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Orientadora: Profa. Dra. Iara José de Messias-Reason Coorientadora: Profa. Dra. Jane Manfron Budel Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna e Ciências da Saúde. Defesa : Curitiba, 28/09/2021 Inclui referências Resumo: Piper amalago L. (Piperaceae) é uma planta medicinal encontrada na América Central e do Sul que possui atividades anti-inflamatória, antimicrobiana, anti-litíase e usada como agente cicatrizante de feridas, queimaduras, abcessos, furúnculos e picadas de insetos. O objetivo deste estudo foi analisar a composição química e a atividade antimicrobiana de óleos voláteis e os possíveis efeitos do extrato aquoso liofilizado obtidos de folhas de P. amalago em diferentes concentrações e em diferentes tempos de incubação, utilizando o modelo in vitro de fibroblastos de camundongo (3T3). O óleo essencial foi obtido por hidrodestilação e a análise da atividade antimicrobiana foi realizada em discos de papel filtro impregnados com óleo volátil contra cepas de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Enterococcus faecalis e Escherichia coli. O extrato aquoso foi testado em fibroblastos de camundongo (3T3) em diferentes concentrações por 24 horas para a avaliação da viabilidade celular através do vermelho neutro; da viabilidade celular pelo MTT; da adesão celular e do grau de espraiamento; da determinação de proliferação celular pelo cristal de violeta; da análise morfológica através de microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura; detecção de microfilamentos de actina através de citoquímica de fluorescência. No tempo de exposição por 96 horas ao extrato, os ensaios foram realizados para determinar a concentração de hidroxiprolina e a atividade da metaloproteinase MMP2. No estudo dos óleos voláteis obtidos de folhas de Piper amalago foram identificados 28 compostos que representam 99,35% de seus constituintes. Na análise de atividade antimicrobiana, o óleo essencial resultou em zona de inibição para as cepas de Enterococcus faecalis e Staphylococcus aureus. O extrato aquoso obtido de folhas de P. amalago sobre a linhagem de fibroblastos (3T3) apresentou as seguintes atividades: modulação positiva no grau de disseminação celular, proliferação celular, adesão, coesão intercelular e produção de colágeno. Esses resultados endossam o uso etnofarmacológico de P. amalago como agente cicatrizante de feridas e queimaduras pelas comunidades da América Central e do Brasil, podendo ser importante no desenvolvimento de novos fitomedicamentos. Palavras-chave: Jaborandi-manso. Óleos voláteis. Extrato aquoso. Atividade antimicrobiana. Fibroblastos 3T3. ABSTRACT Piper amalago L. (Piperaceae) é uma planta medicinal encontrada na América Central e do Sul que possui atividades anti-inflamatória, antimicrobiana, anti-litíase e usada como agente cicatrizante de feridas, queimaduras, abcessos, furúnculos e picadas de insetos. O objetivo deste estudo foi analisar a composição química e a atividade antimicrobiana de óleos voláteis e os possíveis efeitos do extrato aquoso liofilizado obtidos de folhas de P. amalago em diferentes concentrações e em diferentes tempos de incubação, utilizando o modelo in vitro de fibroblastos de camundongo (3T3). O óleo essencial foi obtido por hidrodestilação e a análise da atividade antimicrobiana foi realizada em discos de papel filtro impregnados com óleo volátil contra cepas de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Enterococcus faecalis e Escherichia coli. O extrato aquoso foi testado em fibroblastos de camundongo (3T3) em diferentes concentrações por 24 horas para a avaliação da viabilidade celular através do vermelho neutro; da viabilidade celular pelo MTT; da adesão celular e do grau de espraiamento; da determinação de proliferação celular pelo cristal de violeta; da análise morfológica através de microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura; detecção de microfilamentos de actina através de citoquímica de fluorescência. No tempo de exposição por 96 horas ao extrato, os ensaios foram realizados para determinar a concentração de hidroxiprolina e a atividade da metaloproteinase MMP2. No estudo dos óleos voláteis obtidos de folhas de Piper amalago foram identificados 28 compostos que representam 99,35% de seus constituintes. Na análise de atividade antimicrobiana, o óleo essencial resultou em zona de inibição para as cepas de Enterococcus faecalis e Staphylococcus aureus. O extrato aquoso obtido de folhas de P. amalago sobre a linhagem de fibroblastos (3T3) apresentou as seguintes atividades: modulação positiva no grau de disseminação celular, proliferação celular, adesão, coesão intercelular e produção de colágeno. Esses resultados endossam o uso etnofarmacológico de P. amalago como agente cicatrizante de feridas e queimaduras pelas comunidades da América Central e do Brasil, podendo ser importante no desenvolvimento de novos fitomedicamentos. Abstract: Piper amalago L. (Piperaceae) is a medicinal plant found in Central and South America that has anti-inflammatory, antimicrobial, anti-lithiasis activities and used as a healing agent for wounds, burns, abscesses, boils, and insect bites. The aim of this study was to analyze the chemical composition and antimicrobial activity of volatile oils and the possible effects of the lyophilized aqueous extract obtained from P. amalago leaves at different concentrations and at different incubation times, using the in vitro mouse fibroblast model (3T3). The essential oil was obtained by hydro distillation and the analysis of antimicrobial activity was performed on filter paper discs impregnated with volatile oil against Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Enterococcus faecalis and Escherichia coli strains. The aqueous extract was tested on mouse fibroblasts (3T3) at different concentrations for 24 hours to assess cell viability through neutral red; cell viability by MTT; cell adhesion and degree of spreading; determination of cell proliferation by crystal violet; morphological analysis through light microscopy and scanning electron microscopy; detection of actin microfilaments by fluorescence cytochemistry. At the 96-hour exposure time to the extract, assays were performed to determine the hydroxyproline concentration and the metalloproteinase MMP2 activity. In the study of volatile oils obtained from P. amalago leaves, 28 compounds were identified that represent 99.35% of its constituents. In the analysis of antimicrobial activity, the essential oil resulted in an inhibition zone for the strains of Enterococcus faecalis and Staphylococcus aureus. The aqueous extract obtained from P. amalago leaves on the fibroblast lineage (3T3) showed the following activities: positive modulation in cell dissemination degree, cell proliferation, adhesion, intercellular cohesion, and collagen production. These results support the ethnopharmacological use of P. amalago as a healing agent for wounds and burns by communities in Central America and Brazil and may be important in the development of new phytomedicines.

La Fibrosis Pulmonar idiopática (FPI) está definida como una neumonía intersticial fibrosante crónica de causa desconocida, progresiva y fatal que afecta fundamentalmente a adultos mayores de 60 años, limitada a los pulmones y asociada con el patrón histopatológico de neumonía intersticial usual (NIU). La ausencia de manifestaciones específicas de la FPI supone un obstáculo para su detección temprana. Es una enfermedad de diagnóstico difícil y tardío, con un abordaje terapéutico de eficacia reducida. Estas características suscitan la necesidad de encontrar nuevos biomarcadores asociados a la fibrosis y nuevas dianas terapéuticas para un diagnóstico temprano e incrementar la calidad y esperanza de vida de los pacientes. La patogenia de la enfermedad conlleva una pérdida de células epiteliales alveolares, una proliferación de fibroblastos y su transformación a miofibroblastos, en un ambiente de remodelación de la matriz extracelular producida por un desequilibro de factores de secreción y solubles. Este microambiente fibrótico favorece la senescencia celular, la adquisición de fenotipo mesenquimal y/o asociado al miofibroblasto, así como cambios en el metabolismo celular. El fenotipo miofibroblasto, considerado efector del proceso fibrótico, juega un papel de enorme importancia debido a su capacidad de proliferación, migración, contracción y síntesis de colágeno y otras proteínas de la matriz extracelular. Resultados previos de nuestro grupo identifican la enzima metabólica NNMT como directora de la transformación epitelio-mesenquimal (EMT) en modelos de células epiteliales tumorales de cáncer de pulmón no microcítico resistentes a la terapia. Otros estudios describen su importancia en procesos similares asociados al cáncer gástrico, cáncer de próstata, cáncer de ovario y glioblastomas. La NNMT cataliza la metilación de la nicotinamida (NAM) y compuestos similares usando la S-adenosilmetionina (SAM) como dador de metilos para producir S-adenosilhomocisteína (SAH) y metilnicotinamida (1-MNA), modificando el metabolismo y la capacidad de metilación celular. Con estos antecedentes, nuestra hipótesis fue que la NNMT podría jugar un papel de relevancia en los procesos fibróticos asociados a la transformación fibroblasto-miofibroblasto (FMT) que se pudiese reflejar en el desarrollo clínico de los pacientes con FPI. Por tanto, nuestro objetivo ha sido estudiar la implicación de la NNMT en la FMT, la senescencia y el metabolismo de poblaciones de fibroblastos aislados de pacientes con FPI respecto a los fibroblastos control. Utilizando muestras clínicas de histología, también nos planteamos determinar si NNMT podría ser un biomarcador de la enfermedad. Se aislaron y cultivaron poblaciones de fibroblastos primarios procedentes de biopsias pulmonares de pacientes con FPI (N=15) y se compararon con poblaciones de fibroblastos obtenidos de pacientes con neumotórax como grupo control (N=30). Utilizando TGF-β1 como factor profibrótico e IL1β como factor antifibrótico y proinflamatorio, se caracterizaron estas poblaciones analizando parámetros asociados al proceso FMT, EMT y de senescencia. A continuación, mediante técnicas de transducción génica con lentivirus, se inhibió y se sobreexpresó la NNMT con objeto de evaluar su rol en estos procesos y su repercusión en el metabolismo celular. Finalmente, se analizó la presencia de NNMT en cortes histológicos procedentes de pacientes comparándola con otros marcadores fibróticos. Los resultados nos muestran que los fibroblastos de FPI presentan una sobreexpresión de marcadores fibróticos como el α-SMA, COL1A1 y COL1A2, así como de marcadores de senescencia (p16, p21 y actividad β-galactosidasa) respecto a los fibroblastos control. La inducción con TGF-β1 produjo un aumento en la expresión de marcadores fibróticos como el α-SMA, FN1, COL1A1 y COL1A2 y marcadores mesenquimales como la n-cadherina y SNAI1, tanto en fibroblastos fibróticos como control. En cambio, la IL1β provocó una disminución de estos marcadores en los fibroblastos fibróticos, pero no en los fibroblastos control. La actividad enzimática de la NNMT se mostró incrementada en fibroblastos de FPI respecto a los controles. Este resultado se corroboró al observar un aumento significativo de la expresión proteica y génica de dicha proteína en los fibroblastos fibróticos. La inhibición de NNMT en fibroblastos de FPI provocó una disminución en la expresión de marcadores fibróticos (α-SMA), mesenquimales (SNAI1 y vimentina) y de senescencia (p16, p21 y actividad β-galactosidasa) en estas poblaciones shNNMT respecto a las poblaciones control (shNT). En contraste, la sobreexpresión de NNMT en fibroblastos de FPI (NNMT) produjo un aumento significativo de los marcadores fibróticos, mesenquimales y de senescencia respecto a las poblaciones control (Flag). Respecto a la capacidad de cierre de la herida de los cultivos de fibroblastos, la represión y la sobreexpresión de NNMT produjo un incremento y una disminución del área cerrada por migración y/o proliferación respectivamente, comparado con fibroblastos control. Estudios de inmunofluorescencia en estas poblaciones con anticuerpos fluorescentes específicos para NNMT y α-SMA mostraron que ambos marcadores co-expresan, lo que podría indicar que tendrían una relación directa en la adquisición del fenotipo miofibroblastos y el desarrollo de la fibrosis. La modulación de los niveles de NNMT representaron un cambio metabólico en los fibroblastos fibróticos. Las poblaciones de fibroblastos con niveles elevados de NNMT mostraron una disminución de 1-MNA y NAM y un aumento de los metabolitos de la ruta de las poliaminas (espermina y espermidina). Sin embargo, los niveles de NAD+ no mostraron cambios entre los distintos grupos. Finalmente, los resultados de inmunohistoquímica obtenidos de cortes de tejido parafinado procedentes de pacientes con FPI nos mostraron que NNMT, al igual que α-SMA, se expresa en las zonas de fibrosis reactiva y no en tejido sano. En conclusión, nuestros resultados indican que la NNMT se expresa en muestras clínicas de pacientes con FPI y en fibroblastos obtenidos de los mismos. Además, los fibroblastos control y fibróticos sobreexpresan NNMT en ambientes profibróticos (TGF-β1) y esta expresión disminuye en ambientes antifibróticos (IL-1β). La sobreexpresión génica de NNMT aumenta el fenotipo fibrótico y senescente asociado a los fibroblastos y su represión lo disminuye. Todo ello apunta a que la NNMT juega un papel de relevancia en los procesos fibróticos, de senescencia y metabólicos asociados a los fibroblastos fibróticos y a la FPI y nos presenta a esta enzima como un marcador prometedor de fibrosis que podría constituir una diana terapéutica para el tratamiento de esta patología. Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) is defined as a chronic fibrosing interstitial pneumonia of unknown, progressive and fatal cause that mainly affects adults over 60 years of age, limited to the lungs and associated with the histopathological pattern of usual interstitial pneumonia (UIP). The absence of specific manifestations of IPF is an obstacle to its early detection. It is a disease of late and challenging diagnosis, with a therapeutic approach of reduced efficacy. These characteristics raise the need to find new biomarkers associated with fibrosis and new therapeutic targets for an early diagnosis and increase patients' quality and life expectancy. The pathogenesis of the disease involves a loss of alveolar epithelial cells, a proliferation of fibroblasts and their transformation to myofibroblasts in an environment of remodeling of the extracellular matrix produced by an imbalance of secretory and soluble factors. This fibrotic microenvironment favors cellular senescence, the acquisition of the mesenchymal phenotype and/or associated with the myofibroblast, as well as changes in cellular metabolism. The myofibroblast phenotype, considered an effector of the fibrotic process, plays a role of enormous importance due to its capacity for proliferation, migration, contraction and synthesis of collagen and other proteins of the extracellular matrix. Previous results from our group identify the metabolic enzyme NNMT as a director of epithelial-mesenchymal transformation (EMT) in models of non-small cell lung cancer tumor epithelial cells resistant to therapy. Other studies describe its importance in similar processes associated with gastric cancer, prostate cancer, ovarian cancer and glioblastomas. NNMT catalyzes the methylation of nicotinamide (NAM) and similar compounds using S-adenosylmethionine (SAM) as a methyl donor to produce S-adenosylhomocysteine (SAH) and methyl nicotinamide (1-MNA), modifying metabolism and cellular methylation capacity. With this background, we hypothesized that NNMT could play a relevant role in the fibrotic processes associated with fibroblast-myofibroblast transformation (FMT) that could be reflected in the clinical development of patients with IPF. Therefore, our objective has been to study the involvement of NNMT in FMT, senescence and metabolism of primary fibroblasts isolated from patients with IPF compared to control fibroblasts. Using clinical histology samples, we also considered whether NNMT could be a biomarker for the disease. Primary fibroblast cultures were isolated and cultured from lung biopsies of IPF patients (N = 15) and compared with fibroblast populations obtained from pneumothorax patients as a control group (N = 30). Using TGF-β1 as a profibrotic factor and IL-1β as an antifibrotic and pro-inflammatory factor, these populations were characterized by analyzing parameters associated with the FMT, EMT and senescence process. Next, using lentivirus gene transduction techniques, NNMT was inhibited and overexpressed to evaluate its role in these processes and its impact on cell metabolism. Finally, the presence of NNMT was analyzed in histological sections from patients, comparing it with other fibrotic markers. The results show us that IPF fibroblasts exhibit overexpression of fibrotic markers such as α-SMA, COL1A1 and COL1A2, and senescence markers (p16, p21 and β-galactosidase activity) compared to control fibroblasts. Induction with TGF-β1 produced an increase in the expression of fibrotic markers such as α-SMA, FN1, COL1A1 and COL1A2 and mesenchymal markers such as n-cadherin and SNAI1, both in fibrotic fibroblasts and controls. In contrast, IL-1β caused a decrease in these markers in fibrotic fibroblasts but not in control fibroblasts. The enzymatic activity of NNMT was shown to be increased in IPF fibroblasts compared to controls. This result was corroborated by observing a significant increase in the protein and gene expression of this protein in fibrotic fibroblasts. The inhibition of NNMT in IPF fibroblasts caused a decrease in the expression of fibrotic markers (α-SMA), mesenchymal (SNAI1 and vimentin) and senescence (p16, p21 and β-galactosidase activity) in shNNMT fibroblasts compared to the control ones (shNT). In contrast, the overexpression of NNMT in IPF fibroblasts (NNMT) produced a significant increase in fibrotic, mesenchymal and senescence markers compared to control fibroblasts (Flag). Regarding the wound closure capacity of fibroblast cultures, the repression and overexpression of NNMT produced an increase and a decrease in the area closed by migration and/or proliferation, respectively, compared to control fibroblasts. Immunofluorescence studies in these fibroblasts with fluorescent specific antibodies for NNMT and α-SMA showed that both markers co-express, which could indicate that they would have a direct relationship in the acquisition of the myofibroblast phenotype and the development of fibrosis. Modulation of NNMT levels represented a metabolic change in fibrotic fibroblasts. Fibroblast populations with high levels of NNMT showed a decrease in 1-MNA and NAM and an increase in metabolites of the polyamine pathway (spermine and spermidine). However, the levels of NAD + did not show changes between the different groups. Finally, the immunohistochemical results obtained from paraffin tissue sections from patients with IPF showed us that NNMT, like α-SMA, is expressed in reactive fibrosis areas and not in healthy tissue. In conclusion, our results indicate that NNMT is expressed in clinical samples from patients with IPF and in fibroblasts obtained from them. Furthermore, control and fibrotic fibroblasts overexpress NNMT in profibrotic environments (TGF-β1), and this expression is decreased in antifibrotic environments (IL-1β). NNMT gene overexpression increases the fibrotic and senescent phenotype associated with fibroblasts, and its repression decreases it. All of this points to the fact that NNMT plays an essential role in the fibrotic, senescence and metabolic processes associated with fibrotic fibroblasts and IPF and presents us with this enzyme as a promising fibrosis marker that could constitute a therapeutic target for the treatment of this pathology.

La fascia es una red de tejido conectivo, que se ha definido como una capa protectora o envolvente pasiva y limitada presente en un sistema integrado que es nuestro cuerpo. Está compuesta por una matriz de tejido conectivo extracelular, fibroblastos y ácido hialuronico que forma estructuras circundantes sobre o entre todos los órganos de nuestro cuerpo está relacionado con el sistema musculoesquelético, fibras nerviosas, vasos sanguíneos, linfa etc. Frente a modelos clásicos anatómicos en donde el esqueleto es el soporte principal y se mantiene unido por compresión, mientras que las partes blandas se encuentran suspendidas o actuando como compresores locales. Surgen estudios en donde actualmente la fascia está siendo considerado como un cuarto sistema con una propiedad tridimensional y cualidades de tensegridad, dadas a que en el cuerpo los huesos van a ser los componentes comprimidos y la fascia conforma la red de componentes traccionados, lo cual nos permitiría entender que la forma en que se distribuyen las fuerzas tensionales y de compresión en su interior, constituye una estructura estable que es capaz de reaccionar e interactuar de manera dinámica. Es de este modo que surgen perspectivas de estrategias terapéuticas como el de la Neural Terapia en donde se evidenciaría la relación anatómica y funcional entre el sistema nervioso y la fascia, que va complementado por funciones de mecanotransducción, efectos de memoria y acumulativos, integrativos, dinámicos donde la continuidad mecánica de la fascia crea un vínculo mioquinetico, en el que cada musculo actúa de una manera sinérgica en conjunto con los demás músculos, con lo cual podríamos intervenir con la procaína a bajas dosis en la submucosa oral y tener mejoría de dolor a distancia y liberación de fascias sin necesidad de seguir una distribución metamérica ni de dermatoma. Abstract: The fascia is a network of connective tissue, which has been defined as a protective or enveloping limited passive layer present in an integrated system that is our body. It is composed of a matrix of extracellular connective tissue, fibroblasts and hyaluronic acid that forms surrounding structures on or between all the organs of our body is related to the musculoskeletal system, nerve fibers, vessels blood, lymph etc. Compared to classic anatomical models where the skeleton is the main support and is held together by compression, while the soft parts are suspended or acting as local compressors. Studies arise where the fascia is currently being considered as a third system with a three-dimensional property and tensegrity qualities, given that in the body bones are going to be the compressed components and the fascia forms the network of traction components, which would allow us to understand that the way in which tension and compression forces are distributed inside, constitutes a stable structure that is able to react and interact in a dynamic way. It is in this way that emergent perspectives of therapeutic strategies like that of the Neural therapy where it would be evident the anatomical and functional relation between the nervous system and the fascia, that is complemented by functions of mechanotransduction, effects of memory and cumulative, integrative, dynamic where the mechanical continuity of the fascia creates a myokinetic bond, in which each muscle acts in a synergistic manner in conjunction with other muscles, so we could intervene with procaine at low doses in the Oral submucosa and have improved pain at a distance and release of fascias without the need to follow a metameric distribution or dermatome. Maestría

Fibrose pulmonar (FP) ? o resultado de um processo de les?o cr?nica no qual fibroblastos se tornam ativados e passam a secretar e depositar grandes quantidades de matriz extracelular (ECM). Este fato leva uma dificuldade na degrada??o da ECM, seguido por rigidez tecidual, perda de fun??o tecidual e morte. A frutose-1,6-bisfosfato ? um metab?lito intermedi?rio da rota glicol?tica que vem sendo estudada h? v?rios anos e tem demonstrado a??es protetoras em diferentes tipos celulares e tecidos. H? evid?ncias de que a FBP ? capaz de prevenir o desenvolvimento da FP induzida por bleomicina (BLM) em camundongos, mas o mecanismo pelo qual isso acontece ainda ? desconhecido. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da FBP sobre a preven??o e/ou regula??o do processo fibr?tico em um modelo experimental de FP in vivo e em c?lulas pulmonares in vitro. Para isso, tratamos animais que receberam BLM intratraqueal com FBP por 14 dias. Ainda, utilizamos culturas prim?rias de fibroblastos e miofibroblastos pulmonares extra?dos de camundongos saud?veis e fibr?ticos, respectivamente. Analisamos, a fun??o pulmonar, a express?o g?nica de subtipos de col?genos e outros componentes importantes no processo fibrotico, assim como as taxas de prolifera??o, contra??o e migra??o celular, al?m das prote?nas envolvidas na degrada??o da ECM. No modelo de FP, a FBP foi capaz de melhorar significativamente a fun??o pulmonar, como demonstrado pela redu??o do dep?sito de col?geno e diminui??o da express?o de genes relacionados ? ECM, como col?geno e fibronectina. In vitro, miofibroblastos tratados com FBP por 3 dias demonstraram uma menor taxa de prolifera??o, contra??o e migra??o, o que s?o ind?cios de desativa??o e revers?o fenot?pica. Al?m disso, a FBP tamb?m diminui a express?o de genes e prote?nas relacionados ? ECM, como col?geno, fibronectina e actina de m?sculo liso ? em cultura prim?ria de miofibroblastos. MMP1, uma colagenase respons?vel pela degrada??o da ECM, teve sua express?o aumentada, enquanto a TIMP-1, um inibidor da MMP1, diminuiu. MMP2, que est? associada ao aumento da invas?o do tecido por miofibroblastos, tamb?m teve sua express?o diminu?da. Nossos resultados demonstram que a FBP pode prevenir o desenvolvimento de FP induzida por BLM atrav?s da redu??o da produ??o e dep?sito de col?geno e outros componentes de ECM e isso pode ser mediado atrav?s do aumento da produ??o de MMP1 e diminui??o da TIMP-1, o que promoveria uma degrada??o efetiva da ECM depositada no tecido. Pulmonary fibrosis (PF) is the result of chronic injury where fibroblasts become activated and secrete large amounts of extracellular matrix (ECM), leading to impaired ECM degradation followed by tissue stiffness, loss of lung function and death. Fructose-1,6-bisphosphate is a metabolite from glycolytic pathway that has been studied for many years and showing beneficial actions in different cell lines and tissues. In a recent study from our laboratory, FBP was able to prevent the development of FP bleomycin (BLM)-induced on mice, but the underlying mechanism is still unknown. In this way, the objective of this study was to evaluate the effects of FBP under prevention and regulation of fibrotic process in PF mouse model and lung fibroblasts. In this way, we treated mice that received BLM intratracheally with FBP for 14 days. We also extracted lung fibroblasts and myofibroblasts from healthy and fibrotic animals, respectively. We analyzed lung function, gene expression of collagen subtypes and other important components of ECM, as well proliferation, contraction and migration rates, and proteins involved in ECM degradation. In PF mice model, lung function was improved by FBP as revealed by reduced collagen deposition and downregulation of ECM gene expression such as collagens and fibronectin. Myofibroblasts treated with FBP for 3 days in vitro showed decreased proliferation, contraction, and migration, which are characteristic of myofibroblast to fibroblast phenotype reversal. ECM-related genes and proteins such as collagens, fibronectin and ?-smooth muscle actin, were downregulated in FBP-treated myofibroblasts in vitro. Moreover, MMP1, responsible for ECM degradation, and TIMP-1, a MMP1 inhibitor, were up and down regulated, respectively. MMP2, which is associated with fibroblast invasion on tissue, also was downregulated. These results demonstrate that FBP may prevent bleomycininduced PF development through reduced expression of collagen and other ECM components mediated by a reduced TIMP-1 and increased MMP1 production, which would allow a better ECM degradation. Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Florianópolis, 2019. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta cicatricial de ratos a enxerto de fibroblastos gengivais provenientes de cultura primária suplementada com PRP e semeados em matriz de celulose bacteriana (MCB) e matriz dérmica acelular humana (MDA - Surederm®). Inicialmente foi realizada uma cirurgia de remoção de um pequeno explante de tecido conjuntivo/epitelial da mucosa oral de rato. Logo em seguida, foi realizada a técnica de obtenção do Plasma Rico em Plaquetas (PRP). Então, se realizou a cultura primária de fibroblastos em meio suplementado com PRP, substituindo o Soro Fetal Bovino. Depois de estabelecida a cultura celular, as células foram semeadas nas matrizes e somente então se iniciaram os procedimentos cirúrgicos. Foram realizados defeitos cirúrgicos na mucosa jugal dos ratos com um bisturi circular. Os ratos foram divididos em 06 grupos: I-controle negativo (apenas criação do defeito); II-controle positivo (enxerto gengival livre obtido do palato); III-MCB; IV-fibroblastos em MCB; V-MDA; VI-fibroblastos em MDA. Quinze dias após as cirurgias de enxertia, foram realizadas avaliações clínicas, verificando a regularidade do epitélio e a presença de úlcera, rubor e edema. Foi realizada a biópsia da área operada. Foram obtidos cortes histológicos para coloração em Hematoxilina e Eosina e para realização da técnica imunohistoquímica com os anticorpos anti-a-SMA (marcador de miofibroblastos), e PAN-Cytokeratin (marcador de células epiteliais). A avaliação histológica considerou se ocorreu a reepitelização completa da área operada e classificou o novo epitélio em fino ou regular, com cristas epiteliais e/ou queratina. Também se ralizou a contagem de vasos sanguíneos, células inflamatórias e miofibroblastos. O número de células foi obtido dentro de uma mesma área e classificado em leve, regular ou intenso, e uma análise estatística pelo teste exato de Fisher foi realizada. Os resultados clínicos demonstraram que os grupos testados não apresentaram úlcera e apresentaram epitélio regular, sem rubor e sem edema. Os resultados histológicos demonstraram que estes grupos apresentaram um epitélio regular com cristas epiteliais e queratina, com miofibroblastos presentes no tecido conjuntivo. A técnica de engenharia tecidual realizada obteve resultados clínicos e histológicos semelhantes à técnica de enxerto gengival livre. A cultura primária de fibroblastos suplementada com PRP além de favorecer o processo de cicatrização, viabiliza a técnica para utilização em humanos. As duas matrizes testadas podem ser usadas como arcabouço celular, sendo a MDA a matriz mais indicada em enxertos gengivais livres. Abstract : The objective of this work was to evaluate in vivo the healing response of rats grafted with gingival fibroblasts from primary culture, seeded in bacterial cellulose matrix (MCB) and human acellular dermal matrix (MDA - Surederm ®). Initially, surgery was performed to remove a small conective / epithelial tissue explant from the oral mucosa of the rat. Soon after, the technique of obtaining the Rich Plasma in Platelet (PRP) was carried out. Then, the primary culture of fibroblasts was performed in medium supplemented with PRP, replacing Fetal Bovine Serum. After the cell culture was established, the cells were seeded in the matrices and only then the surgical procedures began. Surgical defects were performed in the oral mucosa of the rats with a circular scalpel. The rats were divided into 6 groups: I-negative control (defect creation only); II-positive control (free gingival graft obtained from the palate); III-MCB; IV-fibroblasts in MCB; V-MDA; VI-fibroblasts in MDA. Fifteen days after the grafting surgeries, clinical evaluations were performed, evaluating the regularity of the epithelium and the presence of ulcer, flushing and edema. The biopsy of the surgical area was performed. Histological sections were obtained and stained with Hematoxylin and Eosin; and immunohistochemically with anti-a-SMA antibody (myofibroblast marker), and PAN-Cytokeratin (epithelial cell marker). The histological evaluation considered whether a complete reepithelialization of the operated area occurred and then classified the new epithelium as thin or regular, with epithelial ridges and/or keratin. Counting of blood vessels, inflammatory cells and myofibroblasts was also performed. The number of cells was obtained within the same histological area and classified as mild, regular or intense, and a statistical analysis applying Fisher exact test was performed. Clinical results showed that the tested groups had no ulcer and had regular epithelium, no flushing and no edema. Histological results demonstrated that these groups had a regular epithelium with epitelial ridges and keratin and with myofibroblasts present in the connective tissue. The performed tissue engineering technique obtained clinical and histological results similar to the free gingival graft technique. The primary culture of fibroblasts supplemented with PRP besides favoring the cicatrization process, allows the technique for use in humans. The two matrices tested can be used as a cellular scaffold, MDA being the most indicated matrix in free gingival grafts.

Piper amalago L. is a medicinal plant traditionally used as a healing agent for wounds, burns, abscesses, boils, and insect bites. The current study aimed to evaluate the possible effects of the aqueous crude extract obtained from P. amalago leaves, in different concentrations and in different incubation times, using the in vitro model of mouse fibroblasts (3T3). The extract was tested in different concentrations at the 24 h incubation time for analysis of cell viability, cytotoxicity, proliferation, cell morphology, immunostaining, adhesion and cell spreading assays, as well as to determine the hydroxyproline concentration and activity of the metalloproteinase MMP2. Morphologically, after exposure to the concentrations of 15 and 150 µg/mL, the cells maintained the morphology, yet a greater number of cells with more expansions of the cell body and larger than the control cells were observed. The treated cell culture also showed a greater number of cells, larger cells, a greater expansion of the cell body, adherent cells spread over the substrate, and a more juxtaposed, central and spherical nucleus. The treatment induced greater cell adhesion to the polymer, fibronectin, and collagen I. Biochemical results showed a significant increase in the hydroxyproline amino acid after exposure for 96 h. The extract did not induce loss of cell viability until the concentration reached 150 µg/mL, positively modulating proliferation, morphology, adhesion, degree of spreading, and organization of microfilaments. The extract also promoted a significant increase in the hydroxyproline amino acid. Piper amalago L. es una planta medicinal utilizada tradicionalmente como agente cicatrizante de heridas, quemaduras, abscesos, furúnculos y picaduras de insectos. El presente estudio tuvo como objetivo evaluar los posibles efectos del extracto crudo acuoso obtenido de las hojas de P. amalago, en diferentes concentraciones y en diferentes tiempos de incubación, utilizando el modelo in vitro de fibroblastos de ratón (3T3). El extracto se probó a diferentes concentraciones en el tiempo de incubación de 24 horas para el análisis de viabilidad celular, citotoxicidad, proliferación, morfología celular, inmunotinción, ensayos de adhesión y propagación celular, así como para determinar la concentración de hidroxiprolina y la actividad metaloproteinasa de MMP2. Morfológicamente, tras la exposición a concentraciones de 15 y 150 µg/mL, las células mantuvieron su morfología, pero se observó un mayor número de células con más expansiones del cuerpo celular y más grandes que las células control. El cultivo celular tratado también mostró un mayor número de células, células más grandes, mayor expansión del cuerpo celular, células adherentes difundidas sobre el sustrato y núcleos más yuxtapuestos, centrales y esféricos. El tratamiento indujo una mayor adhesión celular al polímero, fibronectina y colágeno I. Los resultados bioquímicos mostraron un aumento significativo en el aminoácido hidroxiprolina después de 96 h de exposición. El extracto no indujo pérdida de viabilidad celular hasta que la concentración alcanzó 150 µg/mL, modulando positivamente la proliferación, morfología, adhesión, grado de diseminación y organización de los microfilamentos. El extracto también promovió un aumento significativo del aminoácido hidroxiprolina. Piper amalago L. é uma planta medicinal tradicionalmente usada como agente de cura para feridas, queimaduras, abcessos, furúnculos e picadas de insetos. O presente estudo teve como objetivo avaliar os possíveis efeitos do extrato bruto aquoso obtido das folhas de P. amalago, em diferentes concentrações e em diferentes tempos de incubação, utilizando o modelo in vitro de fibroblastos de camundongo (3T3). O extrato foi testado em diferentes concentrações no tempo de incubação de 24 horas para análise de viabilidade celular, citotoxicidade, proliferação, morfologia celular, imunomarcação, adesão e ensaios de propagação celular, bem como para determinar a concentração de hidroxiprolina e atividade da metaloproteinase MMP2. Morfologicamente, após exposição às concentrações de 15 e 150 µg/mL, as células mantiveram a morfologia, porém foi observado um número maior de células com mais expansões do corpo celular e maiores que as células controle. A cultura celular tratada também apresentou maior número de células, células maiores, maior expansão do corpo celular, células aderentes espalhadas pelo substrato e núcleo mais justaposto, central e esférico. O tratamento induziu maior adesão celular ao polímero, fibronectina e colágeno I. Os resultados bioquímicos mostraram um aumento significativo no aminoácido hidroxiprolina após exposição por 96 h. O extrato não induziu perda de viabilidade celular até a concentração atingir 150 µg/mL, modulando positivamente a proliferação, morfologia, adesão, grau de disseminação e organização dos microfilamentos. O extrato também promoveu um aumento significativo no aminoácido hidroxiprolina.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES The skin is the largest organ in the human body and acts as a barrier protecting the body from the environment. The rupture of its integrity caused by an injury culminates in the activation of a complex healing process, which seeks the closure of the injured area and involves three overlapping stages over time: inflammatory, proliferative and remodeling. Often, the healing process is not efficient, necessitating the use of drugs or herbal medicines. A medicinal plant that has important healing properties is the Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville, popularly known as barbatimão and native of the Brazilian Cerrado biome. However, it is still unclear how this plant acts on the steps of the healing process. Within this context, the present study aimed to evaluate the in vitro effect of Stryphnodendron adstringens on the modulation of inflammatory and proliferative markers of the wound healing process. For this, an independent bi-cellular experimental model was developed using the commercial cell lines of macrophages (RAW 264.7) and dermal fibroblasts (HFF-1). Cells were maintained in cell culture separately, under sterile conditions at 37°C and 5% CO2. Macrophages were activated with the mitogenic agent phytohemagglutinin (PHA) and, after 24 hours, were treated with different concentrations of the barbatimão bark extract (0.24; 0.49; 0.99; 1.99; 3.98 mg/mL). After 72 hours, cell proliferation was evaluated by the test of 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolic bromide (MTT). With the result of this test, the concentrations of 0.49 and 0.99 mg/mL of the barbatimão extract were defined for use in the subsequent analyzes. It was then evaluated, after 72 hours of treatment with both concentrations, the effect of the plant on protein levels (via immunoassay) and levels of gene expression (via Quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR)) of the proinflammatory cytokines interleukin one beta (IL-1β), interleukin six (IL-6), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interferon gamma (IFN-ү) and the anti-inflammatory cytokine interleukin ten (IL-10) in activated and non-activated macrophages, to investigate the inflammatory phase. An additional protocol, which mimics in vitro healing processes, was also used. For this, cultures of fibroblasts with 80% of monolayer confluence were scratched with the aid of a 200 μL tip to mimic an injury and subsequently these cells were treated with both concentrations of the barbatimão extract. Then, after 24 and 72 hours of treatment, the levels of fibroblast growth factor one (FGF-1) and keratinocyte growth factor (KGF) were analyzed in scratched and integral fibroblasts to evaluate the proliferative state. The results showed anti-inflammatory effect of barbatimão on the activated macrophages, through a decrease of the protein levels and the gene expression levels of the proinflammatory cytokines and increase of the levels of the anti-inflammatory cytokine IL-10. In addition, barbatimão also increased the levels of both growth factors in scratched and integral fibroblasts after 24 and 72 hours of treatment. Despite the methodological limitations related to the in vitro studies, the results indicate that barbatimão has an effective action in the inflammatory modulation of macrophages, as well as it is able to induce the increase of the levels of growth factors related to proliferative events of fibroblasts during the process of wound healing. A pele é o maior órgão do corpo humano e atua como uma barreira de proteção do corpo ao meio ambiente. O rompimento da sua integridade provocado por uma lesão culmina na ativação de um processo complexo de cicatrização, que busca o fechamento da área lesionada e envolve três etapas sobrepostas ao longo do tempo: inflamatória, proliferativa e de remodelação. Muitas vezes, o processo de cicatrização não é eficiente, necessitando fazer-se uso de fármacos ou fitoterápicos auxiliares. Uma planta medicinal que apresenta importante propriedade cicatrizante é o Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville, popularmente conhecido como barbatimão e nativo do bioma Cerrado brasileiro. No entanto, ainda não está claro de que maneira esta planta atua sobre as etapas do processo cicatricial. Dentro deste contexto, o presente estudo objetivou avaliar o efeito in vitro do Stryphnodendron adstringens na modulação de marcadores inflamatórios e proliferativos do processo de cicatrização de feridas. Para isso, foi desenvolvido um modelo experimental bi-celular independente utilizando as linhagens celulares comerciais de macrófagos (RAW 264.7) e fibroblastos dérmicos (HFF-1). As células foram mantidas em cultivo celular separadamente, sob condições de esterilidade a 37ºC e a 5% de CO2. Os macrófagos foram ativados com o agente mitogênico fitohemaglutinina (PHA) e, após 24 horas, foram tratados com diferentes concentrações do extrato da casca de barbatimão (0,24; 0,49; 0,99; 1,99; 3,98 mg/mL). Após 72 horas, foi avaliada a proliferação celular, através do teste do brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Com o resultado deste teste, foram definidas as concentrações de 0,49 e 0,99 mg/mL do extrato de barbatimão para serem utilizadas nas análises subsequentes. Avaliou-se, então, após 72 horas de tratamento com ambas as concentrações, o efeito da planta sobre os níveis proteicos (via imunoensaio) e os níveis de expressão gênica (via Quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR)) das citocinas pró-inflamatórias interleucina um beta (IL-1β), interleucina seis (IL-6), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interferon gama (IFN-ү) e da citocina anti-inflamatória interleucina dez (IL-10) em macrófagos ativados e não ativados, para a investigação da fase inflamatória. Um protocolo adicional, que imita processos cicatriciais in vitro, também foi utilizado. Para isso, culturas de fibroblastos com 80% de confluência de monocamada foram rasgadas com o auxílio de uma ponteira de 200 μL, para mimetizar uma lesão e, posteriormente, estas células foram tratadas com ambas as concentrações do extrato de barbatimão. Então, após 24 e 72 horas de tratamento, foram analisados os níveis do fator de crescimento de fibroblastos um (FGF-1) e do fator de crescimento de queratinócitos (KGF) em fibroblastos rasgados e íntegros, para avaliar o estado proliferativo. Os resultados mostraram efeito anti-inflamatório do barbatimão sobre os macrófagos ativados, via diminuição dos níveis proteicos e dos níveis de expressão gênica das citocinas pró-inflamatórias e aumento dos níveis da citocina anti-inflamatória IL-10. Além disso, o barbatimão também aumentou os níveis de ambos os fatores de crescimento em fibroblastos rasgados e íntegros, após 24 e 72 horas de tratamento. Apesar das limitações metodológicas relacionadas aos estudos in vitro, os resultados indicam que o barbatimão possui uma ação efetiva na modulação inflamatória de macrófagos, assim como é capaz de induzir o aumento dos níveis dos fatores de crescimento relacionados a eventos proliferativos de fibroblastos durante o processo de cicatrização de feridas.

Os nanotubos de carbono (NTC) compreendem uma importante classe de materiais com excelentes propriedades físico-químicas, a qual tem recebido grande atenção em aplicações biológicas. Dados conflitantes em relação a seus efeitos citotóxicos têm sido relatados. Essa discrepância deve se à falta de padronização de metodologias, as quais deveriam levar em consideração não somente a dose e o tempo de exposição ao agente, parâmetro bem estabelecido na toxicologia clássica, mas também as características intrínsecas dos NTC e seu comportamento na interface com o sistema biológico. Assim, apesar da grande quantidade de dados gerados nestes últimos 10 anos, sobre a toxicidade desses nanomateriais, a nanotoxicologia é ainda um grande desafio. O presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial citotóxico, genotóxico e mutagênico dos nanotubos de carbono de paredes múltiplas, funcionalizados com polietilenoglicol (2 kDa) modificado com pireno (MWNT- PyPEG), após a exposição da linhagem celular fibroblasto de pulmão de hamster (V79-4). A pesquisa foi conduzida por meio dos métodos MTT e Cell Titer Blue®, para estimar a viabilidade celular e por meio dos testes cometa e ensaio de micronúcleos com bloqueio de citocinese citoma (CBMN-Cyt) com (+S9) e sem (S9) ativação metabólica, para avaliar a genotoxicidade e mutagenicidade. Os resultados utilizando o método MTT, na faixa de concentrações testadas (1,2 a 18,5 µg mL1), mostraram diminuição significativa na viabilidade celular das células tratadas com MWNT- PyPEG somente da concentração de 18,5 µg mL1 em relação ao grupo controle (P

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2018. As células da papila dérmica (CPD) são consideradas como chave central do processo de sinalização que controla o complexo sistema de morfogênese e crescimento do folículo piloso. Contudo, a contribuição destas células, por meio de moléculas secretadas (efeito parácrino), no reparo cutâneo e proteção ao fotoenvelhecimento da pele adjacente não está completamente elucidada na literatura. Os fibroblastos dérmicos são elementos fundamentais para o restabelecimento da homeostase e reparo da pele, tendo atividade destacada na promoção do fechamento da lesão e na produção e remodelamento da matriz extracelular (MEC), funções também relacionadas com a fisiopatologia do fotoenvelhecimento. O presente trabalho investigou, em modelos murino e humano, os efeitos parácrinos das CPD no reparo cutâneo in vitro, avaliando a ativação de fibroblastos, produção de MEC e envolvimento de vesículas extracelulares (VE), além de proteção ao fotoenvelhecimento. Para isso, primeiramente, CPD foram isoladas pela técnica de explante a partir de papilas dérmicas dissecadas de folículos pilosos de camundongos e humanos. Após expansão, foi coletado o meio condicionado das células da papila dérmica murinas (MC-CPDm) e este foi avaliado em modelo de cultivo organotípico do folículo piloso, demonstrando que o MC-CPDm estimula o crescimento do pelo, mantendo a habilidade indutora sobre o folículo piloso. Em seguida, o MC-CPDm foi estudado frente a ativação de fibroblastos murinos (3T3), avaliando a proliferação, a migração e a conversão fibroblasto-miofibroblasto, através do ensaio de contração de colágeno e avaliação da expressão de a-SMA. Os resultados obtidos demonstraram que o MC-CPDm estimula a proliferação e o fechamento da lesão in vitro, reduzindo a conversão fibroblasto-miofibroblasto. Visando a potencial aplicação biotecnológica e clínica para potencialização do processo de reparo cutâneo com maior qualidade de cicatrizes por meio da ativação do remodelamento dérmico, a ativação de fibroblastos e a produção de MEC foi avaliada em células humanas. Para isso, foi coletado o meio condicionado das células da papila dérmica humanas (MC-CPDh) e este foi avaliado quanto a proliferação e migração de fibroblastos dérmicos humanos, demonstrando que o MC-CPDh estimula a proliferação e migração celular. Em relação à produção de MEC, foi investigada a expressão proteica de colágeno I e fibronectina. Os resultados obtidos demonstraram que o MC-CPDh promoveu aumento na produção de fibronectina, entretanto não foi observada diferença significativa sobre a síntese de colágeno I. Uma vez que VE vêm sendo apontadas como importantes mediadores de efeitos parácrinos em diversos sistemas, a participação destas na interação com fibroblastos também foi investigada. As VE presentes no MC-CPDh (VE-CPDh) foram isoladas por ultracentrifugação e a interação vesícula-célula foi analisada através da observação da incorporação de VE-CPDh coradas com corante fluorescente por fibroblastos dérmicos, além da investigação da atividade biológica medida em termos de proliferação celular. Os resultados mostraram que VE-CPDh estão presentes no MC-CPDh e são incorporadas por fibroblastos dérmicos humanos. Além disso, demonstram que ambos, VE-CPDh e fatores solúveis presentes no sobrenadante da ultracentrifugação do MC-CPDh, atuam na proliferação de fibroblastos dérmicos humanos. Para avaliação da proteção ao fotoenvelhecimento, foi estabelecido modelo in vitro para o fotoenvelhecimento de fibroblastos dérmicos por exposição à radiação UVB. Os fibroblastos expostos à radiação UVB apresentaram os indicadores de fotoenvelhecimento, aumento na atividade de ß-galactosidase e expressão de p21, associado à morfologia característica de células senescentes e redução na produção de MEC (colágeno I e fibronectina). Em seguida, o efeito do MC-CPDh foi avaliado sobre a viabilidade celular e morte por apoptose em fibroblastos fotoenvelhecidos. Os resultados indicaram que o MC-CPDh estimulou a sobrevida destas células, exercendo efeito protetor contra a morte celular por apoptose, induzida pela exposição à radiação UVB. Quanto à produção de MEC, o MC-CPDh foi capaz de recuperar parcialmente expressão de fibronectina diminuída após fotoenvelhecimento dos fibroblastos dérmicos, porém não foi observado efeito sobre a produção de colágeno I. Em conjunto, os resultados sugerem que as CPD exercem efeito parácrino sobre fibroblastos dérmicos durante o processo de reparo cutâneo, promovendo os eventos celulares que levam ao fechamento efetivo da lesão, além de fornecer proteção contra o fotoenvelhecimento, favorecendo a sobrevida de fibroblastos fotoenvelhecidos. Em adição, VE-CPDh estão envolvidas nos efeitos observados e apontam para a relevância de sua exploração como uma promissora ferramenta terapêutica para o reparo cutâneo. Abstract : Dermal papilla cells (DPC) are known as key signaling center that controls the complex system of morphogenesis and hair growth. However, the paracrine contribution of these cells to skin repair and photoaging protection remains elusive. Dermal fibroblasts are essential elements to skin homeostasis and repair, with highlighted activity in wound closure and extracellular matrix (ECM) production and remodeling. These functions are also related to the physiopathology of photoaging. The present work aimed to investigate in vitro the paracrine effects of DPC in skin repair, evaluating fibroblast activation, ECM production and the involvement of extracellular vesicles (EV), as well as photoaging protection. Firstly, DPC were isolated by dermal papilla explant from mice and humans hair follicles. After expansion, the murine dermal papilla cells conditioned medium (mDPC-CM) was collected and evaluated in hair follicle organotypic culture, demonstrating that it stimulates hair growth, maintaining the hair inductive ability. Then, the effect of mDPC-CM was evaluated concerning murine fibroblasts (3T3) activation - proliferation, migration and fibroblast-myofibroblast conversion, through the collagen contraction assay and a-SMA expression. Results showed that mDPC-CM stimulates the proliferation and wound closure in vitro and reduces fibroblast-myofibroblast conversion. Aiming for a biotechnological and clinical application to promote the skin repair with higher quality scars through the activation of dermal remodeling, fibroblast activation and ECM production were evaluated in human cells. For this, the human dermal papilla cells conditioned medium (hDPC-CM) was collected and the proliferation and migration of human dermal fibroblasts was evaluated. Data showed that hDPC-CM stimulates cell proliferation and migration. Regarding the ECM production, the protein expression of collagen I and fibronectin was investigated. The results showed that hDPC-CM promoted an increase in fibronectin production, with no difference in type I collagen. Since EV have been identified as important mediators in several systems, its participation in fibroblasts activation was also investigated. EV present in hDPC-CM (hDPC-EV) were isolated by ultracentrifugation and vesicle-cell interaction analyzed by incorporation of fluorescent stained-hDPC-EV by dermal fibroblasts. In addition, its biological activity was measured by cell proliferation. Results showed that hDPC-EV are present in hDPC-CM and are incorporated by human dermal fibroblasts. In addition, both hDPC-EV and soluble factors present in the hDPC-CM supernatant, stimulate the proliferation of human dermal fibroblasts. To evaluate photoaging protection, an in vitro photoaging model was established by exposure of dermal fibroblasts to UVB radiation. UVB-exposed-fibroblasts showed the photoaging indicators - increased ß-galactosidase activity and p21 expression, associated with senescent morphology and ECM (collagen I and fibronectin) reduced production. Then, the effect of hDPC-CM was assessed in cell viability and death by apoptosis in photoaged fibroblasts. Results indicated that hDPC-CM stimulated cell survival with protective effect against UVB-induced cell death by apoptosis. Regarding ECM production, hDPC-CM was able to partially recover the decreased fibronectin expression by photoaged fibroblasts, with no effect in collagen I production. Taken together, results suggest that DPC exerts paracrine effects in dermal fibroblasts during cutaneous repair, promoting cellular events that lead to wound closure, besides providing protection against photoaging, favoring the survival of photoaged fibroblasts. In addition, hDPC-EV are involved in the observed effects and point to the relevance of their exploration as a promising therapeutic tool for cutaneous repair.

La composición y las propiedades físicas de la matriz extracelular (ECM, ExtraCellular Matrix) condicionan significativamente el comportamiento de las células presentes en los tejidos. En los últimos años, el papel de la deposición y remodelado de la ECM ha cobrado una gran importancia como elemento esencial en la progresión tumoral. Sin embargo, los mecanismos por los que las células estromales regulan la formación de la ECM son aún poco conocidos. La interacción estroma-tumor depende de manera fundamental de la comunicación celular a través de exosomas, pequeñas vesículas secretadas por la mayoría de los tipos celulares y generadas en el lumen de los cuerpos multivesiculares (MVBs, MultiVesicular Body). En este trabajo hemos mostrado que Caveolina-1 (Cav1), un organizador esencial de las membranas lipídicas, juega un papel crucial en la regulación tanto de la biogénesis de exosomas como en la selección de su cargo proteico a través de la modulación del colesterol. Mediante ensayos proteómicos, hemos podido identificar que las proteínas de matriz constituyen una de las principales familias cuya incorporación a los exosomas depende específicamente de la presencia de Cav1. En concreto, y dentro de esta familia, Tenascina-C (TnC) es uno de los representantes más relevantes. Utilizando diferentes ensayos funcionales hemos demostrado que Cav1 modula la deposición de ECM a través de exosomas, lo que promueve la invasión y migración celular. Además, hemos confirmado que los exosomas derivados de células Cav1WT, pero no los procedentes de células Cav1KO, eran capaces de nuclear ECM en nichos distantes en diferentes órganos in vivo. Estas observaciones sugieren, por tanto, el papel clave de Cav1 como regulador de los niveles de colesterol en los MVBs, lo cual condiciona la deposición de ciertos componentes de la ECM a través de su selección para la entrada en los exosomas. Todos estos datos apoyan el modelo en el que Cav1 es un regulador central de las interacciones estroma-tumor a través de la deposición de ECM mediada por exosomas. Sí

Las arritmias cardiacas representan hoy en día una de las principales causas de mortalidad en los países desarrollados y en concreto la insuficiencia cardíaca constituye un importante problema de salud pública en todo el mundo. Recientemente se han publicado estudios en los que se ha podido observar que muchas enfermedades cardiacas se encuentran relacionadas con la aparición de fibrosis en el tejido cardiaco. Por tanto surge la necesidad de estudiar en profundidad la relación entre la fibrosis cardiaca y las enfermedades cardiovasculares, en concreto la insuficiencia cardiaca. El estudio de éstas mediante modelización y simulación podría suponer un avance en la investigación clínica con resultados muy prometedores. En el presente TFM se ha realizado un análisis mediante simulación computacional de las causas por las cuales la proliferación de fibroblastos o fibrosis es arritmogénica, especialmente en insuficiencia cardiaca. Para ello, se han desarrollado modelos de acoplamiento entre cardiomiocito y fibroblastos que han sido utilizados para estudiar los efectos del acoplamiento sobre las características electrofisiológicas del miocito. Además se ha implementado un análisis de sensibilidad para estudiar cómo la variabilidad de las corrientes del fibroblasto podría modular las principales características electrofisiológicas en insuficiencia cardiaca. Los resultados obtenidos demuestran que el acoplamiento del fibroblasto al miocito tanto en condiciones normales como en insuficiencia provoca una reducción en el APD así como una disminución del pico de [Ca+2]i de carácter progresivo. A medida que la unión se hace más fuerte, aumentado el valor de Ggap, la reducción de ambos parámetros es más brusca. Además, en insuficiencia cardiaca las corrientes más importantes del miocito (IK1, IKr, ICaL, INaCa) se ven reducidas. En ambas condiciones, a medida que Ggap aumenta, las corrientes se adelantan en el eje temporal por lo que alcanzan su máximo milisegundos antes provocando así la disminución del APD del cardiomiocito ventricular. Por otro lado, la reducción del potencial de membrana del fibroblasto (Ef) provoca un aumento del APD (tanto del miocito como del fibroblasto) y del pico de [Ca+2]i. El estudio de sensibilidad revela los parámetros del fibroblasto más influyentes en el valor de los biomarcadores estudiados: Ggap y Gkv. Podemos afirmar por tanto que la presencia de fibroblastos afecta considerablemente al comportamiento de los cardiomiocitos por lo que resultaría fundamental incluir estas células en posteriores estudios que permitan aclarar los mecanismos arritmogénicos y así avanzar en el conocimiento de las mismas lo que permita una mejora notable en los diagnósticos y tratamientos clínicos., Nowadays, cardiac arrhythmias represent a serious cause of mortality in developed countries and in particular, heart failure is a major public health problem worldwide. In some recently published studies, it has been observed that many heart diseases are related to the appearance of fibrosis in cardiac tissue. Therefore, there is a need to study the relationship between cardiac fibrosis and cardiovascular diseases, specifically heart failure. Research in this field through modeling and simulation is having an impact in clinical practice with very promising results. In this TFM, a computer simulation analysis has been developed to study the reasons why fibroblast or fibrosis proliferation is arrhythmogenic, especially in heart failure. For that purpose, models of coupling between cardiomyocyte and fibroblasts have been developed and used to study the coupling effects on the electrophysiological characteristics of the myocyte. Furthermore, a sensitivity analysis has been implemented to study how the variability of fibroblast currents could modulate the main electrophysiological characteristics in heart failure. The results obtained show that the coupling of the fibroblast to the myocyte both in normal conditions and in heart failure causes a progressive reduction in the APD as well as a decrease in the peak of [Ca+2]i. As the union becomes stronger, which means the increase of Ggap value, the reduction of both parameters is more significant. In addition, the most important currents of the myocyte in heart failure (IK1, IKr, ICaL, INaCa) are reduced. In both conditions, as Ggap increases, the currents activity reaches its maximum milliseconds earlier causing the decrease of the APD of the ventricular cardiomyocyte. On the other hand a reduction of the fibroblast membrane potential (Ef) causes an increase in the APD (both myocyte and fibroblast) and the peak of [Ca+2]i. The sensitivity study reveals the most influential fibroblast parameters in the value of the biomarkers studied: Ggap and Gkv. Therefore, we can affirm that the presence of fibroblasts significantly affects the cardiomyocyte behavior, so it would be essential to include these cells in subsequent studies to clarify the arrhythmogenic mechanisms. This will constitute a further step towards the knowledge of them, which allows a notable improvement in the diagnoses and clinical treatments., Les arítmies cardíaques representen hui en dia una de les principals causes de mortalitat en els països desenvolupats i en concret la insuficiència cardíaca constitueix un important problema de salut pública en tot el món. Recentment s'han publicat estudis en què s'ha pogut observar que moltes malalties cardíaques es troben relacionades amb l'aparició de fibrosi en el teixit cardíac. Per tant, sorgeix la necessitat d'estudiar en profunditat la relació entre la fibrosi cardíaca i les malalties cardiovasculars, en concret la insuficiència cardíaca. L'estudi d'estes mitjançant la modelització i simulació podria suposar un avanç en la investigació clínica amb resultats molt prometedors. En aquest TFM s'ha realitzat un anàlisi, mitjançant la simulació computacional, de les causes per les quals la proliferació de fibroblasts o fibrosi és aritmogènica, especialment en insuficiència cardíaca. Per a això, s'han desenvolupat models d'adaptació entre cardiomiòcit i fibroblast que han sigut utilitzats per a estudiar els efectes de l'adaptament sobre les característiques electrofisiològiques del miòcit. A més s'ha implementat un anàlisi de sensibilitat per a estudiar com la variabilitat dels corrents del fibroblast podria modular les principals característiques electrofisiològiques en insuficiència cardíaca. Els resultats obtinguts demostren que l'acoblament del fibroblast al cardiomiòcit tant en condicions normals com en insuficiència, provoca una reducció en l'APD així com una disminució del pic de [Ca+2]i de caràcter progressiu. A mesura que la unió es fa més forta, augmentant el valor de Ggap, la reducció d'ambdós paràmetres és més brusca. A més, en insuficiència cardíaca, els corrents més importants del cardiomiòcit (IK1, IKr, ICaL, INaCa) es veuen reduïts. En ambdós condicions, a mesura que Ggap augmenta, els corrents s'avancen en l'eix temporal, pel que aconsegueixen el seu màxim uns pocs mil•lisegons abans, provocant així la disminució de l'APD del cardiomiòcit. D'altra banda, la reducció del potencial de membrana del fibroblast (Ef) provoca un augment de l'APD (tant del miòcit com del fibroblast) i del pic de [Ca+2]i. L'estudi de sensibilitat revela els paràmetres del fibroblast més influents en el valor dels biomarcadors estudiats: GGap i GKv. Podem afirmar per tant que la presència de fibroblasts afecta considerablement al comportament dels cardiomiòcits, pel que resultaria fonamental incloure aquestes cèl•lules en posteriors estudis que permeten aclarir els mecanismes arritmogénics i així avançar en el coneixement de les mateixes, permetent així una millora notable en els diagnòstics i tractaments clínics.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Florianópolis, 2018. O Poli-éter-éter-cetona (PEEK) representa atualmente uma alternativa na implantodontia para a fabricação de implantes, abutments e cicatrizadores, devido à sua biocompatibilidade e baixo módulo de elasticidade em relação ao titânio. O PEEK, através do processo de sulfonação (sPEEK), permite gerar uma nanoestrutura em 3D, com a possibilidade de incorporação de agentes antibiofilme. Com intuito de melhorar sua relação com o meio bucal e atingir uma superfície bioativa com propriedades antimicrobianas e biocompativeis. O objetivo deste estudo foi analisar a comportamento bacteriano (Streptococcus mutans) e celular (Fibroblastos L929) sobre PEEK, sPEEK e sPEEK/agentes antibiofilme (Lactonas L1, L2, L1-2 e Furanona C30). As amostras de PEEK foram funcionalizadas por tratamento com ácido sulfúrico (98%) e dissolvidas em Dimetilsulfóxido (DMSO) para incorporação dos agentes antibiofilme. O grau de sulfonação (DS) e a incorporação dos compostos foram caracterizados quimicamente por Análise Termogravimétrica (TGA), Ressonância Magnética Nuclear (1H-NMR), Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) e Espectroscopia de Energia Dispersa (EDS). A análise de superfície foi realizada através de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), ângulo de contato, perfilometria e Microscopia de Força Atômica (AFM). O comportamento bacteriano na presença do polímero modificado foi avaliado (4 e 14 h) através de crescimento planctônico, Unidades Formadoras de Colônia (UFC.mL-1), viabilidade bacteriana (baclightTM/bacterial®), formação de biofilme através de MEV e microscopia confocal. A atividade metabólica de fibroblastos na presença do polímero modificado foi analisada por MTS, ensaio de proliferação celular (Quant-iT PicoGreen®dsDNA) durante 1, 3 e 7 dias, e a morfologia celular foi avaliada por MEV. Os resultados foram analisados estatisticamente por Análise de Variância (ANOVA, p

Trabalho de Projeto do Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica apresentado à Faculdade de Ciências e Tecnologia A Engenharia de Tecidos, um campo do saber em grande crescimento, tem vindo a dar contributos de grande valor na área de Medicina Regenerativa, visando substituir tecidos humanos e promover a sua regeneração. Uma das estratégias mais utilizadas atualmente é a aplicação de scaffolds.A caraterística mais importante de um material para este tipo de aplicações é a biocompatibilidade, habilidade de um material em ser compatível com tecidos vivos, em especial, o corpo humano. Materiais biocompatíveis são desenvolvidos especificamente em função da aplicação a que se destinam e têm de obedecer a um amplo espectro de parâmetros.Os scaffolds estudados neste trabalho foram produzidos usando um processo de fabricação aditiva, usando uma bioextrusora desenvolvida pelo Instituto Politécnico de Leiria. A poli(caprolactona) foi o material base utilizado, sozinho, ou combinado com hidroxiapatite, em duas diferentes percentagens (10 e 25%) de origem natural ou sintética, cuja adição visa potenciar a bioatividade do biomaterial e reforçar a estrutura. O objetivo principal deste trabalho é comparar a esterilização de scaffolds para regeneração óssea por radiação gama, com a esterilização por óxido de etileno, o método mais utilizado para material médico. Com este intuito, foi testado o seu comportamento biológico, através de ensaios in vitro e in vivo. Foi avaliada a citotoxicidade e proliferação celular usando macrófagos e fibroblastos, isolados e em co-cultura. A esterilização por radiação gama foi efetuada pelo Centro de Ciências e Tecnologias Nucleares do Instituto Superior Técnico de Lisboa. Foi usada uma dose média de aproximadamente 25 kGy. Já a esterilização por óxido etileno foi feita no Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra, de acordo com o protocolo de rotina para material cirúrgico.Os ensaios in vitro foram realizados com fibroblastos, macrófagos e com a sua co-sultura. Os fibroblastos foram desenvolvidos a partir da polpa e papila radical de dentes jovens, através de uma colaboração com a área de Endodontia do Departamento de Estomatologia, Medicina Dentária e Cirurgia Maxilo-Facial da Faculdade de Medicina da Faculdade de Coimbra. Usaram-se macrófagos peritoneais de rato, colhidos pela equipa, uma vez que possuem caraterísticas muito semelhantes aos macrófagos humanos.Para avaliar o desempenho dos scaffolds in vitro, utilizou-se o MTT (brometo de 3-(4,5,-dimetiltiazol-2-il)-difenil tetrazólio), um método colorimétrico que permite avaliar a viabilidade celular por comparação direta de absorvância.Foram também realizadas experiências in vivo, usando ratos Wistar (modelo animal escolhido). Nestes foram implantadas cirurgicamente pequenas amostras dos scaffolds de modo a avaliar o seu comportamento biológico. No decorrer das experiências foram cumpridas todas as normas nacionais e internacionais de experimentação animal. Tissue Engineering, a rapidly growing field of knowledge, has been giving great contributions to the area of Regenerative Medicine. Aiming to replace human tissues and promote their regeneration, nowadays one of the most commonly used strategies is the use of scaffolds.The most important feature for a material with this type of applications is its biocompatibility, the material’s ability to be compatible with living tissues, especially the human body. Biocompatible materials are developed specifically for an intended application, and have to comply with a wide variety of parameters.The scaffolds were produced using an additive manufacturing process with a bio-extruder, developed by the Instituto Politécnico de Leiria. Poly(caprolactone) was the base material, used alone or combined with hydroxyapatite in two different percentages (10 and 25%), of natural and synthetic nature. The addition of hydroxyapatite intends to enhance the bioactivity of the biomaterial and to reinforce the structure.The main goal of this work is to compare the sterilization of scaffolds for bone regeneration by gamma radiation versus ethylene oxide sterilization, the most widely used method for medical material. To this purpose, their biological behavior has been tested through in vitro and in vivo assays. The cytotoxicity and cell proliferation of isolated macrophages, fibroblasts, and their co-culture has been evaluated.Sterilization by gamma radiation was performed in collaboration with the Centro de Ciências e Tecnologias Nucleares do Instituto Superior Técnico de Lisboa. An average dose of approximately 25 kGy was used. The ethylene oxide sterilization was performed at the Hospital and University Center of Coimbra, according to their routine protocol for surgical material.The assays were performed with fibroblasts, macrophages and their co-culture. Fibroblasts were developed from dental pulp and apical papilla of immature teeth, obtained through a collaboration with Endodontics of the Dentistry Department of the Medical School of the University of Coimbra Peritoneal rat macrophages were collected by the team, as the present similar characteristics to human macrophages.In vitro, MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-diphenyl-tetrazolium bromide) was the chosen method to evaluate the biological performance of scaffolds; this colorimetric assay enables the cell proliferation evaluation by direct absorbance comparison..In vivo experiments were also performed using Wistar rats (experimental animal model). Small samples of the scaffolds were implanted surgically in order to evaluate their biological behavior. All national and international standards of animal experimentation were fulfilled.

Submitted by Débora de Fatima Almeida null (debbie_pink04@hotmail.com) on 2017-09-03T22:41:43Z No. of bitstreams: 1 2017-08-27 Dissertação Final.pdf: 2303235 bytes, checksum: c1cb20ce15afa09c1796e24837ffa3db (MD5) Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-09-06T14:24:20Z (GMT) No. of bitstreams: 2 almeida_df_me_bot_par.pdf: 1068148 bytes, checksum: e5c16ea19f0d4ff46a10b1f0397a0130 (MD5) almeida_df_me_bot_int.pdf: 2303235 bytes, checksum: c1cb20ce15afa09c1796e24837ffa3db (MD5) Made available in DSpace on 2017-09-06T14:24:21Z (GMT). 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Apesar da fibrogênese na PCM ser reconhecida como um processo precoce, seus mecanismos não estão totalmente conhecidos. Assim, o presente estudo tem por objetivo avaliar a influência de componentes dos isolados fúngicos e do hospedeiro sobre fibroblastos pulmonares. Foram utilizados fibroblastos pulmonares humanos da linhagem MRC-5 e fibroblastos pulmonares murinos, isolados de camundongos BALB/c. Fibroblastos foram cultivados in vitro com exoantígenos de isolados das espécies P. brasiliensis (Pb18 e Pb326) e P. lutzii (Pb01, Pb8334 e Pb66); gp43 purificada, e soros de pacientes com FC em diferentes momentos do tratamento (antes do tratamento, cura clínica, cura sorológica e cura aparente). Após 24 horas de cultivo, foram avaliadas a proliferação celular e produção de citocinas e fatores de crescimento por fibroblastos murinos e humanos. Nossos resultados demonstraram que componentes do fungo interferem em fibroblastos pulmonares, pela indução da proliferação, aumento dos níveis de TGF-β1 e diminuição dos níveis de IL-6 e VEGF e FGFb. Além disso, nós observamos que exoantigenos induziram altas produções de pró-colágeno I por fibroblastos humanos. Gp43 induziu aumento nos níveis de TGF-β1 em fibroblastos humanos. Em conclusão, nossos resultados demonstram pela primeira vez que componentes de P.brasiliensis e P.lutzzi interferem na fibrogênese por agir diretamente na biologia de fibroblastos pulmonares. Além disso, evidenciamos que soros de pacientes com FC interferem diferentemente na proliferação e ativação de fibroblastos pulmonares de acordo com cada momento do tratamento. Paracoccidioidomycosis (PCM) is an endemic mycosis caused by fungi of genus Paracoccidioides; its main clinical forms are acute/subacute form and the chronic form (CF). Endemic in Latin America, PCM presents high incidence in Brazil, Colombia and Venezuela, especially among rural workers. Most part of patients with FC exhibits sequelae even after an effective fungal treatment, presenting pulmonary fibrosis (PF). The social, economic and psychological issues caused by PF are still underestimated. In PCM, fibrogenesis is recognized as an early process; however, its mechanisms are unknown. Thus, the present study aimed to evaluate the modulatory and functional influence of fungal and host components on pulmonary fibroblast. For this, it was utilized human pulmonary fibroblasts of cell line MRC-5 and murine pulmonary fibroblasts isolated of BALB/c mice. Next, cells were cultivated with different concentrations of isolates of P. brasiliensis (Pb18 and Pb326) and P. lutzii (Pb01, Pb8334 and Pb66); purified gp43, and serum of patients with CF in different moments of treatment (before treatment, clinical cure, serological cure and apparent cure). After 24 hours, cellular proliferation and production of cytokines and grow factors by murine and human pulmonary fibroblasts were evaluated. Our results showed that the fungal components interfered in fibroblast by induce proliferation and increased levels of TGF-β1 and decreased IL-6, VEGF and bFGF. In addition we observed that exoantigens induced high production of pro-collagen I by human fibroblasts. Gp43 induced increased levels of TGF-β1 by human cells. In conclusion, our findings showed at first time that components of P.brasiliensis and P.lutzii interfere in the fibrogenesis by directly act in the biology of pulmonary fibroblast. Furthermore, we verified that serum of FC-patients interfere in proliferation and activation of pulmonary fibroblasts according to each moment of treatment. CNPq: 470221/2014-3

[ES] Actualmente las arritmias cardiacas suponen una de las principales causas de mortalidad en los países desarrollados. Dichas arritmias acontecen en situaciones patológicas como es el caso de la isquemia miocárdica, la cual surge como consecuencia a una oclusión de una arteria coronaria. Esta patología conlleva a un aumento de la predisposición a la aparición y el mantenimiento de arritmias malignas, cuyo origen se basa en las reentradas. Sin embargo, no se conocen todavía con detalle los mecanismos que desencadenan dichas arritmias. Por lo tanto, es interesante la realización de estudios mediante modelización y simulación para poder avanzar de manera sustancial en el conocimiento de las causas que desencadenan arritmias potencialmente mortales. En el presente Trabajo Fin de Máster se ha realizado un análisis mediante simulación por ordenador de las causas que explican que la proliferación de fibroblastos o fibrosis sea arritmogénica, especialmente en situaciones de isquemia miocárdica. Para ello, se han desarrollado modelos de acoplamiento entre cardiomiocito ventricular y fibroblasto y se han estudiado los efectos del acoplamiento sobre las características electrofisiológicas del cardiomiocito. Además, se ha llevado a cabo un análisis de sensibilidad para conocer los parámetros del fibroblasto más influyentes en un conjunto seleccionado de biomarcadores preclínicos arritmogénicos. Los resultados obtenidos indican que la presencia de fibroblastos afecta al comportamiento electrofisiológico de los cardiomiocitos, alterando la morfología de su potencial de acción y de los transitorios intracelulares de calcio, por lo que cada vez queda más clara la necesidad de incluir a los fibroblastos en los estudios de modelos cardiacos con el fin de hallar nuevos conocimientos que permitan avanzar en diagnóstico y tratamiento en la práctica clínica ., [EN] Currently the cardiac arrhythmias are one of the main causes of mortality in developed countries. These arrhythmias occur in pathological situations such as myocardial ischemia, that appears as consequence to an occlusion of a coronary artery. This pathology leads to an increased predisposition to the onset and maintenance of malignant arrhythmias, the origin of which is based on reentry. However, the mechanisms that trigger such arrhythmias are not yet fully understood. Therefore, it is interesting to carry out studies using modeling and simulation to be able to advance substantially in the knowledge of the causes that trigger potentially fatal arrhythmias. In this Final Master¿s Work, a computer simulation analysis has been carried out on the causes that explain that the proliferation of fibroblasts or fibrosis is arrhythmogenic, especially in situations of myocardial ischemia. For this, models of coupling between ventricular cardiomyocyte and fibroblast have been developed and the effects of coupling on the electrophysiological characteristics of the cardiomyocyte have been studied. In addition, a sensitivity analysis has been performed to determine the most influent fibroblast parameters in a selected set of preclinical arrhythmogenic biomarkers. The results indicate that the presence of fibroblasts affects the electrophysiological behavior of cardiomyocytes, altering the morphology of their action potential and the intracellular calcium transients, so every time becomes clearer the need to include the fibroblasts in the studies of cardiac models in order to find new knowledge that allows progress in diagnosis and treatment in clinical practice.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. A eletrofiação é uma promissora técnica à geração de sistemas de liberação de fármacos e engenharia de tecidos. Este trabalho descreve o desenvolvimento de matrizes nanoestruturadas permissivas à diferenciação de células neuronais. Inicialmente, o efeito dos parâmetros processuais da eletrofiação e da configuração do coletor na arquitetura das fibras foi estudado. O processo foi otimizado para obtenção de nanofibras randomizadas e alinhadas. Nanofibras de policaprolactona (PCL) foram produzidas usando três configurações de coletor: um cilindro metálico rotatório, fios de cobre e um mandril rotatório. O coletor cilíndrico gerou uma nanomatriz com estrutura típica tridimensional, na qual a velocidade de rotação mecanicamente promoveu a redução do diâmetro e alinhamento das fibras. Um padrão de fibras randomizadas com um diâmetro médio de 1142 ± 391 nm foi observado a 0 rpm, enquanto nanofibras alinhadas com um diâmetro médio de 663 ± 334 nm foram produzidas a 2000 rpm. Os cabos de cobre originaram um novo padrão de matriz, cujo grau de orientação das fibras relacionou-se à distribuição do campo elétrico no coletor. Por sua vez, o coletor de mandril deu origem a uma matriz tubular constituída de fibras com diâmetro médio de 606 ± 329 nm. Em seguida, avaliou-se a influência do efeito do polietilenoglicol (PEG) em nanofibras compostas por blendas de PEG e PCL. Três tipos de PEG consoante à massa molecular (400, 1500, e 35000 Da) e três concentrações (1, 5, e 10% em relação à PCL) foram estudados. As matrizes foram caracterizadas quanto a sua arquitetura por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e propriedades mecânicas por teste de tração uniaxial, utilizando um analisador de textura. Em presença de PEG houve uma redução do diâmetro e da resistência mecânica das fibras. Estudos de cultura celular demonstraram a ausência de citotoxicidade destes biomateriais. A adequação do uso do PEG para prolongar a liberação de NGF foi demonstrada. A bioatividade do NFG incorporado nas matrizes foi avaliada através da diferenciação de células PC12. As matrizes constituídas de nanofibras alinhadas promoveram o alinhamento de neuritos e a presença de PEG influenciou positivamente o perfil de liberação do NGF e a degradabilidade das matrizes. Por fim, foi produzido um sistema de liberação prolongado de NGF constituído por uma matriz tubular de nanofibras randomizadas na camada externa e alinhadas no lúmen. Os resultados obtidos indicam que as matrizes desenvolvidas, constituídas de nanofibras de PCL e PEG, apresentam potencial de aplicação como sistema de liberação de NGF e no estudo da regeneração nervosa periférica. Abstract : Electrospinning is a promising technique to generate scaffolds for delivery systems and nerve tissue engineering. This study describes the development of a nanostructured matrix permissive to neural cell differentiation. Firstly, the effect of setting up parameters and collector design on the alignment and architecture of electrospinning fibers was studied. The process was optimized to obtain randomized and aligned nanofibers. Polycaprolactone (PCL) fibers were produced using three collectors: metallic rotating drum, copper wires, and a rotating mandrel. The drum collector produced a typical tridimensional structure whereby the rotational speed mechanically stretches fibers and affects their diameter and alignment. Randomly oriented fibers with an average diameter of 1142 ± 391 nm were obtained at 0 rpm, while aligned fibers with an average diameter of 663 ± 334 nm were produced at 2000 rpm. Static copper wires produced a novel fiber pattern in which the degree of orientation of the fibers was related to the electrical field distribution along the collector. Mandrel collector produced a tubular mat composed by nanofibers with an average diameter of 606 ± 329 nm. In a second series of experiments, the influence of polyethyleneglycol (PEG) on nanofibers composed of PCL and PEG blends was evaluated. Three types of PEG with t molecular weights (400, 1500, and 35000 Da) and concentrations (1, 5, and 10% ratio to PCL) were studied. Mats were characterized in terms of architecture by Scanning Electron Microscopy (SEM) and mechanical properties by uniaxial tensile tests using a texture analyser. The presence of PEG decreased the diameter and mechanical resistance of fibers. Cell culture studies have demonstrated the absence of cytotoxicity of these biomaterials. The suitability of using polyethylene glycol (PEG) to prolong the delivery of NGF incorporated into PCL electrospinning nanofibers was demonstrated. The effect of released nerve growth factor (NGF) from the mats was evaluated by neuronal differentiation using PC12 cells. Electrospun scaffolds composed by aligned nanofibers promoted alignment and neurite outgrowth of PC12 cells along the axis of the aligned nanofibers. PEG influenced positively the release profile of NGF and mats degradability. Finally, a sustained NGF deliver system composed by a tubular matrix of randomized nanofiber in the outer layer and aligned nanofibers in the lumen was produced. Therefore, the results obtained indicate that the developed matrix, composed by PCL and PEG nanofibers, present potential application as a NGF delivery system and in the study of the peripheral nervous regeneration.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2017. A crista neural (CN) é uma estrutura embrionária transitória, comum a todos os vertebrados, que se origina da parte dorsal do tubo neural e coloniza o embrião em desenvolvimento, dando origem a diversas estruturas como células gliais, neurônios e os melanócitos da pele. As células da CN diferenciam em resposta a uma complexa rede de sinalização presente no microambiente, incluindo a sinalização de FGF2 e fatores de transcrição como Sox10, FoxD3 e Mitf. O FGF2, um fator mitogênico envolvido nos processos da CN desde a sua indução até a diferenciação final, pode representar uma importante ferramenta no tratamento de neurocristopatias. Neste trabalho, foi demonstrado em culturas secundárias de células da CN da região truncal (CNT) de embriões de aves, que o FGF2 aumenta a população de células da CN através do aumento da proliferação e, principalmente, através do aumento da sobrevida das células em culturas secundárias. Contudo, o tratamento com FGF2 não alterou o halo de migração e proliferação celular durante a fase de migração em culturas primárias. As células da CNT tratadas com FGF2 e estimuladas à diferenciação apresentaram maior sobrevida dos progenitores com capacidade de diferenciação em melanócitos. Pode-se propor assim, que o FGF2 aumenta a sobrevida dos progenitores de melanócitos através da modulação da expressão dos fatores de transcrição Sox10, FoxD3 e Mitf. Além disso, o FGF2 não alterou a potencialidade das células da CNT, porém, estimulou a propagação de progenitores mesenquimais da CNT, fenótipos estes que são gerados in vivo apenas pelas células da CN da região cefálica (CNC), através de várias passagens sem que houvesse prejuízo aos fenótipos neurais. Ademais, as culturas tratadas com FGF2 apresentaram vários gânglios neuronais e maior capacidade de diferenciação em células gliais por até 5 passagens. Este trabalho acrescenta informações para o avanço na compreensão do processo de diferenciação das células da CN embrionária e é importante para o aperfeiçoamento tecnológico na busca de prevenir ou restaurar danos causados por enfermidades relacionadas às células da CN, como melanoma e vitiligo. Abstract : Neural crest (NC) is an embryonic and transitory structure of vertebrates; it arises at the dorsal region of neural tube and colonizes the developing embryo giving rise to various cell phenotypes such as glial cells, neurons and the melanocytes from the skin. NC cells differentiate in response to a complex signaling network present in microenvironment, including FGF2 signaling and transcription factors such as Sox10, FoxD3 and Mitf. FGF2, a mitogenic factor involved in NC processes from induction to the complete cell differentiation, could represent an important tool in treatment of neurocristopathies. In this work, it was demonstrated in NC cell cultures of the trunk region (TNC) from avian embryos, that FGF2 increases cell population through the increase in cell proliferation and specially through increasing cell survival in secondary cultures. Nevertheless, FGF2 treatment did not alter cell migration and proliferation during the migration phase in primary cultures. TNC cells treated with FGF2 and stimulated to differentiation showed increased survival of progenitors endowed with melanocytic phenotype. We suggest FGF2 increases the melanocyte progenitors by modulating the expression of the transcription factors Sox10, FoxD3 and Mitf. Furthermore, FGF2 did not modify the potentiality of TNC cells, but, it did stimulate the propagation of TNC mesenchymal progenitors, through several passages without losing the neural phenotypes. The mesenchymal phenotypes are generated in vivo by NC from cephalic region (CNC) and not by TNC. In addition, the treated cultures showed several neurons ganglia and increased differentiation in glial cells up to 5 passages. This work adds information to move forward the understanding of the differentiation process of embryonic NC cells and it is important for chasing advanced technologies to avoid or restore injuries caused by NC related illness, ass melanoma and vitiligo.

Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016. Introdução: Células-tronco mesenquimais (MSCs) são células progenitoras multipotentes potencial fonte para várias terapias celulares. MSCs são caracterizadas pela expressão dos marcadores celulares CD73, CD90 e CD105, e ausência de expressão dos marcadores CD34, CD45, CD11a, CD19 e HLA-DR. CD90 é uma glicoproteína presente na membrana de MSC, várias células adultas e células-tronco de câncer. A função de CD90 em MSC ainda é pouco elucidada. Objetivo: Obter MSCs com expressão reduzida de CD90 para investigar a função desse marcador na morfologia, proliferação e diferenciação de MSCs humanas. Metodologia: Foi avaliada a função de CD90 na morfologia, proliferação, supressão da proliferação de células T e diferenciação osteogênica e adipogênica de MSCs por meio da redução da expressão desse marcador, usando vetores lentivirais que expressam shRNA contra CD90. Resultados: O estudo mostrou que a redução da expressão de CD90 resultou em maior eficiência das diferenciações osteogênica e adipogênica de MSCs in vitro e, inesperadamente, resultou também no decréscimo da expressão dos marcadores CD44 e CD166. Conclusão: O estudo sugere que CD90 controla a diferenciação de MSCs e possa agir como um obstáculo a ser superado para que haja diferenciação e a manipulação de CD90, na presença de um correto estímulo para a diferenciação pode levar a taxas de diferenciação in vitro de MSCs mais eficientes. Introduction: Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are multipotent progenitor cells used in several cellular therapies. MSCs are characterized by the expression of CD73, CD90 and CD105 cell markers, and the absence of CD34, CD45, CD11a, CD19 and HLA-DR cell markers. CD90 is a glycoprotein present in the MSC membranes, various adult cells and cancer stem cells. The role of CD90 in MSCs remains unknown. Here, we sought to analyse the role of CD90 plays in the characteristic properties of in vitro-expanded human MSCs. Methodology: We investigated the function of CD90 in: the morphology; proliferation rate; suppression of T cell proliferation; and osteogenic/adipogenic differentiation of MSCs by reducing the expression of this marker using CD90 target shRNAs lentiviral vectors. Results: The present study shows that a reduction in CD90 expression enhances the osteogenic and adipogenic differentiation of MSCs in vitro and, unexpectedly, causes a reduction the expression of CD44 and CD166. Conclusion: Our study suggests that CD90 controls the differentiation of MSCs by acting as an obstacle in the pathway of differentiation commitment which may be overcome, in the presence of the correct differentiation stimuli, supporting the idea that CD90 level manipulation may lead to more efficient differentiation rates in vitro.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Curso de Ciências Farmacêuticas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2016. O envelhecimento da pele em humanos é um processo complexo e pode ser induzido por fatores intrínsecos e extrínsecos. Uma das alterações observadas é a redução no número de fibroblastos que além de produzirem componentes da matriz extracelular, como diferentes tipos de colágeno, fibronectina e proteoglicanos, produzem também as metaloproteinases (MMP). No envelhecimento cronológico, o que se observa é um aumento dos níveis de MMP com a idade, uma menor taxa da síntese de colágeno e redução dos inibidores teciduais das MMP (TIMP), o que explica o aspecto flácido da pele envelhecida. Nesse estudo, a influência de diferentes concentrações de L-arginina na síntese de colágeno em cultura de fibroblastos dérmicos humanos e, consequentemente, na elasticidade da pele foi avaliada. A L-arginina é o substrato da síntese de óxido nítrico, o qual pode estar envolvido na angiogenese, proliferação celular e na síntese de colágeno, uma vez que aumenta a expressão de COL1A1. Ao mesmo tempo, ela também pode ser precursora indireta da síntese de colágeno, atuando como fonte de prolina, componente da fibra de pró-colágeno. Para avaliar a influência da L-arginina na síntese de colágeno e, consequentemente, na elasticidade da pele, foram estudados a citotoxicidade desse ativo, a expressão gênica de COL1A1, MMP-1 e TIMP-1 por RT-PCRq, a síntese de colágeno, os níveis de glutationa reduzida e oxidada, a atividade da catalase e da superóxido dismutase, os níveis de metabólitos oxidativos gerados após os tratamentos e o efeito estimulante da L-arginina na síntese de colágeno via óxido nítrico sintase. Os resultados encontrados mostraram que a Larginina não é citotóxica e que, nas concentrações de 1000 µM, 2500 µM e 6000 µM, tende a induzir um aumento na expressão gênica e na síntese de colágeno. No entanto, na concentração de 6000 µM foi observado um aumento da expressão de MMP-1 e uma diminuição na expressão de TIMP-1. Por ser um doador de NO, o tratamento com a L-arginina aumentou os metabólitos oxidativos, mas em contrapartida as células aumentaram a atividade da superóxido dismutase (SOD) e da catalase (CAT), mantendo o estado redox das células, que foi observado através da relação entre glutationa reduzida e glutationa oxidada. Diante desses resultados e da possibilidade de utilizar a L-arginina como um ativo cosmético, foi iniciado o estudo de pré-formulação com a avaliação da hidroxipropil-β-ciclodextrina (HP β C) e β -ciclodextrinas (β C). No entanto, esses dois sistemas de inclusão aumentaram a atividade de MMP-2 e a HP β C diminuiu a expressão de COL1A1. Portanto, a Larginina se mostrou um excelente candidato a ativo cosmético, capaz de aumentar a síntese de colágeno em fibroblastos dérmicos humanos. Skin aging in humans is a complex process and can be induced by intrinsic and extrinsic factors. One of the observed changes is a reduction in the number of fibroblasts that not only produce extracellular matrix components, such as different types of collagen, fibronectin and proteoglycans, but also produce metalloproteinases (MMPs). In chronological aging, it is observed an increase in MMP levels with age, a lower rate of collagen synthesis and reduction of tissue inhibitors of MMPs (TIMPs), which explains the flaccid appearance of aged skin. In this study, it was evaluated the influence of different L-arginine concentrations in collagen synthesis, in cultured human dermal fibroblasts, and, consequently, in skin elasticity. L-arginine is the substrate for nitric oxide synthesis, which may be involved in angiogenesis, cell proliferation and collagen synthesis, since it increases the expression of COL1A1. Also, it can be an indirect precursor of collagen synthesis, acting as a source of proline, pro-collagen fiber component. To evaluate the effect of L-arginine on collagen synthesis and, consequently, on skin elasticity, cytotoxicity, COL1A1, MMP- 1 and TIMP-1 gene expression by RT-qPCR, collagen synthesis, levels of reduced and oxidized glutathione, catalase activity and superoxide dismutase activity, levels of oxidative metabolites generated after treatment and the stimulating effect of Larginine in collagen synthesis via nitric oxide synthase were studied. The results showed that L-arginine is not cytotoxic and at concentrations of 1000 μM, 2500 μM and 6000 μM tends to lead to an increase in gene expression and synthesis of collagen. However, at concentration of 6000 μM L-arginine induced an increase in MMP-1 expression and a decrease in TIMP-1 expression. Since it is a NO donor, treatment with L-arginine increased oxidative metabolites but, by the other hand, the cells increased the activity of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), maintaining the redox state of cells, what was observed through the rate of reduced and oxidized glutathione. Considering these results, and the possibility of using Larginine as an active cosmetic, the pre-formulation study was started by evaluation of hydroxypropyl--cyclodextrin (HPC) and -cyclodextrins (C. However both the excipients increased MMP-2 activity and HPC promoted a decrease in COL1A1 expression. In conclusion, L-arginine shown to be an excellent candidate to cosmetic active, once it was able to increase collagen synthesis in human dermal fibroblasts.

Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Nonociência e Nanobiotecnologia, 2016. A nanotecnologia é uma ciência em expansão e dentre as suas aplicações, destaca-se o uso de nanopartículas (NPs) de óxido de níquel. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito citotóxico de diferentes suspensões de nanopartículas de óxido de níquel, frente a viabilidade de células de fibroblastos (linhagem NIH-3T3) e de queratinócitos (linhagem HaCat). Assim, neste trabalho, realizou-se a síntese, caracterização e preparação de suspensões de óxido de níquel por meio de três metodologias, utilizando-se diferentes precursores metálicos (NiCl2, NiCl₂.6H₂O ou Ni(C2H3O2)2·4H2O) e/ou solventes (água ou etanol). As formulações produzidas foram denominadas respectivamente: NiO-Cl, NiO-Et e NiO-OAc e foram caracterizadas por difratometria de raios – X (DRX), termogravimetria (TG), análise textural (B.E.T.), microscopia eletrônica de transmissão (MET) e espectroscopia de infravermelho (FTIR). As suspensões foram caracterizadas por espalhamento dinâmico de luz (DLS) e foi feito um estudo da estabilidade dessas, usando como parâmetros o potencial zeta, o diâmetro hidrodinâmico, o índice de polidispersão (PDI) e o pH. O teor de níquel em suspensão foi quantificado por espectroscopia de absorção atômica (EAA). Por meio das análises de DR-X notou-se; respectivamente, que NiO-Cl, NiO-Et e NiO-OAc apresentaram diâmetro médio de 13, 19 e 21 nm e, por meio da análise de B.E.T., verificou-se que a área superficial destas NPs foram de 33, 31 e 27 m2/g respectivamente. Em relação à análise TG, verificou-se que a formação de óxido de níquel ocorreu acima de 385 °C para as três formulações investigadas. Também, foi notado que estas formulações apresentaram forma, predominantemente esférica e com tendência à aglomeração. Quanto a estabilidade observou-se que a formulação NiO-Et manteve - se estável em todos os parâmetros avaliados, enquanto que as demais formulações apresentaram estabilidade moderada. Ainda, o efeito citotóxico das três formulações foi avaliado pelo método do MTT e notou-se que todas as formulações induziram maior citotoxicidade com o aumento da dose e tempo de tratamento. Nanotechnology is a science in expansion and among its applications, there is the use of nanoparticles (NPs) of nickel oxide. However, there are few studies on the toxicity of these types of NPs especially those involving occupational risk. The aim of this study was to investigate the cytotoxic effect of different suspensions of nickel oxide nanoparticles front viability of fibroblast cells (NIH-3T3 line) and keratinocytes (HaCaT line). In this work, we carried out the synthesis, characterization and preparation of nickel oxide slurries by using three methods where different metal precursor were used (NiCl2, NiCl₂.6H₂O or Ni (C2H3O2)2•4H2O) and/or solvents (water or ethanol). The produced formulations were called: NiO-Cl, NiO-Et and NiO-OAc and were characterized by - ray diffraction (XRD), thermogravimetry (TG), texture analysis (B.E.T.), transmission electron microscopy (TEM) and infrared spectroscopy (FTIR). The suspensions were characterized by light scattering (DLS) and was made a study of the stability of these parameters using as the zeta potential, the hydrodynamic diameter, the polydispersity index (PDI) and pH. The nickel content of the suspension was quantified by atomic absorption spectroscopy (AAS). Through DR-ray analyzes are noted, respectively, that NiO-Cl, NiO-Et NiO-OAc had an average diameter of 13, 19 and 21 nm, and B.E.T. analysis, it was found that the surface area these NPs were 33, 31 and 27 m2/g respectively. Regarding the TG analysis showed that the nickel oxide formation occurred above 385 °C for three fomulações investigated. Also, it was noted that these formulations exhibited form predominantly spherical and prone to agglomeration. The stability was observed that the NiO-Et formulation maintained - stable in all parameters, while the other formulations showed moderate stability. Also, the cytotoxic effect of the three formulations was evaluated by the MTT method, and it was observed that all formulations induced higher cytotoxicity with increasing dose and duration of treatment. In most cases it was noticed greater cytotoxic effect at 72 h in the NIH-3T3 line.

A Equisetum arvense conhecida popularmente como cavalinha é uma planta que apresenta diversas propriedades e indicações, dentre elas: atividade diurética e adstringente do trato geniturinário, remineralizante, cicatrizante e reparadora dos tecidos ósseos e da pele. Dessa forma, considerando o crescente uso de ativos cosméticos de origem vegetal e tendo em vista a carência de pesquisas científicas sobre o mecanismo de ação destes ativos, este trabalho avaliou a ação de diferentes concentrações do extrato bruto hidroalcoólico de Equisetum arvense na proliferação de fibroblastos em diferentes períodos de tempo, além de mensurar os níveis de colágeno. Neste sentido, nossos resultados sugerem que a E. arvense na concentração de 1000ug/mL aumentou a proliferação de fibroblastos humanos, além de aumentar, embora não significativamente a quantidade de colágeno destas células. Por fim, nossos resultados nos permitem sugerir o uso da E. arvense também como auxiliar na regeneração tecidual, assim como agente capaz de melhorar a síntese de colágeno cutâneo.

Submitted by Guilherme Lemeszenski (guilherme@nead.unesp.br) on 2013-08-22T18:59:59Z No. of bitstreams: 1 S0103-84782008000600026.pdf: 503541 bytes, checksum: f2afcf685aabcbe0fdc88bf3c94b5f6d (MD5) Made available in DSpace on 2013-08-22T18:59:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 S0103-84782008000600026.pdf: 503541 bytes, checksum: f2afcf685aabcbe0fdc88bf3c94b5f6d (MD5) Previous issue date: 2008-09-01 Made available in DSpace on 2013-09-30T19:57:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0103-84782008000600026.pdf: 503541 bytes, checksum: f2afcf685aabcbe0fdc88bf3c94b5f6d (MD5) S0103-84782008000600026.pdf.txt: 21149 bytes, checksum: ed6484b7c32f5282804da63eafb22505 (MD5) Previous issue date: 2008-09-01 Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T13:15:34Z No. of bitstreams: 2 S0103-84782008000600026.pdf: 503541 bytes, checksum: f2afcf685aabcbe0fdc88bf3c94b5f6d (MD5) S0103-84782008000600026.pdf.txt: 21149 bytes, checksum: ed6484b7c32f5282804da63eafb22505 (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-20T13:15:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0103-84782008000600026.pdf: 503541 bytes, checksum: f2afcf685aabcbe0fdc88bf3c94b5f6d (MD5) S0103-84782008000600026.pdf.txt: 21149 bytes, checksum: ed6484b7c32f5282804da63eafb22505 (MD5) Previous issue date: 2008-09-01 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade cicatrizante da calêndula (Calendula officinalis L.) sobre feridas cutâneas experimentais, em 15 coelhos, distribuídos em três grupos denominados: excipiente, calêndula e controle. Cada animal foi submetido à uma incisão cirúrgica de 6cm de comprimento, lateral à coluna vertebral e suturada no padrão U. Os produtos avaliados foram colocados sobre as incisões durante sete dias na quantidade de 0,1ml (loção cremosa não-iônica - grupo excipiente; tintura de calêndula a 5% - grupo calêndula) e nos animais do grupo controle não se utilizou nenhum produto. A biópsia de pele foi realizada no 1°, 3°, 5° e 7° dia após a incisão cirúrgica para avaliação morfométrica do processo cicatricial, analisando-se o número de fibroblastos e fibrócitos. A morfometria foi realizada por meio de microscópio óptico adaptado a um sistema computadorizado de análise de imagens. de acordo com os resultados, a calêndula propiciou obtenção dos maiores valores médios das células envolvidas no processo cicatricial, os fibroblastos, deduzindo que a mesma, inferiu uma resposta mais satisfatória na cicatrização em relação aos demais tratamentos. The aim of this study was to evaluate the scarring capability of marigold (Calendula officinalis L.) on experimental skin wounds in 15 rabbits, distributed in three groups: excipient, marigold and control. Each animal was subjected to a surgical incision measuring 6cm in length, laterally to the spinal column and sutured in U-shape. Products evaluated were placed on the incisions for 7 days, at a rate of 0.1ml (nonionic creamy lotion - excipient group; 5% marigold extract) and no treatment was provided to control animals. Skin biopsy was performed on 1, 3, 5, and 7 days after wounding, for morphometric and cicatricial process evaluations. The morphometry was performed with an optical microscope adapted to a computadorized picture analysis system. The results showed that marigold allowed the highest growth rate in cells directly involved in the cicatricial process, the fibroblasts and fibrocytes and can therefore be considered the most satisfactory on the wound healing in comparison to the other treatments. Universidade Estadual Paulista Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Universidade Estadual Paulista Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal Universidade Estadual Paulista Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Departamento de Zootecnia Universidade Estadual Paulista Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Universidade Estadual Paulista Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal Universidade Estadual Paulista Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias Departamento de Zootecnia

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:22:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:28:45Z : No. of bitstreams: 1 000851207.pdf: 1059422 bytes, checksum: 3ef98dc609c2e964bafefa24cd2efdc7 (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) A endometrose é uma alteração degenerativa das glândulas uterinas e do estroma circundante, caracterizada pelo arranjo periglandular de miofibroblastos e a deposição de matriz extracelular (ECM). O presente trabalho objetivou avaliar a expressão de colágeno tipo I, III e IV e α-actina de músculo liso (α-SMA) nas endometroses equinas, procurando esclarecer a participação dos miofibroblastos na progressão destes processos. Foram utilizadas 24 biópsias uterinas com diagnóstico de endometrose, recebidas pelo Serviço de Patologia Veterinária e de Reprodução Animal da FMVZ, UNESP, Botucatu, SP. Cortes histológicos foram submetidos às técnicas histoquímicas de Tricrômico de Masson, Picrosirius Red sob luz polarizada e Ácido Periódico de Schiff (PAS) e imuno-histoquímicas para os três tipos de colágeno citados e α-SMA. Ainda, traçou-se um paralelo entre a técnica de Picrosirius Red e a imunomarcação dos colágenos tipos I e III. A análise histológica revelou que as fibras de colágeno denso correspondem ao colágeno tipo I, predominantes nas endometroses inativa e inativa destrutiva. As fibras de colágeno frouxo correspondem ao colágeno tipo III, predominantes nas endometroses ativas e ativas destrutivas. Nestes mesmos processos, a membrana basal revelou espessamento, aparentemente não relacionado ao colágeno tipo IV, e uma maior imunomarcação de miofibroblastos periglandulares em relação às endometroses inativa e inativa destrutiva. Desta forma, nota-se que os miofibroblastos estão relacionados ao aumento na deposição de colágeno tipo III nos ninhos fibróticos ativos Endometrosis is a degenerative change of the uterine glands and surrounding stroma, characterized by periglandular arrangement of myofibroblasts and deposition of extracellular matrix (ECM). The aim of this study was evaluate the expression of collagen type I, III and IV and α-smooth muscle actin (α-SMA) in equine endometroses, and investigate the role of myofibroblasts in the progression of these processes. A parallel was made with histochemical techniques of Masson's trichrome, Picrosirius Red under polarized light and Periodic Acid-Schiff (PAS). Twenty four uterine biopsies received by the Veterinary Pathology Service and Animal Reproduction of FMVZ, UNESP, Botucatu, SP, were diagnosed with endometrosis. Histological analysis revealed that the orange dense collagen fibers correspond to type I collagen, being prevalent in inactive and inactive destructive endometrosis. And the green loose collagen fibers correspond to type III collagen, and are predominant in active and active destructive endometrosis. In the same processes, a greater amount of periglandular myofibroblasts were observed in comparison to inactive and inactive destructive endometrosis. The presence of these cells in active processes are strongly related to an increased deposition of collagen type III in fibrotic nests. Regarding the basement membrane, the active destructive and active endometrosis shows thickening, apparently not related to an increase in expression of type IV collagen. The active destructive and inactive destructive endometrosis exhibited disruption areas in type IV collagen fibers. Thus, it is noted that the myofibroblasts are related to increased deposition of type III collagen in active fibrotic nests

A hipertensão arterial sistêmica (HAS) é definida pela pressão sistólica≥140mmHg e pressão diastólica≥90mmHg, afetando 1/5 da população mundial sendo um grande problema de saúde mundial. Inúmeros avanços têm sido realizados para o entendimento das bases fisiopatológicas desta síndrome. No entanto falta muito ainda por ser investigado para se conhecer bem a patogênese da hipertensão arterial, reconhecidamente de origem multifatorial. Apesar dos avanços farmacológicos, a HAS não apresenta cura definitiva. O presente trabalho foi realizado com objetivo de investigar os efeitos do transplante de células mononucleares cultivadas em meio basal de endotélio sobre os níveis pressóricos, como uma possível estratégia terapêutica. Células mononucleares (MNC) de medula óssea foram extraidas da tíbia e fêmur de 16 ratos espontaneamente hipertensos (SHR) machos de 16 semanas e em seguida plaqueadas em placas de cultura recobertas com fibronectina e cultivadas em meio basal de endotélio suplementado com fatores de crescimento por duas semanas. Fibroblastos, usados como células controle, foram extraídos da pele dos mesmos animais utilizados na extração das MNC. Células mononucleares cultivadas em meio basal de endotélio (n=14) ou fibroblastos (n=11) marcados com CM-Dil celltracker foram injetados intravenosamente (1 x 106celúlas/rato, i.v.) em fêmeas SHR de 16 semanas de idade. Fêmeas SHR (grupo controle; n=14) pareados por idade receberam veículo. A pressão arterial indireta foi analisada antes e após o transplante pelo método de pletismografia da cauda. No 15° dia pós-transplante, os animais foram anestesiados e canulados e após 24 h fez-se o registro direto de pressão arterial por 1 hora (freqüência de amostragem de 1000Hz). A partir do sinal de pressão arterial direta séries temporais de pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD) e intervalo de pulso (IP) foram avaliadas por analise espectral autorregressiva mono e bivariada. Ao final, sob anestesia, a função endotelial sistêmica foi avaliada em cada animal medindo-se as respostas vasodepressoras à acetilcolina e nitroprussiato de sódio. Os resultados do presente trabalho não demonstrou diferença significativa entre os grupos em relação a pressão arterial média (151.12±4.58mmHg no grupo transplantado MNC; 151.82.±4.23mmHg no grupo dos fibroblastos e 146.83±3.91mmHg no grupo controle, p=não significativo) e nem entre os parâmetros espectrais. A freqüência cardíaca dos animais transplantados com fibroblastos foi menor quando comparada aos demais grupos (340.33±10.67bpm grupo fibroblasto;*# 369.96±4.57bpm no grupo tratado MNC e 374.47±5.55bpm no grupo controle, p

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:25:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-18. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:46:37Z : No. of bitstreams: 1 000846277.pdf: 2026141 bytes, checksum: 0bb21e6aa2c7922e2a387ecf5fd901d7 (MD5) The age as well as the presence of inflammation can influence the cellular metabolism, slowing the tissue healing process. Different therapies, such as the application of growth factors and low level laser therapy (LLLT) are capable of biostimulating cells by increasing their proliferation and metabolism. The aim of this study was to evaluate: the functions of gingival fibroblasts obtained from young and elderly individuals (Study 1); the response of these cells exposed to tumor necrosis factor alpha - TNF-α (Study 2); and the effect of LLLT or epidermal growth factor - EGF on the viability and metabolism of these connective cell type (Study 3). Primary culture of gingival fibroblasts of 6 patients (3 young - Y and 3 elderly - E) were collected and cultured in complete culture medium (DMEM). In the Study 1 fibroblasts were seeded in 96-well plates in complete DMEM containing 10% of fetal bovine serum (FBS) for 24, 48 or 72 hours and subjected to evaluation of cell viability (MTT, n=36), total protein production (TP, n=36) and collagen synthesis (SR, n=36). In the Study 2, after 24-hour cell seeding, the complete DMEM was replaced by DMEM without FBS supplemented or not with TNF-α (100 ng/mL) which was kept in contact with cells for additional 24 hours. Then, the production of reactive oxygen TNF-α species (ROS, n=36), nitric oxide (NO, n=36) and synthesis of CCL5 chemokine (ELISA, n=36) were assessed. In the Study 3 fibroblasts were seeded in 24-well plates for 24 hours, and then exposed to EGF (100 μM) or submitted to low power laser irradiation (LASERTable device, InGaAsP - 780 ± 3nm; 25mW). Cell viability (Alamar Blue®, n=12), cell migration (Wound Healing, n=12), collagen synthesis (SR, n=12), and synthesis of vascular endothelial growth factor - VEGF (ELISA, n=12) were assessed 72 hours after the treatments. The data were statistical...(Complete abstract electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-19Bitstream added on 2015-01-26T13:30:22Z : No. of bitstreams: 1 000797541_20160819.pdf: 204494 bytes, checksum: 5159b054dd0286b6cb00db354c498376 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-08-19T10:11:52Z: 000797541_20160819.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-19T10:12:27Z : No. of bitstreams: 1 000797541.pdf: 2105106 bytes, checksum: 2d3aec491ee32b71519aa0aed2eda6b0 (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) É sabido que a maior consequência causada pela radiação ultravioleta gerada pela luz solar é o fotoenvelhecimento e o desenvolvimento de cânceres cutâneos por meio da ação dos radicais livres gerados na pele. A utilização, pela população, de uma formulação, de uso tópico, que auxilie na prevenção do envelhecimento precoce e de doenças causadas pelos radicais livres à pele humana teria imenso impacto, pois promoveria benefícios estéticos, que influenciariam diretamente a saúde psicológica do usuário e preveniriam a fotocarcinogênese. Este fato se torna ainda mais importante em um país tropical como o Brasil, onde a incidência de radiação UV tem se tornado cada vez maior, assim como o desenvolvimento de cânceres de pele na população. Este trabalho teve como objetivo realizar ensaios que comprovem a eficácia e a segurança de um fitocosmético contendo extrato de goiaba (Psidium guajava L.), além de descrever respostas celulares promovidas pelo tratamento com este extrato. No que diz respeito à eficácia deste produto, foram explorados os efeitos quimioprotetores, que podem ser obtidos com o emprego deste extrato e os efeitos relacionados à melhoria do aspecto da pele envelhecida. Em relação à segurança, foram realizadas análises in vivo e utilizados métodos alternativos, visando a substituição do emprego de animais. De acordo com os estudos realizados, o extrato de Psidium guajava L. é citotóxico apenas em concentração bastante superior à concentração ativa, com uma margem de segurança satisfatória. Nas concentrações sugeridas para efeito cosmético, o extrato vegetal não é mutagênico e não causou irritação dérmica, ocular e, nem mesmo comedogenicidade, quando aplicado em coelhos. Além disso, o extrato de Psidium guajava L. revelou atividade inibidora sobre os efeitos deletérios do peróxido de hidrogênio em modelos experimentais in vitro e in vivo, é capaz de estimular a ... It is known that the major consequence caused by the ultraviolet radiation generated by sunlight is photoaging and the development of skin cancers through the action of free radicals generated on the skin. The use by the population of a topical formulation aiming to prevent the premature skin aging and diseases caused by free radicals to human skin would be of great value. It also should provide aesthetic benefits that directly influence the psychological health of the user and would prevent photocarcinogenesis. This fact becomes even more important in a tropical country like Brazil, where the incidence of UV radiation has become increasingly larger, as well as the development of skin cancers in the population. This research aimed to performe assays to prove the efficacy and safety of a phytocosmetic containing guava (Psidium guajava L.) extract, and also, describe cellular responses observed with the treatment with this extract. With regard to the efficacy of this product, the chemoprotectors effects that can be obtained with the use of this extract and the improvement on the aged skin that could be obtained with the treatment with it were explored. In relation to the assessment of the safety of this phytocosmetic, in vivo and alternative methods to the use of animals were conducted. According to the results, the Psidium guajava L. extract is cytotoxic only at concentrations higher than the active concentration of this compound, exhibiting a satisfactory margin of safety. At the concentrations suggested for the cosmetic effect, the plant extract is not mutagenic and did not cause dermal, ocular, or even comedogenicity irritation when applied to rabbits. Moreover, the extract of this fruit was able to inhibit the deleterious effects of hydrogen peroxide in in vitro and in vivo experimental models, was able to induce the fibroblasts proliferation and collagen biosynthesis and is capable of reducing hyperpigmentation produced by overexposure...

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-03-14. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:47:03Z : No. of bitstreams: 1 000830081_20160101.pdf: 121876 bytes, checksum: 342f21a15b1d2e738af168b1e2467da5 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-01-04T10:26:29Z: 000830081_20160101.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-01-04T10:28:25Z : No. of bitstreams: 1 000830081.pdf: 809941 bytes, checksum: ea53cd5ef0cec7fb993a2745e82dad53 (MD5) The antimicrobial peptides LL-37, hBD-1, hBD-2 and hBD-3 are considered an endogenous antibiotic, with important role in the prevention of periodontal diseases due to their ability to regulate the immune response. However those peptides could be degraded by periodontal pathogens. Therefore, therapies able to up regulate the secretion of those peptides by human cells, and the association of antimicrobial peptides with natural compounds, which may act in synergism to modulate the immune response, may be a novel approach for effectively controlling periodontal diseases. The aim of this in vitro study were: i) investigate the ability of green tea extract and EGCG to induce hBD-1 and hBD-2 secretion and gene expression by gingival epithelial cells (B11) and to protect hBDs from degradation by P. gingivalis, ii) A 3D co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts stimulated with A. actinomycetemcomitans LPS (1 μg/ml) were used to investigated the anti-inflammatory properties of the hBD-3, LL-37, ACPACs and EGCG and to determine whether LL-37 acts in synergy with AC-PACs, EGCG and hBD-3. Gingival epithelial cells were stimulated with green tea extract or EGCG in the presence and absence of specific inhibitors. The secretion and gene expression of hBD-1 and hBD-2 was respectively measured by ELISA and qPCR. The ability of green tea extract and EGCG to prevent hBDs degradation by P. gingivalis present in a bacterial culture supernatant was evaluated by ELISA. A 3D co-culture model composed of gingival fibroblasts embedded in a collagen matrix overlaid with gingival epithelial cells had a synergistic effect with respect to the secretion of IL-6 and IL-8 in response to A. actinomycetemcomitans LPS stimulation compared to fibroblasts and epithelial cells individually. The 3D co-culture model was stimulated with noncytotoxic concentrations of: i) hBD-3 (10 and 20 μM) ...(Complete abstract electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-19Bitstream added on 2015-01-26T13:30:41Z : No. of bitstreams: 1 000793457.pdf: 4940625 bytes, checksum: 33d37f3e9d163f7bc90f3beb34d29c57 (MD5) Introdução: A Engenharia de Tecidos consiste na regeneração de órgãos e tecidos, obtidos através da coleta de partes de órgãos ou tecidos do indivíduo, que, dissociados em células, são cultivadas sobre suportes biológicos ou sintéticos (scaffolds), tendo como principal premissa o reestabelecimento e recuperação da funcionalidade do tecido lesado ou perdido. Esta tecnologia, portanto, abre novos caminhos para gerar transplantes funcionais e vitais. Dentro da Engenharia Biomédica e de Biomateriais, o Laboratório de Engenharia Celular do Hemocentro de Botucatu possui, desde 2001, pesquisas na área de produção de curativos biológicos, que são aqueles que interagem de forma ativa nas diversas fases do processo cicatricial, nos vários tipos de feridas. Diante da realidade de que o tratamento das feridas crônicas englobam altos custos econômicos, sociais e humanos, comprometendo a vida dos indivíduos acometidos e da necessidade de se otimizar e minimizar o impacto negativo do descarte de hemocomponentes excedentes da prática transfusional, o desafio é buscar alternativas de scaffolds para Terapia Celular. Objetivos: Avaliar o desempenho de diferentes arcabouços biológicos como a cola de fibrina, gel de plaquetas e membrana de quitosana dopada com fatores de crescimento extraídos de plaquetas, para cultura de células. Material e Métodos: Foi coletado um fragmento de pele e um de gordura de cinco pacientes diferentes. Estes tecidos foram submetidos a protocolos de dissociação mecânica, enzimática e por explante, seguido de isolamento, semeadura e expansão das células obtidas: células-tronco mesenquimais, fibroblastos e queratinócitos. As células foram cultivadas até ao menos a quarta passagem, caracterizadas e separadas em dois grupos: testes pré-scaffold e pós-scaffold, que consistiu nas análises de imunofenotipagem, imunocitoquímica, dosagem de citocinas inflamatórias no sobrenadante de cultura, teste do ... Introduction: Tissue engineering comprises in organ and proper tissue regeneration achieved by collecting small tissue fragments that are dissociated into cells and then cultivated into biological or synthetics scaffolds. The main characteristic of these constructs is their capacity to behave as their biological matrix counterparts, providing mechanical support and the required micro environment to the cells. This technology paves the way for the creation of functional and vital tissues for transplants. Within Biomedical Engineering and Biomaterials, the Cell Engineering Laboratory of the Botucatu Blood Transfusion Center has been investigating these topics since 2001, starting with the production of biological dressings. Biological dressings interact actively with the several phases of chronic wounds, which involves high economic, social and psychological costs, often condemning the patients quality of life. Considering this reality, the contribution of tissue engineering is to develop alternatives on cell therapy using scaffold technology. Aims: To assess the performance of different biological scaffolds such as fibrin glue, platelet gel and chitosan membrane for cell culture. Material and Methods: Five fragments of adipose tissue and skin were collected, dissociate with mechanical, enzymatic and explant techniques, and the resulting cells were seeded on tissue culture flasks, amplified and characterized using multiparameter techniques. Following characterization, these cells were cultivated into three different scaffolds made of fibrin glue, platelet gel and chitosan - which was performed in two distinct ways, on its natural form and incorporated with platelet-derived growth factors to analyze this interaction. Discussion and Results: cell cultures were amplified and cultivated making a good cell bank. However, keratinocytes were difficult to grow and the rest of experiments were unfeasible to drawn up. Immunocytochemistry analysis ...

Aranhas do gênero Loxosceles representam um risco para a saúde humana, devido aos efeitos necróticos e sistêmicos de sua piacada. Os sintomas do envenenamento com as aranhas marrons variam de dermonecrose na maioria dos casos a hemólise sistêmica e coagulopatia, levando à falência renal agúda na minoria dos acidentes. Ao contrário dos efeitos sistêmicos, que já são bem caracterizados, os mecanismos de morte celular induzidas pela peçonha das aranhas marrons, ainda não são tão bem descritos na literatura. Existem evidências de que células tratadas com a peçonha iniciam uma resposta apoptótica, mas nenhuma via de apopotose foi caracterizada. No presente trabalho estudamos as caspases ativadas durante o processo de apoptose iniciado in vitro pela peçonha de Loxosceles similis em fibroblastos humanos. Utilizando o teste de metabolização de MTT, verificamos que dentre todas as linhagens testadas, apenas fibroblastos primários foram susceptíveis à ação da peçonha. Através das técnicas de microscopia de fluorescência e de citometria de fluxo, verificamos que fibroblastos humanos tratados com a peçonha iniciam uma resposta apoptótica. Fazendo uso ainda da citometria de fluxo, verificamos que a inibição das caspases-9, 6 e 4 influenciaram no curso do processo apoptótico, diminuindo a marcação para anexina V-FITC em relação ao grupo tratado apenas com a peçonha. Por fim, utilizando a microscopia de fluorescência mostramos que as caspases efetoras 3 e 7 também são ativadas durante o processo. Spiders from the Loxosceles genus represent a risk to human health due to the systemic and necrotic effect of their bite. The symptoms of envenomation with the brown spiders may vary from dermonecrosis in the majority of cases to coagulopathy and hemolysis leading to acute renal failure. Even though the systemic effects are well characterized, the cell death mechanisms triggered by the venom of the brown spiders are still not well described in literature. There is evidence in literature that many cells treated with the venom enter in an apoptotic process, however the triggering of this response is not well comprehended. In the present study we assessed the caspases activated during the process of apoptosis begun in vitro by the Loxosceles similis venom. Using the test of MTT metabolization, we verified that among all tested cell lines, only primary fibroblasts were affected by the brown spiders venom. We demonstrate using fluorescence microscopy and flow cytometry that human fibroblasts treated with the whole venom started an apoptotic response. Furthermore, using flow cytometry we verified that the inhibition of caspases-4, -6 and -9 decreased the percentage of cells labeled with the apoptosis marker annexin V-FITC. Ultimately, by fluorescence microscopy we could observe that the effectors caspases-3 and -7 are also activated during the process.

A fisiopatologia da artrite reumatoide (AR) envolve a participação de diversas células e citocinas. A interleucina 33 (IL-33) é um membro recentemente descrito da família da interleucina 1 (IL-1) e seu papel no desenvolvimento e perpetuação da resposta inflamatória vem sendo demonstrado em diversos estudos em pacientes com AR e em modelos experimentais. Na membrana sinovial, fibroblastos sinoviais (FS) assumem comportamento crucial no processo inflamatório da AR estando implicadas na patogênese da sinovite e do dano estrutural, através da produção de citocinas inflamatórias e metaloproteinases (MMPs). Comparar a morfologia de FS do líquido articular e do tecido sinovial de pacientes com AR com FS obtidos de modelo experimental de artrite induzida pelo colágeno (CIA) por microscopia óptica e eletrônica. Estudar o efeito do estímulo com IL-33 sobre essas células quanto à produção de interleucina-6 (IL-6) e MMPs 1 e 3. Adicionalmente avaliar a produção de MMPs 1 e 3 após estímulo com fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) e interleucina 1 beta (IL-1 beta). Estabeleceu-se protocolo de cultivo de fibroblastos de sinóvia e líquido sinovial de pacientes com AR e de camundongos com CIA. Foram utilizadas células humanas entre a quarta e oitava passagens e células de modelo de CIA entre 27ª e 38ª passagens. As células foram comparadas morfologicamente por microscopia óptica e eletrônica de transmissão (MET) e varredura (MEV). As concentrações basais de IL-6 foram avaliadas nos FS humanos e murinos. Os FS de modelo de CIA foram estimulados por 18 horas com IL-33 nas doses de 1, 3, 10, 30 e 100ng/mL e a produção de TNF-alfa e IL-6 foi identificada pela técnica de ELISA. FS humanos receberam estímulo com IL-33 10ng/mL e as concentrações de IL-6 foram dosadas após 1, 3, 6, 9, 12 e 24 horas. FS humanos também foram estimulados com TNF-alfa e IL-1b nas doses 0,5; 1, 5 e 10 ng/mL cada um isoladamente por 18 horas e a produção de MMP 1 e 3 foi analisada por ELISA. FS humanos e murinos exibiram morfologia ultraestrutural semelhante, com citoplasma abundante e presença de corpúsculos lamelares. No modelo de CIA a produção basal média de IL-6 foi de 73,94 (± 4,0) ng/mL e após estímulo com IL-33 houve aumento na produção de IL-6 com doses crescentes de IL-33. Não foi detectado nível de TNF-alfa basal ou após estímulo com IL-33. Nas células humanas, as concentrações de MMP-1 se correlacionaram positivamente com as doses crescentes de TNF-alfa e IL-1 beta. As concentrações de MMP-3 ultrapassaram os limites de detecção do método. FS humanos de pacientes com AR e do modelo de CIA exibem características morfológicas semelhantes, dando suporte ao uso do modelo animal para o estudo da doença. A análise por MET e MEV permitiram a caracterização dos FS, uma vez que os corpúsculos lamelares constituem organelas armazenadoras de surfactante presentes exclusivamente em FS da camada sinovial interna. O comportamento dos FS murinos em resposta ao estímulo com IL-33 confirmam a participação dessa citocina no ambiente inflamatório da CIA e podem ter implicações no estudo e desenvolvimento de alvos terapêuticos. The pathophysiology of rheumatoid arthritis (RA) involves the participation of various cells and cytokines. Interleukin 33 (IL-33) is a recently described member of the family of interleukin 1 (IL-1) and its role in the development and perpetuation of the inflammatory response has been demonstrated in several studies in RA patients and in experimental models. In the synovial tissue, synovial fibroblasts (SF) assume behavior in critical inflammatory environment being involved in RA synovitis and structural damage cycle through production of inflammatory cytokines and matrix metalloproteinases (MMPs). Comparative ultrastructural morphology of SF derived from synovial fluid and synovial tissue of patients with RA and experimental model of collagen-induced arthritis (CIA). To study the effect of IL -33 stimulation on these cells for the production of interleukin-6 (IL-6) and MMPs 1 and 3. Evaluate the production of MMPs 1 and 3 after stimulation with tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin-1 beta (IL-1 beta). A protocol of cultured fibroblasts from synovium and synovial fluid of RA patients and mice with CIA were established. Human cells were used between the fourth and eighth passages and cells CIA model between 27th and 38th passages. Cells were compared morphologically by transmission (TEM) and scaning electron microscopy (SEM) and scanning. Basal levels of IL-6 were evaluated in murine and human SF. The CIA model SF were stimulated for 18 hours with IL-33 at doses 1, 3, 10, 30 and 100ng/ml TNF-alpha and IL-6 was identified by ELISA. Human SF received stimulation with 10ng/mL IL-33 and IL-6 concentrations were measured after 1, 3, 6, 9, 12 and 24 hours. Also SF were stimulated with human TNF-alpha and IL-1b at doses of 0.5, 1, 5 and 10 ng/ml each alone for 18 hours, and production of MMP 1 and 3 was analyzed by ELISA. Human and murine SF exhibited similar ultrastructural morphology with abundant cytoplasm and presence of lamellated corpuscles. In the CIA model mean basal production of IL-6 was 73,94 (± 4,0) ng/mL and after stimulation with IL -33 increased the production of IL-6 with increasing doses of IL -33. There was no detectable level of basal TNF-alpha or after stimulation with IL -33. In human cells, the concentrations of MMP-1 positively correlated with increased TNF- alpha and IL- 1 beta. The MMP- 1 concentration exceeded the limit of detection method. Human SF from patients with RA and SF from CIA model exhibit similar morphological characteristics, supporting the use of an animal model for the study of disease. The SEM and TEM analysis allowed characterization of SF, since the corpuscles lamellar surfactant-storage organelles are unique synovial fibroblasts inner layer. The behavior of murine SF in response to stimulation with IL -33 confirms the involvement of this cytokine in the inflammatory environment of CIA and has implications for the study and development of therapeutic targets.

Made available in DSpace on 2014-08-27T14:36:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-05Bitstream added on 2014-08-27T15:57:02Z : No. of bitstreams: 1 000749985.pdf: 1413898 bytes, checksum: 7421bc33cc6d75478dcb676de29021bd (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) A quimiocina C-X-X motif ligand 12 (CXCL12) e seu receptor de quimiocina 4 (CXCR4) desenvolvem um papel crítico na inflamação das vias aéreas. No entanto, os efeitos da ativação da via CXCL12/CXCR4 sobre fibroblastos pulmonares ainda são desconhecidos. Neste estudo, investigamos o efeito da via CXCL12/CXCR4 sobre a quimiocina (C-C motif) ligante 3 (CCL3) e (C-X-C motif) ligante 2 (CXCL2) e sobre os mediadores lipídicos leucotrienos B4 (LTB4) e C4 (LTC4) por fibroblastos pulmonares e a sinalização intracelular envolvida neste processo. CXCL12 foi capaz de induzir a produção de CCL3, CXCL2, LTB4 e LTC4; a produção de CCL3 não é dependente da produção de CXCL2, mas a produção de CXCL2 é dependente da produção de CCL3. A produção de LTB4 pode ser parcialmente regulada por CXCL2 e CCL3 e a produção de LTC4 é dependente da produção de CCL3 e CXCL2. Fibroblastos pulmonares constitutivamente expressam CXCR4 e a estimulação com CXCL12 induz sua expressão. Análises de Western blot mostraram que CXCL12 aumenta a expressão proteica de CXCR4 e induz a fosforilação da S339 do CXCR4. A expressão gênica constitutiva e induzida de CXCR4 foram inibidas pelo anticorpo anti-CXCL2. No entanto, o anticorpo anti-CCL3 e o inibidor farmacológico MK886 foram capazes de diminuir a expressão gênica induzida de CXCR4. Os fibroblastos pulmonares foram pré-tratados com MK886, dexametasona (Dexa) e/ou loratadina (Lor). MK886 e Lor promoveram a diminuição da produção de LTC4 e LTB4, mas não a de CCL3 e CXCL2. Dexa diminuiu níveis de CCL3, CXCL2, LTB4 e LTC4, e quando associado com Lor esta diminuição foi mais eficaz. Identificamos... C-X-X motif ligand 12 (CXCL12) and its specific receptor Chemokine receptor 4 (CXCR4) play a critical role in airway inflammation. However, the effects of CXCL12/CXCR4 axis on pulmonary fibroblast activation are unknown. In this study, we investigated the effect of CXCL12/CXCR4 axis on chemokine (C-C motif) ligand 3 (CCL3), chemokine (C-X-C motif) ligand 2 (CXCL2), leukotrienes B4 (LTB4) and C4 (LTC4) production by pulmonary fibroblasts and the intracellular signaling involved in the process. CXCL12 induced CCL3, CXCL2, LTB4 and LTC4 production, and CCL3 production is not dependent on CXCL2; but CXCL2 production is dependent on CCL3 production. LTB4 production can be partially down-regulated by CXCL2 and CCL3 production and LTC4 production is dependent on CCL3 and CXCL2 production. Pulmonary fibroblasts constitutively expressed CXCR4, and CXCL12 stimulation up-regulated its expression. Western blot analysis showed that CXCL12 increased protein expression of CXCR4 and induced phosphorylation at S339 of CXCR4. Constitutive CXCR4 expression was decreased by anti-CCL3 antibody or MK 886. Inducible CXCR4 was inhibited by anti-CXCL2 antibody. Indeed pulmonary fibroblasts were pretreated with MK886, dexamethasone (Dexa) and loratadine (Lor). MK886 and loratadine was able to reduced LTB4 and LTC4 production but not CCL3 and CXCL2. Dexa decreased CCL3, CXCL2, LTB4 and LTC4 production, and when associated with Lor this decrease was more effective. We found that PI-3K and JNK intracellular signaling play a role in CCL3 production; p38, MEK1/2, PI-3K and JNK are involved in CXCL2 production and p38 and MEK1/2 pathways are involved in LTB4 production by...

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-01Bitstream added on 2014-08-13T18:01:04Z : No. of bitstreams: 1 000740552_20150801.pdf: 754242 bytes, checksum: bc5e88cf87d7787c34d18c1a6e215275 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-03T12:20:57Z: 000740552_20150801.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-03T12:22:17Z : No. of bitstreams: 1 000740552.pdf: 1359921 bytes, checksum: 8d035cb78ff5afaa9c1f0d1ef3b02d72 (MD5) O fator de crescimento dos fibroblastos 8 (FGF8) é expresso pelo oócito bovino, ativa os receptores expressos por células do cumulus e oócitos, e está envolvido na regulação da glicólise e meiose no CCO de murinos. O primeiro objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do FGF8 sobre a expansão das células do cumulus, a progressão da meiose e metabolismo energético em CCOs bovinos submetidos à MIV. Uma vez que foram observadas influências sobre a progressão da meiose e no metabolismo energético, os efeitos de FGF8 sobre a abundância de genes que codificam o RNAm que controlam estes processos foram avaliados. O FGF8 não afetou a expansão do cumulus, mas diminuiu a porcentagem de oócitos que alcançaram a metáfase II, consequentemente houve o aumento da porcentagem de oócitos na metáfase I. Tal efeito foi associado com um efeito inibitório do FGF8 sobre os níveis de RNAm que codifica a Ciclina B1 no oócito. Em contraste com os achados anteriores em murinos, o FGF8 leva à diminuição dos níveis de RNAm de NPR2 nas células do cumulus. O FGF8 tende a diminuir a absorção de glicose e produção de lactato, que foi acompanhada por uma redução significativa nos níveis de RNAm para PFKP em células de cumulus. O FGF8 também tende a diminuir a expressão de RNAm para o LDHA, mas não alterou os níveis de RNAm para GLUT1, GLUT4 e PDHA1 nas células do cumulus, enquanto que aumentou a expressão de RNAm para o PDHA1 no oócito. Este estudo apresenta evidências de que o FGF8 pode retardar a progressão da meiose durante a MIV em bovinos por meio de mecanismos que envolvam redução da expressão de Ciclina B1. Além disso, novamente em contraste com estudos em ratos, os dados sugerem um efeito inibidor modesto de FGF8 sobre o metabolismo glicolítico das células do cumulus durante a maturação in vitro de bovinos Fibroblast growth factor 8 (FGF8) is expressed by the bovine oocyte, activate receptors expressed by cumulus cells and oocytes, and is involved in the regulation of glycolysis and meiosis in the murine COC. The first aim of this study was to assess the effects of FGF8 on cumulus expansion, meiosis progression and energy metabolism in bovine COCs submitted to IVM. Then, once influences on meiosis progression and energy metabolism were observed, effects of FGF8 on abundance of mRNA encoding genes that control these processes were assessed. FGF8 did not affect cumulus expansion but decreased the percentage of oocytes reaching metaphase II, while increasing the percentage of oocytes in metaphase I. This was associated with an inhibitory effect of FGF8 on levels of mRNA encoding Cyclin B1 in the oocyte. In contrast with previous findings in mice, FGF8 decreased mRNA levels of NPR2 in cumulus cells. FGF8 tended to decrease glucose uptake and lactate production, which was accompanied by a significant reduction in PFKP mRNA abundance in cumulus cells. FGF8 also tended to decrease LDHA mRNA expression, but did not change GLUT1, GLUT4 and PDHA1 mRNA levels in cumulus cells, while it increased PDHA1 mRNA abundance in the oocyte. This study presents novel evidence that FGF8 can slow meiosis progression during IVM in cattle through mechanisms involving reduction of Cyclin B1 expression

As bolsas de gordura da pálpebra humana são uma fonte potencial de isolamento de células-tronco para uso na medicina regenerativa. Para futura aplicação clínica dessas células é fundamental estabelecer condições de cultivo livres de componentes animais assim como definir claramente a população de células-tronco diferenciando-a de outros tipos celulares, como os fibroblastos. As células-tronco mesenquimais (MSCs) compartilham semelhanças in vitro com os fibroblastos e não há marcadores específicos que permitam a clara distinção entre estes dois tipos celulares. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho é comparar fenotípica e funcionalmente as células-tronco isoladas das bolsas de gordura da pálpebra (OFSCs) e os fibroblastos residentes na pele da pálpebra cultivados em meio de cultura suplementado com plasma (PH) ou soro alogênico humano (SH) em substituição ao soro fetal bovino (SFB). Os resultados demonstraram que houve maior cinética de proliferação celular na presença do meio de cultura suplementado com SH indicando a viabilidade do uso desse suplemento para cultivo em larga escala de células para fins terapêuticos. As OFSCs cultivadas nesse meio apresentaram as características imunofenotípicas de MSCs, foram capazes de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condrócitos e apresentaram altos níveis de atividade da fosfatase alcalina. Em contraste, os fibroblastos não exibiram propriedades de multipotência in vitro e apresentaram baixos níveis de expressão e atividade de fosfatase alcalina. Os resultados obtidos possibilitaram distinguir com sucesso as populações de OFSCs e fibroblastos viabilizando futuros estudos de avaliação dos fibroblastos da pálpebra como substituto dos fibroblastos do limbo em trabalhos visando a reconstrução da superfície ocular e permitirão também estudos de avaliação das pálpebras como um nicho de células-tronco para o globo ocular. Human orbital fat tissues are a potential source to isolate stem cells for the development of regenerative medicine therapies. For future clinical application of these cells is critical to establish animal components free culture conditions as well as clearly define the stem cells population differentiating it from other cell types, such as fibroblasts. The mesenchymal stem cells (MSCs) share in vitro similarities with fibroblasts and there are no specific markers allowing a clear distinction between these two cell types. Therefore, the aim of this study is to compare phenotypic and functionally orbital fat-derived stem cells (OFSCs) and fibroblasts resident in the eyelid skin grown in culture medium supplemented with allogeneic human serum (HS) or plasma (HP) replacing fetal bovine serum (FBS). The results showed that there was a greater cell proliferation kinetics in the presence of culture medium supplemented with HS indicating the feasibility of use of this supplement for clinical application to optimize the ex vivo expansion of cells before transplants. The OFSCs grown in this medium showed the immunophenotypic characteristics of MSCs and were able to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes. In contrast, the fibroblasts did not have multilineage differentiation potential and showed low levels of alkaline phosphatase expression and activity. The results enabled us to successfully distinguish OFSCs and fibroblasts populations and enabling future studies to evaluate the eyelid fibroblasts as a substitute for limbal fibroblasts works for ocular surface reconstruction and also allow evaluation studies of the eyelids as a stem cells niche to the eyeball.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Florianópolis, 2010 Cirurgias para reconstrução de tecido mole que utilizam material autógeno aumentam a morbidade e o riscos de complicações com a segunda área cirúrgica. Como alternativa para eliminar esses inconvenientes, a engenharia tecidual busca encontrar um arcabouço ideal para carrear células e fatores de crescimento responsáveis pela criação de tecidos em ambiente in vitro. Dessa forma o objetivo deste estudo é analisar quatro membranas absorvíveis como potencial arcabouço para a engenharia de tecidos. Foram utilizados fibroblastos humanos gengivais provenientes de cultura primária. Quatro membranas foram utilizadas: Osseoguard®, Genderm®, ácido poli(ácido lactico-co-glicólico) (PLGA) e ácido poli(ácido lactico-co-glicólico) associado com hidroxiapatita (PLGA+HA). Testes de proliferação, análise da degradação através da microscopia eletrônica de varredura (MEV), teste de viabilidade celular (MTT) e análise do pH do meio de cultura foram os métodos utilizados para avaliar as membranas. Os índices de proliferação não foram estatisticamente significativos entre grupos, contudo todas as membranas possibilitaram a proliferação celular. A análise do MEV mostrou que as membranas com base polimérica (PLGA e PLGA + HA) apresentam características mais apropriadas a arcabouços para engenharia tecidual. Os níveis de viabilidade celular diminuíram e os níveis de pH foram similares para todos os grupos exceto o PLGA que se apresentou ácido. A membrana de PLGA + HA é a que apresenta melhores características biológicas e estruturais para funcionar como arcabouço para a engenharia de tecidos. Soft tissue reconstruction using autogenous material increases morbidity and risk of complications with the second surgical area, the donor site. As an alternative to eliminate these drawbacks, tissue engineering seeks to find an ideal scaffolds to wash cells and growth factors that are responsible for a tissue environment fabrication in vitro. Thus the aim of this study is to analyze four absorbable membranes as a potential scaffold for tissue engineering. Human gingival fibroblasts (HGF) from primary cell culture were used. Four types of bioabsorbable membranes were used as cell carrier: OsseoGuard®, Genderm®, poly (lactic-co-glycolic) acid (PLGA) and poly (lactic-co-glycolic) acid associated with hydroxyapatite (PLGA+HA). Proliferation assays, degradation analysis by scanning electron microscopy (SEM) cell viability assay (MTT) and pH analysis of the culture mediums were used to evaluate the membranes. The proliferation index was not statistically significant between groups, yet all the membranes allowed cell proliferation. The SEM analysis showed that the membranes based on polymers (PLGA and PLGA HA) have more appropriate scaffolds characteristics for tissue engineering. The level of cell viability decreased and the pH levels were similar for all groups except that PLGA. The PLGA+HA membrane has the best biological and structural functions as a scaffold for tissue engineering.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Florianópolis, 2009. Diversas pesquisas clínicas ou com cultura de células têm sido realizadas com o intuito de identificar o meio mais adequado para a conservação de dentes avulsionados ou de fibroblastos periodontais. Embora, na maioria das vezes, essas pesquisas confirmem ou refutem uma hipótese experimental, normalmente elas dão origem a algumas dúvidas. Esta tese de doutorado é composta de 4 pesquisas desenvolvidas com os objetivos de: 1) verificar se a renovação do leite, em intervalos regulares de 12, 24 ou 48h, é capaz de prolongar sua capacidade de manter a viabilidade de fibroblastos do ligamento periodontal humano (FLPH); 2) verificar se o tempo de estocagem da solução salina balanceada de Hank (HBSS) exerce influência sobre a sua capacidade de manter a viabilidade de FLPH; 3) comparar o efeito de diferentes meios de conservação sobre a viabilidade de FLPH; e 4) comparar o efeito de diferentes meios de conservação sobre a viabilidade e a capacidade proliferativa de FLPH. Para executá-las, as células foram conservadas, a 5 e/ou a 20°C, em própolis, clara de ovo, água de coco, HBSS, Save-A-Tooth®, leite desnatado e leite integral por períodos variáveis. Células armazenadas em Meio Essencial Mínimo (MEM) a 37°C e em água de torneira (5 e/ou a 20°C) serviram de controle-positivo e negativo, respectivamente. A viabilidade e a capacidade de proliferação celular foram determinadas pelo ensaio MTT. Os dados foram analisados pelos testes de Kruskal-Wallis, Scheffé e Mann-Whitney (a=5%). Com base nos resultados obtidos nos diferentes experimentos foi possível concluir que: 1) a renovação do leite foi capaz de prolongar a sua capacidade de manter a viabilidade de FLPH somente quando realizada, a cada 48h, no leite mantido a 5ºC; 2) o tempo de estocagem da HBSS influenciou negativamente a sua capacidade de manter a viabilidade de FLPH; 3) em ambas as temperaturas, o leite desnatado foi o melhor meio de conservação, seguido pelo leite integral e HBSS. O própolis, a clara de ovo e a água de coco podem ser indicados para a conservação de fibroblastos periodontais por um período máximo de 3h; 4) em ambas as temperaturas, os meios mais efetivos em manter a viabilidade celular (0h) foram o leite desnatado e o leite integral. Quando os meios foram mantidos a 5°C, o leite desnatado e o leite integral proporcionaram maior capacidade proliferativa aos FLPH. Quando mantidos a 20°C, a HBSS revelou os melhores resultados. Several clinical trials or cell culture studies have been carried out in order to identify the most appropriate storage medium for the maintenance of avulsed teeth or periodontal fibroblasts. Although in most cases, these studies confirm or refute an experimental hypothesis, they often give rise to some uncertainties. This doctoral thesis is composed of 4 studies developed with the following purposes: 1) to analyze whether the replacement of milk at 12, 24 or 48 h, can extend its ability to maintain human periodontal ligament fibroblasts (HPDLF) viability; 2) to verify if the storage time influences the effectiveness of Hank's balanced salt solution (HBSS) in maintaining HPDLF viability; 3) to compare the effect of different storage media to preserve HPDLF viability; and 4) to evaluate the effect of different storage media on the maintenance of the viability and proliferative capacity of HPDLF. The cells were stored at 5 and / or 20°C in propolis, egg white, coconut water, HBSS, Save-A-Tooth ®, skimmed and whole milk for different periods of time. Cells stored at 37°C in Minimum Essential Medium (MEM) and tap water (5 and / or 20°C) served, respectively, as positive and negative controls. The viability and cellular proliferation capacity was determined by MTT assay. Data were analyzed by Kruskal-Wallis, Scheffe and Mann-Whitney tests (á = 5%). Based on the results obtained in the different experiments, it was concluded that: 1) milk replacement was able to extend its ability to maintain HPDLF viability only when carried out every 48 hours at 5°C, 2) the storage time of HBSS negatively influenced its effectiveness, 3) at both temperatures, skim milk, followed by whole milk and HBSS preserved significantly more viable cells than any other tested solution. Propolis, egg white and coconut water can be indicated to preserve HPDLF for up to 3 hours, 4) at both temperatures, the most effective mediums to maintain cell viability (0 h) were skimmed and whole milk. When the media were kept at 5° C, skimmed and whole milk provided higher proliferative capacity to HPDLF. When kept at 20°C, HBSS showed the best results.

Compósitos a base de Silorano vêm apresentando bons resultados mecânicos em diversos estudos laboratoriais, mas pouco se sabe ainda sobre seus efeitos sobre as células do tecido gengival e seu grau de conversão. O objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade celular e o grau de conversão de uma resina composta a base de silorano (Filtek P90 3M ESPE) e de três resinas convencionais de metacrilato (Filtek Z350XT- 3M ESPE; Filtek Z100- 3M e Filtek Z250- 3M ESPE), todas fotopolimerizadas por 20 ou 40 segundos pelo LED (Flash lite DISCUS), em cultura primária de fibroblastos gengivais. Avaliou-se também se existe correlação entre grau de conversão e viabilidade celular. Para tanto, foram confeccionados seis espécimes (n=6) de cada compósito, a partir de um molde. O metabolismo celular foi avaliado após 24 h por meio do teste de MTT (metiltetrazólio), onde 1,5x105 células/poço foram semeadas em placas de 96-poços, e após 48h, colocadas em contato com o extrato proveniente da incubação prévia dos espécimes de resina composta por 24h ou 12 dias. O grau de conversão foi analisado por meio de FTIR. Análise de variância (ANOVA) com correção de Bonferroni (p

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Ciências Animais, 2012. Fatores epigenéticos são responsáveis por controlar a expressão de genes e diferenciação durante a vida celular. Dentre eles, a metilação do DNA é o mais estudado. Cada tipo celular possui um padrão epigenético altamente especializado. Após a fecundação natural ou clonagem por transferência nuclear (TNCS), um padrão epigenético préexistente deve ser apagado e restabelecido para garantir o correto desenvolvimento embrionário. Porém, nos clones, essa reprogramação é ineficiente mas é possível que o uso de substâncias desmetilantes de DNA utilizadas durante o cultivo celular de células doadoras de núcleo possa desmetilar o DNA, aumentando a eficiência da técnica. O objetivo desse estudo foi avaliar, em fibroblastos bovinos, o efeito da S-Adenosil-L-Homocisteína (SAH) na viabilidade celular, metilação de DNA e expressão do transcrito específico do gene XIST responsável pela inativação do cromossomo X. Células foram cultivadas em meio de cultivo DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium -Gibco®), suplementado com 0.5mM, 1.0mM, 1.5mM e 2.0mM de SAH (Sigma®), incubado a 39°C e 5% de CO2. O padrão de metilação do DNA foi avaliado através do sequenciamento de sequências de DNA tratadas com bissulfito de sódio, usando o kit EZ DNA methylation Kit™ (ZymoResearch®), para converter citosinas não metiladas. O RNA total das células foi extraído com o kit RNeasy Plus Micro kit (Qiagen®) e o transcrito de XIST foi quantificado por PCR em tempo real, usando GAPDH e CYC-A como controles endógenos. O número de células foi comparado entre o grupo controle e os grupos tratados com 0.5mM, 1.0mM, 1.5mM e 2.0mM de SAH e a metilação do DNA e a expressão entre o grupo controle e o grupo tratado com 2.0mM de SAH. Não houve diferença na viabilidade celular, metilação de DNA e expressão gênica entre os tratamentos. O grupo controle apresentou 100% de sequências hipermetiladas e 87,58% de metilação e o grupo tratado com 2.0mM de SAH apresentou 92,86% de sequências hipermetiladas e 82,35% de metilação. O uso do SAH como agente desmetilante no cultivo celular é uma alternativa viável que continua sendo estudada. Acredita-se que um processo de desmetilação é induzido pelo uso do SAH durante o cultivo celular, contribuindo para o aumento da eficiência da TNCS. Contudo, é necessário avaliar outras concentrações e diferentes tempos de cultivo com o SAH. _______________________________________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT Epigenetic factors are responsible for controlling gene expression and differentiation through the cell life. Among them, DNA methylation is the most studied. Each cell type possesses a specific and highly specialized epigenetic pattern. After natural fertilization or cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT), a pre-existing epigenetic pattern must be erased and reestablished to ensure correct embryo development. However, in cloning this reprogramming is inefficient and it is possible that the use of a DNA demethylating substance can improve the efficiency of the technique. The aim of this study was to evaluate, in bovine skin fibroblasts, the effects of S-(5’-adenosyl)-L-homocysteine (SAH) on cell viability, DNA methylation and expression of the X-inactive specific transcript (XIST) gene. Cells were cultivated in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco®) supplemented with 0.5mM, 1.0mM, 1.5mM e 2.0mM of SAH (Sigma ®) incubated at 39°C with 5% CO2 in air. The pattern of DNA methylation was assessed by bisulfite sequencing, using the EZ DNA methylation Kit™ (ZymoResearch®) to convert unmethylated cytosines. Total RNA was extracted with the RNeasy Plus Micro kit (Qiagen®) and the XIST transcript was quantified by qPCR using GAPDH and CYC-A as endogenous controls. The number of cells was compared among 0.5mM, 1.0mM, 1.5mM e 2.0mM of SAH and control groups and DNA methylation and gene expression between control and 2.0mM groups. There were no differences in cell viability, DNA methylation and gene expression among treatments. Control group showed 100% of hypermethylated sequences and 87.58% of methylation and the 2.0mM group showed 92.86% of hypermethylated sequences and 82.35% of methylation.The use of SAH as a DNA demethylating agent in cell culture is a viable alternative and still little studied. It is believed that a demethylation process is induced by the useof SAH in the culture, contributing to increase the efficiency of SCNT. However, it is necessary to evaluate other concentrations and different times of cultivation with SAH.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-29Bitstream added on 2014-06-13T19:56:59Z : No. of bitstreams: 1 grandi_f_me_botfm.pdf: 914284 bytes, checksum: 7e8beca0af748a53dac236ca291fea62 (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O melanoma é uma das neoplasias cutâneas mais comumente diagnosticadas no homem e nos cães. O microambiente tumoral é composto pelas células neoplásicas e células estromais interagindo constantemente para garantir a progressão tumoral. Os fibroblastos associados ao câncer (FAC) representam uma população heterogênea de células caracterizadas pela expressão de diversos marcadores incluindo a proteína α-SMA e S100A4. Acredita-se que estas células originem-se de diversas fontes incluindo a transição endotelial fibroblástica. Neste trabalho, quantificamos a imunoexpressão da prpteína S100A4 nos fibroblastos associados ao câncer em melanomas cutâneos caninos, verificamos a potencial contribuição das células endoteliais na gênese desta população e correlacionamos os achados com parâmetros patológicos, incluindo a microdensidade vascular. Quarenta e oito casos de melanoma dermais caninos (21 epitelióides, 14 fusiformes e 13 mistos) previamente categorizados nos níveis de Clark 4, 5 e até 4 foram submetidos a imunofluorescência dupla utilizando os anticorpos primários α-SMA, fator de Von Willebrand (vWF) e S100A4 objetivando-se caracterizar os fibroblastos associados ao câncer e a contribuição da transição endotelial mesenquimal. Os melanomas não pigmentados foram caracterizados pela imunoistoquímica utilizando-se os anticorpos vimentina, pancitoqueratina, S100 e Melan A. A densidade microvascular foi analisada utilizando-se a técnica de imunofluorescência e o anticorpo primário anti-fator de Von Willebrand. O cálculo do número de vasos foi realizado selecionando-se cinco campos microscópicos de 200x contendo o maior número de vasos. O percentul de expressão da proteína S100A4 foi calculado através da técnica de segmentação de conglomerados de cor. Apenas um caso demonstrou... Skin melanoma is one of the most common skin neoplasm seen in humans and dogs. Tumor microenvironment is composed by cancer cells and stromal cells that interacts to guarantee tumor progression. Cancer associated fibroblasts (CAF) represents a heterogeneous cell population characterized by expression of several markers including α-SMA and S100A4 proteins. These cells are thought to derive from different sources including endothelial-to-fibroblast transition. Here we characterize CAF in canine skin melanomas, verify the potential contribution of the endothelial cells to this population and correlate findings to pathological parameters, including microvascular density (MVD). Forth-eight cases of canine dermal melanomas (21 epithelioid, 14 spindle and 13 mixed) classified under Clark´s level 4 and 5 were submitted to a double immunofluorescence assay using primary antibodies α-SMA, Von Willebrand Factor (vWF) and S100A4 in order to characterize cancer associated fibroblasts and verify the contribution of endothelial to fibroblast transition. Non-pigmented samples were characterized by immunohistochemistry using primary antibodies pan-cytokeratin, vimentin, S100 and Melan A. Microvascular density was evaluated by immunofluorescent assay using vWF and by calculating total number of vessels in five 200x fields (“hotspots”).S100A4 imunoexpression was calculated using K-means clustering segmentation method. Only one case showed α-SMA and vWF co-expression restricted to myofibroblasts in tumor stroma. The cells were predominantly peritumoral and periadnexal. S100A4 expression was significantly different among three histotypes with mixed melanomas displaying lesser percentage of positive cells. Some neoplastic cells mainly in spindle cell melanomas were also positive for S100A4. There were no significant differences between MVD/histotypes... (Complete abstract click electronic access below)

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. Este trabalho descreve a síntese de filmes poliméricos, sua modificação e a avaliação quanto à adesão de espécies celulares. Filmes de poliestireno (PS) e poli (metacrilato de metila) (PMMA) e mistura com 1:1 de composição preparados por casting foram avaliados quanto ao crescimento e proliferação de fibroblastos L-929. Estudos envolvendo modificação da superfície destes polímeros foram desenvolvidos, com resultados promissores decorrentes da utilização de plasma frio através de descarga de barreira dielétrica (DBD) para induzir a modificação da superfície, após planejamento fatorial das condições experimentais. Alterações nas propriedades da superfície com relação às amostras não tratadas foram acompanhadas por medidas de ângulo de contato, energia de superfície, histerese, microscopia eletrônica de varredura (SEM) e SEM com espectrometria de energia dispersiva, microscopia de força atômica (AFM) e espectrometria fotoeletrônica de raios-X. Após o tratamento, excelente aderência e proliferação de células foram observadas em todos os filmes com maior proliferação celular no filme PS/PMMA 1:1. Filmes finos de zeína obtidos por spin coating foram também tratados por plasma frio com DBD. Após o tratamento, uma pequena variação de molhabilidade foi detectada, além de aumento de rugosidade. A adsorção de albumina de soro bovino na superfície dos filmes foi também avaliada. Todos os filmes apresentaram excelente adesão das células L-929 após os dois tratamentos. Resultados preliminares para filmes finos nanoestruturados formados a partir de dois copolímeros em bloco de poliestireno e poli(ácido acrílico) são também descritos. Ambos os filmes, após análise por AFM, apresentaram superfícies mais rugosas e uma significativa melhora na adesão e proliferação das células L-929, o que os torna potenciais biomateriais para aplicação biomédica. This work describes the synthesis of polymeric films, their surface modification and an evaluation of their ability to promote adhesion of cell species. Films formed with the casting technique from poly(styrene) (PS), poly (methyl methacrylate) (PMMA) and a 1:1 mixture of both were evaluated towards the growth and proliferation of L-929 fibroblasts. Studies involving the surface modification of the polymeric films were carried out, with promising results obtained from the use of cold plasma generated by a dielectric barrier discharge (DBD), following a factorial design for optimization of the operating parameters. Changes in the surface properties of the plasma-treated films were evaluated by means of contact angle, surface energy and hysteresis measurements, scanning electron microscopy (SEM) and energy-dispersive SEM, atomic force microscopy (AFM) and X-ray photoelectronic spectrometry. Substantial proliferation of cells was observed on the surface of all plasma-treated films, with a superior performance of the PS/PMMA 1:1 film. Thin films produced from zein using the spin coating technique were also submitted to DBD-cold plasma treatment. A minor variation in the wetability of the plasma-treated films was observed, in addition to increased rugosity. The effect of adsorption of bovine serum albumin on the polymeric film surface was also evaluated. Both surface-based treatments resulted in enhanced adhesion of L-929 cells on the polymeric films. Preliminary results for nanostructured thin films formed from two block copolymers of poly(styrene) and poly(acrylic acid) are also presented. AFM analysis of the surface of both plasma-treated films evidenced increased rugosity, which was accompanied by a substantial improvement in the adhesion and proliferation of L-929 cells, turning these polymeric films into promising biomaterials.