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Pseudoxanthoma elasticum (PXE) is an autosomal recessive disorder caused by mutations in the \(\textit {ATP-binding cassette sub-family C member 6}\) gene. Our previous studies revealed that PXE might be associated with premature aging. Treatment with statins showed positive effects not only for PXE but also for other diseases associated with premature aging like Hutchinson–Gilford progeria syndrome. Nevertheless, the molecular mechanisms in the case of PXE remain unclear. Thus, this study was performed to evaluate the efficiency of atorvastatin by analyzing key characteristics of the PXE phenotype in primary human dermal fibroblasts of PXE patients. Our data indicate that an atorvastatin treatment has a positive effect, especially on factors associated with cholesterol biosynthesis and prenylation processes, whereas the effect on age- and calcification-related factors was less pronounced.

Background: ATP-binding cassette (ABC) transporters are involved in a huge range of physiological processes. Mutations in the ABCC6 gene cause pseudoxanthoma elasticum, a metabolic disease with progressive soft tissue calcification. Methods: The aim of the present study was to analyze gene expression levels of selected ABC transporters associated with cholesterol homeostasis in metabolic active tissues, such as the liver, kidney and white adipose tissue (WAT) of Abcc6 -/- mice from an early and late disease stage (six-month-old and 12-month-old mice). Results: The strongest regulation of ABC transporter genes was observed in the liver tissue of six-month-old Abcc6 -/- mice. Here, we found a significant increase of mRNA expression levels of phospholipid, bile salt and cholesterol/sterol transporters Abcb1b, Abcb11, Abcg1, Abcg5 and Abcg8. Abcd2 mRNA expression was increased by 3.2-fold in the liver tissue. We observed strong upregulation of Abca3 and Abca1 mRNA expression up to 3.3-fold in kidney and WAT, and a 2-fold increase of Abca9 mRNA in the WAT of six-month-old Abcc6 knockout mice. Gene expression levels of Abcb1b and Abcg1 remained increased in the liver tissue after an age-related disease progression, while we observed lower mRNA expression of Abca3 and Abca9 in the kidney and WAT of 12-month-old Abcc6 -/- mice. Conclusions: These data support previous findings that Abcc6 deficiency leads to an altered gene expression of other ABC transporters depending on the status of disease progression. The increased expression of fatty acid, bile salt and cholesterol/sterol transporters may be linked to an altered cholesterol and lipoprotein metabolism due to a loss of Abcc6 function.

Table S1. Primer sequences used for qPCR (DOCX 25 kb)

Die humanen Xylosyltransferasen-I und -II (XT-I/-II) katalysieren den initialen Schritt der posttranslationalen Proteoglykan-Glykosylierung im Golgi-Apparat und werden mit dem xylosylierten Akzeptor in den extrazellulären Raum sekretiert. Eine gesteigerte XT-Aktivität resultiert in einer Proteoglykan-Akkumulation und Gewebe-Remodellierung, die maßgeblich an der Manifestation fibrotischer Erkrankungen beteiligt ist. Die Quantifizierung der Serum-XT-Aktivität kann bei Erkrankungen, die mit einem dysregulierten Metabolismus der extrazellulären Matrix einhergehen, einen wertvollen diagnostischen Beitrag leisten. Trotz umfangreicher, biochemischer Charakterisierungen ist bisher jedoch unklar, welchen physiologischen und pathologischen Regulationen die XT unterliegen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals eine Untersuchung der humanen XYLT-Promotorregionen auf Sequenzvariationen durchgeführt, um zu analysieren, ob diese Einfluss auf die natürliche Variabilität der Serum-XT-Aktivität nehmen. Hierbei wurde erstmalig ein evolutionär hochkonservierter Sequenzabschnitt von 238 bp in der XYLT1-Promotorregion nachgewiesen, der kein Bestandteil bisher veröffentlichter humaner Referenzsequenzen ist. Eine in silico Analyse sowie Promotoraktivitätsstudien zeigten, dass dieser Bereich Transkriptionsfaktor-Bindestellen enthält, die für die basale XYLT1 Genexpression sowie deren Induzierbarkeit durch den transforming growth factor-β1 (TGF-β1) obligat sind. Über die Genotypisierung 100 gesunder Blutspender konnten ein Mikrosatellit und zwei Einzelnukleotid-Variationen (single nucleotide variant, SNV) im XYLT1-Promotor sowie fünf SNV im XYLT2-Promotor identifiziert werden. Wenngleich der Einfluss der Variationen auf die Serum-XT-Aktivität nur marginal war, konnte die SNV c.-1088C>A mit einer signifikanten Verringerung der Promotoraktivität assoziiert werden. Somit ergeben sich erste Hinweise auf eine transkriptionale Regulation der XT durch XYLT-Promotor-Sequenzvariationen. Ein weiterer Fokus dieser Arbeit lag auf der Identifizierung XT-regulierender, profibrotischer Mediatoren. In einem eigens zu diesem Zweck etablierten Zellkulturmodell zur Kultivierung dermaler Myofibroblasten konnte erstmals eine Beteiligung der XT-I an der Myofibroblasten-Differenzierung aufgezeigt werden. Neben TGF-β1 konnte auch Activin A als potenter fibrotischer Mediator der XT herausgestellt werden. CTGF (connective tissue growth factor), PDGF-AB (platelet derived growth factor-AB), Angiotensin-II und Endothelin-1 wiesen hingegen eine modulative Wirkung auf die anderen profibrotischen Faktoren auf. Darüber hinaus konnte in vitro erstmalig eine XT-Regulation durch die miRNAs miR-34a und miR-18a detektiert werden. Da mittels miRNA-Array jedoch keine TGF-β1-abhängige, signifikante Genexpressionsänderung einer dieser beiden miRNAs in dermalen Myofibroblasten aufgezeigt werden konnte, muss der Stellenwert der miRNA-vermittelten XT-Regulation in der Fibrogenese weiterführend evaluiert werden. Im dritten Teilprojekt dieser Arbeit konnte die XT-I als Schlüsselmediator arthrofibrotischer Gewebe-Remodellierungen in synovialen Fibroblasten herausgestellt werden. Während die profibrotische Behandlung mit TGF-β1 oder mechanischem Stress zu einer zellulären Induktion der XYLT1 mRNA Expression und XT-Aktivität führte, konnte hingegen kein signifikanter Unterschied in der Serum-XT-Aktivität von Arthrofibrose-Patienten und gesunden Kontrollen verzeichnet werden. Dies gibt Hinweise darauf, dass die Arthrofibrose als ein über die Synovialmembran abgegrenzter, lokaler Prozess definiert werden kann, der durch klinisch systemische Parameter wie eine erhöhte Serum-XT-Aktivität nicht abzubilden ist. Zusammenfassend leisten die erzielten Erkenntnisse dieser Dissertation einen entscheidenden Beitrag zur Aufklärung der XT-Regulation und untermauern das Potenzial einer XT-Inhibition als therapeutische Option bei fibrotischen Erkrankungen.

\(\textbf{Background:}\) Dysregulations in cholesterol and lipid metabolism have been linked to human diseases like hypercholesterolemia, atherosclerosis or the metabolic syndrome. Many ABC transporters are involved in trafficking of metabolites derived from these pathways. Pseudoxanthoma elasticum (PXE), an autosomal-recessive disease caused by ABCC6 mutations, is characterized by atherogenesis and soft tissue calcification. \(\textbf{Methods:}\) In this study we investigated the regulation of cholesterol biosynthesis in human dermal fibroblasts from PXE patients and healthy controls. \(\textbf{Results:}\) Gene expression analysis of 84 targets indicated dysregulations in cholesterol metabolism in PXE fibroblasts. Transcript levels of ABCC6 were strongly increased in lipoprotein-deficient serum (LPDS) and under serum starvation in healthy controls. For the first time, increased HMG CoA reductase activities were found in PXE fibroblasts. We further observed strongly elevated transcript and protein levels for the proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9), as well as a significant reduction in APOE mRNA expression in PXE. \(\textbf{Conclusion:}\) Increased cholesterol biosynthesis, elevated PCSK9 levels and reduced APOE mRNA expression newly found in PXE fibroblasts could enforce atherogenesis and cardiovascular risk in PXE patients. Moreover, the increase in ABCC6 expression accompanied by the induction of cholesterol biosynthesis supposes a functional role for ABCC6 in human lipoprotein and cholesterol homeostasis.