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XXVIII Congreso Nacional de Microbiología, 28 de junio a 2 de julio de 2021, formato virtual, La quitina, el segundo polímero más abundante en la naturaleza después de la celulosa, está constituida por unidades de N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) con enlaces ß(1¿4). La hidrólisis de quitina o quitosano (su producto desacetilado) da lugar una serie de quitooligosacáridos (COS) que contienen diferentes proporciones de D-glucosamina (GlcN) y GlcNAc, según el método empleado en su obtención. Los COS muestran propiedades interesantes como antimicrobianos, antioxidantes, antivirales, antitumorales, antiinflamatorios, neuroprotectores, antihipertensivos y prebióticos. Su actividad biológica depende en gran medida del grado de polimerización (DP), grado de desacetilación (DD) y patrón de acetilación (PA). En nuestro consorcio GLICOENZ (http://www.glicoenz.org) estamos desarrollando distintas estrategias para la obtención de COS con una composición química definida: COS totalmente acetilados (faCOS, formados exclusivamente por GlcNAc), COS parcialmente acetilados (paCOS, compuestos por GlcN y GlcNAc) y COS desacetilados (fdCOS, formados solo por GlcN). Para ello trabajamos con varias quitinasas (Chit33 y Chit42) de Trichoderma harzianum, que han sido expresadas en Pichia pastoris, además de otros extractos con actividad quitinolítica. Recientemente hemos empezado la búsqueda de enzimas con actividad quitina-desacetilasa, que nos permitirían un mayor control sobre el grado de acetilación de los COS. Las mezclas complejas que se obtienen en estas reacciones se caracterizan mediante cromatografía aniónica con detección amperométrica de pulsos (HPAEC-PAD) y espectrometría de masas MALDI-TOF. La estructura 3D de alguna de las quitinasas ha sido resuelta y además se han realizado estudios estructura-función para determinar los aspectos diferenciales que modulan la especificidad de estas enzimas., EU-EMFF-Blue-Economy-2018 (proyecto FISH4FISH-863697), MICINN Proyectos PID2019-105838RB-C31/C32/C33, Fundación Ramón Areces

Chitin-active enzymes are of great biotechnological interest due to the wide industrial application of chitinolytic materials. Non-stability and high cost are among limitations that hinder industrial application of soluble enzymes. Here we report the production and characterization of chitooligosaccharides (COS) using the fungalexo-chitinase Chit42 immobilized on magnetic nanoparticles and food-grade chitosan beads with an immobilization yield of about 60% using glutaraldehyde and genipin linkers. The immobilized enzyme gained operational stability with increasing temperature and acidic pH values, especially when using chitosan beads-genipin that retained more than 80% activity at pH 3. Biocatalysts generated COS from colloidal chitin and different chitosan types. The immobilized enzyme showed higher hydrolytic activity than free enzyme on chitosan, and produced COS mixtures with higher variability of size and acetylation degree. In addition, biocatalysts were reusable, easy to handle and to separate from the reaction mixture., Spanish Ministry of Economy and Competitiveness [BIO2016-76601-C3-1/-2], the Spanish Ministry of Science and Innovation PID2019-105838RB-C32/-31, Fundación Ramón Areces

The antioxidant properties of polyphenols make these compounds useful for treatments of diseases related with oxidative processes, such as cancer or Alzheimer disease. However, they exhibit low bioavailability due to their low stability and low solubility, so their biotechnological application is very limited. An alternative to optimize these properties is by means of glycosylation. Polyphenol glycosides have shown a greater solubility and stability compared to their respective aglycones. In this work, we report the enzymatic synthesis of glucosides of some polyphenols: epigallocatechin gallate (EGCG), pterostilbene, rutin and hesperetin. The enzyme employed was a cyclodextrin glucosyltransferase (CGTase). Furthermore, the combined use of CGTase with an amyloglucosidase (STA1) from Saccharomyces cerevisiae enhances, in some cases, the formation of a single monoglycosylated product (Scheme 1). Finally, some properties such as stability, solubility or cellular toxicity of EGCG and pterostilbene glucosides have been evaluated, comparing the results with their aglycones.

Trabajo presentado en la 33ª ed. de la reunión científica regional "ZYMOMADRID" organizada por la Sra. Catedrática en Microbiología y Pasitología Dra. dña. María Molina Martín (Dpto. Microbiología II, Fac. Farmacia, UCM) en el Campus de Moncloa (UCM, Madrid, España) durante el día 18 de marzo de 2019., En la actualidad, la síntesis enzimática de productos específicos con un valor añadido está adquiriendo un mayor peso en la industria debido a su bajo coste y respeto hacia el medio ambiente. Por ello, la búsqueda de nuevas enzimas en levaduras no convencionales permite alternativas a los métodos químicos convencionales. La levadura Schwanniomyces occidentalis expresa una β-fructofuranosidasa (Ffase, EC 3.2.1.26) que, además de hidrolizar sacarosa, es capaz de transferir moléculas de fructosa al disacárido y generar pequeños fructooligosacáridos (FOS) con enlaces β-(2→6) y β-(2→1), básicamente 6-kestosa y 1-kestosa, respectivamente. La enzima puede fructosilar también distintos monosácaridos y compuestos hidroxilados, entre ellos polioles como el manitol y eritritol. La estructura 3D de la Ffase fue ya previamente caracterizada, se obtuvieron distintos complejos proteína-sustratos/productos y los determinantes estructurales implicados en la capacidad hidrolasa y transferasa de la proteína fueron también determinados. En este trabajo, se han analizado las bases moleculares de la selectividad del proceso de producción de fructosil-eritritol/manitol de Ffase. Para ello, se purificaron los correspondientes polioles fructosilados y se cristalizaron en complejo con la variante inactiva de la proteína Ffase-D50A, previamente expresada en Saccharomyces cerevisiae. El análisis cristalográfico de los complejos reveló que los residuos Q176 y Q228 de la proteína tenían un papel fundamental en el reconocimiento de manitol, y la posición N254 en el del eritritol. Se realizaron reacciones de fructosilación de polioles utilizando variantes mutantes de la Ffase en las que las posiciones referenciadas habían sido sustituidas por diferentes aminoácidos y se evaluaron los productos obtenidos utilizando técnicas cromatográficas (HPLC-ELSD). Los resultados verificaron el papel de estos residuos en el proceso de producción de polioles fructosilados, y en uno de los mutantes utilizados se logró mejorar la producción de fructosil-eritritol en un 20%.

Joint 12th EBSA congress / 10th ICBP – IUPAP congress: Biophysics for life and technology, Madrid, Spain, July 20-24, 2019. -- http://www.ebsa2019.org/

Trabajo presentado en la 2ª ed. del congreso nacional "Jornadas Españolas de Biocatálisis" (JEB) organizado por la Sociedad Española de Biotecnología en el Campus de El Cristo de la Universidad de Oviedo (Asturias, España) durante los días 25 al 26 de junio de 2018., Los procesos sintéticos mediados por enzimas están adquiriendo hoy en día cada vez mayor importancia en la industria, especialmente para la obtención de moléculas altamente específicas de manera poco costosa y respetuosa con el medio ambiente. En este contexto, las levaduras no convencionales ofrecen una verdadera oportunidad para descubrir nuevas enzimas alternativas que permitan desempeñar acciones catalíticas inéditas con múltiples posibles aplicaciones. Recientemente, el ascomiceto Schwanniomyces occidentalis ha suscitado interés biotecnológico por disponer de un amplio sistema glicosilhidrolítico extracelular de elevada operatividad y robustez. Su enzima β-fructofuranosidasa (EC 3.2.1.26) no sólo se ha mostrado capaz de escindir eficientemente enlaces fructosídicos β-(2→1) ó β-(2→6) presentes en diversos sacáridos o heterósidos (actividad hidrolítica); sino que también tiene el potencial para transfructosilar con distinto grado de regioselectividad ciertos sustratos aceptores a partir de donadores no activados como la sacarosa (actividad transferente). El estudio en detalle de esta habilidad catalítica ha permitido conocer con mayor exactitud la especificidad aceptora de esta enzima sobre una gran cantidad de azúcares y glicitoles. Las reacciones con dos de los glicitoles que mostraron mayor rendimiento, eritritol y manitol, fueron escaladas y los productos obtenidos purificados y caracterizados. Asimismo, se han puesto en práctica distintas estrategias para aumentar la tasa de transfructosilación de los aceptores positivos, como son la optimización de las concentraciones de sustrato, la variación de los tiempos de reacción y el empleo de biodisolventes, tanto derivados de biomasa como líquidos iónicos. Todo ello está generando como resultado la formación biocatalítica de nuevos compuestos fructoconjugados de posible interés bioactivo que serían de lo contrario difíciles de obtener por síntesis química clásica.