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11 Pág. Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA), The identification of the vertebrate blood meal sources of mosquitoes allows insight to better understand the dynamics of vector-borne pathogens. To do so, different approaches have been used, based on the use of the remains of blood present in the abdomen of recently engorged mosquito females. Among others, different authors have used serological techniques to the more recently developed approaches based on host DNA amplification or mass spectrometry. These methods have allowed researchers to identify the vertebrate hosts of mosquitoes accurately to the species level or, even, at the individual level, providing information on the relative importance of different mosquito species in the transmission of particular pathogens. These approaches have been especially relevant to reveal the contact rates between vectors, susceptible and competent hosts, and mosquito-borne pathogens, including zoonotic ones. Additionally, these methods have revealed important asymmetries in the attraction of mosquitoes towards different host species, allowing to identify key vertebrates for the amplification of some pathogens. This chapter reviews those tools most frequently used for the identification of the blood meals of mosquitoes in order to highlight the main advantages and limitations of these methodologies., This study was funded by the projects PGC2018-095704-B-I00 and PID2020-118205GB-I00 from the Spanish Ministry of Economy and Competition cofinanced by the European Regional Development Fund (FEDER). RGL was partially supported by a Margalida Comas contract from the Government of the Balearic Islands cofinanced by the European Regional Development Fund (FEDER) (REF-PD/038/2019) and a Juan de la Cierva-Formación contract.

The intensification of agriculture, animal husbandry and the expansion of cities, has led to changes in environmental conditions, reduced biodiversity and altered interactions between organisms affecting many ecological processes, involving pathogen transmission. In addition, detrimental effects of habitat anthropization on the life history of many species of birds have been reported, including in some species apparently thriving in urban areas. Urbanization affects not only the life history, abundance, and composition of vertebrate communities, but also those of hematophagous insects living in these areas and, consequently, the vector-borne pathogens they transmit. Urbanization can alter the incidence and distribution of vector-borne parasites, as well as the susceptibility of vertebrates to infectious diseases through its effects on host immunocompetence. In this thesis, I used a multidisciplinary approach to determine how the dynamics of vector-borne parasites are affected by habitat anthropization, and how the joint effects of anthropization and parasite infections impact the health of wild birds. For this purpose, I focussed on the widespread vector-borne parasites of the genus Plasmodium, commonly known as avian malaria parasites, and the related genera Haemoproteus and Leucocytozoon, which were molecularly identified. In addition, I used the house sparrow (Passer domesticus), one of the best examples of urban exploiter historically associated with human settlements, as the avian study model species. Since the 1970s, this bird species has been suffering a dramatic decline across Europe, especially in cities, with human activities and infectious diseases being identified as the main factors. Using an extensive dataset of birds sampled at localities in southern Spain, I first determined how vector-borne parasites dynamics are affected by habitat anthropization (Section 1). To do that, I compared the variation in the prevalence and richness of the three genera of blood parasites over two years in 15 wild house sparrow populations that included urban, rural, and natural habitats (Ch. 1). The prevalence of both Haemoproteus and Leucocytozoon parasites differed and were correlated between years, while no significant differences were found for Plasmodium parasites. Variation in the environmental requirements between vector groups, habitat characteristics and climatic variability strongly determined the stability and activity of vector populations, potentially affecting bird exposure and thus prevalence in the population. Both Haemoproteus and Leucocytozoon richness also varied with habitat and time. Variation in the composition of vector and/or bird communities may affect the number and identity of parasite lineages circulating and infecting house sparrows, but host-related factors and susceptibility may also explain the infection patterns found. Secondly, I determined the impact of both anthropization and parasite infections on the health of wild house sparrows (Section 2). In the three chapters included in this section, I measured three major variables reflecting the health of birds, namely body condition (Ch. 2), the composition of plasma fatty acids (Ch. 3)and the oxidative status (Ch. 4) in relation to Plasmodium, Haemoproteus andLeucocytozoon infection status and including house sparrow populations from urban, rural and natural habitats. Results show that urbanization increased the levels of fatty acids and oxidative damage to lipids and negatively affected bird body condition which, in turn, influenced the activity of antioxidant enzymes. Among other possibilities, this could be due to the low availability of good quality food in urban habitats that prevent birds to fulfil physiological requirements during development resulting in lower body condition, immunocompetence and antioxidant capacity. Moreover, Plasmodium infected juvenile house sparrows had lower proportion of ω-6 and higher proportion of ω-3 PUFAs, as well as lower activity of antioxidant enzymes (GPx, SOD and GR). These results may reflect that, due to the low antioxidant activity of infected birds, only birds with moderate levels of pro-inflammatory fatty acids against parasite infection were likely to survive. Additionally, results from this thesis show that birds exposed to two different sources of stress, namely urbanization and parasite infection, may suffer greater deleterious effects. Birds from natural habitats infected by Plasmodium, showed lower ω-6/ω-3 ratio and tended to have a higher proportion of ω-3. It is likely that, due to differential availability of ω-3 PUFA between habitats, only infected house sparrows from natural habitats can promote a greater anti-inflammatory immune response to Plasmodium infections because the consumption of food rich in ω-3 PUFA. Moreover, higher body condition of juvenile house sparrows was associated with infections by Plasmodium and Haemoproteus, especially in urban habitats. This result may be explained by a higher mortality rate of infected birds with worst body condition unable to respond to infection, consequently, infected individuals surviving to infection were in a higher body condition than uninfected ones. To sum up, in this thesis I provide novel information on the dynamics of vector-borne parasites in anthropized ecosystems and the joint negative effects of urbanization and parasite infections on wild birds. I highlight the importance of also including habitats with different landscape uses, such as rural habitats, in the studies of urbanization impact, where the effect of human activities and domestic animals on wildlife may differ from cities. Moreover, pollutants levels, availability of green spaces or the stability of resources may widely differ among cities, which may determine the final effects on wildlife health and the interpretation that researchers can make of the impact of urbanization. This work contributes to the growing area of Urban Ecology and may help to better understand the effects that both urbanization and pathogens have on the ecology and evolution of wildlife under the current scenario of global change

Las últimas décadas han presenciado una acelerada emergencia o el resurgimiento de enfermedades transmitidas por vectores (ETVs) en muchas áreas geográficas, afectando a humanos, animales salvajes y domésticos, lo que representa una gran amenaza para la salud pública y la conservación de la biodiversidad. A pesar del impacto médico y económico de las ETVs, la ecología de estas, especialmente las interacciones entre los hospedadores y los vectores, aún son insuficientemente conocidas. Los estudios epidemiológicos previos han asumido tradicionalmente una interacción aleatoria entre hospedadores y vectores, ignorando los posibles efectos de la heterogeneidad en las características del hospedador, tales como el estado de salud del individuo y la historia evolutiva, en las tasas de transmisión de patógenos. La falta de reconocimiento e incorporación de los posibles efectos de las características del huésped en los modelos epidemiológicos podría dar lugar a estimaciones sesgadas de la dinámica de transmisión de ETVs. Por lo tanto, los cuatro capítulos incluidos en esta tesis se centran en el estudio de los efectos de la heterogeneidad de ciertos rasgos del hospedador en las interacciones hospedador-vector a nivel tanto inter como intraespecífico. Aunque algunos patógenos transmitidos por vectores (PTVs) causan enfermedades en humanos, la mayoría de ellos son zoonóticos, siendo la fauna silvestre el hospedador vertebrado primario. Los mosquitos son vectores primarios de muchos PTVs, como el Plasmodium aviar y el virus de West Nile (WNV). Dado el importante papel de los mosquitos y los hospedadores silvestres en el ciclo de transmisión de los PTVs, en esta tesis se utilizó principalmente un patógeno transmitido por los mosquitos, el Plasmodium aviar, sus vectores naturales Culex pipiens y Culex restuans y el hospedador vertebrado Gorrión Común (Passer domesticus) como sistema de estudio. Las características del huésped pueden tener una profunda influencia en la interacción entre este y los mosquitos, ya que los mosquitos basan su búsqueda de alimento en ciertas características del hospedador, lo que resulta en una preferencia de alimentación que da lugar a tasas de contacto huésped-vector heterogéneas. La actividad de búsqueda de hospedador por parte de los mosquitos es un proceso integrador que combina múltiples señales. En esta tesis, en primer lugar revisé el papel de las características morfológicas, comportamentales y fisiológicas del huésped en la atracción de los mosquitos. La preferencia de alimentación de los mosquitos es el resultado de las interacciones entre la preferencia por determinados huéspedes y los factores extrínsecos, incluido el atractivo y la disponibilidad de los mismos. La preferencia puede verse afectada por la variación en las características del hospedador, a través de señales olfativas, visuales, y térmicas, entre otras, utilizadas en el proceso de búsqueda de los huéspedes. Las lagunas aún existentes en el conocimiento sobre los efectos de la heterogeneidad de las características del huésped en la preferencia de alimentación de mosquitos ponen de manifiesto la necesidad de realizar estudios específicos tanto teóricos como empíricos sobre este tema. Para determinar el efecto de las características morfológicas y comportamentales del huésped en la preferencia de alimentación de los mosquitos, llevé a cabo un estudio comparativo mediante la combinación de datos sobre tasas de alimentación de mosquitos en una comunidad de aves de América del Norte con datos de morfología y comportamiento de dichas aves. Las aves con plumaje de coloración más clara, tamaño corporal más grande y comportamiento de descanso solitario fueron picadas con mayor frecuencia de lo esperado en función de su abundancia relativa en la comunidad. Este estudio destaca el papel de las características morfológicas y comportamentales del huésped en las diferencias inter-específicas en los patrones de alimentación de los mosquitos. Estos resultados resultan de utilidad en la aplicación de programas de vigilancia de PTVs, pudiendo centrarse en especies de aves más grandes, con hábitos de descanso solitarios y / o de colores más claros como especies focales. Para determinar el papel de las características fisiológicas del huésped en la preferencia de la alimentación de los mosquitos, realicé experimentos de selección doble, consistente en exponer dos gorriones con diferentes tasas metabólicas a Cx. pipiens y analicé la relación entre las preferencias de alimentación del mosquito y el metabolismo del hospedador. Las aves con tasas metabólicas basales más bajas fueron picadas por mosquitos con mayor frecuencia que sus conspecíficos. Esto representa la primera evidencia experimental del vínculo entre el metabolismo del huésped y la preferencia de alimentación del vector. Además, las aves con mayor masa corporal fueron picadas con mayor frecuencia por los mosquitos. Como Cx. pipiens es un vector clave para múltiples PTVs, la identificación de las características que afectan a la preferencia de alimentación de esta especie de mosquito puede arrojar luz sobre la epidemiología de estos patógenos. Para evaluar el impacto de infección del huésped por el patógeno Plasmodium en los patrones de alimentación de los mosquitos, llevé a cabo dos experimentos de selección doble. Así, expuse dos gorriones con diferente estado de infección (es decir, infectados por Plasmodium y no infectados) y con diferente intensidad de infección (a través de un tratamiento que reduce la carga parasitaria, es decir, una carga de Plasmodium más alta frente a una carga más baja) a los mosquitos en búsqueda de alimento. Las aves infectadas con Plasmodium fueron picadas con mayor frecuencia que aquellas infectadas aunque medicadas. Sin embargo, el estado de infección de las aves en sí mismo no afectó significativamente el patrón de alimentación de los mosquitos, siendo las aves infectadas por Plasmodium y no infectadas picadas de manera similar por los mosquitos. Estos resultados apoyan, al menos parcialmente, la hipótesis de la manipulación parasitaria, la cual probablemente opera a través de una reducción en el comportamiento defensivo del hospedador, y destacan la importancia de considerar la carga parasitaria en estudios sobre las interacciones huésped-vector-patógeno. Mediante el uso de un enfoque interdisciplinar que combina estudios comparativos, análisis moleculares y aproximaciones experimentales, esta tesis logra identificar varias relaciones clave entre las características del huésped y la preferencia de alimentación de los mosquitos, a nivel tanto inter como intra-específico, lo que puede ayudar a comprender mejor la dinámica de tasas de contacto entre hospedadores y vectores y, por tanto, la dinámica de transmisión de PTVs. La incorporación de la heterogeneidad de las características del huésped en futuros estudios sobre la ecología de las ETVs puede mejorar nuestro esfuerzo de vigilancia y control de la compleja red de transmisión de ETVs.

Programa de Doctorado en Estudios Medioambientales, Tutor: Francisco Eduardo Narbona Fernández, Los patógenos son agentes biológicos externos que se alojan en un huésped determinado, dañando de alguna manera su anatomía a partir de enfermedades o daños visibles o no. Ambos, patógenos y hospedadores, se encuentran en constante competencia por los recursos, en los que el primero intenta maximizar sus posibilidades de desarrollo y transmisión, mientras que el segundo desarrolla diferentes mecanismos fisiológicos y/o comportamentales de respuesta frente a estos patógenos. En algunos procesos, como en el caso de los patógenos transmitidos por insectos vectores, su ciclo de vida engloba varias fases en las que se alternan estadios de desarrollo en diferentes grupos de hospedadores, incluyendo insectos y vertebrados. Por tanto, en este sentido podemos englobar dentro de la definición de patógenos organismos de muy distinta índole, por ejemplo, virus y protozoos, que en conjunto ejercen un importante papel en la regulación del tamaño y en la dinámica de poblaciones de hospedadores, siendo a su vez importantes factores selectivos que pueden determinar la evolución de sus hospedadores. De manera general, la mayoría de estudios desarrollados hasta la fecha, tanto aplicados como teóricos, se han centrado en modelos y sistemas patógeno-hospedador de elevada especificidad. Es decir, patógenos que afectan a una única o a un número muy reducido de especies hospedadoras debido a la mayor simplicidad de estos sistemas, lo que facilita su abordaje empírico y teórico. Sin embargo, muchos sistemas de enfermedades zoonóticas son generalistas, lo que implica la interacción entre varios patógenos, varias especies de hospedadores, y varias especies de vectores. Los conocimientos sobre la dinámica de transmisión de estos patógenos generalistas son mucho más reducidos, donde, por ejemplo aspectos como el impacto que la diversidad de vectores u hospedadores puede tener sobre la amplificación del patógeno apenas han sido explorados. Por esa razón, el estudio de la transmisión de patógenos por vectores en condiciones naturales requiere un enfoque integrador como el propuesto en esta tesis, que combine el estudio de las comunidades de patógenos, vectores y hospedadores y los factores ambientales que determinan su interacción. En las últimas décadas, el número de enfermedades emergentes se ha incrementado considerándose, en parte, como resultado del cambio global debido, entre otros factores, a la alteración del hábitat natural y el cambio climático. Estas variaciones pueden afectar directamente a la ecología de diferentes enfermedades, muchas de ellas causadas por patógenos transmitidos por vectores, alterando las intensidades de las interacciones vector-hospedador, vector-patógeno o patógeno-hospedador. Cabe destacarse que aproximadamente el 75% de las enfermedades infecciosas emergentes que afectan a los seres humanos mantienen un ciclo vital zoonótico, circulando en la naturaleza a través de poblaciones de vertebrados no humanos. En muchos de estos casos, de hecho, los humanos son solo un hospedador accidental en los que la infección se produce muy raramente. Bajo esa perspectiva, las características del hábitat también se presentan como un elemento fundamental afectando la dinámica de transmisión de los patógenos. Estos efectos tienen un origen multifactorial que pasa por los cambios en la abundancia y diversidad de vectores y de potenciales hospedadores. Varios autores han señalado que la biodiversidad, entendida como riqueza de especies (número de especies diferentes en una localidad), podría jugar un papel fundamental en el control de la epidemias reduciendo la circulación de patógenos, generando un gran debate sobre la importancia de la biodiversidad en el funcionamiento de los ecosistemas. Sin embargo, modelos teóricos recientes sugieren que una mayor biodiversidad de hospedadores puede producir tanto un efecto de dilución (disminución del riesgo de transmisión a humanos u otros organismos focales) como un efecto de amplificación (aumentando el riesgo de transmisión) dependiendo de las características de los patógenos, los reservorios y el comportamiento de los vectores. Aspectos tales como la presencia de determinadas especies en particular por un aumento en la riqueza de especies en un medio podría afectar estas asociaciones. De este modo, considerar la biodiversidad como una medida de la abundancia relativa de cada especie en el medio, y no como la presencia de diferentes especies, podría afectar en gran medida a las predicciones realizadas en este contexto. En esta tesis se estudiarán principalmente dos patógenos transmitidos por mosquitos, como modelos de estudio. Los mosquitos son los principales transmisores de importantes patógenos como los de la malaria, fiebre amarilla o dengue, que ocasionan cuantiosas pérdidas humanas y animales con implicaciones económicas a escala global. Estos sistemas de transmisión engloban tres organismos fundamentales, los hospedadores vertebrados (incluyendo fauna silvestre y doméstica y los seres humanos), los mosquitos como organismos vectores y los patógenos. Tradicionalmente, el estudio de las interacciones entre estos organismos se realizaba parcialmente, dos a dos. No obstante, desde un punto de vista ecosistémico, como ocurre en la naturaleza, es esencial no solo estudiar la interacción entre cada uno de los actores, sino también comprender este proceso con una perspectiva general. Bajo dicho enfoque, el principal objetivo de esta tesis es testar el efecto de la biodiversidad sobre la transmisión de dos patógenos transmitidos por mosquitos: el virus West Nile y los parásitos de la malaria aviar. El virus West Nile (WNV) es un arbovirus de la familia Flaviviridae (flavivirus) para el que las aves son su hospedador primario. De manera accidental, este virus puede producir la infección tanto en mamíferos de interés ganadero (p. ej. caballos) como en humanos. El WNV es un virus re-emergente del viejo mundo, donde ha provocado numerosos brotes en Eurasia y África, su área histórica de distribución. En 1999, el virus se extendió a Norteamérica donde provocó una alta mortalidad en aves y afectó a miles de personas. En el caso de España, parte de la población humana que vive cerca de humedales presenta anticuerpos frente al WNV y aunque escasos, a lo largo de los últimos años se han venido registrando casos de encefalitis en estas poblaciones. En 2004 se registró un caso clínico en humanos en Badajoz y en 2010 dos casos clínicos en la provincia de Cádiz. Más recientemente, durante el año 2016 se han citado tres casos más de posible infección por este virus en poblaciones de Andalucía. Se considera que las aves migratorias pueden actuar como vector de dispersión del WNV, no obstante, donde se la dinámica de transmisión del virus se ha venido estudiando más extensivamente, como en el caso de Doñana y su entorno, existen fuertes evidencias de la circulación activa y permanente del virus en el medio. Por otro lado, en esta tesis se ha estudiado los parásitos sanguíneos de la malaria aviar, entendiéndolos en sentido amplio, incluyendo tanto a los parásitos del género Plasmodium, como los géneros filogenéticamente relacionados Haemoproteus y Leucocytozoon. Aunque los principales vectores de cada uno de estos tres géneros de parásitos difiere, siendo Plasmodium los únicos transmitidos por mosquitos, los ciclos de vida de todos ellos son muy similares incluyendo a las aves como hospedadores vertebrados y diferentes grupos de insectos hematófagos en los que los parásitos desarrollan su reproducción sexual. En conjunto, todos estos patógenos representan un sistema modelo perfecto para los estudios de ecología del parasitismo y de transmisión de enfermedades por insectos vectores. Las especies del género Plasmodium que infectan a las aves se comportan como parásitos generalistas, siendo transmitidos por mosquitos de diferentes géneros, entre los que destacan aquellos del género Culex. Precisamente este aspecto de la transmisión de Plasmodium es un área de estudio en reciente expansión gracias al uso de técnicas moleculares que están poniendo de manifiesto interesantes interacciones entre multitud de insectos potenciales vectores y distintos linajes genéticos de Plasmodium. El ciclo vital de este parásito, al igual que ocurre en la transmisión de los arbovirus, requiere de la participación del insecto hematófago vector, el cual tiene que alimentarse de la sangre de un ave infectada. Recientes estudios han señalado que el actual panorama de cambio climático podría estar favoreciendo un incremento en la prevalencia de infección por malaria en aves, especialmente en África y Europa. Los parásitos de la malaria aviar tienen efectos adversos sobre el estado de salud, éxito reproductor y probabilidad de supervivencia de las aves silvestres, pero a diferencia del WNV, causan infecciones crónicas. Esto permite trabajar directamente con la prevalencia del parásito en lugar de tener que recurrir a la detección de anticuerpos como en el caso del WNV. Para cumplir con el objetivo general de esta tesis hemos trabajado en tres diferentes niveles explorando las interacciones entre los patógenos y sus vectores, los patógenos y los hospedadores y finalmente, un análisis general donde se testa la hipótesis del efecto de la diversidad sobre la transmisión de patógenos., 1) En el primer bloque se incluyen 3 capítulos abordando los siguientes objetivos: - identificar el efecto de las alteraciones del hábitat por los seres humanos sobre la comunidad de mosquitos vectores de patógenos, - estudiar la variación temporal y los efectos de las preferencias de alimentación de los mosquitos sobre la amplificación y transmisión de los parásitos de la malaria aviar por mosquitos, - investigar la red de transmisión de los parásitos de la malaria aviar por Culicoides que infectaban a las aves silvestres. Para ello, se caracterizarán las poblaciones de mosquitos de áreas naturales, rurales y urbanas del Sur de España, explorando las interacciones entre factores ambientales tales como el uso del suelo, el nivel de urbanización, de características hidrológicas y de vegetación con las comunidades de mosquitos (medidas en términos de diversidad y riqueza de especies) y cuantificando las poblaciones de las especies más comunes en este área. Las actividades humanas previsiblemente determinan la composición de las comunidades mosquitos y además inciden en el riesgo de que los humanos entren en contacto con los patógenos que transmiten. Los estudios que he desarrollado han permitido caracterizar la dinámica espacial de las distintas especies de mosquitos presentes en Andalucía Occidental comparando las comunidades de mosquitos en 45 localidades de las provincias de Cádiz, Huelva y Sevilla. Se identificaron así las características ambientales que más afectan a la composición y abundancia de la comunidad de mosquitos, entre las que destacarían la superficie urbanizada y natural del entorno, la distancia a fuentes de agua aptas para la cría de los mosquitos o la densidad poblacional (Capítulo 1). Estos resultados evidencian el fuerte impacto de la urbanización del medio sobre la composición y abundancia de mosquitos. Una vez conocidos los factores que determinan la comunidad de insectos vectores, en el segundo y tercer capítulo se estudiará la dinámica de transmisión de los parásitos de la malaria aviar por parte de estos vectores, investigando su variación temporal, su grado de especificidad y el efecto del comportamiento de alimentación utilizando para ello dos modelos de estudio, los mosquitos y los jejenes del género Culicoides. Mediante técnicas moleculares de amplificación y secuenciación de ADN hemos determinado el estado de infección de los mosquitos por Plasmodium e identificado los patrones de alimentación de estos vectores. Hemos encontrado que el comportamiento de alimentación influenció la tasa de infección por parásitos aviares en los mosquitos, presentando aquellas especies ornitofílicas (que preferían alimentarse en aves) valores más altos respeto a los especies más encuentran en los mamíferos su principal fuente de alimento. Al mismo tiempo, la tasa de infección en mosquitos aumentó entre las estaciones del año, alcanzando su máxima prevalencia en otoño. Finalmente, no se identificaron claras diferencias en la prevalencia de cada linaje genético con respecto a las especies de mosquitos, lo que sugiere una baja especificidad en la transmisión de estos patógenos por las diferentes especies de mosquitos presentes en el área (Capítulo 2). Además, se estudió la diversidad de parásitos de la malaria aviar transmitidos por Culicoides y la prevalencia y diversidad de estos parásitos en aves acuáticas del entorno de Doñana con el fin de identificar las potenciales redes de transmisión de estos parásitos. Utilizando una aproximación molecular, se identificaron algunos nodos de la red parásitos-vectores-aves mediante la comparación de linajes de Plasmodium y Haemoproteus aislados en los insectos con aquellos que infectaban a las aves silvestres, incluyendo algunas especies amenazadas. En conjunto, estos tres capítulos suponen un paso fundamental para identificar los factores que determinan la comunidad de vectores y permiten conocer los patógenos y los factores que determinan la interacción con estos vectores en el área. Este paso es esencial para abordar el estudio de las redes de transmisión de estos patógenos en condiciones naturales (Capítulo 3). 2) En el segundo bloque se abordó el estudio de la interacción entre los patógenos y los hospedadores vertebrados, afrontando los siguientes objetivos: - determinar la prevalencia de anticuerpos frente a WNV en aves presentes en áreas próximas a granjas con de interés ganadero. - investigar el impacto de la composición del hábitat y de la comunidad de mosquitos y vertebrados sobre la comunidad de parásitos del genero Plasmodium. Para ello, primero se caracterizó la prevalencia de anticuerpos de WNV en diferentes poblaciones de aves silvestres, mayoritariamente paseriformes, de Andalucía Occidental. Durante el año 2013, se constató la circulación local del WNV en aves en lugares próximos a zonas con brotes declarados en caballos. Anticuerpos contra el WNV fueron confirmados en un ejemplar juvenil de curruca cabecinegra (Sylvia melanocephala) residente, suponiendo el primer apoyo a la transmisión local del WNV en el sur de España durante 2013 (Capítulo 4). Cabe destacar la metodología empleada en este estudio, donde las muestras fueron primero testadas utilizando un kit ELISA específico para flavivirus en aves y posteriormente confirmadas por pruebas de neutralización utilizando formas víricas de frente a los virus WNV y USUTU. Seguidamente se estudió como las características del hábitat y de las comunidades de vectores y vertebrados (aves y mamíferos), representan un factor clave para determinar la prevalencia y diversidad de parásitos de la malaria aviar en las aves silvestres. La dinámica de transmisión de los parásitos de la malaria aviar del género Plasmodium, puede verse afectada por la estructura y composición de la comunidad de vectores (distribución, abundancia y diversidad de especies de mosquitos), de la comunidad de vertebrados (por la disponibilidad de hospedadores susceptibles a la infección) y por las características ambientales, probablemente debido a su impacto sobre la biología de vectores y vertebrados (p.ej. uso del suelo). Estos resultados contribuyen a la comprensión de la variación geográfica observada en los linajes de Plasmodium y la dinámica de transmisión de patógenos transmitidos por mosquitos en el medio silvestre. Elegimos al gorrión común como organismo modelo de este estudio porque es una especie generalista que se puede muestrear en localidades con distinto grado de perturbación antrópica permitiendo la comparaciones entre diferentes tipos de hábitat (ver capítulo 1), además de ser un hospedador competente para la transmisión de los parásitos de la malaria aviar y WNV (ver capítulos sucesivos). Basándonos en información previa, el estudio se centró en las especies de mosquitos del género Culex, debido a su abundancia e implicación en la transmisión de Plasmodium (de acuerdo a capítulo 2). En particular, se identificó como la prevalencia, diversidad y riqueza de los linajes de Plasmodium se veían afectados por i) la comunidad de mosquitos; ii) las comunidades de aves y mamíferos; iii) las características ambientales, siendo la distancia a diferentes fuentes de agua, entre otras, variables ambientales las que pudieran afectar en mayor medida en la dinámica de transmisión de estos parásitos. Se identificó como factores ligados a la comunidad de hospedadores fueron más relevantes para identificar los patrones de variación de la riqueza de parásitos en las diferentes localidades, mientras que aspectos ligados a la comunidad de vectores fueron más determinantes para explicar la prevalencia de parásitos en las aves (Capítulo 5). En conjunto, estos estudios permitieron identificar la prevalencia y diversidad de patógenos transmitidos por vectores que infectan a las aves silvestres e identificar aquellos factores que determinan su dinámica de transmisión. 3) En el tercer bloque se pretende determinar los efectos potenciales de la biodiversidad en general, o la presencia de algunas especies de vector y/o hospedador, sobre la dinámica de transmisión de patógenos aviares, englobando los siguientes objetivos: - estudiar la importancia de las poblaciones de diferentes especies de mosquitos sobre la transmisión de WNV a las aves silvestres. - determinar el papel de la diversidad de la comunidad de mosquitos y vertebrados sobre la amplificación de patógenos transmitidos por vectores. Para ello, se estudió la de la composición de las comunidades de mosquitos (riqueza y abundancia de las especies más comunes) sobre la dinámica de transmisión del WNV en poblaciones de aves silvestres, utilizando el gorrión común como modelo de estudio. Se observaron asociaciones entre las abundancias de diferentes especies de mosquitos y la seroprevalencia del WNV en las aves (medida de acuerdo al Capítulo 4), aunque el sentido de estas asociaciones difirió en función de su patrón de alimentación de los mosquitos y su riesgo relativo de transmisión de este patógeno. De acuerdo a lo esperado según estudios previos, se observó que la abundancia de Culex perexiguus mostró una asociación significativa y positiva con la prevalencia de WNV en las diferentes poblaciones de aves (Capítulo 6). El hecho de que las aves con anticuerpos frente a WNV se encontraron en áreas naturales y rurales (con baja densidad de población humana) podría explicar la baja incidencia de WNV en los seres humanos en el área de estudio, a pesar de la circulación local del virus. Además, hemos proporcionado pruebas de la importancia de la vigilancia de mosquitos para comprender los ciclos naturales de WNV y otros flavivirus en la naturaleza, confirmado el papel crucial de la especie Culex perexiguus en la circulación del WNV en el Sur de España. Finalmente, integrando los conocimientos adquiridos en los capítulos anteriores sobre la ecología de las interacciones de patógenos transmitidos por vectores y sus interacciones con la comunidad de mosquitos y de vertebrados, se testó la hipótesis del efecto dilución en nuestro sistema compuesto por 4 patógenos aviares transmitidos por diferentes vectores (Capítulo 7). Esto permitió determinar los efectos potenciales de la biodiversidad en general, y de la presencia de distintas especies en particular, sobre la amplificación de estos patógenos y su transmisión a humanos u otras especies de interés ganadero. Para ello, se utilizó el gorrión común como modelo de hospedador vertebrado y datos de censos de las comunidad de aves y mamíferos ya empleados en capítulos anteriores. Se encontró que no existe una relación significativa en término general que nos permita asumir que la biodiversidad tenga un efecto dilución sobre la transmisión del WNV y de los parásitos de los géneros Plasmodium, Haemoproteus y Leucocytozoon, no encontrando apoyando para la universalidad de este fenómeno. No obstante, las complejas relaciones entre la biodiversidad y la epidemiología de los patógenos transmitidos por vectores pueden estar impulsadas por otros factores, incluyendo la presencia de ciertas especies en particular de hospedadores y/o de vectores en el ecosistema. Por eso, estudios de este tipo son fundamentales para comprender mejor la importancia de la biodiversidad de las comunidades de vectores y vertebrados sobre el riesgo de transmisión de patógenos y desarrollar estrategias de gestión (es decir, planes de control de plagas de mosquitos o de vacunas de aves en las ciudades más afectadas) para reducir su riesgo de transmisión y amplificación. En conjunto, en esta tesis se une el estudio de la biodiversidad de las comunidades de vertebrados (hospedadores) y la ecología de los vectores (mosquitos), para intentar comprender la heterogeneidad de las dinámicas espaciales en la distribución de los patógenos WNV y Plasmodium, así como el riesgo de exposición de los distintos grupos de vertebrados en hábitats naturales y antropizados. He investigado la dinámica de transmisión de estos patógenos con un enfoque integrativo, partiendo de la descripción de los factores que afectan la comunidad de vectores y su interacción con diferentes grupos de patógenos, para continuar abordando el estudio de los factores bióticos y abióticos que determinan la infección de las aves silvestres y finalmente identificar como la biodiversidad en general determina la exposición y éxito de transmisión a las aves de los patógenos que circulan naturalmente en el área. Esta tesis supone un paso fundamental para comprender una de las preguntas más importantes actualmente en estudios de ecología y evolución de transmisión de patógenos por vectores y se beneficia de un enfoque multidisciplinar que engloba herramientas de estudio de disciplinas tan dispares como la ecología, la parasitología, la ornitología y la entomología. A modo informativo sobre el estado de las publicaciones que formarán parte de esta tesis, los primeros 4 Capítulos han sido publicados en revistas incluidas en el Journal of Citation Reports (Scientific Reports, PloS ONE, Parasites & Vectors y Epidemiology and Infection) donde soy primera autora de todos ellos (compartiendo primera autoría en uno). Además, el Capítulo 5, del que soy primera autora, se encuentra bajo revisión en la revista Journal of Animal Ecology. Finalmente, los manuscritos correspondientes a los Capítulos 6 y 7, en la que soy primera autora en uno de ellos y segunda (compartiendo primera autoría) en el otro, se encuentran pendientes de ser enviados para su publicación., Universidad Pablo de Olavide. Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímica, Postprint

Programa de Doctorado en Estudios Medioambientales, Biological species are distributed across the earth's surface according to their ability to disperse and the set of environmental conditions that fulfil their ecological niche, which limit their potential dispersal range.For species lacking the ability to move by themselves, such as plants, dispersal must be mediated by a vector that transports them. In inland aquatic ecosystems many taxa that produce propagules, such as macrophytes and invertebrates, rely on a variety of dispersal vectors for overland dispersal, i.e. between isolated waterbodies. Sorne of these vectors may disperse propagules over long distances (long distance dispersal,LOO), depending on their nature or movement behaviour.In particular, migratory waterbirds have been shown to disperse large amounts of propagules, but their potential to disperse propagules during active migration has been poorly studied. Furthermore, realistic estimates of long distance propagule dispersal had never been produced, because, besides flight speed, waterbird movement behaviour had never been incorporated into dispersal models. In Chapter 1 we developed mechanistic models of passive dispersal of macrophytes and zooplankton that integrated (i) movement data (based on recoveries of ringed individuals) of two waterfowlspecies, collected for over a century during the fall migration season,(ii) propagule retention time in the birds¿ gut, and (iii) bird flight speed. 8oth waterfowl species had the potential to disperse propagules over hundreds of kilometres, but the frequency and distance of dispersal events, namely those of LOO events (i.e. those produced by migratory movements), differed between migratory strategies and regions (Europe and North America}, as well as between different vectored aquatic species, in particular between plant seeds and zooplankton cysts. Although dispersal distances were shorter than those based only on the vector flight speed, they suggest that the propagules of aquatic organisms may be dispersed regularly over tens of kilometres and occasionally over hundreds of kilometres (i.e. at continental scale). Different migratory vectors might then contribute differently to the dispersal of a given aquatic organism (because of, among other factors, different migratory behaviours; Chapter 1), thus its full dispersal potential has to be estimated according to the full array of vectors.In Chapter 2,we estimated propagule dispersal by migratory birds by using a wide range of both waterbird and vectored aquatic species, and determined key features of bird movement and propagule retention time involved in the dispersal process (by means of a sensitivity analysis).Bird size scaled to these key features (related to migratory flight distance and propagule retention time), providing a simple analytical tool to investigate the potential of each migratory bird species as vector of long distance propagule dispersal. Moreover, the inclusion of several waterbird species and the examination of some traditional model assumptions allowed to estimating the range of LOO frequency (0-3.5% of dispersal events longer than 100 km). Nevertheless, empirical and direct evidence on propagule dispersal by migratory vectors during active migration had never been obtained. We investigated whether migratory birds flying southward, between Europe and Africa, during autumn migration were carrying propagules in their digestive tract (Chapter 3). This study was conducted in a small islet of the Canary lslands (Alegranza) where Eleonora's falcons prey upon migratory birds along their migration route (though blown off their usual course by trade winds). All migratory birds were caught while in migratory flight over the sea, in an area between Alegranza and the African coast, as proven by the analysis of locations provided by GPS-tagged falcons. We sampled the digestive tracts of 408 migratory birds stored around the falcons' nests and found that 1.2% of these birds (two passerine and one galliform species) were transporting seeds (57 seeds of five different families) while in migratory flight. Most seeds belonged to plant families currently absent from the Canary lslands, or at least from those nearby Alegranza (the Eastem group). We therefore conclude that migrating birds are actually able to ensure long-distance dispersal of ingested propagules,even across continents or into oceanic islands. Moreover, the absence of plant species dispersed by migratory birds from either the whole Canary lslands or the closest (and driest) ones indicates that the local environment (abiotic and/or biotic) probably hamper their successful establishment. We then investigated whether the high dispersal potential of organisms dispersed by migratory birds is reflected in their communities by quantifying the effect of spatial (i.e. regional) processes,representing dispersallimitation, on diversity patterns. Using variation partitioning analyses, we assessed the relative importance of spatial and niche processes in driving species richness (¿-diversity;Chapter 4) and variation in species composition (-diversity; Chapter 5) in natural communities of aquatic plants (aquatic angiosperms) and cladocerans (crustacean zooplankton) at local, regional (within-region: up to 300 km) and continental (among-region) scales.In Chapter 4 the lack of spatial correlation among the species richness of the sampled lakes after partialling out the effect of environmental variation suggested weak dispersal limitation within regions. Although some connectivity-related variables (amount of nearby habitat) had a significant effect, the environment had a much stronger effect on species richness, particularly the total phosphorus concentration (a surrogate of productivity in many aquatic systems). Region was the most important factor in explaining variation in species richness, which indicates an important effect of biogeographic factors such as the number of unique species found in each region (i.e. the levelof "endemicity" in the study). Variation in community composition was mostly explained by species turnover rather than by gradual species loss (i.e. nestedness), both within and among regions {Chapter 5).In addition, the spatial structure of lakes within regions, including the distance among them, did not influence the variation in community composition, meaning that these communities are not generally limitad by dispersal. Rather, both biotic and abiotic variables, and to a lesser extent connectivity variables, explained the majority of the variation in community composition. Much of this environmental variation was regionally structured,in particular climatic variables (temperatura and precipitation), which resultad in high variation in community composition among regions. The pure effect of region was also significant, providing evidence for biogeographic patterns ¿ which might be reinforced by dispersal limitation at continental scale. Although spatial and niche processes could explain many diversity patterns, we observed an extremely high species turnover at short spatial scales.even among nearby lakes where environmental conditions are more similar and dispersal limitation is almost inexistent. In Chapter 6 we investigated experimentally whether the resident community of either macrophytes or zooplankton could prevent immigration, through priority effects (i.e. whether the time of arrival influenced immigration success) and diversity resistance (i.e. whether increased resident diversity caused less immigration); and whether these effects could ultimately determine the species richness and composition of such communities. Strong priority effects were observed in the assemblages of both taxa. In macrophyte communities, increasing resident diversity along the growth season reinforced priority effects (i.e. increased diversity resistance), whereas strong priority effects exerted by the founder organisms (since the very beginning of community assembly) constrained the invasibility of zooplankton communities. Overall, 1 conclude that migratory movements of birds can mediata long distance propagule dispersal (over distances of more than 100 km) and influence the community ecology and biogeography of vectored organisms. Different migratory bird species, acting as propagule vectors, can provide different but complementary dispersal services depending on their body size and in turn on their migratory strategy. Waterbirds, in particular,have the potential to disperse propagules regularly over tens of kilometres and occasionally (up to 3.5% of the dispersal events) over more than 100 km. In fact, vectored aquatic organisms are not generally limited by dispersal, although connectivity-related factors might affect species diversity in some regions. lnstead,niche processes largely determine ¿- and -diversity through abiotic and biotic filtering. Dispersal limitation might only be detectable at continental scale and thus reinforce compositional heterogeneity at broad scale (i.e. promote biogeographic patterns).Finally, priority effects (which, depending on the taxon,might be reinforced by diversity resistance) might explain the high species turnover observed at short spatial scale.In combination with long distance propagule dispersal,priority effects might explain the "mosaic" distributional patterns of aquatic communities. This thesis provides a general framework that can be used for hypotheses testing relating LOO mediated by migratory birds to its hypothesised ecological and biogeographical consequences., Universidad Pablo de Olavide. Centro de Estudios de Postgrado

Tesis doctoral inédita. Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Ecología . Fecha de lectura: 29-11-2010

Memoria presentada por el Licenciado Joaquín Muñoz García para optar al título de Doctor en Biología por la Universidad de Sevilla. 2009

Vector-borne pathogens cause important diseases such as malaria and are nowadays a major public health concern, because they cause human –and animal- fatalities worldwide and have a significant impact on local economies. Factors associated to global change, such as habitat alteration and introduction of invasive species, have largely contributed to the spread of potential insect vectors and the pathogens they are able to transmit, thus creating novel epidemiological scenarios. Therefore, it becomes essential to study the factors that modulate the transmission risk of these disease agents involving the interactions between vertebrate hosts (humans and other animals), pathogens and insect vectors in natural ecosystems. In this thesis, I used a multidisciplinary approach combining molecular tools, experimental bioassays and statistical analyses to assess the ecological and evolutionary factors that affect the transmission success of two mosquito-borne pathogens. In particular, I considered the interactions between insect vectors, vertebrate hosts, the avian malaria parasites and the flavivirus Zika virus. I focused on two major steps directly influencing the pathogen transmission success: i) the contact rate between mosquitoes and infected/susceptible vertebrate hosts and ii) the development of the pathogen in the mosquito and its consequences on the pathogen transmission risk. To do that, first I tested the potential causes underlying differences in the biting patterns of mosquito species. I exposed two bird species to two mosquito species to determine the role of mosquito species identity and effect of three host-related factors on host-vector contact rates (i.e. body mass, gender, and infection status by avian malaria). I found clear interspecific differences in the biting rates of mosquitoes, which were also influenced by variation in hosts’ traits, although these effects differed depending on the particular mosquito-host assemblage. Therefore, the biting patterns of mosquitoes are far from being generalizable. Secondly, I assessed the vector competence of different mosquito species for the transmission of Zika virus and avian malaria using mosquito saliva. I found that the ability of mosquito-borne pathogens to develop in mosquitoes differed between insect species, which may be the result of complex co-evolutionary processes. In addition, I assessed the consequences of parasite development in the mosquito vectors and their implications for the pathogen transmission risk. I found that host parasite load and parasite identity play affect the impact of parasites on mosquito longevity finally determining the transmission risk of the parasites. With this information mostly derived from studies under controlled conditions, I assessed the importance of environmental conditions affecting the host-parasite-vector assemblages in the wild. I found that habitat characteristics, which determine the existence and abundance of insect vectors, and host related factors (i.e. immune-competence) determines the prevalence of avian malaria parasites in insular ecosystems. Altogether, in this thesis I identified key factors affecting the transmission success of vector-borne pathogen affecting humans or wildlife allowing a better understanding the complex transmission dynamics of vector-borne pathogens. Los patógenos transmitidos por vectores que causan enfermedades importantes como la malaria son a día de hoy un importante problema de salud pública, ya que causan numerosas muertes humanas y animales en todo el mundo teniendo un gran impacto en la economía local. Factores asociados al cambio global, así como la alteración del hábitat y la introducción de especies invasoras, han contribuido en gran medida a la expansión de posibles insectos vectores y de patógenos que pueden transmitir, creándose nuevos escenarios epidemiológicos. Por lo tanto, es esencial estudiar aquellos factores que influyen en el riesgo de transmisión de estos patógenos considerando las interacciones entre los huéspedes vertebrados (humanos y otros animales), los patógenos insectos vectores en los ecosistemas naturales. En esta tesis, mediante un enfoque multidisciplinario que combina herramientas moleculares, bioensayos experimentales y análisis estadísticos, se evalúan los factores ecológicos y evolutivos que afectan al éxito de transmisión de dos patógenos transmitidos por mosquitos. En particular, se consideraron las interacciones entre los parásitos de la malaria aviar y el virus (flavivirus) del Zika.y sus insectos vectores y hospedadores vertebrados, En concreto, me centro en dos procesos principales que influyen directamente en el éxito de la transmisión de patógenos: i) la tasa de contacto entre mosquitos y hospedadores vertebrados infectados/susceptibles y ii) el desarrollo del patógeno en el mosquito y sus consecuencias sobre el riesgo de transmisión de estos. Para ello, primero estudié las posibles causas que subyacen a las diferencias en los patrones de alimentación de las especies de mosquitos. Se expusieron dos especies de pájaros a dos especies de mosquitos para determinar el papel de la especie de mosquito y el efecto de tres factores relacionados con el hospedador vertebrado sobre las tasas de contacto entre el hospedador y el vector (masa corporal, género e infección por parásito de la malaria aviar). Encontré claras diferencias inter-específicas en las tasas de picadura de los mosquitos, que también se vieron influenciadas por la variación en los rasgos de los hospedadores, aunque estos efectos difirieron dependiendo de la asociación mosquito hospedador. Por lo tanto, los patrones de alimentación de los mosquitos parecen estar lejos de ser generalizables. En segundo lugar, estudié la competencia vectorial de diferentes especies de mosquitos para la transmisión del virus del Zika y de parásitos de la malaria aviar utilizando la saliva del mosquito. Descubrí que la capacidad de desarrollo de los patógenos difería entre las especies de mosquitos, pudiendo esto ser el resultado de complejos procesos coevolutivos. Además, evalué las consecuencias que tiene el desarrollo de los parásitos en los mosquitos en el riesgo de transmisión de estos. También encontré que tanto la carga parasitaria del hospedador vertebrado como la identidad del parásito afectan a la longevidad de los mosquitos y consecuentemente determina el riesgo de transmisión de los parásitos. Con esta información, derivada principalmente de estudios en laboratorio, con condiciones controladas, evalué como afectan las condiciones ambientales a las asociaciones entre hospedador-parásito-vector en la naturaleza. Descubrí que las características del hábitat, las cuales van a determinan la existencia y abundancia de insectos vectores, así como los factores relacionados con el huésped (inmunocompetencia), determinan la prevalencia de parásitos de la malaria aviar en los ecosistemas insulares. Premio Extraordinario de Doctorado US