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Metachromatic leukodystrophy (MLD) is an autosomal recessive lysosomal disorder caused by deficiency of arylsulfatase A (ARSA), leading to an accumulation of sulfatides. Sulfatides have been quantified in urine, dried blood spots (DBS), and tissues of patients with MLD. Newborn screening (NBS) for MLD has already been proposed based on a two-tier approach with the quantification of sulfatides in DBS followed by the quantification of ARSA by liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS). Prenatal screening for MLD is also crucial, and sulfatide quantification in amniotic fluid (AF) can aid diagnosis. The prenatal study was initiated due to a family history of MLD at 19 weeks of gestation. ARSA was quantified in cultured amniocytes. C16:0 sulfatide was quantified by LC-MS/MS in the supernatant of AF. Molecular analysis of the ARSA gene was performed in cultured amniocytes. ARSA was deficient in fetal cells, and C16:0 sulfatides were significantly elevated in comparison to age-matched controls (3-fold higher). Genetic studies identified the c.465+1G>A variant in homozygosis in the ARSA gene. Our study shows that sulfatides can be quantified in the supernatant of AF of MLD fetuses, and it could potentially aid in a faster and more accurate diagnosis of MLD patients.

Mucopolysaccharidosis IVA (MPS IVA, Morquio A syndrome) is a rare autosomal recessive lysosomal storage disorder caused by mutations in the N-acetylgalactosamine-6-sulfatase (GALNS) gene. We collected, analyzed, and uniformly summarized all published GALNS gene variants, thus updating the previous mutation review (published in 2014). In addition, new variants were communicated by seven reference laboratories in Europe, the Middle East, Latin America, Asia, and the United States. All data were analyzed to determine common alleles, geographic distribution, level of homozygosity, and genotype-phenotype correlation. Moreover, variants were classified according to their pathogenicity as suggested by ACMG. Including those previously published, we assembled 446 unique variants, among which 68 were novel, from 1190 subjects (including newborn screening positive subjects). Variants' distribution was missense (65.0%), followed by nonsense (8.1%), splicing (7.2%), small frameshift deletions(del)/insertions(ins) (7.0%), intronic (4.0%), and large del/ins and complex rearrangements (3.8%). Half (50.4%) of the subjects were homozygous, 37.1% were compound heterozygous, and 10.7% had only one variant detected. The novel variants underwent in silico analysis to evaluate their pathogenicity. All variants were submitted to ClinVar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/) to make them publicly available. Mutation updates are essential for the correct molecular diagnoses, genetic counseling, prenatal and preimplantation diagnosis, and disease management.

Introdução:Mucopolissacaridose tipo II é uma doença lisossômica causada pela deficiência da enzima idounato-2-sulfatase. A incidência de MPS II é muito baixa, geralmente menos de 1 caso para cada 1.000.000 recém-nascidos. Até o presente momento, cerca de 340 mutações foram identificadas no gene da idorunatosulfatase. Objetivo: O presente trabalho teve como objetivo principal identificar as alterações moleculares presentes em 149 pacientes brasileiros e sul americanos com diagnóstico bioquímico de MPS II. Métodos: Após a realização do protocolo inicial proposto e que incluía o sequenciamento completo do gene IDS, alguns pacientes não apresentaram alterações e foram incluídos num protocolo adicional para casos “especais”. Resultados: Uma deleção de 178pb foi encontrada na região promotora do gene, em 2 pacientes que não apresentaram alterações em região codificante, bem como outros 2 pacientes apresentaram um polimorfismo na mesma região, que nunca havia sido relatado em pacientes com MPS II. A detecção de uma deleção em 3 pacientes através da técnica de PCR convencional,exon por exon, nos mostrou que a deleção se estendia da região proximal do gene IDS até a região dos genes FRAXA e FRAXE, contudo análises adicionais, através de SNP-array, confirmaram a deleção restrita a estas regiões em 2 pacientes e identificaram a deleção total retrita ao gene IDS em outro. Após a análise de 105 pacientes com MPS II, 30 novas mutações foram encontradas o que demonstra uma grande heterogeneidade genica. Conclusão: Tais análises são importantes para elucidar o defeito básico e assim poder identificar portadoras nas famílias, o que tem uma importância fundamental para o aconselhamento genético, diagnóstico pré-natal e prevenção de novos casos. Adicionalmente, a informação sobre o defeito genéticomolecular é muito importante para a predição do fenótipo e consequentemente para a definição da melhor estratégia de tratamento. Background: Mucopolysaccharidosis type II is a lysosomal disease caused by deficiency of the enzyme idounate-2-sulfatase. The incidence of MPS II is very low, usually less than 1 case per 1 million newborns. To date, about 340 mutations have been identified in the IDS gene. Objective: This study aimed to identify the molecular alterations present in 149 Brazilian and South American patients with biochemical diagnosis of MPS II. Methods: After molecular analysis using the initial protocol proposed, wich included complete sequencing of the IDS gene, someof the patients showed no DNA alterations of the gene coding region and were included an additional protocol for “special” cases. Results: A deletion of 178pb was found in the promoter region of the gene in two patients. An other 2 patients had a polymorphism in the same region, which had never been reported in patients with MPS II. A deletion was observed in 3 patients by conventional PCR, exon by exon, which extended from the proximal IDS gene until the fagile sites FRAXA and FRAXE. Additional analyzes using SNP-array confirmed the deletion of those regions in two patients and have identified the full deletion restricted to IDS in another. After analysis of 105 patients with MPS II, 30 new mutations were found which shows a broad genomic heterogeneity. Conclusion: Such analyzes are important to elucidate the basic defect and thus enable to identify carriers in families, which is of fundamental importance for genetic counseling, prenatal diagnosis and prevention of new cases. In addition, information about the molecular genetic defect is very important for the prediction of phenotype and thus for defining the best tstrategy for treatment.

Introdução: As mucopolissacaridoses são um grupo de 11 doenças lisossômicas causadas por defeitos enzimáticos específicos relacionados com o catabolismo dos glicosaminoglicanos, que se acumulam e podem ser identificados como biomarcadores dessas doenças. Apresentam quadro multissistêmico e progressivo, podendo haver envolvimento cognitivo. Todas elas têm padrão de herança autossômico recessivo, exceto a MPS tipo II, que é ligada ao X recessiva. O tratamento das MPS inclui medidas de suporte e reabilitação, além de tratamentos específicos disponíveis para alguns dos tipos, como o transplante de células tronco hematopoiéticas e a terapia de reposição enzimática intravenosa. A prevalência para cada uma delas varia conforme o país estudado, sendo que a MPS II, ao contrário do que acontece na maioria dos países da América do Norte e da Europa, é o tipo mais comum no Brasil. Objetivos: Investigarfatores que possam explicar a maior frequência relativa de MPS II no Brasil; verificar se a alta frequência relativa de MPS II tem maior predominância em alguma região brasileira; avaliar a variabilidade fenotípica intra-familiar em pacientes com MPS II; avaliar o tempo de atraso no diagnóstico dessa patologia no Brasil. Métodos: O estudo foi realizado com dados de pacientes diagnosticados com MPS pelo Serviço de Genética Médica do HCPA e pela Rede MPS Brasil entre 1982 e 2020. Nós calculamos a incidência das MPS no Brasil, por região e estados da federação a partir dos dados da nossa amostra e de informações do Sistema de Informações sobre Nascidos Vivos do sistema de saúde brasileiro. Para a MPS II, estudamos o perfil molecular dos pacientes e de suas mães. Também revisamos dados clínicos registrados em prontuários e relacionamos o fenótipo neuronopático e não-neuronopático da MPS II com as variantes encontradas nesses pacientes. Resultados: No Brasil, a prevalência da MPS ao nascimento (para cada 100.000 nascidos vivos) entre 1994 e 2018 foi de 1,57 e foi maior para a MPS II nas regiões centro-oeste, norte, sudeste e sul. Na região nordeste, a MPS VI foi o tipo mais comum. Estudando o perfil molecular de 280 pacientes de 206 famílias com MPS II, observamos que mutações de ponto foram encontradas em 70% dos casos, sendo as variantes patogênicas do tipo missense as mais comumente detectadas no gene IDS. Considerando as formas neuronopática e não-neuronopática da MPS II, houve concordância do fenótipo entre os familiares afetados, exceto entre dois meio-irmãos. As mães dos pacientes com MPS II foram portadoras da variante considerada patogênica no gene IDS em 82% dos casos. Considerando os dados clínicos, a mediana do atraso ao diagnóstico para as MPS em geral foi de 40 (15,25 – 84) meses e não houve diferença na idade ao diagnóstico entre o primeiro caso e os demais casos de MPS diagnosticados em uma mesma família. Para pacientes com MPS II, a forma neuronopática foi diagnosticada mais cedo do que a forma não-neuronopática. Consanguinidade parental foi detectada em 4,1% dos casos de MPS II e em 35,1% dos casos com as formas autossômicas recessivas, sendo mais encontrada no Ceará, Distrito Federal e Paraíba e com a região nordeste mostrando uma tendência à maior consanguinidade. Conclusão: Na ausência de uma variante patogênica que contribua particularmente para a sua alta frequência, o maior número de afetados nas famílias com MPS II, associada à baixa taxa de consanguinidade na população em geral, podem ser fatores responsáveis pela maior proporção relativa de MPS II no Brasil, para a qual parece contribuir a falta de um aconselhamento genético eficiente. Introduction: Mucopolysaccharidoses are a group of 11 lysosomal diseases caused by specif enzymatic defects related to the catabolism of glycosaminoglycans, which accumulate and can be indentified as biomarkers. They present as multisystemic and progressive diseases, and there may be cognitive involvement. All of them are inherited as an autosomal recessive trait, except for MPS type II, which is X-linked recessive. Treatment for MPS includes supportive and rehabilitative measures, as well as specific treatments availaible for some types, such as hematopoietic stem cell transplantation and intravenous enzyme replacement therapy. Their prevalence varies according to the country studied and, unlike what happens in most American and European countries, MPS II is the most common in Brazil. Objectives: To investigate factors that may explain the higher relative frequency of MPS II in Brazil; verify whether the high relative frequency of MPS II is related to any Brazilian region; to assess intra-familial phenotypic variability in patients with MPS II; to assess the delay in diagnosis for MPS in Brazil. Methods: The study was carried out with data from patients diagnosed with MPS from the Medical Genetics Service of Hospital de Clínicas de Porto Alegre and the MPS Brazil Network between 1982 and 2020. We calculated the incidence of MPS in Brazil, per region and federation states using data from our sample and from the Information System on Live Births of the Brazilian Health System. For MPS II, we studied the molecular profile of patients and their mothers. We also reviewed clinical data from medical records and related the neuronopathic and the nonneuronopathic MPS II phenotype with the variants found in the patients. Results: In Brazil, the birth prevalence of MPS (per 100,000 live births) between 1994 and 2018 was 1.57 and it was higher for MPS II on the Midle-West, North, Southeast, and South regions. In the Northeast region, the MPS VI was the most common type. Molecular profile of 280 patients from 206 families with MPS II showed that point mutations were found in 70% of the cases, with pathogenic missense variants being the most commonly detected in the IDS gene. Considering the neuronopathic and non-neuronopathic forms of MPS II, affected family members had concordant phenotype, except between two half-siblings. The mothers of patients with MPS II were carriers of the variant considered pathogenic in the IDS gene in 82% of the cases. Considering the clinical data, the median delay in diagnosis for MPS in general was 40 (15.25 – 84) months and there was no difference in the age at diagnosis between the first case and further MPS cases diagnosed in the same family. For patients with MPS II, the neuronopathic form was diagnosed earlier than the non-neuronopathic form. Parental consanguinity was detected in 4.1% in MPS II cases and in 35.1% of the autossomal recessive ones, being more frequent in Ceará, Distrito Federal and Paraíba, and also the Northeast region showed a trend towards consanguinity. Conclusion: In the absence of a particular pathogenic variant that explains its high relative frequency, the higher number of affected members from MPS II families, associated with the low consanguinity of the general population may be factors responsible for the higher incidence of this MPS type in Brazil, for which the lack of adequate genetic counseling seems to contribute.

Introdução: A coleta e o transporte de amostras biológicas fazem parte da fase pré- analítica do processo operacional de realização de exames laboratoriais, sendo essa uma fase crítica para as análises. O Serviço de genética Medica (SGM) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) é conhecido como um centro de referência nacional e internacional em diagnóstico laboratorial e pesquisa de diferentes doenças genéticas raras, onde são recebidas amostras de todo Brasil e diversos outros países. Devido à importância das avaliações laboratoriais e com o avanço tecnológico na área de diagnósticos verificamos a necessidade de investigação e otimização dos processos de coleta e transporte de amostras biológicas. Objetivo: O principal objetivo desse projeto foi avaliar diferentes métodos de coleta e transporte de amostras biológicas para a realização de testes diagnósticos para erros inatos do metabolismo, assim facilitando o acesso ao diagnóstico, minimizando o número de solicitações de novas amostras, bem como apoiar o desenvolvimento de pesquisas na área. Metodologia: O presente trabalho avaliou 2848 amostras biológicas encaminhadas para o Serviço de Genética Médica do HCPA por 276 instituições, de 25 estados diferentes, verificamos os dados de identificação, volume, temperatura de transporte, tempo decorrido entre a coleta e o transporte em comparação com diferentes sistemas de coleta utilizados pelos serviços associados às redes, entre si e com um sistema padrão desenvolvido pelo nosso serviço. Após uma avaliação inicial realizamos também uma intervenção com material informativo, estratégias educacionais, treinamento de profissionais sobre procedimentos adequados de coleta, remessa e transporte de amostras biológicas. Resultados: 1308 amostras foram enviadas pré-intervenção sendo que destas 254 (19%) apresentaram alguma inconformidade. Após a realização da intervenção através do uso de instruções de coleta e envio uma redução de 62% foi encontrada (119 amostras de 1540). Conclusão: Uma redução considerável no número de amostras inadequadas para uso foi obtida através do uso deste material informativo, tal redução tem considerável impacto nos exames de pesquisa e assistência do HCPA. Este projeto contribuiu para o aperfeiçoamento dos processos de coleta, armazenamento e transporte de material biológico. Protocolos como este podem vir a proporcionar a melhora na qualidade do serviço diagnóstico prestado no SGM e demais utilizadores deste. Além disto, o diagnóstico precoce de uma doença genética poderá facilitar a intervenção mais precoce, através de tratamentos que sabidamente tem um melhor resultado quanto mais cedo se iniciar. Além do mais, o impacto de um diagnóstico preciso e precoce é extremamente benéfico para o sistema de saúde, visando também fortalecer e dar continuidade ao treinamento dos profissionais de saúde e divulgação de informações especializadas. Introduction: The collection and the transport of biological samples belong to the preanalytical phase of laboratory tests, which is a critical step for the analyzes. The Medical Genetics Service (SGM) of Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) is a national and an international reference center for the diagnosis and research of rare genetic diseases, receiving samples from Brazil and several other countries. Due to the importance of laboratory evaluations and technological advances in the area, we verified the need for investigation and optimization of biological sample collection and the transport processes. Objective: The main objective of this project was to evaluate different methods for collecting and transporting biological samples to perform diagnostic tests for inborn errors of metabolism, facilitating access to diagnosis, minimizing the number of requests for new samples, as well as supporting research in the area. Methodology: This study has evaluated 2,848 samples from 276 centers from 25 Brazilian states. We have verified the sample information, the sample volume, temperature of transport, time between sample collection and shipping and we have compared the different collection systems offered by the several networks with a standardized system created by our service. After an initial evaluation prior to any intervention we have also evaluated the efficacy of this novel protocol in order to reduce the need of sample recollection by the use of an informative sheet that lead to the training of health professionals with information regarding sample collection, shipping and transportation of biological samples. Results: 1308 samples were evaluated before the educational intervention, 254 (19%) out of these had at least one nonconformity. After the use of the educational sheet that had information about sample collection and shipping there was a reduction of 11.3% in the preanalytical erros (119 samples out of 1,540). Conclusions: A substantional reduction in the number of inappropriate samples was obtained after the use of this informative material. This reduction has great impact in our health care at the HCPA. This project has contributed to aid sample collection, storage and shipping. Such educational protocols can help to improve the quality of our diagnostic procedures as well as of other services. Besides, early diagnosis of genetic disorders can aid early intervention that is well known to have greater outcomes. Furthermore, the impact of a precise early diagnosis is beneficial to our health system aiming to strengthen the training of health professionals as to spread revelant information.

Introdução: As doenças lisossômicas (DLs) são patologias genéticas que, apesar de serem classificadas como raras, acometem uma significativa porcentagem da população. Muitos fatores tornam seu diagnóstico desafiador, entre eles a variabilidade no fenótipo, com poucos sinais e sintomas clínicos específicos. O desenvolvimento de ferramentas inovadoras de investigação, destacando-se os novos métodos de sequenciamento massivo, reduziria a “odisseia diagnóstica” enfrentada pelo paciente e sua família, proporcionaria um diagnóstico mais precoce com melhor resultado no tratamento nas situações em que há terapia disponível, além de um adequado aconselhamento genético. A tecnologia de sequenciamento de nova geração (next-generation sequencing, NGS) tem claras vantagens sobre as técnicas de sequenciamento convencional, oferecendo um alto rendimento diagnóstico ao permitir definir um espectro mutacional abrangente. O NGS permite o sequenciamento de vários genes simultaneamente com custo global relativamente baixo, tornando painéis de genes uma alternativa atrativa para o screening genético. Esta abordagem é capaz de detectar, de maneira altamente específica, variantes missense, nonsense, de sítio de splicing, e pequenas indels, e algumas grandes deleções em homozigose ou hemizigose. No entanto, para que essa tecnologia seja aplicável à prática clínica, é necessária uma etapa de validação prévia para a determinação dos parâmetros críticos de análise desde o processamento da amostra até a análise e interpretação de dados. Após a validação dos métodos, será possível a avaliação da utilidade clínica de painéis NGS para diversas aplicações, incluindo seu uso como método confirmatório nos casos de triagem neonatal alterada para doenças lisossômicas. Objetivos: 1) Desenhar e validar uma estratégia baseada no NGS para a análise de 24 genes, incluídos em 3 painéis distintos de acordo com parâmetros pré definidos, e associados com 22 DLs; 2) Avaliar a qualidade e eficiência do ADN extraído de sangue impregnado em papel filtro (SIPF) para uso no NGS; 3) Avaliar a utilidade clínica do NGS para: a) diagnóstico molecular, b) diagnóstico diferencial e, c) confirmação diagnóstica de casos alterados na triagem neonatal para pelo menos 4 dessas condições (doença de Gaucher, Fabry, Pompe e Niemann-Pick tipo A/B). Metodologia: Estudo descritivo, amostragem por conveniência, incluindo pacientes com diagnóstico clínico e bioquímico das DLs estudadas. Foi utilizada a plataforma NGS Ion Torrent Personal Genome Machine (Thermo Fisher Scientific) para sequenciamento de três painéis de genes, desenhados através da ferramenta Ion AmpliseqTM Designer (Thermo Fisher Scientific). Para a validação foram incluídos pacientes com diagnóstico molecular prévio por sequenciamento de Sanger. Para a extração de ADN de SIPF, foi avaliado o método não comercial de fenol-clorofórmio. A utilidade clínica do NGS foi estabelecida através do: a) diagnóstico molecular de um grupo de pacientes com suspeita de lipofuscinose ceróide neuronal tipo 2 (CLN2) para o estabelecimento do genótipo (TPP1) associado à doença, assim como estabeleceu-se o diagnóstico molecular de outros pacientes com suspeita clínica e/ou bioquímica de algumas das DLs selecionadas, b) diagnóstico diferencial de um paciente utilizando um dos painéis NGS desenhados e, c) avaliação das amostras de recém-nascidos (obtidas em estudo paralelo) que tiveram resultados inicialmente alterados na triagem neonatal bioquímica para algumas das DLs selecionadas. Resultados: 1) Três painéis foram desenhados, cada um consistindo em dois pools de primers que amplificam as regiões codificantes e 20pb da junção exon-intron. Os painéis A, B e C têm amplitude de cobertura de 97.74, 99.6 e 98.38%, respectivamente. Nesta validação foi possível estabelecer a sensibilidade, especificidade e limitações de cada painel (Artigo 1); 2) foi estabelecida a metodologia para a extração de ADN para seu uso em vários processos moleculares downstream: PCR convencional, Real-Time PCR, PCR-RFLP, MLPA, Sequenciamento de Sanger e NGS na plataforma Ion Torrent PGMTM (Artigo 2); 3) A utilidade clínica dos painéis desenhados foi estabelecida através de: a) Genotipagem de 48 pacientes com suspeita clínica e bioquímica de CLN2 (painel C) (Artigo 4), e de 3 outros casos: 1 caso de Niemann-Pick tipo B (SMPD1) (painel B) e 2 casos de doença de Danon (LAMP2) (painel A) (Artigo 1), b) o diagnóstico diferencial foi realizado através do caso de um paciente com suspeita inicial de Niemann-Pick C que, após a análise molecular, foi diagnosticado com Niemann-Pick tipo B utilizando o painel B, (Artigo 1) c) a aplicabilidade dos painéis de genes para a confirmação diagnóstica em casos de triagem neonatal foi realizada em 2 casos com resultados alterados na triagem neonatal: um caso de Pompe (painel A) e outro de Gaucher (painel B) (Artigo 3 e Anexo I). Conclusão: A abordagem por NGS através do uso de painéis, foi capaz de identificar diferentes alterações genéticas nos genes estudados, incluindo variantes do tipo missense, nonsense, de sítio de splicing, e pequenas indels. Estes painéis oferecem uma estratégia de triagem dos 24 genes associadas às DLs selecionadas. Este trabalho foi inovador ao utilizar o NGS para a análise molecular dos genes associados às DLs no Brasil; foi desenvolvido no Laboratório de Genética e Biologia Molecular do Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, conhecido como um centro de referência em diagnóstico e pesquisa de DLs, e que atualmente tem os painéis NGS como principal ferramenta de diagnóstico molecular. Introduction: Lysosomal diseases (LDs) are genetic pathologies that, although classified as rare, affect a significant percentage of the population. Many factors make its diagnosis challenging, including variability in phenotype, with few specific clinical signs and symptoms. The development of innovative research tools, highlighting new methods of massive sequencing, would reduce the "diagnostic odyssey" faced by the patient and his family, would provide an earlier diagnosis with better treatment outcome in situations where therapy is available, in addition to adequate genetic counseling. Next-generation sequencing (NGS) technology has clear advantages over conventional sequencing techniques, offering a high diagnostic yield by enabling a comprehensive mutational spectrum to be defined. The NGS allows the sequencing of several genes simultaneously with relatively low overall cost, making gene panels an attractive alternative for genetic screening. This approach is able to detect, in a highly specific manner, missense, nonsense, splicing, and small indels variants, and some large deletions in homozygosis or hemizygosis. However, for this technology to be applicable to clinical practice, a prior validation step is required to determine the critical parameters of analysis from sample processing to data analysis and interpretation. After validation of the methods, it will be possible to evaluate the clinical usefulness of NGS panels for several applications, including their use as a confirmatory method in cases of altered neonatal screening for lysosomal diseases. Objectives: 1) To design and validate an NGS-based strategy for the analysis of 24 genes, included in 3 different panels according to pre-defined parameters, and associated with 22 LDs; 2) To evaluate the quality and efficiency of DNA extracted from dried blood spots (DBS) for its use in NGS; 3) To evaluate the clinical use of NGS for: a) molecular diagnosis, b) differential diagnosis and c) diagnostic confirmation of altered cases in neonatal screening for at least 4 of these conditions (Gaucher, Fabry, Pompe and Niemann-Pick type A / B). Methodology: Descriptive study, convenience sampling, including patients with clinical and biochemical diagnosis of selected LDs. The NGS Ion Torrent Personal Genome Machine (Thermo Fisher Scientific) platform was used for the sequencing of three gene panels, designed using the Ion Ampliseq ™ Designer tool (Thermo Fisher Scientific). For the validation, patients with previous molecular diagnosis by Sanger sequencing were included. For the extraction of DBS DNA, a non-commercial method of phenol-chloroform was evaluated. The clinical utility of NGS was established through: a) molecular diagnosis of a group of patients with suspected type 2 neuronal cercoid lipofuscinosis (CLN2) to establish the disease-associated genotype (TPP1), as well as the molecular diagnosis of other patients with clinical and / or biochemical suspicion of some of the selected LDs, b) differential diagnosis of a patient using one of the designed NGS panels, and c) evaluation of the newborn samples (obtained in a parallel study) that initially had altered results in the neonatal screening for some of the selected LDs. Results: 1) Three panels were designed, each consisting of two pools of primers that amplify the coding regions and 20pb of the exon-intron junction. Panels A, B and C have coverage range of 97.74, 99.6 and 98.38%, respectively. In this validation it was possible to establish the sensitivity, specificity and limitations of each panel (Article 1); 2) the methodology for the extraction of DNA for its use in several downstream molecular processes was established: conventional PCR, Real-Time PCR, PCR-RFLP, MLPA, Sanger Sequencing and NGS in the Ion Torrent PGMTM platform; 3) The clinical use of the panels was established through: a) Genotyping of 48 patients with clinical and biochemical CLN2 (panel C) (Article 4), and of 3 other cases: 1 case of Niemann-Pick type B ( SMPD1) (panel B) and 2 cases of Danon's disease (LAMP2) (panel A) (Article 1), b) he differential diagnosis was made through the case of a patient with initial suspicion of Niemann-Pick C who, after molecular analysis, was diagnosed with Niemann-Pick type B using panel B (Article 1), c) the applicability of the gene panels for diagnostic confirmation in cases of neonatal screening was performed in 2 cases with altered results in neonatal screening: one case of Pompe (panel A) and another case of Gaucher (panel B) (Article 3 and Annex I) . Conclusion: The NGS approach using gene panels was able to identify different genetic alterations in the genes studied, including missense, nonsense, splicing variants, and small indels. These panels offer a screening strategy for the 24 genes associated with the selected LDs. This work was innovative by using NGS for the molecular analysis of genes associated with LDs in Brazil; it was developed in the Laboratory of Genetics and Molecular Biology of the Medical Genetics Service of the Hospital de Clinicas de Porto Alegre, known as a reference center in diagnosis and research of LDs, and that currently has the NGS panels as the main tool of molecular diagnosis.