminación de Wee1 no sólo inducía la fosforilación de H2AX, sino que además disparaba una respuesta general a daño en el ADN y causaba el bloqueo de la replicación, resultando en un acúmulo de células en fase S del ciclo celular. Estas células mostraban un descenso en la velocidad de la horquilla de replicación, demostrando la implicación de Wee1 en la replicación del ADN. La respuesta a daño en ausencia de Wee1 depende críticamente de la endonucleasa Mus81-Eme1, y descubrimos que la eliminación conjunta de Mus81 y Wee1 suprimía el retraso en fase S. Además, Wee1 y Mus81 interaccionan in vivo, lo que sugiere una relación de regulación directa entre ambas. En su conjunto, estos resultados demuestran un novedoso papel para Wee1 en el control de Mus81 y de la replicación del ADN en células humanas.

A barreira hematoencefálica (BHE) é uma estrutura que impede e/ou dificulta a passagem de substâncias do sangue para o sistema nervoso central, tais como anticorpos, complemento e fatores de coagulação. A BHE é formada por células endoteliais que ficam alinhadas com os capilares, impedindo ou dificultando a passagem de substâncias do sangue para o tecido nervoso. Com isso, o presente estudo pretende realizar uma revisão na literatura sobre os aspectos celulares e fisiológicos da barreira hematoencefálica. Foi realizada uma revisão na literatura utilizando os seguintes bancos de dados: Medline, PubMed, Scielo , Lilacs e Capes. Como critério de seleção, analisaram-se as informações presentes nos resumos, discussões e referências dos artigos dos bancos de dados citados anteriormente, alcançando-se o número total de 40 artigos científicos. O período de abrangência pesquisado foi entre 2000 e 2012. Concluímos que a BHE é de extrema importância, pois atua como uma barreira seletiva, controlando a entrada de medicamentos e substâncias tóxicas no SNC. Existem poucas pesquisas e artigos sobre a BHE, mostrando uma falta de conhecimento sobre os seus mecanismos e suas funções.

El correcto funcionamiento de la ruta secretora depende, además de factores extrínsecos, de la participación de numerosos efectores intracelulares que traducen e integran la información de las señales extracelulares y ponen en marcha los mecanismos celulares de respuesta que regulan este proceso (Bonifacino y Glick, 2004). La alteración en la funcionalidad de alguno de estos efectores en células neuroedocrinas repercute directamente en el desarrollo de patologías severas caracterizadas por la secreción deficitaria o excesiva de un determinado neuropéptido o factor hormonal. Previamente, nuestro grupo ha identificado la GTPasa de bajo peso molecular Rab18 como un nuevo componente regulador de la ruta de secreción regulada en condiciones fisiológicas y patológicas (Vazquez-Martinez et al., 2007; 2008). Concretamente, en células neuroendocrinas Rab18 frena el tráfico intracelular de gránulos de secreción, lo que conlleva una reducción de la actividad secretora celular (Vazquez-Martinez et al., 2007). Además, en ciertas enfermedades caracterizadas por hipersecreción hormonal, la expresión de Rab18 está significativamente reducida (Vazquez-Martinez et al., 2008), lo que apunta a esta GTPasa como un factor crucial en la modulación de la intensidad de la respuesta secretora por parte de las células. Sin embargo, aún se desconocen los mecanismos moleculares que subyacen en la función de Rab18 en el control del tráfico intracelular de gránulos de secreción. Atendiendo a estas consideraciones, el principal objetivo de la presente Tesis Doctoral ha sido caracterizar el mecanismo de acción de Rab18 en la línea celular neuroendocrina PC12 en relación con componentes del citoesqueleto y con distintos integrantes del complejo motor responsable del movimiento de gránulos de secreción, así como identificar otros efectores y reguladores potenciales de la acción de esta proteína.

Programa de doctorado en Biotecnología y Tecnología Química, La migración celular es un proceso fundamental tanto en el desarrollo embrionario como a lo largo de la vida del organismo. En organismos adultos, tiene gran importancia en los procesos homeostáticos como la respuesta inmune y la reparación de tejidos. La migración celular también puede contribuir a algunos procesos patológicos, incluyendo enfermedades vasculares, enfermedades inflamatorias crónicas y procesos metastáticos (Friedl et al., 2004). Durante el desarrollo, existen dos modos principales de movimiento celular, la migración individual y la migración colectiva. Las células que migran de forma individual son células procedentes de epitelios que mediante una transición epitelio-mesénquima (EMT), en el que tiene lugar cambios en la polaridad y adhesión celular, se delaminan y se convierten en células mesenquimales con capacidad de migrar. La migración colectiva se entiende como el movimiento de varias células, bien formando parte de un grupo, de una fila o de una capa, que mantienen características similares a las células epiteliales. Este tipo de migración no se rige por una EMT como tal ya que no pierde totalmente la identidad epitelial. Existen varios ejemplos de migración colectiva durante el desarrollo como es la gastrulación y de procesos patológicos como la metástasis. En general, la migración celular se considera un proceso cíclico. Este ciclo comienza con la adquisición de una polaridad celular que genera una asimetría espacial entre la parte frontal y la trasera de la célula. Esta polarización se debe a la recepción de señales externas, estímulos quimiotácticos, factores de decrecimiento o proteínas de la matriz extracelular, las cuales determinan la dirección de la migración. Estas señales activan a receptores de membrana situados en el frente celular como son los receptores tirosina kinasas EGFR y PDGF (Forsberg-Nilsson et al., 1998; Simpson and Armstrong, 1999). Estos receptores se activan gracias a la fosforilación de su dominio intracelular por la unión de sus ligandos al dominio extracelular. Otra proteína implicada en el establecimiento de la polaridad celular y en la adhesión y mantenimiento de epitelios es la proteína E-cadherina. Esta proteína ejerce un papel importante en la migración colectiva durante el desarrollo, donde si bien la disminución de los niveles de E-cadherina en el frente de células pertenecientes a un epitelio promueve la migración, el aumento de expresión de esta proteína la inhibe (revisado en Shapiro and Weis, 2009 y en Peinado et al., 2004; Acloque et al., 2009). Esto ocurre en el cierre del tubo neural o durante la gastrulación en el desarrollo embrionario. Esta polarización y la consecuente activación de las rutas de señalización de los receptores EGFR y PDGF, implica la emisión de proyecciones transitorias en el frente celular (Sarmiento et al., 2008). Estas prolongaciones o extensiones, conocidas como filopodios y lamelipodios, son responsables del movimiento celular. Una molécula importante implicada en la formación de estas extensiones es la actina, un componente del citoesqueleto celular. La polimerización y despolimerización de actina para la formación de proyecciones celulares depende de reorganizaciones del citoesqueleto. En este proceso están involucradas las proteínas pertenecientes a las Rho GTPasas, Rac1 y Cdc42 (Sander et al., 1999). Varios estudios han mostrado que la activación de Rac1 o Cdc42 resulta en un incremento de la formación de lamelipodios y filopodios, respectivamente (Ridley et al., 1992; Machesky and Hall, 1997). Una vez formados estos lamelipodios y filopodios, deben anclarse al sustrato, ya sea a la matriz extracelular o a otras células adyacentes. Estos anclajes se denominan adhesiones focales o fibras de estrés. El proceso de unión de las proyecciones al sustrato se lleva a cabo por otro miembro de la familia de las Rho GTPasas denominado Rho, a través de su interacción con actina. Al mismo tiempo que se generan las adhesiones focales en las proyecciones del frente celular, la parte trasera de la célula debe retraerse para permitir el movimiento celular. En este proceso también se encuentra implicada la proteína Rho, la cual debe ser inhibida en la parte trasera para desestabilizar las uniones de la célula al sustrato a la vez que ejerce su papel en la contracción del cuerpo celular mediante su interacción con la miosina (Ridley and Hall, 1992; Ridley and Hall, 1994; Chrzanowska-Wodnicka and Burridge, 1996). Las Rho GTPasas deben estar bien reguladas para poder ejercer de forma correcta su papel de reorganización del citoesqueleto de actina durante la migración celular. Las Rho GTPasas presentan dos estados conformacionales que dependen de su unión a GTP (activa) o a GDP (inactiva). La regulación de este ciclo de activación/inactivación va a depender de tres tipos de proteínas distintas: unas proteínas activadoras denominadas GEF del inglés Guanine Nucleotide Exchange Factor, las cuales catalizan la unión de las proteínas a GTP; unas proteínas inactivadoras GAP, que procede del inglés GTPase Activating Proteins, implicadas en la hidrólisis del GTP y la posterior unión de las Rho GTPasas a GDP; y unas proteínas inhibidoras de la disociación de nucleótidos de guanina, GDI del inglés Guanine Nucleotide Disociation Inhibitor, las cuales se mantienen unidas a las Rho GTPasas inhibiendo la asociación con el nucleótido de guanina previniendo así su activación (Kjoller and Hall, 1999). Los factores GEFs son los más estudiados respecto a la activación de las GTPasas. Los miembros pertenecientes a la familia de las RhoGEF se caracterizan por poseer el complejo DH-PH, que interviene tanto en la localización de las RhoGEFs en la membrana plasmática como en la regulación la actividad catalítica (revisado en Rossman et al., 2005). Cabe destacar el GEF Vav por ser una proteína que contiene un bucle de autoinhibición situado en el extremo amino-terminal que regula negativamente al dominio catalítico DH, bloqueando así la accesibilidad a las Rho GTPasas (Schmidt and Hall, 2002). Además, esta proteína contiene los dominios SH2-SH3-SH2 en su extremo carboxi-terminal, por el cual se activa mediante fosforilación (Bishop and Hall, 2000). Vav ha sido situado corriente abajo de algunos receptores tirosina kinasas. Tras la estimulación de estos receptores, Vav es fosforilado, lo que produce la estimulación del dominio catalítico DH, pudiendo así interaccionar con las Rho GTPasas (Garrett et al., 2007). Concretamente, se ha implicado en la regulación de la proteína Rac1 y se ha establecido su papel en migración celular principalmente en células en cultivo, donde se ha mostrado que mutaciones de vav pueden generar una disminución de la activación de Rac1 impidiendo así la migración en células en cultivo (Citterio et al., 2012; Lin et al., 2012). En resumen, los receptores tirosina kinasas juegan un papel fundamental en la migración celular dirigida, ya que su activación por señales externas, activan una cascada de señalización que a través de GEFs y Rho GTPasas controlan la reorganización del citoesqueleto y por tanto la migración celular. Los mecanismos moleculares por los cuales las Rho GTPasas y sus activadores, los GEFs, regulan la migración celular han sido mayormente descritos in vitro o in vivo mediante experimentos en cultivos celulares. Por ello, poco se sabe de su función en situaciones fisiológicas en el contexto de un organismo vivo. En esta tesis utilizaremos como modelo de migración las células del borde del ovario de Drosophila melanogaster para tratar de descifrar in vivo el papel de estas proteínas reguladoras del citoesqueleto de actina durante procesos de migración celular que tienen lugar durante el desarrollo. El sistema reproductivo de la hembra adulta de Drosophila melanogaster está compuesto por dos ovarios situados en el abdomen. Cada ovario tiene aproximadamente entre 16 y 20 ovariolas, conteniendo cada una de ellas una hilera de 14 cámaras huevo en distintos estadios del desarrollo. Las cámaras huevo están formadas por 15 células nutricias y un oocito que proceden de la línea germinal. Rodeando a la cámara huevo se encuentran las células foliculares, las cuales proceden de la línea somática. (...), Universidad Pablo de Olavide. Centro de Estudios de Postgrado, Centro Andaluz de Biología del Desarrollo

Las células acumulan potasio para múltiples funciones. Ha sido bien documentadoque la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae crece a diferentes concentracionesexternas de cationes alcalinos y mantiene altas y bajas concentraciones intracelulares depotasio y sodio, respectivamente. Sin embargo, se ha prestado poca atención al estudio dela distribución intracelular de estos cationes. La aproximación experimental másampliamente utilizada, la permeabilización de la membrana plasmática, produceresultados incompletos, ya que usualmente sólo considera el citoplasma y las vacuolascomo compartimentos donde los cationes están presentes en cantidades significativas.Mediante el aislamiento y análisis de los principales organelos de esta levadura, se hadeterminado la localización subcelular de potasio y sodio en S. cerevisiae. Se ha observadoque mientras las vacuolas acumulan la mayoría del potasio y sodio intracelular, el citosolcontiene cantidades relativamente bajas de estos cationes, lo cual es especialmenterelevante en el caso del sodio. Sin embargo, las concentraciones de potasio en el citosol,son mantenidas bastante constantes durante el proceso de ayuno de potasio,concluyéndose que para este propósito el potasio vacuolar es rápidamente movilizado.También se observó que la distribución intracelular está alterada en cuatro mutantesdiferentes con una fisiología vacuolar defectuosa. Tanto en la cepa silvestre como en losmutantes vacuolares, el núcleo contiene y mantiene un porcentaje relativamenteconstante e importante de potasio y sodio, los cuales están muy probablementeinvolucrados en la neutralización de cargas negativas.El contenido intracelular de potasio de un mutante carente del principal sistema detransporte de la membrana plasmática (trk1,2) fue menor que el de la cepa silvestrecuando creció en condiciones limitantes del catión(5 mM KCl). Por el contrario, durante lafase estacionaria, el contenido intracelular del catión fue mayor en el mutante. Esto se vioreflejado en el potasio de los organelos, el doble mutante cultivado en 5 mM de KClacumuló menos potasio en la vacuola, núcleo y “citoplasma” en fase logarítmica, mientrasque en fase estacionaria retuvo más potasio en los mismos que la cepa silvestre.S. cerevisiae es capaz de adaptar sus niveles intracelulares de potasio a cambios enel medio externo. La homeostasis de potasio en la cepa silvestre, resuspendida en unmedio con bajo potasio es un ejemplo de adaptación imperfecta, ya que la concentración..., Living cells accumulate potassium to fulfil multiple functions. It is welldocumented that the model yeast Saccharomyces cerevisiae grows at very differentconcentrations of external alkali cations and keeps high and low intracellularconcentrations of potassium and sodium respectively. However less attention has beenpaid to the study of the intracellular distribution of these cations. The most widely usedexperimental approach, plasma membrane permeabilization, produces imcompleteresults, since it usually considers only cytoplasm and vacuoles as compartments where thecations are present in significant amounts. By isolating and analysing the main yeastorganelles, we have determined the subcellular location of potassium and sodium, thecytosol contains relatively low amounts, which is especially relevant in the case of sodium.However, K⁺ concentrations in the cytosol are kept rather constant during the K ⁺-starvation process and we concluded that, for that purpose, vacuolar K ⁺ has to be rapidlymobilized. We also show that this intracellular distribution is altered in four differentmutants with impaired vacuolar physiology. Finally, we show that both in wild-type andvacuolar mutants, nuclei contain and keep a relatively constant and important percentageof total intracellular K ⁺ and Na ⁺, which most probably is involved in the neutralization ofnegative charges.Yeast mutants lacking the main plasma membrane potassium transportercontained less potassium than the wild type when grown at limiting potassium(5 mMKCl).However, duringstationary phase, the intracellular content was higher in the mutant. Thisfact was also observed in the main organelles. The double mutantcontainedlesspotassiumin the vacuole, the nucleus and"cytoplasm" during log phase, while in thestationary phase, the same organelles retained more potassium than the control strain.S. cerevisiae cells are able to grow at very different potassium concentrationsadapting its intracellular cation levels to changes in the external milieu. Potassiumhomeostasis in wild type cells resuspended in media with low potassium is an example ofnon-perfect adaptation since the same intracellular concentration is not approachedirrespective of the extracellular levels of the cation. By using yeasts lacking the Trk1,2system or expressing different versions of the mutated main plasma membrane potassium...

Programa de doctorado en Biotecnología y Tecnología Química, We are aimed at understanding how cells acquire their characteristic shape. To study these questions, we are using a simple eukaryote, genetically tractable fission yeast Schizosaccharomyces pombe, as a model organism. Fission yeast is a useful model for addressing these problems, due to its easy genetics, availability of genome-wide collection of gene deletions and well developed microscopic, genetic and molecular biology tools. S. pombe polarized growth is produced via hierarchical regulatory interactions of microtubule-dependent cortical polarity markers with regulators of actin polymerization and vesicle secretion. In addition, intracellular signalling pathways act to maintain the polarized state and to control cellular decisions in response to environmental conditions, as for instance, in growth response to pheromone gradients. The MOR pathway is an evolutionarily conservad signalling pathway that controls cellular morphogenesis and cell separation in yeasts and fungi. This pathway is composed of a module of three kinases,known in S. pombe as Ste20-like, Nak1 or Orb3 linked to the scafolding protein Mor2 that is associated with the plasma membrana. This module signals to the NDR Orb6 and its coactivator Mob2 that actívate downstream targets to regulate ceU polarity and gene expression. The role of the MOR pathway in the regulation of polarizad growth is poorly understood. Sorne evidence suggests that the downstream NDR kinase regulates polarizad growth by controlling Golgi- and Sec2/Sec4-dependent transport processes. In S. pombe the NDR-kinase Orb6 controls polarized cell growth by spatial regulation of Cdc42, a universal regulator of cell polarity. In the fission yeast, inactivation of the MOR pathway results in the impairment of cell polarization giving rise to round unpolarized cells. In this work we have investigated how fission yeast cells establish and maintain growth zones to restrict cell growth to the tips of the cylindrical cell. We have characterized a new role of PP2A and the MOR morphogenesis pathway in the spatial control of Cdc42 activity. This data suggest that this control occurs via regulation of non-growing cellular domain containing Rga4, a Cdc42 inhibitor, by PP2A in conjunction with the NDR kinase Orb6. Rga4 forms a nodular structure in the central lateral cortex of fission yeast cells and is excluded from the tips. Our data demonstrate that PP2A and the MOR signaling pathway regulate the Rga4 nodular structure as well as its dynamic properties. tnactivation of the MOR or PP2A results in the progressive loss of the Rga4 nodular domain, leading to the loss of cell polarity and the ectopic growth at this lateral domain. Also, using a proteome-wide screeng for PP2A substrates we have identified a number of proteins likely regulated by PP2A, sorne of which are, in fact, components of the MOR signalling pathway., Universidad Pablo de Olavide. Centro de Estudios de Postgrado

Mestrado em Biologia Aplicada - Biologia Molecular Celular Protein synthesis is tightly regulated and fidelity in this process is essential for maintenance of essential cellular functions. Under normal physiological conditions errors can occur, at frequencies around 10-4 errors per codon decoded. This level of mistranslation can be tolerated by cells. When the frequencies of errors increase mechanisms of protein quality control can fail leading to accumulation of misfolded proteins, which are more prone to form toxic aggregates, can compromise cell viability, disrupt cellular homeostasis and lead to the development of diseases. In order to elucidate how cells respond to mistranslation and understand how protein accumulation can cause disease and cell degeneration, we exposed human HEK293FT cells to canavanine and azetidine-2-carboxylic acid (AZC) which are analogues of arginine and proline, respectively. Their misincorporation into proteins leads to erroneous protein synthesis, misfolding and likely to protein aggregation. Such mistranslation event decreased slightly cellular viability and increased the number of cells arrested in G2/M and S phases of cell cycle. In HEK293FT cells was detected an increase in proteins conjugated with ubiquitin, without altering proteasome activity, which may indicate that at this level of mistranslation, protein quality control mechanisms are active to counteract the formation of protein aggregates. Transcriptional analysis showed that down-regulated genes were mainly associated with extracellular matrix and cell adhesion and up-regulated genes were involved in negative regulation of transcription and response to unfolded proteins. This study provides new insights into the response of human cells to mistranslation by giving a global analysis of transcriptional alterations that occur in response to proteotoxic stress. HEK293FT cells can be a good model to understand the molecular basis of human diseases caused by mRNA mistranslation. A síntese proteica é um mecanismo sujeito a uma apertada regulação, pois a manutenção de funções celulares essenciais está dependente da fidelidade deste processo. Em condições fisiológicas normais podem ocorrer erros, a uma frequência de aproximadamente 10-4 erros por codão descodificado. Este nível de erro é tolerado pelas células, mas quando a frequência destes aumenta, os mecanismos de controlo de qualidade das proteínas podem falhar levando à acumulação de proteínas aberrantes (misfolded) que tendem a formar agregados tóxicos, podem comprometer a viabilidade celular, alterar a homeostasia e levar ao desenvolvimento de doenças. Com o objectivo de elucidar os mecanismos de resposta à acumulação de erros durante a síntese proteica e entender como o aumento de proteínas aberrantes pode levar ao desenvolvimento de doenças e degeneração celular, foram utilizadas células HEK293FT expostas a canavanina e azetidine-2- carboxylic acid (AZC), análogos da arginina e prolina respectivamente. A incorporação destes análogos de aminoácidos leva a uma síntese proteica aberrante e origina proteínas que tendem a agregar e ter consequências tóxicas para as células. No nosso estudo observámos que a incorporação de análogos de aminoácidos levou a uma diminuição ligeira da viabilidade celular, assim como levou ao aumento do número de células nas fases G2/M e S do ciclo celular. Também foi detectado um aumento de proteínas conjugadas com ubiquitina, não se observando alteração na actividade do proteasoma. Isto pode indicar que a este nível de erro a que as células estão sujeitas, os mecanismos de controlo de qualidade de proteínas estão a ser activados de forma a evitarem a agregação proteica. Através das análises ao transcriptoma observou-se que os genes cuja expressão diminuiu estão relacionados com a matriz extracelular e adesão celular e os genes cuja expressão aumentou, estão envolvidos na regulação negativa da transcrição e na resposta a proteínas aberrantes. Este estudo permitiu adquirir novos conhecimentos acerca da resposta celular à incorporação de erros durante a síntese proteica, através da análise de alterações transcripcionais causadas pelo stress proteotóxico. As células HEK293FT são um bom modelo de estudo para compreender as bases moleculares de doenças humanas originadas por uma síntese proteica aberrante.

Reducción alta, Tesis Univ. Granada, Dpto. de Parasitología. Leída el 14 de marzo de 1991

Mestrado em Biologia Aplicada - Biologia Molecular e Celular Submitted by Maria da Graça Mónica do Casal Breda (gbreda@ua.pt) on 2012-04-12T14:08:41Z No. of bitstreams: 1 247562.pdf: 1234423 bytes, checksum: 8efeb078749596b34b98aa79c8026128 (MD5) Made available in DSpace on 2012-04-12T14:08:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 247562.pdf: 1234423 bytes, checksum: 8efeb078749596b34b98aa79c8026128 (MD5) Previous issue date: 2011

Mestrado em Biologia Aplicada - Biologia Molecular e Celular Cadmium exerts harmful effect on public health. Environmental and occupational exposure, are the two main ways for human exposure. It was also shown that even low levels of cadmium exposure can leave to renal and other organs failure. Exposure to cadmium is associated with various bone problems and diseases like bone loss, fragilization and osteoporosis. Moreover, it was reported that cadmium exposure may perturb calcium homeostasis, Vitamin D formation and interact directly on bone metabolism. Reactive oxygen species have an important function in bone resorption, so disruption of the oxidative balance in bone tissue may result in disorders in bone metabolism. Although the deleterious effects of cadmium in bone are known, the mechanisms of action in bone cell are still not completely understood. The aims of this research study were to evaluate cadmium role in promoting cellular alterations, namely inducing oxidative stress imbalance and ultimately apoptosis. To investigate cadmium effects the human osteoblast-like cell line MG-63 was used. Inhibition of cell viability by cadmium was assessed by MTT assay. Based on these results, the sublethal doses of cadmium, 20 and 50 μM were chosen, for further studies. Cells were exposed to those concentrations of cadmium chloride for two periods of time (24 and 48 hours). After that, cells were harvested and several parameters were evaluated. The cytotoxic parameters followed a comprehensive set of oxidative stress assays with enzymatic parameters, namely determination of the activity of superoxide dismutase, catalase glutathione reductase and total glutathione content. Moreover, cadmium-induced apoptosis was assessed with annexin V assay. We observed differences in all anti-oxidant enzymes, namely an increase, catalase activities with the increased of cadmium dose and a glutathione reductase activity inhibition and also depletion on glutathione content, which may result in imbalance in oxidative stress. Finally, for the doses and periods tested, cadmium induced cell apoptosis.. In conclusion, cadmium chloride at 20 μM and 50 μM induced changes on human MG-63 cell line physiology, as it cause oxidative stress imbalance which lead to cell death by apoptosis. O cádmio exerce efeitos nocivos para a saúde pública. A exposição ambiental e ocupacional, são as duas principais formas de exposição em humanos. Foi também demonstrado que mesmo baixos níveis de exposição ao cádmio podem causar falência de diferentes órgãos. A exposição ao cádmio está também associada a doenças relacionadas com o tecido ósseo. Além disso, foi relatado que a exposição ao cádmio pode perturbar a homeostasia do cálcio, formação de vitamina D e é também capaz de interagir directamente no metabolismo ósseo. As espécies reactivas de oxigénio têm uma função importante na reabsorção óssea e, desta forma, a ruptura do equilíbrio oxidativo pode resultar em distúrbios no seu metabolismo. Embora os efeitos deletérios do cádmio no osso sejam conhecidos, os mecanismos de acção nas células ósseas ainda não estão completamente esclarecidos. Os objectivos deste estudo consistiram em avaliar o papel do cádmio na promoção de alterações celulares, tais como desequilíbrio oxidativo e indução de apoptose. Para investigar os efeitos do cádmio foi utilizada a linha humana de osteosarcoma MG-63. A inibição da viabilidade celular pelo cádmio foi avaliada através do ensaio de MTT. Com base nesses resultados foram escolhidos as doses subletais de cádmio (20 e 50 μM) a serem utilizadas nos estudos posteriores. As células foram expostas às duas concentrações de cádmio em dois períodos de tempo (24 e 48 horas). Os seus efeitos citotóxicos foram avaliados vários por parâmetros enzimáticos de stress oxidativo,nomeadamente a determinação da actividade de superóxido dismutase, catalase e a glutationa reductase assim como conteúdo total de glutationa . Além destes, foi também avaliada a indução da apoptose pelo cádmio, através do ensaio com anexina V. Observaram-se diferenças em todas as enzimas anti-oxidantes, nomeadamente, um aumento da actividade catalase com o aumento da dose de cádmio e uma inibição da actividade da glutationa reductase assim como da concentração de glutationa, resultando em stress oxidativo. Finalmente, observou-se que nas doses e tempos testados, o cádmio induziu apoptose nas células. Em conclusão, o cádmio, nas concentrações de 20 μM e 50 μM induziu alterações na fisiologia da linha celular humana MG-63, causando stress oxidativo levando à morte celular por apoptose.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2016. A cromatina é essencial para manutenção da fisiologia celular por desempenhar papel-chave na regulação da transcrição, reparo e replicação do DNA. Para tanto, esta deve ser altamente dinâmica, permitindo alterações entre estados compactados e relaxados. O primeiro nível de compactação da cromatina é o nucleossomo, formado pelo DNA e um octâmero de histonas. Moléculas que se ligam ao nucleossomo tem potencial para modular a cromatina. Diversas evidências apontam para o colesterol, lipídio importante para o funcionamento basal das células, como uma molécula ligante de cromatina. Recentemente, foi demonstrado que o colesterol pode modular a estrutura das fibras de cromatina reconstituídas in vitro. Juntos, estes dados sugerem que o colesterol possui um efeito modulador da arquitetura da cromatina por se ligar diretamente ao nucleossomo. Entretanto, os detalhes moleculares da ação do colesterol sobre a estrutura da cromatina ainda não foram esclarecidos. O objetivo deste estudo foi investigar, in silico, a ligação do colesterol ao nucleossomo e observar seu impacto ao nível atômico. Logo, metodologias capazes de tratar interações moleculares com resolução atomística são fundamentais, como a dinâmica molecular (DM) e docking molecular. Aqui identificamos vários sítios de ligação do colesterol distribuídos pelo nucleossomo. Após 200 ns de DM, seis moléculas de colesterol amostradas permaneceram ligadas ao nucleossomo. Para cada sítio investigado, a energia livre de ligação, estimada pelo método LIE (Linear Interactions Energy), indica o favorecimento do complexo entre o colesterol e o nucleossomo. Foi observado um impacto nas flutuações atômicas de vários aminoácidos formadores dos sítios de ligação. Dentre estes, alguns são conhecidamente importantes para modulação da estrutura da cromatina. Além disso, houve redução significativa do número de moléculas de água nas interfaces de interação colesterol-nucleossomo, especialmente em regiões hidrofóbicas essenciais para a manutenção estrutural do nucleossomo. Esses resultados sugerem que o colesterol pode afetar a arquitetura da cromatina através da interação direta com o nucleossomo nos múltiplos sítios de ligação. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT Chromatin is essential for maintenance of cell physiology playing a key role in transcription regulation, DNA repair and replication. Therefore, it must be highly dynamic, allowing changes between compacted and relaxed states. The first level of chromatin compaction is the nucleosome, formed by DNA and histone octamer. Molecules that bind to the nucleosome have the potential to modulate chromatin. Several evidences indicate that cholesterol, important lipid for cell function, may bind to chromatin. Recently, it was demonstrated that in vitro cholesterol may modulate the structure of reconstituted chromatin fibers. Together, these data suggest that cholesterol may modulate chromatin architecture by direct binding to the nucleosome. However, the molecular details of cholesterol’s action on chromatin structure remain unclear. The aim of this study was an in silico investigation of the cholesterol binding to the nucleosome and its impact at the atomic level. Therefore, methodologies capable of handling molecular interactions with atomistic resolution are critical, such as molecular dynamics (MD) and molecular docking. Here, we identified several cholesterol binding sites distributed over the nucleosome. After 200 ns of MD, six sampled cholesterol molecules remained bound to the nucleosome. For every site, the estimated absolute free energies obtained by the LIE method, favour cholesterol binding thus explaining the stability of the molecular complex. Cholesterol impacts the atomic fluctuations of several amino acids forming the binding sites. Among these, some are well-known to modulate the chromatin structure. Furthermore, a significant reduction in the number of water molecules in cholesterol-nucleosome interfaces was observed, especially at key hydrophobic regions for nucleosome structural maintenance. These results suggest that cholesterol may affect the chromatin's architecture via direct interaction with the nucleosome through multiple binding sites.

Mestrado em Biologia Aplicada O presente trabalho teve como base a literatura científica mais actual no sentido de rever a possível relação existente entre algumas patologias humanas e haplogrupos mitocondriais. Uma vez que os haplogrupos mitocondriais resultam de variações SNPs em regiões específicas do genoma mitocondrial interessa saber até que ponto essas alterações são plausíveis de originar desordens a nível da mitocôndria e por conseguinte responsáveis pela expressão fenotípica de diferentes doenças. Apesar do número crescente de pesquisas que se têm verificado nesta área que tentam esclarecer uma possível relação, entre patologias e haplogrupos, estes são ainda insuficientes, tornando-se fundamental dar continuidade a este tipo de estudos. Contudo é essencial que a amostragem utilizada seja representativa de um haplogrupo para que se possa estabelecer uma associação com uma determinada patologia. The study was based on the most current scientific literature in order to analyse the possible existence of a relationship between some pathologies with the various mitochondrial haplogroups. Since the mitochondrial haplogroups result from SNP variations in specific regions of the mitochondrial genome, it is of interest to analyse to what extent these changes can alter the mitochondria and consequently give rise to the phenotypic expression of the different diseases. Even though various studies have been trying to clarify a possible relationship between these pathologies with specific haplogroups, it is fundamental to give continuity to these investigations. However, it is essential to ensure that the study samples used in these type of studies are representative of a specific haplogroup in order to establish an association with a certain disease.

Rodríguez Puyol, Diego, codir., La quinasa ligada a integrinas (ILK) es un efector intracelular de las interacciones entre la célula y la matriz extracelular y regula muchos procesos celulares como crecimiento, proliferación, supervivencia, diferenciación, migración, invasión y angiogénesis. Aunque su papel ha sido ampliamente estudiado durante el desarrollo, poco se conoce sobre su función en la regulación y reparación de tejidos en animales adultos. Con el objetivo de analizar el papel de ILK en la homeostasis de tejidos, se desarrollaron ratones adultos con deleción condicional de ILK, mediante el sistema Cre-lox. En primer lugar se analizó el efecto de la deleción de ILK en la función vascular. Los ratones deficientes en ILK mostraron en la pared del vaso un incremento en la expresión de dos proteínas implicadas en la respuesta celular al óxido nítrico (NO), la guanilato ciclasa soluble y la proteína quinasa G (PKG), con una mayor respuesta hipotensora tras la administración de donadores de óxido nítrico y agonistas de la PKG. Además, estos ratones fueron capaces de responder a nitroprusiato sódico (SNP), aún después de la inducción de tolerancia al NO con un tratamiento crónico con dinitrato de isosorbide, observándose un descenso en la presión arterial que no fue observado en los animales con ILK intacta. El efecto vasodilatador de SNP fue también mayor en los ratones deficientes en ILK a los que se indujo una hipertensión aguda por angiotensina II. En segundo lugar se analizó la implicación de ILK en la reparación tisular eligiendo el modelo de reparación de heridas cutáneas. El déficit de ILK condujo hacia un enlentecimiento en el cierre de la herida cutánea y una disminución de la proliferación celular. La deceleración fue acompañada de una disminución en la expresión proteica de HGF durante el proceso de reparación de la herida. De manera significativa, las alteraciones en la proliferación celular y en el cierre de la herida se revirtieron por la administración exógena de HGF humano en los animales deficientes en ILK. El análisis de los mecanismos intracelulares implicados en este proceso reveló que la herida promovió una rápida activación de la PI3K e ILK necesaria para que se produjera el aumento en HGF que se indujo con la herida. De esta manera, PI3K parece jugar un papel central en la modulación de ILK que, como parece, ejerce de mediador en la síntesis de HGF. En conclusión, la activación de ILK parece ser decisiva para que se pongan en marcha los mecanismos de reparación tisular dependientes de la sobreexpresión de HGF.

Es un hecho ampliamente demostrado que las alteraciones en la vía de señalización del óxido nítrico?guanilato soluble?proteína kinasa G (NO-GCs-PKG) están relacionadas con la génesis de la disfunción endotelial. Previamente se ha demostrado que la expresión de la eNOS y GCs depende de la interacción de las células con la matriz extracelular a través de las integrinas, pero no se han descrito efectos similares en la expresión de PKG. El principal objetivo de este estudio fue evaluar si el contenido celular de PKG dependía de la activación de integrinas y testar la posibilidad de que GCs y PKG pudiesen ser moduladas por la estimulación de integrinas in vivo. La administración de tirofiban en ratas incrementó el contenido de GCs (ß1) en la pared vascular. Como consecuencia de este aumento, también incrementó la respuesta farmacológica a donadores de NO, mejoró la tolerancia asociada con el tratamiento prolongado con nitritos e incrementó la capacidad de reducir la presión arterial sistólica de los donadores de NO en un modelo genético de hipertensión. Por otro lado, la fibronectina incrementó el contenido proteico de PKG I¿ en células mesangiales humanas a través de la interacción con la integrina b1. Akt está implicado en la modulación de la expresión de PKG I¿ por fibronectina. La administración de tirofiban en ratas produjo un aumento del contenido proteico de PKG I¿ en la pared vascular y además, el tirofiban favoreció la respuesta hipotensora del dibutiril GMPc (dbGMPc) en estos animales, lo cual sugiere la relevancia funcional de los cambios detectados en el contenido de PKG I¿ en vaso. La dilucidación de este nuevo mecanismo proporciona una base para posibles farmacoterapias aplicables a determinadas enfermedades vasculares. Estudios previos han demostrado que la sobreexpresión de H-Ras en animales modificados genéticamente produce hipertensión e hipertrofia cardiaca, lo cual sugiere que H-Ras tiene un papel importante en la regulación de la presión arterial. El segundo objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de la ausencia de H-Ras en la presión arterial en ratones deficientes en la isoforma H-Ras. Los ratones H-Ras -/- presentaron una disminución de la presión arterial y un aumento en la respuesta a diferentes agonistas del sistema NO-GCs-PKG, concretamente nitroprusiato sódico (SNP) y dbGMPc. El tratamiento con antagonistas del sistema del NO revertió la hipotensión en los ratones H-Ras -/-. Además, estos animales presentaron un mayor contenido proteico y actividad de eNOS, GCs (¿) y PKG I en pared vascular que los ratones control. Los resultados obtenidos sugieren que H-Ras se podría considerar una diana terapéutica en el campo del tratamiento para la hipertensión.

El condrocito es la única célula presente en el cartílago articular, por lo que es de gran importancia el conocimiento de los mecanismos que regulan sus funciones, en particular los mecanismos de transporte de membrana que le permiten a esta célula enfrentar los continuos cambios de la osmolaridad externa a que están sometidos como consecuencia de las variaciones en la carga mecánica. Los mecanismos implicados en la regulaciín del volumen intracelular, el pH intracelular, la concentraciín citoplásmica de calcio y el potencial de membrana son claves para la comprensiín de los procesos que se afectan con el desarrollo de la enfermedad, puesto que cualquier alteraciín de la homeostasis del condrocito articular afecta el metabolismo de los componentes de la matriz extracelular y por ende, las características funcionales del tejido. El presente artículo revisa los principales elementos funcionales del condrocito articular y su entorno en el contexto del transporte de membrana y su regulaciín.