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Agradecimentos: This research was funded by the São Paulo Research Foundation (FAPESP) grant #2018/18503-2, the Center for Computing in Engineering & Sciences (CCES/UNICAMP) grant #2013/08293-7, and the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior–Brasil (CAPES). This work used resources of the "Centro Nacional de Processamento de Alto Desempenho em São Paulo" (CENAPAD-SP), and CCES grant #2013/08293-7. Abstract: At the molecular scale, bone is mainly constituted of type-I collagen, hydroxyapatite, and water. Different fractions of these constituents compose different composite materials that exhibit different mechanical properties at the nanoscale, where the bone is characterized as a fiber, i.e., a bundle of mineralized collagen fibrils surrounded by water and hydroxyapatite in the extra-fibrillar volume. The literature presents only models that resemble mineralized collagen fibrils, including hydroxyapatite in the intra-fibrillar volume only, and lacks a detailed prescription on how to devise such models. Here, we present all-atom bone molecular models at the nanoscale, which, differently from previous bone models, include hydroxyapatite both in the intra-fibrillar volume and in the extra-fibrillar volume, resembling fibers in bones. Our main goal is to provide a detailed prescription on how to devise such models with different fractions of the constituents, and for that reason, we have made step-by-step scripts and files for reproducing these models available. To validate the models, we assessed their elastic properties by performing molecular dynamics simulations that resemble tensile tests, and compared the computed values against the literature (both experimental and computational results). Our results corroborate previous findings, as Young's Modulus values increase with higher fractions of hydroxyapatite, revealing all-atom bone models that include hydroxyapatite in both the intra-fibrillar volume and in the extra-fibrillar volume as a path towards realistic bone modeling at the nanoscale FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Aberto

Orientadores: Eliane Maria Ingrid Amstalden, Edson Aparecido Liberti Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Introdução: A atividade mastigatória é uma sincronia entre os músculos da mastigação e articulação temporomandibular (ATM). A perda de dentes é um importante fator que contribui para as disfunções do Sistema Estomatognático e consequentes danos aos músculos mastigadores. Considerando os poucos trabalhos sobre o assunto, a necessidade de maior compreensão e detalhamento quanto às alterações das fibras desta musculatura, especialmente na disfunção pela perda dentária, este estudo teve como objetivos: investigar as alterações morfológicas e ultraestruturais do músculo Pterigoideo Medial (PTM) e Masseter, pós exodontia em modelo experimental. Material e Métodos: Foram utilizados 24 ratos wistar para microscopia de luz (ML) e 12 para microscopia eletrônica de transmissão (MET), divididos em três grupos experimentais: GI -15, GII-30 e GIII-60 dias, pós exodontia de molares inferiores esquerdos. Contendo 5 animais experimentais e três controles por grupo para ML e 3 ratos para MET, com 1 controle por grupo. Sob microscopia de luz foram realizados estudos morfométricos e sob luz polarizada, dos músculos PTM e Masseter. A análise morfométrica baseou-se na medida da área das fibras, em cortes transversais, corados pelo H&E (40x.objetiva), com programa digital (software AXION¿vision). Realizadas 240 medidas por animal/ total de 1200 por grupo experimental e 200 medidas por animal/ total de 600 por grupo controle. Análise qualitativa das fibras colágenas foi obtida sob luz polarizada. Também foram observadas, qualitativamente, alterações ultraestruturais destes músculos, ipsilateral às exodontias. Teste ANOVA foi aplicado para a análise dos dados. Resultados: A morfometria da área das fibras do músculo PTM, mostrou redução significante, nos animais submetidos à exodontia, tanto ipsi quanto contralateral. Não foram detectadas diferenças quanto aos quesitos interação entre lados direito e esquerdo e grupos (GI, II e III), nem quando se comparou os lados entre si. Diferenças foram notadas quando se comparou o grupo experimental, nos distintos períodos evolutivos, detectando-se aumento progressivo das áreas das fibras musculares, sendo a média maior no Grupo GIII. Apesar do crescimento progressivo da área das fibras, elas não se tornam hipertróficas nesse estágio avaliatório, uma vez que, a média dos valores obtidos é semelhante à do grupo controle. As fibras do músculo PTM parecem adaptar-se às mudanças. Nenhuma diferença foi detectada quanto à análise morfométrica do músculo Masseter. Ultraestruturalmente, observou-se assimetria e desorganização da linha Z e banda I, apenas no grupo experimental GII, do músculo PTM. A análise das fibras colágenas mostrou que os fascículos musculares são revestidos por uma delicada rede de fibras colágenas do tipo I e do tipo III, com predomínio deste último (fibras reticulares), nos Masseteres, nos diferentes períodos evolutivos. Conclusão: A disfunção temporomandibular, promovida pela exodontia unilateral de molares inferiores em ratos, pode levar a alterações morfométricas ipsi e contralaterais, com redução de áreas de fibras, particularmente no PTM. Entretanto as fibras musculares parecem se adaptar às novas condições, ao longo do experimento. A linha Z e banda I são as mais sensíveis a essa disfunção, no músculo PTM, contudo efêmera, uma vez que foi observada apenas no grupo GII. O músculo PTM mostrou-se mais vulnerável, provavelmente pelas suas características funcionais próprias e maior participação na dinâmica dos movimentos mastigatórios, comparadas às do Masseter. As fibras colágenas do tipo I e do tipo III são os constituintes principais das estruturas fibro conjuntivas desses músculos, com predomínio do tipo III no Masseter e parecem não ser afetadas nesse procedimento Abstract: The loss of dental elements is an important factor in stomatognathic system dysfunctions and consequential damage to the masticatory muscles. The aim of this study was to analyze the morphometric and ultrastructural changes of the pterygoid medial(PTM) and masseter muscle, under occlusal defects, induced by unilateral left molar extraction, of Wistar rats. Thirty-six male rats were used: 24 for light microscopy (LM) and 12 for transmission electron microscopy analysis (TEM), divided into three experimental groups (GI-15; GII-30 and GIII-60 days), containing 5 animals each for LM with 3 control and 3 for TEM with one animal control for each period. Morphometric studies were made measuring the area of PTM and Masseter muscle fibers ipsi and contralateral to dental extraction, using a digital program. A qualitative analysis was performed to evaluate the ultrastructural findings and of the PTM and Masseter muscle. The results were compared using ANOVA test. There was a reduction of area of PTM of animals undergoing tooth extraction, both ipsi as contralateral. Both sides were similar when compared with each other, as assessed in the various evolutive periods. Differences were observed in the fiber area, especially in the first group and these showed progressive increase, reaching their highest average in GIII. No difference was detected regarding the morphometric analysis of the masseter muscle. For ultrastructure observed asymmetry and disorganization of Z line and I band, only the experimental group GII, muscle PTM. The analysis of the collagen fibers showed that the muscle fascicles are lined by a delicate network of collagen type I and type III, with a predominance of the latter (reticular fibers), in the masseter, in different evolutionary periods. Temporomandibular joint dysfunction, promoted by unilateral molar extraction in wistar rats, can lead to morphometric changes ipsi and contralateral with reduction of areas, particularly in the PTM. However seem to adapt to new conditions throughout the experiment. The band Z and the ith row of the muscle cytoskeleton are the most sensitive to this, dysfunction in muscle PTM, however ephemeral, since it was observed only in the Group (GII) with 30 days of the experiment. The muscle PTM proved to be more vulnerable in this experimental model, probably for its own functional features and greater participation in the dynamics of the masticatory movements, compared to the Masseter. The collagen fibers of type I and type III are the major constituents of the connective fibrous tissue structures of these muscles, with a predominance of type III in the Masseter and doesn't seem to be affected, to this procedure Doutorado Ciências Biomédicas Doutora em Ciências Médicas

Agradecimentos: The equipment used for the development of this work was purchased with the help of Fapesp (the São Paulo Research Foundation; 08/57906-3) and CNPq (the National Council for Scientific and Technological Development; 573913/2008-0). We reviewed the content of the manuscript, followed by Ms Diane Ellis, B.A. in education. Biostatistician Cleide Aparecida Moreira Silva, Research Committee, Biostatistics Division, Medical Sciences School, Unicamp, provided statistical consultation Abstract: Solid tumors typically contain high levels of fibrillar collagen. The increased stromal collagen deposition usually promotes cancer progression since biochemical and biophysical cues from tumor-associated collagen fibers stimulate neoplastic cells. Few studies have investigated the relationship between Merkel cell carcinoma (MCC) and the extracellular matrix (ECM), but there are no works evaluating collagen. This is an observational, analytical, retrospective study including 11 patients with MCC. Primary tumor-stained sections were evaluated by second harmonic generation microscopy and texture analysis. Peritumoral texture features (area fraction, mean gray value, entropy, and contrast) showed much lower values than normal skin (P < .0001) revealing extensively altered structure of peritumoral collagen fibers. These differences were not significant between tumors with unfavorable and favorable known prognostic factors. Profound changes in collagen fibers present in the stroma accompanying primary MCC may contribute to the aggressive behavior of this tumor. Our results indicate that whatever MCC histological subtype, size or anatomical location, MCC promotes the same type of ECM for its development. As an outlook, therapies using ECM macromolecules or fibroblasts (the architects of ECM remodeling) as target could be useful in the treatment of MCC FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Aberto

Agradecimentos: This study was funded by the São Paulo Research Foundation (08/57906–3), the National Council for Scientific and Technological Development (573913/2008–0), and the Biologia das Doenças Neoplásicas da Medula Óssea (FAPESP grant 11/51959-0) project with fellowship support from CNPq (310518/2015-6) Abstract: Background: The diagnosis of idiopathic atrophoderma of Pasini and Pierini (IAPP) relies on typical clinical features, particularly distinctive pigmented ovular/round depressed plaques. Histologic examination often reveals no obvious changes, but patterns of collagen distribution, using multiphoton imaging and second harmonic generation can help track hidden details of tissue organization contributing to atrophy. Objective: To identify histologic features that distinguish IAPP from unaffected skin. Methods: Eleven patients were included for conventional analyses. Masson trichromee and Unna-Tanzer orcein-stained sections were evaluated using automated morphometry. Hematoxylin-eosinestained sections were analyzed by multiphoton imaging using 2-photon excited fluorescence and second harmonic generation. Results: No abnormalities were found under light microscopy or by automated quantification. Multiphoton imaging revealed no difference in optical density of either collagen or elastic fibers in lesioned and unaffected skin; however, horizontal collagen fiber organization in lesion specimens increased toward the lower dermis, whereas elastic fibers featured greater disorganization within the upper dermis. Limitations: The low number of patients evaluated. Conclusion: The atrophic appearance of IAPP lesions reflects changes in organization, but not in collagen and elastic tissue content. Minute organizational differences that are imperceptible to the experienced pathologist and undetectable by automated analyses were revealed by multiphoton analyses, particularly second harmonic generation, in association with texture analyses FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ Fechado

Agradecimentos: The author is indebted to Dr. Maria Luiza S. Mello for dis-cussing and reviewing the manuscript. The support of Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Brazil (grants no. 2003/04597-0, 2007/058251-8 and 2013/11078-0) is gratefully acknowledged Abstract: Histological and histochemical observations support the hypothesis that collagen fibers can link to elastic fibers. However, the resulting organization of elastin and collagen type complexes and differences between these materials in terms of macromolecular orientation and frequencies of their chemical vibrational groups have not yet been solved. This study aimed to investigate the macromolecular organization of pure elastin, collagen type I and elastin–collagen complexes using polarized light DIC-microscopy. Additionally, differences and similarities between pure elastin and collagen bundles (CB) were investigated by Fourier transform-infrared (FT-IR) microspectroscopy. Although elastin exhibited a faint birefringence, the elastin–collagen complex aggregates formed in solution exhibited a deep birefringence and formation of an ordered-supramolecular complex typical of collagen chiral structure. The FT-IR study revealed elastin and CB peptide Nsingle bondH groups involved in different types of H-bonding. More energy is absorbed in the vibrational transitions corresponding to single bondCH, single bondCH2 and CH3 groups (probably associated with the hydrophobicity demonstrated by 8-anilino-1-naphtalene sulfonic acid sodium salt [ANS] fluorescence), and to ?CN, dNH and ?CH2 groups of elastin compared to CB. It is assumed that the a-helix contribution to the pure elastin amide I profile is 46.8%, whereas that of the B-sheet is 20% and that unordered structures contribute to the remaining percentage. An FT-IR profile library reveals that the elastin signature within the 1360–1189 cm-1 spectral range resembles that of Conex–Toray aramid fibers FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Fechado

Orientadores: Ângela Cristina Malheiros Luzo, Sara Teresinha Olalla Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Lesões cartilaginosas raramente curam-se espontaneamente. As atuais opções terapêuticas cirúrgicas e não são limitadas ao alívio dos sintomas, mando a necessidade de futura substituição total de joelho. Terapia baseada em células tronco adultas representa uma alternativa promissora para os procedimentos existentes. As células-tronco mesenquimais (MSC) apresentam alta plasticidade celular e podem ser obtidas de diversas fontes teciduais, opção que exige grande aporte celular expondo a necessidade de criopreservação, processo vantajoso. Contudo, protocolos convencionais estão diretamente associados a possíveis danos e mortalidade celular, sendo desencadeados por formação de cristais de gelo intracelular, toxicidade do crioprotetor adotado e desidratação celular. Este projeto tem como objetivo investigar a interferência da criopreservação com dimetilsufóxido (Me2SO-) (DMSO) na capacidade de MSCs em diferenciação em linhagens mesodermais e arranjo de fibras de colágeno produzidas na diferenciação condrogência. MSCs foram obtidas de tecido adiposo (ADSC). Em quarta passagem foram caracterizadas por citometria de fluxo e diferenciadas em linhagem mesodermais. Diferenciação comprovada por análise morfológica e expressão gênica por de RT-PCR. Genes escolhidos ADIPOQ, FABP4 e PPARG linhagem adipogênica, AGCAN, SOX9, COL1A1 e COL2A1 linhagem condrogênica e OC, OPN e COL1A1 linhagem osteogênica. Diferenciação condrogênica realizada pela técnica de micromassa. Arquitetura das fibras colágenas observada por microscopia de Geração de Segundo Harmônico (SHG) de MSCs e images analisadas pelos algoritmos Fast Fourier Transform (FFT) e Gray Level Co-occurrence Matrix (GLCM). ADSCs criopreservadas em taxa controlada de congelamente com solução criprotetora de soro fetal bovino e 10% de DMSO, mesmos ensaios realizados após descongelamento. Células descongeladas submetidas aos mesmos protocolos de caracterização. Características morfológicas obtidas por SHG expressão gênica das células frescas e criopreservadas analisadas estatisticamente. Amostras de ADSC, fresca e criopreservadas, foram capazes de se diferenciar em linhagens mesodermais. Perfil de expressão gênica da linhagem adipogênica foi semelhante ao esperado para tal processo de diferenciação, em ambas amostras, criopreservadas e frescas, estas últimas com maior expressão (p=ns). Na diferenciação para linhagem osteogênica também houve o perfil de expressão esperado para os genes estudas, sendo mais expresso no grupo criopreservado (p=ns). Apesar do fato da expressão do gene COL2A1 de linhagem condrogênica ter sido maior no grupo criopreservado, quando o perfil de expressão gênica do grupo fresco foi analisado, este mostrou-se mais consistente com o perfil esperado normal. Análise das imagens de SHG demonstraram que a arquitetura das fibras colágenas foi mais organizada (p=ns) e uniforme (p>0,0001) nas amostras frescas. O grupo criopreservado demonstrou maior entropia (p=ns) e contraste (p=0,0167), demonstrando haver maior tendência direcional das fibras de colágeno nas amostras frescas. Os resultados de expressão gênica sugerem que a criopreservação pode interferir de forma positiva na diferenciação osteogênica e negativamente nas linhagens adipogênica e condrogênica. A arquitetura da rede tridimensional de colágeno foi modulada negativamente pelo processo de criopreservação, dados esses confirmados por análise das imagens obtidas por SHG, o que poderia interferir com as propriedades físico/mecânicas características do tecido colagenoso, importante na manutenção da cartilagem articular baseada em terapia celular. O uso das imagens de SHG tornou-se uma importante ferramenta na melhor avaliação das fibras colágenas Abstract: Cartilage defects rarely heal spontaneously. Current surgical and non-surgical therapeutic interventions are limited to symptom relief and future total knee replacement continues to be necessary. Adult stem cell based therapy could represent a promising alternative to this procedure. Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have great capacity of differentiation and can easily be obtained from various sources. Cryopreservation offers many advantages for practitioners engaged in cell-based therapies. However, conventional slow freezing, despite using cryoprotectant solution, has always been associated with damage and mortality due to intracellular ice formation, cryoprotectant toxicity, and dehydration. The aim of this work is to investigate whether the Dimethyl Sulfoxide (Me2SO-) (DMSO) cryopreservation process interferes with the MSCs capacity of differentiation to mesodermal lineages and/or with collagen fiber network architecture, produced by chondrogenic cells, comparing fresh and thawed MSCs. MSCs were obtained from adipocyte tissue (ADSCs). At the fourth passage cells were characterized as ADSCs by flow cytometry analysis and differentiation to mesodermic lineages was confirmed by morphology (light optical microscopy) and gene expression analysis (RT-PCR). The following genes were chosen ADIPOQ, FABP4 and PPARG for adipogenic lineage, AGCAN, SOX9, COL2A1 and COL1A1 for chondrogenic and OC, OPN and COL1A1 for osteogenic lineage. Chondrogenic differentiation was carried out by micromass technique. Collagen fibers architecture was observed by Second Harmonic Generation (SHG) microscopy. Images were analyzed by Fast Fourier Transform (FFT) and Gray Level Cooccurrence Matrix (GLCM) algorithms. ADSCs were cryopreserved in a controlledrate freezing device with bovine serum fetal and 10% DMSO as cryoprotectant solution. Thawed cells were submitted to the same characterization protocols. SGH morphologic features and gene expression results from thawed and fresh cells were statistically analyzed. Both, thawed and fresh ADSCs were able to differentiate into mesodermal lineages. Gene expression profile of adipogenic lineage was similar to that expected for the differentiation process in both, thawed and fresh cells, with greater expression in fresh ones (p=ns). Osteogenic lineage also demonstrated the expected gene expression profile, being more expressed in the thawed group (p=ns). Despite the fact that COL2A1 gene expression in chondrogenic lineage was greater in the thawed group, when the gene expression profile was analyzed the fresh group was more consistent with the expected normal profile. SHG images results demonstrated that collagen fibers architecture was more organized (p=ns) and uniform (p

Orientador: Pedro Eduardo de Felicio Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Este trabalho visou avaliar o comportamento funcional dos produtos resultantes das interações entre a fibra de colágeno e as fibras musculares em dois cortes do quarto dianteiro bovino, formados pelos músculos Tríceps braquial e Peitoral profundo. A formulação base da salmoura era constituída por uma solução aquosa de cloreto de sódio (NaCl) fixada em 1,0% de concentração. Variou-se a concentração de tripolifosfato de sódio (TPF) ao máximo de 0,4%; o nível de solução injetada entre 10% e 30% e a concentração da fibra de colágeno a ser adicionada em cada um dos níveis injetados entre 0,1% e 0,3% no produto final. Esta concentração respeita as recomendações do fabricante, que estabelece em 1% o limite máximo de fibra de colágeno no produto final porque tem início a percepção sensorial do sabor e aroma característico de colágeno, indesejável ao consumidor. A amostra padrão consistiu do corte de referência injetado nos níveis estipulados com salmoura constituída somente por uma solução de NaCl a 1%. Para avaliar a qualidade funcional dos cortes utilizados foram efetuadas as análises de pH, capacidade de retenção de água, composição centesimal e teor de colágeno total, em etapa anterior à injeção. As análises microbiológicas seguiram o padrão exigido pela ANVISA na RDC nº. 12, de 12 de janeiro de 2001. Os cortes injetados foram embalados a vácuo e permaneceram em repouso por 24 horas a 4 ºC. Após este período analisou-se a capacidade de retenção de água (CRA) e as perdas durante esta estocagem, só então, passaram pelo processo de cocção industrial usado para a fabricação de ¿Cooked Frozen Beef¿ (CFB), permanecendo estocados em câmaras a -20 ºC durante o período de realização das análises. Para verificar o comportamento funcional, as amostras foram avaliadas quanto a sua maciez objetiva (força de cisalhamento), análise do perfil de textura (TPA), perdas na estocagem e na cocção, bem como o rendimento do processo. Os resultados obtidos foram avaliados através da análise de superfície de resposta. O rendimento do processo foi beneficiado pela presença da fibra de colágeno na formulação injetada, porém, para os dois cortes estudados, este aumento foi inversamente proporcional ao nível de injeção aplicado. A adição da fibra de colágeno na formulação injetada atuou favoravelmente ao acréscimo da capacidade de retenção de água, para os dois cortes musculares estudados, independentemente da presença de tripolifosfato de sódio na formulação, desde que a taxa de injeção fosse mantida em valores menores de 20%. Teores maiores que 0,14% da fibra de colágeno na formulação injetada promoveram um aumento acentuado nos valores de força de cisalhamento observados no m. Tríceps braquial. O m. Peitoral profundo apresentou valores relativamente mais altos de força de cisalhamento que os observados para o m. Tríceps braquial. As diferenças de comportamento entre os cortes musculares merecem estudo posterior. A análise do perfil de textura não apresentou respostas confiáveis nas condições deste trabalho. Esta observação pode ser um reflexo do próprio delineamento experimental proposto, mas existe a possibilidade de ser atribuída às inúmeras variáveis envolvidas no processo Abstract: This project evaluated the functional behavior of the resulting products of the interactions between collagen fibers and muscular fibers in two boneless cut of bovine forequarter: Brisket and Clod, Pectoralis profundi and Triceps brachii muscles, respectively. The base of the enhance formulation was 1.0 % aqueous solution of sodium chloride (NaCl). The TPF concentration was varied to a maximum of 0.4%, the level of injected solution was varied between 10% and 30%, and the concentration of collagen fibers to be added in each of the injected levels was varied between 0.1%, and 0.3% in the final product. This variation is in accordance with the manufacturer¿s recommendation of a maximum of 1% collagen fiber in the final product. This limit is set because the characteristic flavor of collagen is undesirable to the consumer. The main sample was the reference cut injected at the specified levels with the standard brine solution made only by 1% NaCl solution. The following properties of the cut were evaluated before injection: pH, water hold capacity, and centesimal composition of the total collagen. The microbiological analyses followed the requirements of ANVISA in RDC nº. 12, from January 12th, 2001. The injected cuts were wrapped in vacuum and were stored for 24 hours at 4 ºC. After this period the water hold capacity was analyzed (WHC), and the losses from storage passed through the industrial cooking process used for the production of ¿Cooked Frozen Beef¿ (CFB). Throughout the analysis period the cuts remained stored in chambers at -20 ºC. To analyse the functional behavior, the following properties were evaluated: objective tenderness by shear force and texture profile analysis (TPA), losses in storage and cooking, and the process effectiveness. The results obtained were evaluated through surface response analysis. The process benefited from the collagen fiber in the injected formulation. In the two cuts studied this benefit was inversely proportional to the level of the applied injections. The fiber addition in the injection formulation positively impacted the water hold capacity for both studied cuts, independent of the presence of TPF in the formulation. This benefit occurred as long as the injection level was maintained below 20%. Levels higher than 0.14% of the collagen fiber in the injected formulation promoted a substantial increase in the shear force values observed in the Triceps brachii muscle samples. The .Pectoralis profundi muscle displayed shear force values relatively higher than those observed for Triceps brachii muscle. Further researches should investigate the differences between the muscular cuts behavior. A texture profile analysis did not provide reliable data for the conditions in this study. This outcome may be a result of an error in the experimental design protocol, or it could be attributed to unexpected variables involved in the process Mestrado Mestre em Tecnologia de Alimentos