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Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia Com o passar dos anos, as doenças cancerígenas tornaram-se um dos maiores e mais letais problemas de saúde em todo o mundo. No entanto, os tratamentos convencionais contra o cancro têm vindo a ser caracterizados como muito invasivos e prejudiciais para os pacientes, devido aos efeitos secundários indesejáveis e à alta toxicidade, uma vez que não apresentam especificidade para células tumorais. Numa tentativa de superar essas limitações, a nano e a biotecnologia surgiram como ferramentas inteligentes para transportar e entregar agentes terapêuticos no tratamento do cancro e torná-los mais eficientes.As nanopartículas mesoporosas de sílica (MSN) são um nanossistema de entrega promissor com propriedades físico-químicas notáveis, que podem oferecer uma abordagem interessante para a atual investigação no tratamento do cancro e para a prática clínica. Assim, este trabalho tem como objetivo desenvolver e caracterizar um novo sistema de entrega, baseado em MSN, para uma potencial terapia combinada contra Carcinoma Hepatocelular (CHC), utilizando um Interferon α-2b humano recombinante (IFNα-2b) e Epirrubicina (Epi) como agentes terapêuticos.Durante este projeto, as MSN foram sintetizadas e modificadas com (3-Aminopropil) trietoxisilano (APTES) para serem funcionalizados com ácido hialurónico (HA), o que permite que as partículas se liguem especificamente às células tumorais. As nanopartículas obtidas (MSN-HA) apresentaram uma superfície carregada negativamente e um diâmetro hidrodinâmico médio de 467 nm, determinado pelas leituras de LDV e DLS.O IFNα-2b recombinante foi produzido e purificado com sucesso, resultando num grande stock de proteína para ensaios de carregamento e citotoxicidade. Ambos os agentes terapêuticos foram carregados nas MSN-HA, apresentando resultados de alta eficiência e capacidade de carregamento, quando comparados com estudos anteriores.Finalmente, a biocompatibilidade das nanopartículas e o potencial terapêutico do nanossistema carregado foram avaliados em células HepG2. O resultado final foi bastante promissor, uma vez que o MSN-HA provou ser biocompatível quando descarregado, e as nanopartículas carregadas com Epi e IFNα-2b mostraram um efeito antitumoral sinergístico. Over the years, cancer diseases have become one of the biggest and most lethal health problems worldwide. However, conventional cancer treatments have shown to be too invasive and harmful for patients, due to undesirable side effects and high toxicity since they don’t present specificity for tumour cells. In order to try to overcome these limitations nano and biotechnology emerged as smart tools to transport and deliver therapeutic agents in cancer treatment and making them more efficient. Accordingly to that, mesoporous silica nanoparticles (MSN) are a promising delivery nanosystem with remarkable physicochemical properties that can offer an interesting approach for the current cancer treatment research and clinical practice. Thus, this work aims to develop and characterize a new delivery system, based on MSN’s, to a potential combination therapy against Hepatocellular Carcinoma (HCC), using a recombinant human Interferon α-2b (IFNα-2b) and Epirubicin (Epi) as therapeutic agents.During this project, MSN were synthesized and modified with (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) to be functionalized with hyaluronic acid (HA), which allowed them to specifically bind to tumour cells. The obtained nanoparticles (MSN-HA) presented a negatively charged surface and an average hydrodynamic diameter of 467 nm, determined by Laser Doppler Velocimetry (LDV) and Dynamic Light Scattering (DLS) readings. Recombinant IFNα-2b was successfully produced and purified resulting in a great protein stock for loading and cytotoxicity assays. Both therapeutic agents were loaded in MSN-HA presenting high loading efficiency and capacity results when compared with previous studies.Finally, nanoparticles’ biocompatibility and the therapeutic potential of the loaded nanosystem were evaluated in HepG2 cells. The outcome was very promising, since MSN-HA were proven to be biocompatible when unloaded, and the loaded nanoparticles with Epi and IFNα-2b have shown a synergistic antitumour effect.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia O cancro é uma das doenças mais prevalentes e com maior taxa de mortalidade no mundo, cujas opções de tratamento convencionais, como a quimioterapia e radioterapia, têm sido utilizadas para tratar a doença ou usadas em cuidados paliativos para melhorar a qualidade de vida do paciente. Contudo, há uma necessidade urgente de desenvolver novas estratégias de prevenção e de tratamento para ultrapassar certas limitações provenientes dos tratamentos convencionais. A área da nanomedicina oncológica, e mais recentemente a nanoteranóstica, na qual agentes de imagem e terapêuticos são combinados numa só plataforma, proporcionam novas opções de tratamento e de diagnóstico para o cancro. Esta combinação poderá permitir uma terapia mais personalizada e cuidada, em comparação a outros tratamentos padronizados e convencionais. A terapia génica é uma estratégia promissora para o tratamento oncológico que requer um sistema de transporte que entregue eficientemente o material genético nas células alvo. Assim sendo, o objetivo principal deste trabalho é fazer uma revisão dos desenvolvimentos e descobertas recentes correspondentes aos nanosistemas teranósticos, com especial foco naqueles que incorporem simultaneamente agentes de terapia genética e imagem para o tratamento do cancro.O cancro é uma das doenças mais prevalentes e com maior taxa de mortalidade no mundo, cujas opções de tratamento convencionais, como a quimioterapia e radioterapia, têm sido utilizadas para tratar a doença ou usadas em cuidados paliativos para melhorar a qualidade de vida do paciente. Contudo, há uma necessidade urgente de desenvolver novas estratégias de prevenção e de tratamento para ultrapassar certas limitações provenientes dos tratamentos convencionais. A área da nanomedicina oncológica, e mais recentemente a nanoteranóstica, na qual agentes de imagem e terapêuticos são combinados numa só plataforma, proporcionam novas opções de tratamento e de diagnóstico para o cancro. Esta combinação poderá permitir uma terapia mais personalizada e cuidada, em comparação a outros tratamentos padronizados e convencionais. A terapia génica é uma estratégia promissora para o tratamento oncológico que requer um sistema de transporte que entregue eficientemente o material genético nas células alvo. Assim sendo, o objetivo principal deste trabalho é fazer uma revisão dos desenvolvimentos e descobertas recentes correspondentes aos nanosistemas teranósticos, com especial foco naqueles que incorporem simultaneamente agentes de terapia genética e imagem para o tratamento do cancro.O cancro é uma das doenças mais prevalentes e com maior taxa de mortalidade no mundo, cujas opções de tratamento convencionais, como a quimioterapia e radioterapia, têm sido utilizadas para tratar a doença ou usadas em cuidados paliativos para melhorar a qualidade de vida do paciente. Contudo, há uma necessidade urgente de desenvolver novas estratégias de prevenção e de tratamento para ultrapassar certas limitações provenientes dos tratamentos convencionais. A área da nanomedicina oncológica, e mais recentemente a nanoteranóstica, na qual agentes de imagem e terapêuticos são combinados numa só plataforma, proporcionam novas opções de tratamento e de diagnóstico para o cancro. Esta combinação poderá permitir uma terapia mais personalizada e cuidada, em comparação a outros tratamentos padronizados e convencionais. A terapia génica é uma estratégia promissora para o tratamento oncológico que requer um sistema de transporte que entregue eficientemente o material genético nas células alvo. Assim sendo, o objetivo principal deste trabalho é fazer uma revisão dos desenvolvimentos e descobertas recentes correspondentes aos nanosistemas teranósticos, com especial foco naqueles que incorporem simultaneamente agentes de terapia genética e imagem para o tratamento do cancro. Cancer is one of the most prevalent and deadly diseases in the world, to which conventional treatment options, such as chemotherapy and radiotherapy, have been applied to overcome the disease or used in a palliative manner to enhance the life quality of the patient. However, there is an urgent need to develop new preventive and treatment strategies to overcome the limitations of the commonly used approaches. The field of cancer nanomedicine, and more recently the field of nanotheranostics, where imaging and therapeutic agents are combined in a single platform, provide new opportunities for the treatment and the diagnosis of cancer. This combination could bring us closer to a more personalized and cared-for therapy, in opposition to the conventional and standardized approaches. Gene therapy is a promising strategy for the treatment of cancer that requires a transport system to efficiently deliver the genetic material into the target cells. Hence, the main purpose of this work is to review recent findings and developments regarding theranostic nanosystems, with special focus on those that incorporate both gene therapy and imaging agents for cancer treatment.Cancer is one of the most prevalent and deadly diseases in the world, to which conventional treatment options, such as chemotherapy and radiotherapy, have been applied to overcome the disease or used in a palliative manner to enhance the life quality of the patient. However, there is an urgent need to develop new preventive and treatment strategies to overcome the limitations of the commonly used approaches. The field of cancer nanomedicine, and more recently the field of nanotheranostics, where imaging and therapeutic agents are combined in a single platform, provide new opportunities for the treatment and the diagnosis of cancer. This combination could bring us closer to a more personalized and cared-for therapy, in opposition to the conventional and standardized approaches. Gene therapy is a promising strategy for the treatment of cancer that requires a transport system to efficiently deliver the genetic material into the target cells. Hence, the main purpose of this work is to review recent findings and developments regarding theranostic nanosystems, with special focus on those that incorporate both gene therapy and imaging agents for cancer treatment.Cancer is one of the most prevalent and deadly diseases in the world, to which conventional treatment options, such as chemotherapy and radiotherapy, have been applied to overcome the disease or used in a palliative manner to enhance the life quality of the patient. However, there is an urgent need to develop new preventive and treatment strategies to overcome the limitations of the commonly used approaches. The field of cancer nanomedicine, and more recently the field of nanotheranostics, where imaging and therapeutic agents are combined in a single platform, provide new opportunities for the treatment and the diagnosis of cancer. This combination could bring us closer to a more personalized and cared-for therapy, in opposition to the conventional and standardized approaches. Gene therapy is a promising strategy for the treatment of cancer that requires a transport system to efficiently deliver the genetic material into the target cells. Hence, the main purpose of this work is to review recent findings and developments regarding theranostic nanosystems, with special focus on those that incorporate both gene therapy and imaging agents for cancer treatment.

Dissertação de Mestrado Integrado em Engenharia Química apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia O cancro é considerado a segunda maior causa de mortalidade na Europa, sendo que anualmente, emergem cerca de 3,7 milhões de novos casos, associados a 1,9 milhões de mortes anuais. Independentemente da variedade de tratamentos que existem atualmente, há vários problemas relacionados com a sua seletividade ao afetar as células saudáveis e capacidade de contornar barreiras biológicas criadas pelo fígado, pelos rins e pelo sistema imunitário para conseguir uma administração de fármaco eficaz. Assim sendo, existe uma necessidade de melhoria destes tratamentos ou desenvolvimento de novos tratamentos que possam resolver estes problemas. Surge assim o objetivo deste trabalho, que consiste no desenvolvimento de partículas de sílica mesoporosas biodegradáveis revestidas com polissacarídeos para imobilização de proteína de modo a permitir a entrega específica de proteína recombinante com ação antitumoral. Este trabalho insere-se num projeto que tem como objetivo final o transporte de uma proteína recombinante, interferão $\alpha$-2b, para aplicação numa estratégia antitumoral de imunoterapia do cancro. Neste trabalho, foram testados dois polissacarídeos como revestimento das partículas de sílica: ácido hialurónico e pectina. O revestimento foi conseguido através do uso de um agente ligante. Após a seleção inicial de agente ligante, glioxal, não conseguir revestir as partículas devido à ligação Si-O-C formada ser instável, o revestimento foi conseguido com sucesso através do agente ligante (3-glicidoxilpropil)trimetoxisilano. Foram variadas as condições de reação, tais como, a quantidade de polissacarídeo, a aplicação de sonicação antes das reações e as condições de lavagem. As partículas revestidas foram caracterizadas por FTIR, STEM, DLS, potencial zeta e espectroscopia UV-VIS. A quantificação do revestimento foi realizada através do teste de fenol-ácido sulfúrico, sendo o revestimento de ácido hialurónico de 103,43 mg / g de partícula e de pectina de 96,56 mg / g de partícula. Os polissacarídeos reagiram provavelmente pelos seus grupos hidroxilo livres, sendo que revestiram sensivelmente o mesmo. Algo inesperado foi a diminuição do tamanho das partículas com revestimento 123 nm para as partículas revestidas com ácido hialurónico e 105 nm para as revestidas com pectina) e a sua morfologia totalmente irregular face às partículas não revestidas (esféricas e de 151 nm). Supõe-se que esta diminuição de tamanho é devido às ligações tetrasulfeto sofrerem hidrólise em condições alcalinas levando a um aparente possível colapso dos poros das partículas.A proteína selecionada para o estudo de adsorção de proteína na partícula revestida foi a proteína Albumina Sérica Bovina (BSA). Foram testados vários procedimentos, variando a concentração de proteína, a aplicação de sonicação antes da adsorção e o tipo de solvente. A adsorção de BSA foi superior em todas as partículas não modificadas em comparação às revestidas. Isto deve-se provavelmente às partículas serem mesoporosas, proporcionando uma maior área superficial para a adsorção de proteína. As partículas revestidas por pectina adsorveram menor quantidade de BSA. Tanto os polissacarídeos como a proteína utilizados apresentam carga negativa levando a interações eletrostáticas repulsivas entre estes, no entanto estas não são as únicas interações a considerar. De tal modo que se observou que a adsorção de BSA pelas partículas revestidas por ácido hialurónico e pectina são significativas, confirmando a contribuição de forças atrativas de van der Waals entre a proteína e o revestimento. No caso das partículas revestidas por pectina as forças de van der Waals são menores que nas revestidas por ácido hialurónico. Seria de esperar que as partículas sonicadas obtivessem uma maior adsorção de BSA em água em comparação com as não sonicadas, devido a uma maior área superficial em contacto com a proteína. No entanto a sua adsorção foi menor, indicando que a aplicação de sonicação parece inflluenciar as interações entre a proteína e as partículas, resultando numa diminuição da adsorção de BSA. A adsorção de BSA em PBS das partículas sonicadas foi superior para os três tipos de partículas. Isto pode ser devido ao PBS proporcionar uma maior estabilidade à proteína, consequentemente permitindo uma maior adsorção. Cancer is considered the second largest mortality cause in Europe as about 3.7 millions of new cases, associated to 1.9 million deaths, emerge every year. Even with the large variety of treatments that exist today, there are still several problems related to their selectivity, as they tend to also affect healthy cells, and their capacity to overcome the biological barriers created by the liver, kidneys and the immune system in order to effectively administer the required pharmaceuticals. This leads to the need exists for the improvement of existing treatments or the development of better treatments that are able to resolve these issues. As such, the goal of this work involves the development of biodegradable mesoporous silica particles coated with polysaccharides for protein immobilization as to allow the specific delivery of recombinant protein with anti-tumorous properties. This work is part of a larger project that has as final objective the transport of a recombinant protein, interferon $\alpha$-2b, to achieve an anti-tumorous strategy for cancer immunotherapy.In this work, two polysaccharides were tested as coating for silica particles: hyaluronic acid and pectin. The coating was achieved through the use of a binder. After the initially selected binder agent, glyoxal, failed to coat the particles because the formed Si-O-C bond was unstable, coating was successfully achieved through the binder (3-glycidoxypropyl) trimethoxysilane. The reaction conditions varied, such as the amount of polysaccharide, the application of sonication before the reactions and the washing conditions. The coated particles were characterized by FTIR, STEM, DLS, zeta potential and UV-VIS spectroscopy. The coating quantification was performed by the phenol-sulfuric acid test, with the hyaluronic acid coating being 103.43 mg / g particle and pectin being 96.56 mg / g particle. The polysaccharides probably reacted by their free hydroxyl groups, and the same amount of coating was achieved. However, the decrease in the size of the coated particles was unexpected (123 nm for the particles coated with hyaluronic acid and 105 nm for those coated with pectin) and their totally irregular morphology when compared with uncoated particles (spherical and 151 nm). It is assumed that this decrease in size is due to the tetrasulfide bonds undergoing hydrolysis under alkaline conditions leading to an apparent possible collapse of the pores of the particles.The protein selected for the protein adsorption study on the coated particle was the Bovine Serum Albumin (BSA) protein. Several procedures were tested, by varying the protein concentration, the application sonication before the adsorption, and the type of solvent. The adsorption of BSA was higher in all unmodified particles compared to the coated ones. This is probably due to the particles being mesoporous, providing a larger surface area for protein adsorption. The pectin coated particles adsorbed the lowest amount of BSA. Both the polysaccharides and the protein used have a negative charge leading to repulsive electrostatic interactions between them, however these are not the only interactions to consider. Thus, it was observed that the adsorption of BSA by the particles coated with hyaluronic acid and pectin are significant, confirming the contribution of attractive van der Waals forces between the protein and the coating. In the case of the pectin-coated particles, the van der Waals forces are smaller than those coated with hyaluronic acid. It would be expected that the sonicated particles would obtain a higher adsorption rate of BSA in water compared to the non-sonicated ones due to a larger area surface in contact with the protein. However, its adsorption was lower, indicating that the sonication application seems to influence the interactions between the protein and the particles, resulting in a decrease in BSA adsorption. The adsorption of BSA in PBS from the sonicated particles was higher for the three types of particles. This may be due to the PBS providing greater stability to the protein, consequently allowing for greater adsorption.

Trabalho de Projeto do Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica apresentado à Faculdade de Ciências e Tecnologia Com a modernização das diferentes técnicas de biotecnologia, assistiu-se a um avanço brutal no conhecimento da área da genética, desempenhando este um importante papel noutras áreas, destacando-se, dentro deste conjunto, a medicina. A comunhão de áreas como a medicina e a genética resulta, entre outras coisas, no aprimorar de técnicas como a terapia génica, afirmando-se esta como uma das técnicas de maior potencial para tratamento ou cura de diferentes patologias por via da correção da expressão de diferentes genes responsáveis pelas mesmas.A eficácia da terapia génica está intimamente ligada aos sistemas de transporte e entrega de material genético utilizados, devendo estes promover uma entrega do material genético competente e, acima de tudo, segura. Neste âmbito, já se estudaram diferentes tipos de vetores, tanto virais como não virais, chegando-se à conclusão que, apesar da fraca eficácia de transfeção face aos virais, os vetores não virais são muito mais seguros, aliando a isso diversas características, como a versatilidade, grande capacidade de empacotamento, capacidade de funcionalização química e baixa imunogenicidade. No conjunto de vetores não virais, os nanossistemas de base polimérica assumem-se como uns dos mais promissores. Assim sendo, ao longo deste projeto avaliou-se a entrega de genes promovida por poliplexos formados a partir do polímero catiónico poli (2-aminoetil metacrilato), estudando-se a influência que o peso molecular do polímero, a copolimerização deste com o polietilenoglicol (PEG) e a razão de carga (N/P) dos poliplexos formados têm em parâmetros como a atividade biológica e a citotoxicidade tanto dos poliplexos como apenas dos polímeros (no caso da citotoxicidade). De forma a conduzir um estudo rigoroso e a retirar mais conclusões, fez-se uma caracterização físico química das nanopartículas estudadas, consistindo esta na avaliação da carga superficial (potencial zeta) e tamanho dos poliplexos, bem como na capacidade que os polímeros têm de proteger o material genético, após a formação de complexos.A avaliação da atividade biológica dos poliplexos estudados na presença e ausência de soro, mostrou que a presença deste componente conduz a um aumento da transfeção, destacando-se, neste parâmetro, os poliplexos formados a partir do copolímero PEG-b-PAMA29900. Estes resultados permitem concluir também que copolimerização com o PEG permitiu obter melhores resultados, principalmente ao nível da atividade biológica, superiorizando-se estes aos valores obtidos com os poliplexos formados a partir do polímero PEI, considerado o gold standard. A presença do PEG induziu algumas melhorias na citotoxicidade dos poliplexos em destaque, não sendo, no entanto, suficientes para se destacar face ao controlo utilizado (PEI). A caracterização físico-química dos poliplexos baseados no copolímero PEG-b-PAMA29900 mostrou que estes têm uma boa capacidade de proteção do DNA, um potencial zeta positivo e um tamanho que poderá permitir que as nanopartículas se mantenham em circulação por bastante tempo e beneficiar do efeito de permeabilidade e retenção melhorada. Modernizing the different Biotechnology techniques led to several advances regarding areas such as genetics, taking these part in a broad spectrum of sciences, including medicine. The combination of areas such as medicine and genetics results, amongst other things, in the enhancement of techniques like gene therapy, assuming itself as one of the techniques with greater potential for treating or healing different patologies by correcting the expression of different genes responsible for them. The efficacy of gene therapy is intimately connected with the different systems of transport and delivery of genetic material used, having these the obligation to promote a competent and, above all, safe delivery of the genetic material. Having this in mind, different types of vectors have already been studied, both viral and non viral, coming to the conclusion that, despite the low transfection efficacy regarding viral vectors, non viral systems are safer, combining that with different characteristics, such as versatility, packaging capacity, ability to be chemically functionalized and low immunogenicity. Regarding the set of non viral vectors, polymeric nanosystems appear as one of the most promising strategies. Taking this in account, during this project, the delivery of genes promoted by polyplexes formed with the cationic polymer poly (methacrylate 2-aminoethyl) was evaluated, studying the influence that the polymer’s molecular weight, the copolymerization with polyethylene glycol (PEG) and the polyplexes’ charge ratio (N/P) have in parameters as the biological activity of the polyplexes and the cytotoxicity of both polyplexes and polymers. In order to proceed to a thorough study and to collect further conclusions, a physico chemical characterization of the nanoparticles has also been done, consisting this in the evaluation of the zeta potential and size of the polyplexes, as well as in the polymer’s condensing capacity after the formation of complexes.The evaluation of the polyplexes’ biological activity studied in the presence and absence of serum, showed that the presence of this component enhances the transfection levels, highlighting, in this parameter, the polyplexes based in the copolymer PEG-b-PAMA29900. These results show that the copolymerization with PEG led to better results, specially concerning biological activity, being these higher than the ones obtained with the gold standard PEI polyplexes. The presence of PEG enhanced several improvements in the polyplexes’ cytotoxicity, not being able to produce better results than the ones obtained with the control (PEI), though. PEG-b-PAMA29900 polyplexes’ physico chemical characterization showed a good DNA protection, a positive zeta potential and a size that may allow nanoparticles to last longer in circulation and benefit from enhanced permeation and retention (EPR) effect. Universidade de Coimbra - Os materiais utilizados foram financiados pela Universidade de Coimbra.

A terapia génica é reconhecida como um dos grandes avanços da medicina, ao permitir o tratamento de doenças a nível genético, mudando o atual paradigma da terapêutica. A terapia génica tem como objetivo a inserção de material genético nas células e tecidos alvo de um indivíduo, de forma a curar doenças do foro genético, como, por exemplo, o cancro. Neste sentido, o desenvolvimento de vetores de entrega de material genético seguros e eficientes surge como o grande desafio para a sua aplicação clínica. Das duas classes de vetores existentes, os de natureza viral são os mais eficientes. No entanto, a sua utilização é potencialmente perigosa, provocando, entre outros danos, reações imunitárias e inflamatórias graves, razão pela qual existe um interesse crescente sobre os vetores não-virais, onde se incluem os de base polimérica. Os vetores não virais oferecem como vantagens a sua segurança e reduzida resposta por parte do sistema imunitário, assim como flexibilidade de construção e facilidade de fabrico. Neste campo, a engenharia de polímeros possibilita a afinação das propriedades químicas e físicas dos polímeros, adaptando-os, de forma a conseguir polímeros com características ótimas para a entrega de material genético. O objetivo deste trabalho foi assim investigar o potencial de um novo sistema de base polimérica para a entrega de material genético, constituído por diferentes combinações entre três polímeros catiónicos: poli(etileno glicol)-bloco-poli[2-(dimetilamino)etil metacrilato] (PEG-b-PDMAEMA), poli[2-(dimetilamino)etil metacrilato] (PDMAEMA) e poli(β-amino éster) (PβAE), sendo ainda de especial relevância o estudo da influência do PEG sobre o sistema. Foram sintetizados três copolímeros de bloco PEG-b-PDMAEMA, com segmentos de PEG com pesos moleculares entre os 400 e os 2000 g.mol-1 e um homopolímero de PDMAEMA. A síntese realizou-se com recurso a técnicas de polimerização radicalar por transferência de átomo (ATRP), o que permitiu obter polímeros com massas molares e dispersividades controladas. Foi sintetizado um quinto polímero, o PβAE, por uma reação de adição de Michael. Por limites temporais, apenas três destes polímeros foram testados in vitro como vetores de entrega de material genético: os dois homopolímeros e o copolímero PEG1000-b-PDMAEMA. x A atividade de transfeção in vitro foi avaliada em células COS-7 através de ensaios de luminescência. Paralelamente, outros parâmetros como a citotoxicidade, o grau de condensação do DNA e o tamanho e a carga superficial das nanopartículas foram também estimados. Os resultados obtidos indicaram que os poliplexos baseados na combinação de polímeros proposta são bons candidatos para a entrega de material genético, devido à sua grande capacidade de transfeção, principalmente quando comparada com o gold standard dos vetores poliméricos, a polietilenimina ramificada (bPEI). De acordo com o presente estudo, a introdução de PEG não teve influência sobre a atividade de transfeção do sistema, já que as variações na quantidade de polímero PEG1000-b-PDMAEMA não se traduziram em alterações significativas na atividade biológica das diferentes formulações. Todas as outras análises efetuadas indicaram que os poliplexos produzidos têm propriedades físico-químicas adequadas à sua aplicação, nomeadamente, carga superficial positiva, diâmetro médio abaixo dos 150 nm e uma excelente condensação do DNA. Palavras-chave: RDRP, ATRP, copolímeros de bloco, polímeros catiónicos, terapia génica.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra Gene therapy is believed to have the necessary characteristics to become a frontline treatment in a variety of diseases, including cancer. To reach its full potential it is still necessary to develop suitable vectors for the transport and delivery of genetic material into target cells. Currently, the most used vectors are of viral type. However, non-viral strategies have been emerging in the last decades as promising alternatives, and the most prominent examples are liposomes and cationic polymers. These are advantageous especially due to the fact that they are safe and their properties are easy to manipulate. In spite of these advantages, most of the used non-viral systems still demonstrate low efficiencies in transfection. The objective of this work was to investigate the gene delivery potential of novel non-viral vectors, constituted by different combinations of two polymers, to efficiently transport and delivery DNA into target cancer cells. In order to do so, their transfection activity was measured in different cell lines through luminescence, fluorescence microscopy and flow cytometry. Other parameters like their cytotoxicity, degree of DNA condensation, size and surface charge were also evaluated. The obtained results have demonstrated that our formulations are good candidates for gene delivery, due to their potent transfection efficiencies when compared to a “golden standard” polymeric-based gene delivery system, branched polyethylenimine (bPEI). From the developed combined formulations, CE-based polyplexes, prepared at the 100/1 N/P ratio, were selected as the best formulation, owing to their great transfection activity, even in the presence of serum, that is much higher than that obtained with polyplexes prepared with each one of the two polymers, and to their reduced levels of cytotoxicity. Furthermore, the other experimental studies revealed that the polyplexes designed with this combination of polymers present suitable physicochemical properties for in vivo applications, namely a high level of DNA protection and a reduced mean diameter. A terapia génica é considerada uma estratégia terapêutica com as características necessárias para se tornar um tratamento de primeira linha para uma grande variedade de doenças, incluindo o cancro. Apesar disso, para atingir o seu potencial ainda é necessário desenvolver vectores adequados para o transporte e entrega de material genético às células alvo. Actualmente, a maioria dos vectores utilizados são de tipo viral. No entanto, nas últimas décadas, as estratégias do tipo não-viral têm vindo a impor-se como alternativas promissoras, sendo os mais proeminentes exemplos os lipossomas e os polímeros catiónicos. Estes sistemas são vantajosos especialmente na medida em que são seguros e as suas propriedades são fáceis de manipular. Apesar destas vantagens, a maioria destes vectores ainda demonstra uma baixa eficiência de transfecção. O objectivo deste trabalho foi investigar o potencial de novos vectores não-virais, constituídos por diferentes combinações de dois polímeros, para transportar e entregar o material genético de forma eficiente a células cancerígenas. Para tal, a eficiência de transfecção foi avaliada em diferentes linhas celulares através dos ensaios de luminescência, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. Foram também avaliados outros parâmetros como a sua citotoxicidade, capacidade de condensação do DNA, tamanho e carga superficial. Os resultados obtidos mostraram que as nossas formulações são bons candidatos para entrega de material genético, devido à sua potente eficiência de transfecção quando comparada com a obtida com a referência padrão dos sistemas de base polimérica, polietilenimina ramificada (bPEI). Das formulações desenvolvidas envolvendo a combinação de polímeros, os poliplexos com base na combinação CE preparados na razão N/P de 100/1 foram selecionados como a melhor formulação, devido à sua elevada atividade de transfecção, mesmo na presença de soro, que é muito superior à obtida com os poliplexos preparados com cada um dos dois polímeros individualmente, e aos reduzidos níveis de citotoxicidade. Adicionalmente, os outros ensaios experimentais demonstraram que os poliplexos desenvolvidos com esta combinação de polímeros apresentam propriedades físico-químicas favoráveis à sua aplicação in vivo, nomeadamente elevada proteção de material genético e um diâmetro médio reduzido.

Dissertação de mestrado em Bioquímica apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. O carcinoma hepatocelular (HCC) é considerado o sexto tipo de cancro com maior prevalência a nível mundial, correspondendo à terceira causa de morte relacionada com doenças cancerígenas. Actualmente, as opções de tratamento para este carcinoma são limitadas, apresentando reduzidas taxas de sucesso. Neste âmbito, os avanços em terapia génica têm-se mostrado promissores na procura e desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para esta patologia. No entanto, o sucesso desta terapia depende da entrega eficiente e específica do material genético às células alvo. Neste contexto, o principal objectivo deste estudo consistiu no desenvolvimento de uma nova formulação de lipossomas catiónicos, contendo o lípido lactosil-PE para fazer o direccionamento para o receptor da asialoglicoproteina (ASGP-R), uma proteína membranar especificamente expressa em hepatócitos e sobreexpressa em hepatócitos cancerígenos, de modo a promover uma entrega eficiente e especifica de material genético às células do HCC. Os resultados obtidos nos ensaios de transfecção com a linha celular HepG2 mostram que a presença de 15% do lípido lactosil-PE na formulação de lipossomas catiónicos induz uma potenciação substancial da actividade biológica dos complexos EPOPC:Chol:lactosil-PE/ADN (+/-) 2/1, não apenas em termos dos níveis de expressão de transgene mas também em termos da percentagem de células transfectadas. Na presença de galactose, a qual compete com o lactosil-PE pela ligação ao ASGP-R, verificou-se uma diminuição da actividade biológica destes complexos, mostrando que a potenciação da transfecção induzida pela presença do lactosil-PE pode dever-se à sua interação específica com o ASGP-R. Adicionalmente, constatou-se que a presença de lactosil-PE nos lipoplexos promoveu um aumento na sua ligação e internalização celular. Relativamente às características físico-químicas dos lipoplexos, verificou-se que a presença de lactosil-PE resultou num aumento significativo da protecção do ADN e numa diminuição substancial do diâmetro médio e do potencial zeta dos lipoplexos, conferindo-lhe melhores características físico-químicas. Deste modo, os resultados obtidos neste estudo sugerem que a potenciação da actividade biológica induzida pela presença de lactosil-PE pode dever-se à sua ligação específica ao ASGP-R, sobreexpresso em HCC, mostrando que lipoplexos constituídos por EPOPC:Chol:lactosil-PE(15%)/ADN, na razão de carga (+/-) 2/1, podem constituir um novo sistema de transporte e entrega de material genético para a aplicação de novas estratégias terapêuticas em HCC. Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the primary hepatic neoplasms of liver cancer and is considered the sixth type of cancer with the highest prevalence worldwide, corresponding to the third cause of death related to cancer diseases. The current treatment options have many limitations and reduced success rates. In this regard, advances in gene therapy have shown promising results in the search and development of novel therapeutic strategies for this pathology. However, the success of this therapy depends on the efficient and specific delivery of genetic material into target cells. In this context, the main goal of this study was to develop a new formulation of cationic liposomes, containing the lipid Lactosyl-PE targeted to the asialoglycoprotein receptor (ASGP-R), a membrane protein specifically expressed in hepatocytes and overexpressed in HCC cells, for efficient and specific delivery of genetic material into HCC cells. Transfection studies with HepG2 cells, showed that the presence of 15% of Lactosyl-PE in the formulation of cationic liposomes induces a strong potentiation of the biological activity of these complexes, not only in terms of transgene expression levels but also in terms of percentage of transfected cells. In the presence of galactose, which competes with the Lactosyl-PE for the binding to the ASGP receptor, it was observed a reduction in the biological activity levels, showing that the potentiation of transfection induced by the presence of lactosil-PE could be due to its specific interaction with ASGP-Rs. In addition, it was found that the presence of Lactosyl-PE into lipoplexes promotes an increase in their cell binding and uptake. Regarding the physicochemical properties of lipoplexes, the presence of Lactosyl-PE resulted in a significant increased in the DNA protection and a substantial decrease in the mean diameter and zeta potential of lipoplexes, conferring them better physicochemical properties. Overall, the results obtained in this study suggest that the potentiation of the biological activity induced by the presence of lactosil-PE could be due to its specific binding to the ASGP-R, overexpressed in HCC, showing that lipoplexes composed by EPOPC:Chol:lactosil-PE (15%)/DNA, in the charge ratio (+/-) 2/1, could constitute a new gene delivery system for application of new therapeutic strategies in HCC.

Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular. apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. Excluindo o cancro da pele, o cancro da mama é o tipo de cancro mais frequentemente diagnosticado entre as mulheres, sendo a principal causa de morte por cancro neste género. Apesar dos recentes avanços nas estratégias terapêuticas convencionais para o cancro, a resistência a fármacos e os efeitos tóxicos secundários, frequentemente observados, têm limitado a sua aplicação clínica. Desta forma, urge o desenvolvimento de novas e eficientes estratégias anti-tumorais. Neste sentido, a terapia genética constitui uma estratégia promissora, devido à descoberta de novos alvos moleculares associados a uma doença, o que promove a oportunidade de criar novas técnicas terapêuticas, incluindo as que envolvem a p53 e microRNAs. Por outro lado, a investigação em terapia génica tem também estado focada no desenvolvimento de sistemas de transporte e entrega de material genético eficientes, sendo os complexos de lipossomas catioónicos/DNA ("lipoplexos") os mais promissores.Neste contexto, o principal objectivo deste trabalho foi criar uma nova estratégia para o tratamento de cancro da mama, consistindo na combinação de terapia génica e quimioterapia, com o intuito de proporcionar uma actividade antitumoral efectiva, com menos efeitos adversos. Assim, investigou-se a acção combinada de vimblastina ou docetaxel com estratégias de terapia génica envolvendo a expressão de p53 e/ou miR-1, mediada por lipoplexos, em células de adenocarcinoma mamário (linhas celulares MDA-MB-231 e MCF-7). Os resultados obtidos mostraram que a presença de vimblastina ou docetaxel durante a transfecção de células tumorais, com lipoplexos HSA-EPOPC:Chol/DNA (+/-) (4/1), resulta num aumento substancial da expressão dos transgenes luciferase e GFP. A presença destes fármacos também promove um aumento significativo da percentagem de células transfectadas. Observou-se também que a nova estratégia terapêutica, que combina quimioterapia com terapia génica envolvendo elevados níveis de expressão de p53 e miR-1, resultou num efeito anti-tumoral significativo in vitro. Por outro lado, iniciou-se o esclarecimento dos mecanismos envolvidos na acção terapêutica das estratégias desenvolvidas. A correlação entre o efeito terapêutico e os níveis de alguns alvos do miR e da p53, bem como stress oxidativo e vias de morte celular serão posteriormente investigadas, com o objectivo de contribuir para a clarificação dos mecanismos potencialmente envolvidos no efeito anti-tumoral induzido pela estratégia desenvolvida. Estas estratégias combinadas de terapia génica e quimioterapia poderão assumir uma grande importância em aplicações clínicas futuras, permitindo melhorias substanciais no prognóstico de cancro da mama e constituir uma nova plataforma para o desenvolvimento de estratégias inovadoras contra o cancro

Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra O hepatocarcinoma (HCC) tem origem nas principais células do fígado, os hepatócitos, sendo por isso considerado o cancro primário deste orgão. O hepatocarcinoma é o terceiro tipo de cancro que causa maior mortalidade a nível mundial. Actualmente, as opções primárias de tratamento do HCC consistem na recessão cirúrgica do tumor, no transplante de fígado e na quimioterapia, apresentando qualquer uma destas opções de tratamento múltiplas limitações. Assim sendo, existe uma necessidade urgente de desenvolvimento de novas estratégias antitumorais, direccionadas para o HCC, que apresentem uma elevada eficiência. A terapia génica tem contribuído significativamente para o desenvolvimento de estratégias antitumorais promissoras. Contudo, a sua aplicação clínica ainda se encontra bastante limitada, nomeadamente devido à reduzida eficiência de entrega de material genético às células alvo. Assim, a aplicação da terapia génica está dependente, em grande parte, do desenvolvimento de sistemas de entrega de material genético mais eficientes. O HCC é caracterizado pela sobreexpressão do receptor das asialoglicoproteínas (ASGP), que é expresso exclusivamente no fígado. A asialofetuina é um dos ligandos reconhecidos especificamente por este receptor. Deste modo, a utilização deste ligando em sistemas de transporte de material genético poderá permitir uma entrega eficiente e direccionada dos ácidos nucleicos no HCC. O principal objectivo deste trabalho consistiu em desenvolver um novo sistema de transporte e entrega de material genético, específico para células de hepatocarcinoma, baseado em lipossomas catiónicos, compostos por EPOPC (1-palmitoil-2-oleoil-snglicero- 3-etilfosfocolina) e Colesterol, e em asialofetuina. Os resultados obtidos, nos estudos de transfecção realizados na linha celular de hepatocarcinoma HepG2, mostraram que a associação de asialofetuina aos lipoplexos promove uma potenciação significativa da sua actividade biológica, nomeadamente para a formulação composta por EPOPC:Colesterol/ADN, na razão de carga (+/-) 2/1, contendo 10μg de asialofetuina/μg de ADN e para a formulação preparada com EPOPC:Colesterol/ADN, na razão de carga (+/-) 4/1, contendo 20μg de asialofetuina/μg de ADN. Este aumento substancial da actividade biológica dos lipoplexos, induzido pela associação de asialofetuina, foi verificado não apenas pelo aumento da expressão do transgene (quantificação da expressão da luciferase) mas também pelo aumento da percentagem de células transfectadas (quantificação das células que expressavam a proteína verde fluorescente). Os resultados obtidos mostraram também que a actividade biológica registada com os complexos preparados com asialofetuina, em células HepG2, foi superior à verificada com formulações que apresentaram, em diversos estudos, elevada actividade biológica em vários tipos de linhas celulares. O ensaio de protecção de material genético mostrou que a presença de asialofetuina nos lipoplexos resulta num menor acesso do brometo de etídeo ao ADN dos complexos, constituindo um indício da sua maior protecção. Na presença de galactose, que compete com a asialofetuína pela ligação ao receptor ASGP, verificou-se uma diminuição significativa da actividade biológica dos lipoplexos preparados com asialofetuina, não tendo sido, no entanto, observada uma redução da capacidade de transfecção para as outras formulações de complexos. Os resultados registados nos estudos de ligação e associação celular demonstraram que a presença de asialofetuina induz um aumento da ligação e da internalização dos lipoplexos nas células HepG2, sendo esse aumento parcialmente inibido pela presença de galactose. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que estes lipoplexos, preparados com lipossomas catiónicos de EPOPC:Colesterol e asialofetuina, constituem um novo sistema de transporte e entrega de material genético que poderá ser de grande importância para o desenvolvimento de novas estratégias antitumorais contra o HCC. Hepatocellular carcinoma (HCC) is originated in the main liver cells, the hepatocytes, being considered the primary cancer of this organ. Hepatocellular carcinoma is the third largest cause of cancer mortality worldwide. Currently, the primary HCC treatment options consist in tumor surgical recession, liver transplantation and chemotherapy. However, all these treatment options present multiple limitations. Therefore, there is an urgent need to develop new antitumor strategies, targeting HCC and presenting high efficiency. In the last years, gene therapy has significantly contributed to the development of promising antitumor strategies. However, its clinical application is still limited, mainly due to the reduced efficiency of genetic material delivery into target cells. Therefore, the application of gene therapy is largely dependent on the development of efficient gene delivery systems. On the other hand, HCC is characterized by the overexpression of the asialoglycoprotein receptor (ASGP-R), which is exclusively expressed in the liver. Asialofetuin is a ligand that specifically binds to this receptor. Regarding this, the use of this ligand in gene delivery systems may allow an efficient and targeted release of nucleic acids in the HCC. The main goal of this work consisted in the development of a new gene delivery system, specific for hepatocellular carcinoma cells, based on cationic liposomes, composed by 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (EPOPC) and cholesterol, and asialofetuin. The results obtained in transfection studies, performed in the hepatocellular carcinoma cell line HepG2, showed that the association of asialofetuin to lipoplexes promotes a significant increase in their biological activity, this being particularly evident for the lipoplex formulations EPOPC:Cholesterol/DNA, at the 2/1 (+/-) charge ratio, containing 10μg of asialofetuina/μg DNA, and EPOPC:Cholesterol/DNA, at the 4/1 (+/-) charge ratio, containing 20μg of asialofetuina/μg DNA. This substantial enhancement in the biological activity of the lipoplexes, induced by the association of asialofetuin, was observed not only by the increase of the transgene expression (luciferase expression quantification) but also through the enhancement of the percentage of transfected cells (quantification of cells expressing the green fluorescent protein). The results also showed that, in HepG2 cells, the biological activity of these complexes prepared with asialofetuin was higher than that obtained with other formulations known for presenting high biological activity in different cell lines. Regarding the assay on the protection of genetic material, it was observed that the association of asialofetuin to lipoplexes results in a lower access of ethidium bromide to DNA of the complexes, providing an evidence of its higher protection. In the presence of galactose, which competes with the asialofetuin for the binding to the ASGP receptor, it was observed a significant decrease in the biological activity of the lipoplexes containing asialofetuin. This reduction was not observed for the other complexes formulations. The results obtained in the binding and cell association studies showed that the presence of asialofetuina induces an increase in the binding and internalisation of the lipoplexes in HepG2 cells, this increase being partially inhibited by the presence of galactose. The results obtained in this study show that these lipolexes, prepared with EPOPC:Cholesterol cationic liposomes and asialofetuin, constitute a new gene delivery system that may be of great importance for the development of novel antitumor strategies against HCC.