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Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. A tuberculose é uma doença bacteriana infecciosa considerada um grave problema de saúde pública, por ser classificada como a principal causa de morte no mundo por um único agente infeccioso. A OMS recomenda um protocolo de tratamento eficaz, porém, a terapia convencional requer a administração de altas doses diárias de cada medicamento pela via oral para uma resposta satisfatória do paciente, o que culmina na emergência de efeitos adversos graves, reduzindo a adesão à terapia. Neste contexto, o objetivo deste trabalho é sintetizar e funcionalizar nanopartículas inalatórias destinadas ao tratamento de tuberculose e avaliar, in vitro, suas propriedades físico-químicas, toxicidade e atividade biológica. O trabalho empregou estratégias distintas para o desenvolvimento de nanopartículas contendo fármacos antituberculosos. Uma das estratégias consistiu na aplicação de uma metodologia físico-química, em que carreadores lipídicos nanoestruturados de rifampicina foram obtidos pelo método da microemulsão. Esta nanoformulação foi funcionalizada com um peptídeo modificado baseado na sequência da tuftsina, o qual foi previamente sintetizado em fase sólida e, em seguida, acoplado à superfície das nanopartículas para vetorizar o carreador (NP-pRIF). As nanopartículas foram caracterizadas, confirmando a obtenção de um sistema de liberação monodisperso e estável. Os ensaios em cultura de células demonstraram que a NP-pRIF apresentou um potencial de internalização pelos macrófagos significativamente maior que as nanopartículas de rifampicina sem o peptídeo (NP-RIF). Os estudos de citotoxicidade constataram o potencial não-citotóxico de ambas as formulações (NP-pRIF e NP-RIF) em todas as concentrações testadas. Ainda, a eficácia da formulação foi testada frente ao Mycobacterium tuberculosis e apresentou uma concentração inibitória mínima 2 vezes menor que a requerida por uma solução do fármaco puro. Para viabilizar a administração pulmonar, as suspensões de nanopartículas foram acrescidas de manitol e submetidas à secagem por atomização por spray-drying, dando origem a um pó fino, fluido e caracterizado por microscopia eletrônica de varredura como micropartículas esféricas, com tamanho de partícula entre 2 – 10 μm. Os testes in vitro demonstraram o potencial de redispersão das micropartículas em água e liberação das nanopartículas alojadas em seu interior. A outra estratégia abordada neste trabalho envolveu o emprego de uma metodologia química para proceder à síntese de dois conjugados constituídos por um fármaco antituberculoso (rifampicina ou ácido pirazinoico) e o poli(ácido málico), através de reações de esterificação. Em seguida, os conjugados se auto-agregaram em água para a obtenção dos respectivos nanoconjugados (NC-RIF e NC-PA, respectivamente), confirmados pelas imagens de microscopia eletrônica de transmissão. Os testes em cultura de células demonstraram que ambos os nanoconjugados foram eficientemente internalizados pelos macrófagos e que as formulações não apresentaram potencial citotóxico para a maioria das concentrações testadas. Estas formulações serão futuramente secas em spray-drying para obtenção de micropartículas e viabilização da administração pulmonar. Em conclusão, ambas as estratégias empregadas neste trabalho foram eficientes na obtenção de nanocarreadores inovadores e com potencial para contribuição na otimização do tratamento da tuberculose. Tuberculosis is an infectious bacterial disease that is considered a public health concern as it is the leading cause of death from a single infectious agent worldwide. WHO recommends an efficient treatment protocol, however, conventional therapy demands high amounts of drugs daily administered by oral route to achieve a successful patient response, which leads to the emergence of severe adverse effects and decreases patient compliance. The goal of this work is to synthesize and functionalize inhaled nanoparticles for treating tuberculosis and to evaluate in vitro physicochemical properties, toxicity and biological activity. This study employed distinct strategies to develop nanoparticles loaded with anti-tuberculosis drugs. One of these strategies consisted on applying a physicochemical methodology to produce rifampicin nanostructured lipid carriers by microemulsion method. This nanoformulation was functionalized with a modified peptide based on tuftsin sequence, which was previously synthesized on solid phase and thus, attached on nanoparticles surface to vectorize the nanocarrier (NP-pRIF). Nanoparticles were characterized to confirm the production of a monodisperse and stable drug delivery system. Cell culture assays demonstrated that NP-pRIF was significantly more taken up by macrophages than naked rifampicin nanoparticles (NP-RIF). Cytotoxicity studies evidenced the non-toxic potential from both formulations (NP-pRIF and NP-RIF) in a wide range of concentrations. Moreover, nanoparticles efficacy was tested and revealed to be 2-fold more effective against Mycobacterium tuberculosis than free rifampicin. Nanoparticles suspension were added by mannitol and submitted to atomization drying process by spray-drying in order to enable pulmonary administration. The powder obtained was characterized as fine and fluid microparticles, which were further assessed by scanning electron microscopy as spherical shape with a range of particle size between 2 – 10 μm. In vitro tests evaluated the microparticles potential of redispersion in water and their further capacity of releasing nanoparticles stocked inside them. The other strategy employed in this work involved the use of a chemical methodology to synthesize two conjugates constituted by an anti-tuberculosis drug (rifampicin or pyrazinoic acid) and the poly(malic acid). Conjugates were synthesized by esterification reactions and they posteriorly self-assembled into nanoconjugates (NC-RIF e NC-PA, respectively), which was confirmed by transmission electron microscopy images. Cell culture assays proved that both nanoconjugates were successfully taken up by macrophages and that they did not present a cytotoxic potential for the most of concentrations evaluated. These nanoconjugates will be dried by spray-drying and entrapped into trojan microparticles in the future steps to ensure pulmonary administration. In conclusion, both strategies were successfully employed to produce innovative and promising nanocarriers to contribute with the management of tuberculosis.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. CIPHARMA, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto. Os sistemas lipídicos autoemulsionáveis (SEDDS) de uso oral tem sido alvo de intensas pesquisas nos últimos anos, visando o aumento da biodisponibilidade de fármacos pouco solúveis. O ravuconazol (RAV), Classe II no sistema de classificação biofarmacêutica, atua inibindo a enzima CYP51 responsável pela principal etapa da biossíntese do ergosterol e representa um fármaco promissor para o tratamento da doença de Chagas. O presente estudo teve por objetivo desenvolver e caracterizar SEDDS contendo RAV e avaliar a eficácia em modelo experimental murino de infecção aguda pelo T. cruzi. Foram desenvolvidas formulações de SEDDS do tipo IIIA, contendo diferentes concentrações do surfactante Labrasol®, que após a emulsificação, geraram nanoemulsões com diâmetros hidrodinâmicos médios em torno de 250 nm e potencial zeta entre -45 e -57 mV, sem precipitação do RAV sob diluição e com perfil polidisperso em termos de natureza das nanoestruturas formadas quando analisados pela técnica de AF4. O SEDDS aumentou a taxa de dissolução do RAV in vitro em comparação com o fármaco livre, de forma dependente da concentração de Labrasol® no meio de liberação. O SEDDS contendo baixo teor de surfactante (10% v/v) mostrouse seguro no tratamento de animais sãos e infectados por T. cruzi por períodos de 20 a 40 dias. A formulação SEDDS melhorou significativamente a atividade in vitro anti-T. cruzi no nível de IC50 do RAV. Doses diárias de 15mg/kg de RAV-SEDDS durante 20 dias resultaram em atividade supressiva, mas não curativa frente à infecção com a cepa Y de T. cruzi. O tratamento com a dose diária de 20 mg/kg de RAV-SEEDS por 30 dias resultou em 70% de cura, contra 40% para o RAV livre e 50% para benznidazol. A administração prolongada de RAV-SEEDS e RAV livre por 40 dias curou 100% dos animais, e resultou também em 90% de cura com o benznidazol. Estes resultados estão em acordo com atividade in vitro de RAV-SEDDS, onde foi verificada a redução significativa nos valores de IC50, mas não para IC90, em relação ao RAV livre. O tratamento da infecção frente à cepa Colombiana, resistente ao benznidazol com 20 mg/kg/dia de RAV ou RAV-SEDDS por 40 dias apresentou atividade supressiva da parasitemia, com 10% e 20% de cura respectivamente, e 50% de cura para os animais tratados com benznidazol. Esses resultados mostraram que o tratamento em fase inicial da infecção por longo prazo aumenta a eficácia com ambos os fármacos, e que os SEDDS contendo RAV são um sistema promissor de baixo custo, de fácil produção e adequado para a administração oral na terapia da doença Chagas. Lipid-based self-emulsifying drug delivery systems (SEDDS) for the oral administration of drugs have been the subject of intense research in recent years, with the aim of increasing the bioavailability of poorly soluble drugs. Ravuconazole (RAV), a Class II drug in the biopharmaceutical classification system, is an inhibitor of CYP51, an enzyme responsible for the main step in ergosterol biosynthesis and represents a promising drug for the treatment of Chagas disease. The aim of the present study was to develop and characterize SEDDS containing RAV and to evaluate the efficacy in a murine experimental model of acute T. cruzi infection. SEDDS type IIIA formulations containing different concentrations of Labrasol® surfactant were developed, which after emulsification generated nanoemulsions with mean hydrodynamic diameters around 250 nm and zeta potentials between -45 and -57 mV without precipitation of RAV under dilution. The nanostructures had polydispersed profiles when analyzed by the AF4 technique. The SEDDS increased the dissolution rate of RAV in vitro compared to the free drug, depending on the concentration of Labrasol® in the release medium. A SEDDS containing low surfactant content (10% v/v) was found to be safe during treatment of healthy animals and animals infected with T. cruzi for periods of 20 to 40 days. The SEDDS formulation significantly improved in vitro anti-T. cruzi activity at the IC50 level of RAV. Daily doses of 15 mg / kg of RAV-SEDDS for 20 days resulted in suppressive, but not curative, activity against infection with the T. cruzi Y strain. Treatment with the daily dose of 20 mg / kg of RAV-SEEDS for 30 days resulted in 70% cure, against 40% for free RAV and 50% for benznidazole. Prolonged administration of RAV-SEEDS and free RAV for 40 days cured 100% of the animals, and also resulted in 90% cure with benznidazole. These results are in agreement with in vitro activity of RAV-SEDDS, where a significant reduction in IC50 values, but not IC90, was found in comparison with free RAV. The treatment of the infection against the benznidazole-resistant Colombian strain with 20 mg/kg/day of RAV or RAVSEDDS for 40 days presented suppressive activity on parasitemia, with 10% and 20% of cure, respectively, and 50% of cure for animals treated with benznidazole. These results showed that early-stage treatment of long-term infection increases efficacy with both drugs and that a RAV-containing SEDDS is a promising low-cost, easy-to-produce system suitable for oral administration in Chagas disease therapy.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. CIPHARMA, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto. Neste trabalho o fotossensitizador, cloro alumínio ftalocianina (AlClPc), foi incorporado em diferentes sistemas coloidais: nanocápsulas (NC) convencionais de ácido poli-D,L-lático (PLA), NC estericamente estabilizadas ou peguiladas com monometoxipolietilenoglicol-co-poli-D,L-lactídeo (PLA-PEG) e em nanoemulsões (NE) aniônicas e catiônicas utilizando-se a metodologia de precipitação seguida de evaporação do solvente. NC de PLA e PLA-PEG contendo AlClPc foram desenvolvidas e caracterizadas para o tratamento intravenoso de tumores sólidos em modelo animal usando a terapia fotodinâmica (TFD). As preparações de NC contendo AlClPc mostraram estreita distribuição de tamanho (monodispersão) com um índice de polidispersão médio de 0,13. O diâmetro médio, determinado por espectroscopia de correlação de fótons (ECF), variou em torno de 200 nm conforme a formulação e todas as formulações apresentaram potencial zeta negativo. A porcentagem de encapsulação de AlClPc foi próxima de 100% para todas as formulações. O perfil de liberação foi investigado para as nanoestruturas e foi observada uma liberação prolongada por 168 horas. A hemólise induzida pelo AlClPc livre ou pelo AlClPc-NC PLA foi baixa (< 10%), sendo que as NC PLA-PEG contendo AlClPc induziram maior hemotoxicidade (máximo de 37 %). A atividade antitumoral de AlClPc livre e incorporado em NC PLA e NC PLA-PEG foi avaliada em modelo murino de tumor sólido de Ehrlich, nas doses de 0,5 e 6,0 mg/kg de AlClPc e na dose de luz de 50 J/cm2. Os grupos controles apresentaram padrões macroscópicos e histológicos similares, enquanto, os tratados por terapia fotodinâmica induziram 70% e 68% de necrose no tumor após uma única aplicação de NC PLA e NC PLA-PEG nas doses mais altas de AlClPc, respectivamente, mostrando eficácia de NC-AlClPc no tratamento experimental por PDT em nosso modelo animal. Por outro lado, NE e NC aniônicas e catiônicas foram desenvolvidas e caracterizadas para utilização no tratamento tópico de desordens potencialmente malignas da mucosa oral, visando aplicações no tratamento futuro da leucoplasia. Nanoestruturas catiônicas compostas de estearilamina (EA) ou dodecilamina (DA) foram preparadas por nanoemulsificação espontânea. O procedimento resultou em NE monodispersas com diâmetro médio das gotículas de aproximadamente 273 nm. NC também foram preparadas e comparativamente apresentaram tamanho médio muito semelhante (263 nm). As nanoestruturas compostas de DA e EA apresentaram um potencial zeta de +17 e +76 mV, respectivamente. AlClPc-carregada em nanoestruturas catiônicas exibiram porcentagem de encapsulação de 100%. A porcentagem de AlClPc liberada in vitro de NC EA e NE EA foi de 13% e 15%, respectivamente, após 156 horas. A hemólise induzida por nanoestruturas catiônicas apresentou-se aumentada em relação às nanoestruturas aniônicas. Ambas foram também caracterizadas quanto a penetração in vivo de AlClPc através da mucosa da língua e bolsa de hamster, sendo as mucosas analisadas por microscopia confocal. Entretanto, a NE catiônica preparada com dodecilamina apresentou menor penetração na mucosa quando comparado às demais formulações. Estudos de permeação e retenção in vitro foram realizados utilizando-se mucosa da bolsa jugal de hamster com leucoplasia induzida por 7, 12- dimetilbenzoantraceno (DMBA). Os estudos de permeação e retenção in vitro demonstraram que o AlClPc incorporado à NE e mesmo em solução consegue penetrar até as camadas viáveis da mucosa com leucoplasia induzida, permanecendo retido mesmo após 6 horas de sua aplicação. Os resultados obtidos sugerem, portanto, que as nanopartículas contendo AlClPc são um sistema de vetorização promissor para aplicações clínicas na TFD em alterações potencialmente malignas, como a leucoplasia oral. In this work, the fotossensitizer chloroaluminum phthalocyanine (AlClPc) was incorporated in different colloidal systems: conventional nanocapsules of, poly(D,Llactide) (PLA), sterically stabilized or peguilated NC (monometoxipolyethylene glycol co- poly(D,L-lactide)) (PLA-PEG) and anionic and cationic nanoemulsions (NE), using the method of precipitation followed by solvent evaporation. PLA and PLA-PEG NC containing AlClPc were developed and characterized for the intravenous treatment of solid tumors in animal model by photodynamic therapy. The nanocapsules were produced by interfacial polymer deposition. The NC preparations containing AlClPc showed narrow distribution of size (monodisperse) with a mean polydispersive index of 0.13. The mean diameter ranged around of 200 nm, according to the formulation and determined by photon correlation spectroscopy. All formulations presented negative potential zeta. The encapsulation percentage of AlClPc was of 100% for all formulations. The release profile was investigated for all preparations and sustained release was observed for 168 hours. The hemolysis induced by free AlClPc or in PLA NC was extremely low (

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. CIPHARMA, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto. Durante o tratamento radioterápico de tumores, comumente surgem reações na pele em decorrência da exposição à radiação. Essas reações, denominadas radiodermatites, afetam a qualidade de vida do paciente e podem levar a interrupção da terapia. Nesse contexto, é interessante a utilização tópica de substâncias radioprotetoras que têm a capacidade de atenuar ou impedir os danos causados pela radiação. Nesse estudo, desenvolveu-se emulsões com cristais líquidos utilizando tensoativos não-iônicos da classe dos álcoois graxos etoxilados (Brij CS 20 e Brij S2) e óleo de açaí como fase oleosa, na qual foi incorporada o ativo resveratrol. As emulsões foram desenvolvidas através de diagrama de fases ternário, onde foi possível determinar, por análise macroscópica e microscópica sob luz polarizada, qual proporção dos componentes da formulação (combinação de tensoativos, óleo e água) resultava em formulações estáveis e com maior presença de cristais líquidos. Após a escolha da formulação, foram realizados testes de estabilidade, nos quais a formulação mostrou-se estável. A atividade antioxidante do óleo de açaí foi comprovada por dois métodos. Na determinação através do sequestro do radical DPPH, apresentou IC50 de 13,06 mg/mL. No teste que utiliza o radical ABTS•1 liofilizado, o resultado encontrado foi de 1882 mg equivalente de tocoferol por kg do óleo. O comprovado efeito radioprotetor do resveratrol somado à atividade antioxidante do óleo de açaí e ao poder hidratante de emulsões indicam que a formulação desenvolvida tem potencial para ser utilizada topicamente durante o tratamento radioterápico com a finalidade de minimizar os efeitos da radiação ionizante sobre a pele. During tumor radiotherapy, usually skin reactions arise as a result of radiation exposure. These reactions, called radiodermatitis, affect the quality of life of patients and may lead to discontinuation of therapy. In this context, it is interesting to make use of topical substances that present radioprotector activity which have the ability to mitigate or prevent the damage caused by radiation. In the present study, emulsions with liquid crystals were developed using non-ionic surfactants of the class of ethoxylated fatty alcohols (Brij CS 20 and Brij S2) and acai oil as the oil phase, which was incorporated into the active resveratrol. The emulsions were developed using a ternary phase diagram. By this diagram and using macroscopic analysis and microscopic under polarized light analysis, the proportion of the components of the formulation (combination of surfactants, oil and water) that result in stable emulsions and enhanced amount of liquid crystals was determinate. After the choice of the formulation and the incorporation of resveratrol (1% w/w), the stability tests were performed, in these test the formulation showed to be stable. The antioxidant activity of the acai oil was confirmed by two methods. In determining through DPPH radical, was founded IC50 of 13.06 mg / mL. In the test using the ABTS • 1 lyophilised, the result was equivalent to 1882 mg of tocopherol per kg of oil. The proved radioprotective effect of resveratrol, the antioxidant activity of acai oil and the moisturizing capacity of emulsions indicate that the proposed formulation can be used topically during radiotherapy treatment in order to minimize the effects of ionizing radiation on the skin.