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O hidromel é uma bebida tradicional, com 8 a 18% (v/v) em etanol, obtida da fermentação alcoólica de mel diluído em água na presença de leveduras. A produção de mel é uma atividade económica importante em várias regiões de Portugal devendo o desenvolvimento de novos produtos à base de mel, como o hidromel, ser incentivado. Contudo, a produção de hidromel é demorada dependendo do tipo de mel, da estirpe de levedura e da composição do mosto. Assim, um dos principais objetivos dos produtores de hidromel é reduzir o tempo de fermentação, sem diminuir a qualidade do produto final. Numa perspetiva de valorização do mel a partir da produção de hidromel o objectivo principal deste trabalho foi desenvolver e optimizar o processo de produção desta bebida. Para tal, utilizou-­‐se mel escuro e duas estirpes comerciais de levedura Saccharomyces cerevisiae, usadas em enologia. Para optimizar a produção de hidromel inicialmente selecionamos a melhor formulação de mosto-­‐mel, em que foram efectuadas experiências com a adição de sais, vitaminas e vitaminas e sais à formulação base. De seguida, a formulação com melhores resultados foi utilizada para selecionar a melhor concentração de inóculo para a produção de hidromel. Das cinco concentrações testadas, foi escolhida uma concentração celular para comparar o desempenho fermentativo das leveduras sob a forma de células livres e imobilizadas (em camada simples e camada dupla), em sistema descontínuo. As fermentações foram monitorizadas diariamente para estudar o efeito dos parâmetros testados no crescimento das leveduras e no perfil fermentativo. No final das fermentações a qualidade do hidromel produzido foi avaliada por parâmetros enológicos e os compostos voláteis produzidos foram identificados e quantificados por GC. Com este trabalho foi possível obter resultados que permitem a optimização da produção de hidromel. No entanto, uma avaliação sensorial complementar da bebida forneceria informações úteis para os produtores.

Mead is a traditional drink, containing 8-18% (v/v) of ethanol, which results from the alcoholic fermentation of diluted honey performed by yeasts. It has been reported that mead fermentation is a time-consuming process, often taking several months to complete, depending on the type of honey, yeast strain and honey-must’s composition. An important objective of mead makers is to reduce the fermentation time without decreasing the quality of the end product. It has been shown that significant time can be saved in the fermentation process by increasing the pitching rate, i.e., the amount of suspended yeast cells added to a batch fermenter. Therefore, the aim of this study was to determine the adequate inoculum size of two commercial winemaking strains of Saccharomyces cerevisiae (Lalvin QA23 and Lalvin ICV D47) for the optimisation of mead fermentation. Honey must was prepared according to the recipe developed by our team, supplemented with potassium tartrate, pH adjusted to 3.7 with malic acid and the nitrogen concentration adjusted to 267 mg/L with diammonium phosphate. The appropriate amounts of inoculum were pitched into the honey-must to obtain five different pitching rates. Several parameters were determined during the fermentation to evaluate the effect of the inoculum size on yeast growth, fermentation profile and mead composition. Minor differences between the two strains in respect to growth kinetics were detected. As expected the increasing of the inoculum size resulted in significant increases in cell biomass and CFUs’ numbers but also decreased the yeast net growth. The time required to reach the same stage of fermentation ranged from 24 to 96 hours depending on the inoculum size. In accordance to the results obtained the strain ICV D47 appears to be more suitable for the production of high quality meads, although the strain QA23 provided better fermentation profile. However, sugars were not fully consumed and about 25 mg/L of assimilable nitrogen remained at the end of all fermentations. This is the first study of the effect of inoculum size on the optimisation of mead fermentation, however further research is needed to improve its quality.

Mead is a traditional drink, containing X-1 X% (v/v) of ethanol, which results from the alcoholic fermentation of diluted honey performed by yeasts. However, when it is produced in a homemade way mead producers find several problems, namely, the lack of uniformity in the final products low or premature fermentations arrest, and the production of "off-flavours" by the yeasts. These problems could be due to several factors, including lack of essential nutrients such as a deficiency in available nitrogen. Additionally , it has been reported that mead fermentation is a time-consuming process, often taking several months to complete. depending on the type of honey, yeast strain anti honey-must composition. Since mead production is a time-consuming process. to make its production viable it is necessary to reduce the fermentation time while producing an end product of quality. Thus. the aim of this study was to evaluate I he effect of nitrogen addition 10 honey-must on two active dry wine yeasts (ADWY) fermentation performance, as well as on the mead composition and volatile aroma compounds production.

[Excerto] Acidez volátil (AV) é o conjunto de ácidos gordos da série acética que se encontram no vinho, quer no estado livre quer no estado salificado, cujo limite legal é de 1,2 g/L, expressa em ácido acético (3). O ácido acético pode aparecer nos vinhos por actividade das leveduras durante a fermentação alcoólica e por actividade metabólica das bactérias do ácido láctico e bactérias do ácido acético. A presença de ácido acético nos vinhos tem sido sugerida como uma das causas envolvidas no amuo de fermentações vinárias (1). Por outro lado, mesmo noutras situações em que não ocorrem paragens de fermentação podem obter-se vinhos com concentrações de ácido acético que excedem os limites legais. Tal facto torna o vinho impróprio para consumo e traduz-se em prejuízos económicos para o produtor que, em face desta situação, recorre à solução mais frequentemente utilizada e que consiste na destilação do vinho. Neste contexto a remoção de ácido acético de mostos ou vinhos é um aspecto relevante para a indústria vinícola. [...]

Dissertação de Doutoramento em Microbiologia Esta dissertação insere-se no âmbito do tema complexo da selecção de culturas bacterianas ‘starters’ para a realização da fermentação malolática (FML). Neste contexto, o trabalho realizado consistiu na caracterização fenética e funcional de uma colecção de bactérias do ácido láctico (BAL) isoladas de vinhos tintos da Região Demarcada do Douro (RDD), que sofreram a FML espontânea, com o objectivo de seleccionar estirpes autóctones que pudessem ser usadas como ‘starters’ melhor adaptadas ao processo de vinificação. Numa abordagem polifásica, e de acordo com uma estratégia de agrupamento e selecção sequencial de estirpes, foram aplicados métodos fenotípicos e moleculares para avaliação da diversidade fenética da colecção de BAL e para caracterização de um subconjunto de isolados, representativo desta diversidade e com perfil de actividades enzimáticas de interesse enológico. No decorrer deste trabalho foi isolada uma colecção de 793 BAL a partir de 193 amostras de vinho tinto recolhidas em 18 adegas da RDD, em três vindimas consecutivas (1999-2001). Oenococcus foi o género dominante, com 90,6% dos isolados pertencentes a este género, 6,2% pertencentes ao género Lactobacillus e 3,2% a Pediococcus. Para redução do número de isolados em estudo foi seleccionada, de forma aleatória, uma amostra de 295 isolados, representativa da colecção original. Na caracterização fenética destes isolados foram aplicados métodos quimiotaxonómicos e moleculares de tipificação (análise de perfis de proteínas celulares totais e M13-PCR ‘fingerprinting’), para a definição de ‘clusters’ a níveis de semelhança elevados e selecção de estirpes representativas da diversidade subjacente. Em resultado da análise dos perfis de proteínas celulares totais foram seleccionados 227 isolados para tipificação genómica por M13-PCR ‘fingerprinting’. De acordo com a análise dos perfis de ‘fingerprinting’ destes isolados foi possível seleccionar 96 estirpes representantes da diversidade fenética da colecção para identificação a nível de espécie por análise de rDNA 16S. A análise dos perfis de 16S-ARDRA destas estirpes permitiu a identificação de 17 restritipos e a selecção de representantes para sequenciação de rDNA 16S. A identificação a nível de espécie foi realizada por comparação das sequências parciais obtidas com as disponíveis em bases de dados e por análise integrada com os resultados de 16S-ARDRA. Os 295 isolados de BAL foram identificados nas seguintes espécies: Oenococcus oeni (227); Leuconostoc mesenteroides (2); Lactobacillus mali (19); Lactobacillus brevis (11); Lactobacillus plantarum/paraplantarum (6); Lactobacillus vaccinostercus (3); Lactobacillus casei/paracasei/zeae (2); Lactobacillus hilgardii (1); e Pediococcus parvulus (24). A diversidade fenética da colecção de BAL em estudo foi estimada pela aplicação de índices de diversidade que, globalmente, apontaram para a existência de uma diversidade elevada deestirpes de BAL associadas ao processo de produção de vinhos tintos com FML espontânea na RDD, em particular para a espécie Oenococcus oeni. Para a caracterização funcional da diversidade subjacente foram estudadas actividades enzimáticas com relevância enológica, tendo sido efectuado o ‘screening’ da colecção de 295 isolados de BAL para a presença da enzima maloláctica, de ß-glucosidases, das enzimas da via de degradação da arginina, da descarboxilase de tirosina e da descarboxilase de histidina. Com base na análise integrada dos dados provenientes deste ‘screening’ fenotípico e da caracterização fenética dos isolados, seleccionou-se um conjunto de 81 estirpes com características enológicas desejáveis (mle+, ß-glu+, arg-, tdc-, hdc-) representantes da diversidade de cada espécie presente na colecção de BAL em estudo. Para este subconjunto de estirpes procedeu-se à detecção por PCR dos genes associados para confirmação dos resultados do ‘screening’ fenotípico. Para avaliar o comportamento funcional das estirpes seleccionadas pelos ‘screenings’ fenotípico e genotípico, caracterizou-se o seu crescimento em vinho e meios de cultura. As 63 estirpes caracterizadas nestes ensaios foram agrupadas em 6 ‘clusters’ distintos e, ainda que se tenham observado diferenças na distribuição das estirpes de cada sub-região, não se detectou qualquer associação significativa, indicando assim que a diversidade fisiológica das estirpes de BAL responsáveis pela FML espontânea não parece evidenciar qualquer padrão geográfico a nível interno da RDD. Paralelamente, efectuou-se uma caracterização das 41 estirpes de O. oeni, por análise de macrorestrição, para definição do grupo genómico respectivo. Estas estirpes foram agrupadas de acordo com 13 grupos genómicos distintos, tendo o grupo genómico prevalente sido detectado nas três sub-regiões da RDD. De acordo com o objectivo principal desta dissertação, e na sequência da estratégia adoptada, procedeu-se à selecção do subconjunto final de estirpes de O. oeni da RDD que, sendo representativas desta região de produção, possam constituir uma “carteira” de ‘starters’ regionais para FML controlada. Apesar de não ter sido possível caracterizar o comportamento das 17 estirpes seleccionadas em ensaios de transcrição em vinho e meios de cultura, os resultados apresentados, ainda que obtidos a partir de ensaios preliminares, revelam a importância da realização destes estudos na avaliação do comportamento transcricional de genes que codificam para enzimas com relevância enológica. Esta avaliação deverá ser considerada como critério na selecção de estirpes para culturas ‘starter’. This thesis arises in the scope of the complex subject of the selection of bacterial starter cultures for the accomplishment of malolactic fermentation (MLF). Under the main goal of selecting autochthone strains better adapted to the winemaking process, the work involved the phenetic and functional characterization of a collection of lactic acid bacteria (LAB) isolated from red wines of the Demarcated Region of Douro (RDD), which had undergone spontaneous MLF. Following a narrow-down strategy of grouping and sequential selection of strains in a poliphasic approach, phenotypic and molecular methods were applied both to evaluate the phenetic diversity of the BAL collection and to characterize a subgroup of strains, representative of this diversity and with a profile of enzymatic activities oenologically relevant. In the course of this work, a collection of 793 BAL was isolated from 193 samples of red wine collected in 18 wineries of the RDD, in three consecutive vintages (1999-2001). Oenococcus was the dominant genus (90.6%), followed by Lactobacillus (6.2%) and Pediococcus (3.2%). To decrease the number of isolates under in study, 295 isolates were selected as a representative sample. A phenetic characterization of these 295 isolates, based on chemotaxonomic and molecular methods of strain typing (whole-cell protein profiling and M13-PCR fingerprinting), was applied for clustering and selection of a set of strains representative of the underlying diversity. Analysis of the whole-cell protein profiles allowed the selection of 227 isolates for genomic typing by M13-PCR fingerprinting. According to the M13-PCR fingerprinting results, 96 strains representative of the phenetic diversity of the BAL collection were selected for identification at species level. The analysis of 16S-ARDRA profiles for these strains allowed the identification of 17 restritypes and the selection of representatives strains for 16S rDNA sequencing. The identification at the species level was performed by comparison of the obtained partial sequences with those available in public databases and by integrated analysis with 16S-ARDRA results. The 295 BAL isolates were identified as belonging to the following species: Oenococcus oeni (227); Leuconostoc mesenteroides (2); Lactobacillus mali (19); Lactobacillus brevis (11); Lactobacillus plantarum/paraplantarum (6); Lactobacillus vaccinostercus (3); Lactobacillus casei/paracasei/zeae (2); Lactobacillus hilgardii (1); and Pediococcus parvulus (24). The evaluation of the phenetic diversity of the BAL collection under study was performed with diversity indexes, that globally pointed to the existence of a high diversity of BAL strains associated with spontaneous MLF of red wines in RDD, in particular for the species Oenococcus oeni. For the functional characterization of the underlying diversity, the collection of 295 BAL was screened for enzymatic activities with oenological relevance: the presence of malolactic enzyme, β-glucosidases, enzymes involved in arginine degradation pathway, tyrosine decarboxylase and histidine decarboxylase. The integrated analysis of the data from this phenotypic screening and previous phenetic characterization allowed the selection of a set of 81 strains with desirable oenological characteristics (mle+, β-glu+, arg-, tdc-, hdc-), representative of the intra-specific diversity of the BAL collection. Confirmation of phenotypic screening results was performed for this subset of strains, through PCR detection of genes associated with the targeted phenotypes. The functional behavior of the strains selected by both phenotypic and genotypic screenings was evaluated by growth in wine and culture media. The 63 strains characterized in these assays were grouped in 6 distinct clusters and, although differences in strain distribution have been observed, they did not correlate with sub-regions. This fact indicates that the physiological diversity of BAL strains responsible for the spontaneous FML does not seem to follow any geographic pattern at an internal level in RDD. In parallel, the genomic groups of 41 O. oeni strains were assessed by macrorestriction analysis. These strains were grouped in 13 different genomic groups, and the most prevalent group was detected in the three sub-regions of RDD. In accordance with the main goal of this thesis, and in sequence with the adopted strategy, a group of O. oeni strains from RDD was selected as representative of this region of production to constitute a "regional wallet" of starters for controlled FML. Although it has not been possible to characterize the behavior of the 17 selected strains in transcription assays in wine and culture media, the results presented, though obtained in preliminary assays, disclose the importance of the accomplishment of these studies in the evaluation of the transcriptional behavior of genes that codify for enzymes with oenological relevance. This evaluation should be considered as an additional criterion in the selection of strains for starter cultures.

Tese de Doutoramento em Ciências Químicas e Biológicas O hidromel é uma bebida tradicional que contém 8% a 18% (v/v) de etanol e resulta da fermentação alcoólica de mel diluído, realizada por leveduras. Como o mel é uma matriz com uma baixa concentração de nutrientes e outras condições desfavoráveis de crescimento, normalmente são vários os problemas encontrados na produção de hidromel, nomeadamente, paragens ou amuos de fermentação, parâmetros insatisfatórios de qualidade, bem como propriedades sensoriais desagradáveis. Além disso, a fermentação do hidromel é um processo moroso e a qualidade do produto final é muito variável. Neste contexto, o objectivo global deste projecto de doutoramento foi a optimização do crescimento e desempenho fermentativo da levedura para conduzir à maximização da qualidade do hidromel. Para atingir esta finalidade foram seleccionadas duas estirpes da levedura Saccharomyces cerevisiae, QA23 e ICV D47, para realizar vários ensaios de fermentação. Inicialmente, para melhorar a fermentação do hidromel, avaliou-se o potencial do enriquecimento nutritivo do mosto-mel. O mosto foi suplementado com sais, vitaminas ou uma mistura de ambos, embora essas adições não tenham tido efeitos positivos no crescimento de leveduras, no perfil de fermentação ou nas características do hidromel. Na tentativa de optimizar o processo fermentativo, outras estratégias foram testadas, incluindo a utilização de elevadas densidades celulares ou a imobilização das células. O aumento da quantidade de inóculo resultou numa redução do tempo de fermentação, embora não se tenham verificado efeitos positivos adicionais no crescimento das leveduras. Com a menor quantidade de inóculo, detectaram-se pequenas diferenças na cinética de crescimento entre as duas estirpes. Para avaliar a concentração de alginato mais eficaz para a imobilização, as duas estirpes de levedura foram encapsuladas em esferas com 2 ou 4% (p/v) de alginato, embora nenhuma das concentrações tenha sido capaz de evitar a saída das células das esferas para o meio. Assim, a imobilização das células de levedura em camada simples de Ca-alginato ou em camada dupla de alginato-quitosano foi aplicada na produção de hidromel. A imobilização não teve qualquer efeito adverso na viabilidade celular, uma vez que foram observadas diferenças mínimas na cinética de fermentação entre as fermentações conduzidas com células livres ou encapsuladas. Além disso, a imobilização em camada dupla de alginato-quitosano não apresentou nenhuma vantagem comparativamente com a camada simples de Ca-alginato, uma vez que o número de células livres no meio, resultante da saída das células das esferas, foi semelhante. Adicionalmente aos estudos de cinética de crescimento das leveduras e de desempenho fermentativo, pesquisaram-se, em todas as fermentações, tanto a produção de compostos voláteis aromáticos como as características físico-químicas dos hidroméis. No final da fermentação alcoólica procedeu-se à identificação e quantificação dos compostos voláteis dos hidroméis por GC-FID e GC-MS. Os resultados obtidos mostraram que a composição aromática final do hidromel dependeu da concentração do inóculo: a formação de compostos voláteis em concentrações acima dos seus limites de detecção foi particularmente pronunciada com concentrações baixas de inóculo. As células imobilizadas produziram hidroméis com concentrações mais elevadas de compostos com características frutadas e de compostos indesejáveis. Os ésteres, acetato de isoamilo, octanoato de etilo e hexanoato de etilo e o acetaldeído foram os principais odorantes encontrados em todos os hidroméis, embora as concentrações tenham variado de acordo com a concentração do inóculo e a imobilização das células. Em geral, a qualidade enológica de hidroméis, excepto a acidez volátil, não foi influenciada pela concentração do inóculo ou imobilização. O hidromel obtido com células de levedura imobilizadas ou com maiores concentrações de inóculo apresentou mais ácido acético. Finalmente, as fermentações foram realizadas em volumes mais elevados para avaliar uma possível correlação entre a formação dos compostos aromáticos e os atributos sensoriais do hidromel. A formação dos compostos de aromáticos mais agradáveis foi detectada no hidromel fermentado por células de levedura não imobilizadas. A análise sensorial também corroborou esta observação, revelando que os descritores de aroma mais agradáveis estavam correlacionados com o hidromel obtido com células de levedura livres, independentemente da estirpe. Resumindo, as condições que melhoraram os desempenhos fermentativo e de crescimento não resultaram, necessariamente, em hidromel de alta qualidade. Mead is a traditional drink that contains 8 % to 18 % (v/v) of ethanol, resulting from the alcoholic fermentation of diluted honey by yeasts. Honey is a matrix with a low nutrient concentration and other unfavourable growth conditions, so several problems are usually encountered in mead production, namely delayed or arrested fermentations, unsatisfactory quality parameters, as well as unpleasant sensory properties. Also, mead fermentation is a time-consuming process and the quality of the final product is highly variable. In this context, the global objective of this PhD research project was the optimization of growth and fermentative performance of yeast leading to the maximization of mead quality. To achieve this purpose, two wine yeast strains of Saccharomyces cerevisiae, QA23 and ICV D47 were selected to conduct several fermentation trials. Initially, it was evaluated the potential of the nutritive enrichment of honey-must to improve mead fermentation. The must was supplemented with salts, vitamins or a mixture of both, although those additions had no positive effects on yeast growth, fermentation profile or on the characteristics of the mead. In this line further strategies have been tested in an attempt to optimize the fermentative process, including the use of high cell density or cell immobilization. The increasing of inoculum size resulted in a reduction of fermentation length, although no additional positive effects where verified in yeasts net growth. At the lowest innoculum size, minor differences were detected in the growth kinetics between the two strains. In order to assess the most effective alginate concentration for immobilization, the two yeast strains were entrapped in 2 or 4% (w/v) alginate beads, although neither of the concentrations was able to prevent the cell leakage from the beads. So, the immobilization of yeast cells on single-layer Ca-alginate or double-layer alginate-chitosan was applied to mead production. Immobilization had no adverse effect on cell viability, since minor differences were found on fermentation kinetics between fermentations conducted with free or encapsulated cells. Also, the double-layer alginate-chitosan had no advantage compared with the single-layer Ca-alginate, as the number of free cells in the medium, resulting from cell leakage, was similar. In addition to the studies of yeast growth kinetics and fermentative performance, all fermentations have also been screened for the production of aroma volatile compounds and for the physicochemical characteristics of meads. Identification and quantification of volatile compounds was performed by GC-FID and GC-MS in all meads at the end of alcoholic fermentation. The results obtained showed that mead final aroma composition was dependent on the inoculum size: the formation of the volatile compounds in concentrations above their detection thresholds was particularly pronounced at low inoculum sizes. Immobilized cells produced meads with higher concentrations of compounds with fruity characteristics and of undesirable compounds. The esters isoamyl acetate, ethyl octanoate and ethyl hexanoate and acetaldehyde were the major powerful odorants found in all mead, although their concentrations varied according to the inoculum size and cell immobilization. In general, the oenological quality of meads was not influenced by the inoculum size or immobilizations, except for the volatile acidity. Mead obtained with entrapped yeast cells or with higher inoculum size presented more acetic acid. Finally, fermentations were conducted in higher volumes to evaluate a possible correlation between aroma compound formation and the sensory attributes of mead. The most pleasant aroma compounds formation was detected in mead fermented by non-immobilized yeast cells. Sensory analysis corroborates this observation, revealing that the most pleasant aroma descriptors were correlated with mead obtained with yeast free cells, independently of the strain. In sum, the conditions that improved the fermentation and growth performance were not necessarily associated with high quality mead. O presente trabalho beneficiou do apoio financeiro da Fundação para a Ciência e Tecnologia, Bolsa de Doutoramento: SFRH/BD/44265/2008, financiada pelo programa do QREN-POPHFormação Avançada para a Ciência, comparticipado pelo Fundo Social Europeu (FSE) e por fundos nacionais do Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES). Este trabalho foi financiado por Fundos Nacionais através da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia no âmbito do projecto PTDC/AGR-ALI/ 68284/2006 “Optimização das condições de produção de hidromel” e pelo projeto ENOEXEL – FROM VINEYARD TO WINE: TARGETING GRAPE AND WINE EXCELLENCY – NORTE-07-0124-FEDER- 000032 financiado pelo Programa Operacional Regional do Norte (ON.2 – O Novo Norte), ao abrigo do Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER).