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Submitted by phemiran@stj.jus.br (phemiran@stj.jus.br) on 2022-04-11T18:57:19Z No. of bitstreams: 2 direito_digital_relacoes_freitas.pdf: 927060 bytes, checksum: f4608ffe27d6a22425fe80ac4831fa9a (MD5) license.txt: 1239 bytes, checksum: c9b4c351324448672315a00808efb725 (MD5) Approved for entry into archive by Stephanie Moira (rsmoira@stj.jus.br) on 2022-04-12T20:22:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 direito_digital_relacoes_freitas.pdf: 927060 bytes, checksum: f4608ffe27d6a22425fe80ac4831fa9a (MD5) license.txt: 1239 bytes, checksum: c9b4c351324448672315a00808efb725 (MD5) Made available in DSpace on 2022-04-12T20:22:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 direito_digital_relacoes_freitas.pdf: 927060 bytes, checksum: f4608ffe27d6a22425fe80ac4831fa9a (MD5) license.txt: 1239 bytes, checksum: c9b4c351324448672315a00808efb725 (MD5) Previous issue date: 2022

A Biomedicina desempenha um importante papel frente à saúde pública, por meio da atuação em pesquisas científicas necessárias para a descoberta, prevenção, tratamento e diagnóstico de patologias prejudiciais ao bem estar da população (DA SILVA et al., 2014). Uma das formas de inserção a esse meio é a iniciação científica (IC), ferramenta educacional que tem como objetivo incentivar e despertar a vocação científica em graduandos. O grupo atuante no Laboratório de Estudos Moleculares e Terapia Experimental (LEMTE), situado na Universidade Federal de Pernambuco, trabalha entre outros temas no desenvolvimento estratégias vacinais objetivando a prevenção e/ou terapia de agravos a saúde pública, como as infecções pelo Papilomavírus Humano (HPV) (Correio braziliense, 2010). O Papilomavírus Humano é o agente causador de infecções sexualmente transmissíveis mais prevalente no mundo. Os HPVs denominados de alto risco podem provocar a carcinogênese em diversos sítios anatômicos. No Brasil, o Sistema Único de Saúde oferta o imunizante quadrivalente, responsável pela proteção aos HPVs 6, 11, 16 e 18 de maneira profilática, porém nenhuma de cunho terapêutico (CARVALHO et al., 2021). Frente a essa problemática, o grupo LEMTE investiga estratégias vacinais que atuem de forma terapêutica para pacientes com a infecção em curso. As pesquisas desenvolvidas pelo grupo são em caráter pré-clínico, o que significa que as vacinas são testadas in vitro ou em animais-modelo.

Health professionals working to mitigate the COVID-19 pandemic are one of the main risk groups for the disease, being prioritized for vaccination. Considering this, the aim of this study was to analyze the immune response of these professionals immunized with CoronaVac in the first and second doses. Blood samples were collected after the first and second doses of the vaccine (CoronaVac) and used to investigate hematological and biochemical parameters, analysis of immunoglobulin production, cytokines, and gene expression profile, as well as the identification of subsets of immune cells. Post-first dose immunological phenotypic memory (CD27+) profiles (T CD4+, TCD8+ and CD19+) showed a significant increase, as did Monocyte APCs (CD80+HLA-DR+) in relation to the second dose. The cytokines IL-2, IL-6 and IFN-° showed increased values in relation to the other analyzed cytokines. The Th2/Th17 profile in the second dose was characterized by gene expression analysis. The production of IgM and IgG after vaccination showed statistically significant values in the comparison between doses. CoronaVac showed activation of APCs monocytes, memory response of T and B lymphocytes, with immunoglobulins production. This set of responses is characterized by the Th2/Th17 immunological profile.

Este trabalho discute os principais obstáculos para a criação, emissão, circulação e registro de títulos de crédito eletrônicos, em especial, da cédula de produto rural, utilizada em diversas operações comerciais da cadeia agronegocial. O estudo avança em temas pouco discutidos na doutrina ou na jurisprudência abordando não só os desafios de novas tecnologias como a blockchain, mas também aqueles enfrentados pelos registradores para atender aos anseios da sociedade atual, além de analisar os impactos de legislações aprovadas recentemente (Lei da Duplicata Eletrônica, Lei Geral da Proteção de Dados e respectiva Medida Provisória, que a alterou em parte e criou a Agência Nacional de Proteção de Dados) e mesmo possíveis impactos do projeto do novo Código Comercial, no caso de sua aprovação definitiva. A busca de uma alternativa aos títulos de crédito físicos ou com transmutação de suporte evidenciou a possibilidade de se reduzirem externalidades negativas, na medida em que implica ganho de tempo e escala – reduzindo custos de transação –, e essa alternativa também pode fortalecer as políticas de compliance no ambiente corporativo, uma vez que dá transparência e eficiência aos processos internos e externos otimizando atividades, reduzindo riscos e aumentando a rentabilidade das operações. Nesse contexto, o trabalho sugere as melhores práticas que dariam seguimento à efetivação da cédula de produto rural eletrônica sem a necessidade de alteração legislativa, mas recomendando a melhoria de políticas públicas visando adequar a regulamentação, especialmente no que tange ao registro das garantias cedulares. This work discusses the main obstacles to the creation, issuance, negotiation and registration of electronic negotiable instruments, in special the rural product bill [cédula de produto rural], used in several business transactions of the agribusiness chain. The study approaches subjects barely dealt with by the jurists or the case law, including not only the challenges of new technologies, such as the blockchain, but also those faced by the registrars for attending the aspirations of the current society, besides analyzing the impacts of laws recently passed (Electronic Receivables Act [Lei da Duplicata Eletrônica], the General Law for Data Protection [Lei Geral da Proteção de Dados] and the respective Provisional Presidential Decree, which partially amended and created the Brazilian National Agency of Data Protection) and even possible impacts of the new Commercial Code bill, in the case it is finally passed. The search for an alternative to the physical negotiable instruments or with transmutation of support made clear the possibility for reducing negative externalities, since it implies gain of time and scale – reducing transaction costs –, and this alternative may also strengthen the compliance policies in the corporative environment, since it gives transparency and efficiency to the internal and external processes, optimizing activities, reducing risks and increasing the profitability of the operations. Within this context, the work suggests the best practices that would follow up the effectuation of the electronic rural product bill without requiring an amendment to the law, but recommending the improvement of public policies seeking to adapt the regulation, in special as regards the registration of the security for the instruments.

The development of a bovine papillomavirus (BPV) vaccine is an outstanding challenge. BPV protein L1 gene transfection in the Drosophila melanogaster S2 cell expression system failed to produce L1 protein notwithstanding correct L1 gene insertion. Severe genetic inbalance in the host cell line, including cytogenetic alterations, may account for the lack of protein expression. O desenvolvimento de uma vacina para papilomavirus bovino (BPV) consiste em grande desafio. A transfecção do gene codificante da proteína L1 de BPV em sistema de células S2 de Drosophila melanogaster não logrou sucesso, apesar da correta inserção da seqüência gênica em vetor apropriado.Graves alterações genéticas na linhagem celular S2, que incluem aberrações cromossômicas, provavelmente estão relacionadas à ausência da expressão da proteína desejada.

Submitted by Rafaella Carine Monterei null (rcarine@stj.jus.br) on 2015-02-19T14:49:20Z No. of bitstreams: 1 penhora_efetivada_meio_freitas.pdf: 660670 bytes, checksum: 873db3ec1d92b2d62fd1dd2224aaf3a3 (MD5) Made available in DSpace on 2015-02-19T14:49:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 penhora_efetivada_meio_freitas.pdf: 660670 bytes, checksum: 873db3ec1d92b2d62fd1dd2224aaf3a3 (MD5) Previous issue date: 2007

Papillomaviruses are described selectively infecting epithelial tissues and are associated with many forms of cancer in different species. Considering the widespread dissemination of papillomatosis in livestock, interest is being centred on possible forms of viral transmission and respective mechanisms. In the present study, we report the detection of bovine papillomavirus (BPV) DNA sequences in female reproductive tract tissues, fluids and oocytes from slaughtered bovines not afflicted by cutaneous papillomatosis. BPV-2 DNA sequences were found in ovarian and uterine tissues as well as in oocytes, cumulus cells and uterine flushings. The presence of papillomavirus sequences in reproductive organ tissues and fluids shows that viral infection in organisms can be verified in others tissues, not only in epithelial ones. The present findings alert to the possibility of BPV transmission in embryo transfer programs and assisted fertilization procedures. Os vírus do papiloma bovino, descritos como agentes infectantes específicos do epitélio, têm sido associados a diversas formas de câncer em diferentes espécies animais. Dada a intensa disseminação da papilomatose nos rebanhos, a investigação de diferentes formas de transmissão e seus respectivos mecanismos tem exigido especial atenção. No presente estudo, é relatada a detecção de seqüências genômicas do papilomavirus bovino (BPV) em ovócitos e tecidos do trato reprodutivo oriundos de fêmeas abatidas comercialmente, não apresentando papilomatose cutânea. A presença de DNA de BPV-2 em tecidos do trato reprodutivo, lavado uterino, ovócitos e células do cumulus traz evidências de que a infecção viral pode se desenvolver fora do tecido epitelial. Esses achados alertam para a possibilidade de transmissão do BPV através dos procedimentos de transferência de embriões e de fertilização in vitro.

This study has detected BPV-1 DNA sequences in wart, blood and plasma samples collected from animals affected by papillomatosis, suggesting viral presence inside the cell. We sellected an animal in which we could detect BPV-1 DNA sequences in wart, blood, placenta and amniotic liquid samples and her offspring which presented BPV-1 DNA sequences in blood sample collected immediately after birth. These results show a possible vertical transmission of BPV-1. Neste estudo detectou-se DNA de BPV-1 em: verruga, sangue e plasma de animais afetados por papilomatose. Estes resultados trazem evidências sobre possível localização intracelular do BPV-1 no sangue. Avaliamos um animal afetado por papilomatose e positivo para BPV-1 em amostras de verruga, sangue, placenta e líquido amniótico e que teve sua cria recém-nascida também positiva para BPV-1 no sangue. Estes resultados indicam possível transmissão vertical do BPV-1.

CAPES Leveduras, como Pichia pastoris, vêm sendo exploradas não apenas para produção de proteínas recombinantes, mas também como carreadoras de antígenos em estratégias vacinais. O desenvolvimento de vacinas para o vírus da Zika é importante para a saúde pública, devido às manifestações clínicas neurológicas que podem ser desencadeadas pela infecção. O presente trabalho visou a produção de proteínas do ZIKV em P. pastoris e a avaliação imunológica frente às leveduras recombinantes dispondo os antígenos em sua superfície. Os cassetes de expressão foram compostos por epítopos das proteínas Envelope e NS1, preditos in silico quanto a capacidade de ligação a células B, e a MHC classes I e II. Os genes foram fusionados ao gene da proteína âncora α-Aglutinina, clonados em vetor de expressão e utilizados para transformar P. pastoris. Western blot e imunofluorescência foram empregados para confirmar a produção e a ancoragem das proteínas recombinantes. A resposta imune promovida pelas leveduras foi avaliada, in vitro e in vivo (em modelo murino). A dosagem de citocinas indicou um perfil de respota tipo Th1, similar ao induzido pelo vírus. P. pastoris expressando os epítopos EnvNS1 se destacou frente as outras construções compostas pelos conjuntos de epítopos de cada proteína, individualmente. EnvNS1 apresenta uma seleção de epítopos arranjados de forma inédita, e se mostra um candidato vacinal promissor diante do seu potencial imunogênico, em relação a ativação de linfócitos T CD4+ e CD8+, e às citocinas induzidas. Yeasts, such as Pichia pastoris, have been explored not only for the production of recombinant proteins, but also as carriers of antigens in vaccine strategies. The development of vaccines for the Zika virus is important for public health, due to the neurological clinical manifestations that can be triggered by the infection. The present work aimed at the production of ZIKV proteins in P. pastoris and the immunological evaluation of recombinant yeasts displaying the antigens on their surface. The expression cassettes were composed of epitopes of the Envelope and NS1 proteins, in silico predicted in terms of their capacity to bind to B cells, and to MHC classes I and II. The genes were fused to the anchor protein α-Aglutinin gene, cloned into an expression vector and used to transform P. pastoris. Western blot and immunofluorescence were used to confirm the production and anchorage of the recombinant proteins. The immune response promoted by yeasts was evaluated, in vitro and in vivo (in murine model). The cytokine dosage indicated a Th1-type response profile, similar to that induced by the virus. P. pastoris expressing the EnvNS1 epitopes stood out compared to the other constructions composed of the sets of epitopes of each protein, individually. EnvNS1 presents a set of epitopes arranged in an inedited way, and shows an promising vaccine candidate in view of its immunogenic potential, in relation to the activation of CD4 + and CD8 + T lymphocytes and induced cytokines.

CAPES Existem cerca de 200 tipos de HPV, dos quais 40 acometem o trato genital, e 15 deles são considerados de alto risco oncogênico, dentre eles, o HPV-31, que é inclusive, o segundo mais frequente em Pernambuco. As oncoproteínas E6 e E7 são responsáveis pela atividade transformante dos HPVs de alto risco. Através de estudos epidemiológicos foi estabelecida a relação entre os tipos de HPV e câncer cervical. Este estudo teve como objetivo, checar o efeito das variantes no oncogene E6 do HPV-31 presentes em Pernambuco (Nordeste, Brasil), inferindo a importância clínica com relação à oncogenicidade do câncer de colo uterino. Os polimorfismos estudados para E6 HPV-31 foram identificados pelo nosso grupo de pesquisa. As amostras foram sub-clonadas em vetor pCI neo para expressão em células de mamíferos. As amostras clonadas foram sequenciadas e alinhadas com a sequência de referência do HPV-31. As construções apresentando os vetores recombinantes contendo E6 foram utilizadas para transfecção de células HEK293. Para investigar os efeitos dos polimorfismos presentes em E6 na via NF-κB, as células foram transfectadas com o vetor de expressão contendo as variantes H60Y, T64A, K123R, A138V, R144G e o Full (amostra apresentando todas as variantes), com o plasmídeo repórter de luminescência (κB) 3-Luc e com o plasmídeo normalizador de luminescência pRenilla, e com o protótipo de E6 do HPV-31(sequência sem nenhum polimorfismo). Para avaliar os efeitos obtidos, nossas construções foram comparadas com a sequência protótipo, e o vetor vazio que foi usado como controle positivo da ativação da via. Após a transfecção as células foram lisadas, os extratos celulares foram preparados para leitura da luciferase de firefly e renilla as quais determinaram o fold da via NF-κB. Foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre E6 R144G. Porém para a variante T64A houve uma regulação negativa significante na atividade da via, também em conjunto, os polimorfismos apresentaram uma diminuição na atividade de NF-kB. Para a análise da atividade transcricional de E6, a variante R144G, apresentou uma expressão muito baixa de RNAm. Enquanto a variante T64A apresentou níveis aumentados de expressão relativa. Este estudo corrobora com dados já existentes na literatura sobre os polimorfismos. Além de contribuir para expansão do conhecimento acerca de alterações nucleotídicas no oncogene E6 e seu papel na imortalização celular. There are about 200 HPV types, 40 of which involve the genital tract, and 15 of them are considered to be at high risk for oncogenic HPV 31, which is the second most common in Pernambuco. The relationship between HPV types and cervical cancer was established through epidemiological studies. The objective of this study was to verify the effect of the variants on HPV31 E6 oncogene present in Pernambuco (Northeastern Brazil), inferring the clinical importance regarding the oncogenicity of cervical cancer. The E6 and E7 oncoproteins are responsible for the transforming activity of high-risk HPVs. The polymorphisms studied for E6 HPV-31 were identified by our research group. Samples were subcloned into neo pCI vector for expression in mammalian cells. The cloned samples were sequenced and aligned with the HPV-31 reference sequence. The constructs showing recombinant E6-containing vectors were used for transfection of HEK293 cells. To investigate the effects of polymorphisms present in E6 on the NF-κB pathway, the cells were transfected with the expression vector containing the H60Y, T64A, K123R, A138V, R144G and Full variants (the all-variant sample) with the plasmid (κB) 3-Luc reporter and with the pRenilla luminescence normalizing plasmid, and with the HPV-31 E6 prototype. To evaluate the effects obtained, our constructions were compared with the prototype sequence, and the empty vector that was used as positive control of the pathway activation. After transfection the cells were lysed, the cell extracts were prepared for reading of the firefly and renilla luciferase which determined the folding of the NF-κB pathway. For the analysis of transcriptional activity of E6, the R144G variant showed very low mRNA expression. While the T64A variant showed increased levels of relative expression. This study corroborates data already available in the literature on polymorphisms. In addition to contributing to the expansion of knowledge about nucleotide changes in E6 oncogene and its role in cell immortalization.

CAPES O Circovírus suíno 2 (PCV2) é um agente que possui um papel importante nas perdas econômicas em granjas de suínos através da morte e queda no desempenho desses animais. A literatura cita o desenvolvimento e aplicação com êxito da Nested PCR em tubo único (STNPCR) para diagnóstico de patógenos humanos e animais, sendo a padronização desta técnica para a identificação da presença do PCV2, de grande importância para suinocultura da região. Desta forma, este trabalho teve como objetivo padronizar e avaliar a STNPCR para detectar o Circovírus Suíno 2 a partir de amostras de fluido oral de suínos. Para isto, foram coletadas 55 amostras de fluido oral de suínos clinicamente saudáveis. O DNA foi extraído e quantificado para realização da PCR convencional e STNCR. Para garantir a segurança e confiabilidade dos resultados, uma PCR direcionada para o gene da β-actina suína foi realizada em todas as amostras. Foram avaliadas diferentes temperaturas, concentrações de primers e número de ciclos. Todos os fragmentos amplificados foram analisados através de eletroforese. Através dos testes para otimização das técnicas, foi possível detectar o produto esperado em ambas as reações, sendo um fragmento de 478pb na PCR direcionada ao gene da β-actina, e um fragmento de 225pb na STNPCR para detecção do PCV2. A padronização da técnica de STNPCR é uma ferramenta útil para a identificação da presença do PCV2, que pode contribuir na redução do impacto econômico que este problema representa para a suinocultura industrial. Porcine Circovirus 2 (PCV2) is an agent that plays an important role in economic losses in pig farms through the death and decrease in the performance of these animals. The literature cites the successful development and application of Single tube Nested PCR (STNPCR) for the diagnosis of human and animal pathogens, being the standardization of this technique to identify the presence of PCV2, of great importance for swine breeding in the region. Thus, this work aimed to standardize and evaluate the STNPCR to detect Porcine Circovirus 2 from swine oral fluid samples. For this, 55 samples of oral fluid from clinically healthy pigs were collected. DNA was extracted and quantified for the performance of standard PCR and STNCR. To ensure the safety and reliability of the results, a PCR targeted to the β-actin gene was performed on all samples. Different temperatures, primer concentrations and number of cycles were evaluated. All amplified fragments were analyzed by electrophoresis. Through the tests to optimize the techniques, it was possible to detect the expected product in both reactions, being a 478bp fragment in the PCR directed to the swine β-actin gene, and a fragment of 225bp in the STNPCR for the detection of PCV2. A standardization of the STNPCR technique is a useful tool to identify the presence of PCV2, which may contribute to reducing the economic impact of this problem for a Swine Breeding industry.

As infecções causadas pelos HPVs representam a principal causa para o surgimento do câncer cervical. Os genótipos mais comuns e com ampla distribuição no nordeste brasileiro são os do HPV16 e 31. O estudo das variantes do oncogene E5 destes genótipos, tem mostrado a sua participação em inúmeros processos celulares, agindo na regulação dos fatores de crescimento e de proliferação celular, além de atuarem no escape imunológico. Neste estudo, investigamos a circulação de variantes do oncogene E5 dos HPVs 16 e 31 e avaliamos in silico, as possíveis repercussões biológicas destes polimorfismos. As sequências gênicas obtidas de amostras cervicais foram sequenciadas e os polimorfismos identificados com o auxílio do software MEGA6. A estrutura secundária foi obtida pelo software PSIPRED, a pressão de seleção estimadas pelo software PAML e os epítopos mapeados com o auxílio da plataforma IEDB. Dentre as amostras HPV positivas, 24/93 foram HPV16 (sete polimorfismos identificados) e 35/93 foram HPV31 (dez polimorfismos identificados). Para o HPV16, as mutações I44L e I65V foram relacionadas ao aumento e à redução da estabilidade da proteína, respectivamente, e para o HPV31, o polimorfismo P56A foi predito como uma mutação estabilizante. As mutações encontram-se sob diferentes formas de seleção e diversos epítopos foram mapeados com alelos MHC-I e MHC-II. Estes resultados contribuem para o entendimento da distribuição geográfica das variantes e no desenvolvimento de novas estratégias imunoterapêuticas. Infections caused by HPVs are the leading cause of cervical cancer. The most common and widely distributed genotypes in the Brazilian northeast are those of HPV16 and 31. The study of variants of the E5 oncogene of these genotypes has shown their participation in numerous cellular processes, acting on the regulation of growth factors and cell proliferation, as well as acting on immune escape. In this study, we investigated the circulation of E5 oncogene variants of HPVs 16 and 31 and evaluated in silico the possible biological repercussions of these polymorphisms. Gene sequences obtained from cervical samples were sequenced and polymorphisms identified with the aid of MEGA6 software. The secondary structure was obtained by the PSIPRED software, the selection pressure estimated by the PAML software and the epitopes mapped with the aid of the IEDB platform. Among the HPV positive samples, 24/93 were HPV16 (seven polymorphisms identified) and 35/93 were HPV31 (ten polymorphisms identified). For HPV16, the I44L and I65V mutations were related to the increase and reduction of protein stability, respectively, and for HPV31, the P56A polymorphism was predicted as a stabilizing mutation. These mutations are under different forms of selection and several epitopes have been mapped with MHC-I and MHC-II alleles. These results contribute to the understanding of the geographical distribution of variants and the development of new immunotherapeutic strategies.

FACEPE O câncer cervical representa o quarto tipo de neoplasia mais frequente entre as mulheres no mundo. Embora, o HPV-16 seja o mais prevalente na população mundial, o HPV-31 é encontrado em diversos países sendo também um importante agente do processo carcinogênico. Infecções persistentes causadas por Papilomavírus humano de alto risco oncogênico (HR HPVs) é uma condição necessária, porém não suficiente para o desenvolvimento de lesões cervicais e câncer cervical. Fatores ambientais e genéticos estão envolvidos na carcinogênese cervical. Dentre os fatores genéticos, as variantes genéticas dos HR HPVs parecem estar relacionadas com o risco de infecções persistentes. Assim, o presente estudo realizou uma avaliação funcional de variantes da região promotora (LCR) do HPV-31 com a finalidade de verificar o efeito biológico sobre essas variantes e consequente importância clínica com relação à sua oncogenicidade. Para isso, a amplificação e clonagem das variantes A e C (isolados 21, 66 e 89), o regulador transcricional E2 e protótipo (HPV-31 – J04353.1) foram realizadas, seguida pela subclonagem em vetor de expressão em células de mamífero. Os recombinantes foram sequenciados para confirmar a LCR clonada. Uma cultura de células HeLa foi estabelecida e a transfecção com diferentes concentrações de E2 foi feita e se determinou que a concentração de 25 ng é a ideal para ativação da LCR. Posteriormente uma transfecção conjunta de E2 e cada recombinante de LCR foi realizada para se avaliar a atividade da LCR de cada isolado. Dentre os isolados estudados, o 21(apresentando lesão de alto grau - neoplasia intraepitelial cervical grau - NIC - II) e 89 (apresentando lesão de alto grau -NIC- III) possuem uma LCR com maior capacidade de alterar os níveis de expressão do gene-repórter Nluc e o isolado 66 (apresentando lesão de alto grau - NIC - III) apresentou os níveis de expressão do gene-repórter Nluc diminuídos comparado com o controle (LCR- protótipo). A análise estatística mostrou diferença significativa entre as regiões LCR polimórficas e o controle (LCR do HPV-31 sem nenhuma variação) com valor de p

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2017-11-09T14:09:38Z No. of bitstreams: 1 Karin Florencio Lins de Paiva Fontes.pdf: 1877999 bytes, checksum: f485fd2cb08ae45cb8ccefa3349ece7f (MD5) Made available in DSpace on 2017-11-09T14:09:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Karin Florencio Lins de Paiva Fontes.pdf: 1877999 bytes, checksum: f485fd2cb08ae45cb8ccefa3349ece7f (MD5) Previous issue date: 2017-08-30 Equine Infectious Anemia (EIA) is caused by a lentivirus of the family Retroviridae and is considered one of the most important viruses in horses in the world. It is a chronic infection, untreated, prevalent in hot and humid climate regions favorable to transmission by hematophagous insects. The official diagnosis of the disease is made through the detection of circulating antibodies in the IDGA and ELISA tests. In order to increase protein yield and improve the performance of serological tests, the p26 gene sequence was optimized for preferred codons for use in E. coli and fused to maltose binding protein. The resulting recombinant fusion protein (p26rec) was detected by SDS-PAGE and Western blot with anti- HIS monoclonal antibody and used as an antigen in the development and evaluation to evaluate an IDGA and an ELISA (IDGArec and ELISArec) for the diagnosis of EIA. After analysis of 569 equine sera, diagnostic sensitivity (SeD) and diagnostic specificity (SpD) were determined. The cutoff point for ELISArec (> 29.51%) was determined by the ROC curve analysis. For IDGArec both SeD and SpD were 100% and for ELISArec were 100% and 99.6% respectively. The p26rec has been maintained with stable working dilutions for more than three years stored at 4 ° C. The results demonstrated the high degree of confidence obtained with p26rec in the IDGArec and ELISArec tests and could therefore be recommended in the serological diagnosis of the AIE. A Anemia Infecciosa Equina (AIE) é causada por um lentivírus da família Retroviridae e é considerada uma das viroses mais importantes em equinos no mundo. É uma infecção crônica, sem tratamento, prevalente em regiões de clima quente e úmido favorável à transmissão por insetos hematófagos. O diagnóstico oficial da doença é realizado através da detecção de anticorpos circulantes nos testes IDGA e ELISA. Visando aumentar a produção proteica e melhorar o desempenho dos testes sorológicos, a sequência do gene p26 foi otimizada com relação aos códons preferenciais para uso em E. coli e fusionada à proteína ligante de maltose com rendimento 2mg/ml de cultura celular. A proteína de fusão recombinante resultante (p26rec) foi detectada por SDS- PAGE e Western blot com anticorpo monoclonal anti-HIS. A p26rec do VAIE foi utilizada como antígeno no desenvolvimento e avaliação por IDGA e ELISA (IDGArec e ELISArec). Após a análise de 569 soros de equinos, foi determinada a sensibilidade diagnóstica (SeD) e a especificidade diagnóstica (SpD). O ponto de corte para o ELISArec (>29.51%) foi determinado pela análise da curva ROC. Para o IDGArec ambos a SeD e a SpD foram de 100% e para o ELISArec foram de 100% e 99,6% respectivamente. A p26rec vem se mantendo com título estável há mais de três anos armazenada a 4°C. Os resultados encontrados mostram o alto grau de confiança obtido com a p26rec nos testes IDGArec e ELISArec, podendo assim ser recomendados no diagnóstico sorológico da AIE.

CAPES O papilomavírus bovino (BPV) é um vírus altamente disseminado no mundo capaz de infectar rebanhos bovinos e provocar a papilomatose bovina, infecção que debilita a saúde do animal e pode resultar em morte. O Brasil possui o maior rebanho comercial do mundo, tendo grande destaque na exportação de carne bovina e na produção de leite, contudo a falta de dados precisos sobre a doença ainda são escassos o que dificulta o desenvolvimento de medidas de controle da infecção. Além disso, não existe uma vacina ou tratamento efetivo para papilomatose bovina. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo a produção de cassetes para expressão de diferentes antígenos de BPV1 em linhagens recombinantes de Leishmania tarentolae baseadas em um vetor de expressão não comercial. As quimeras foram construídas mediante PCR de fusão a partir do gene L1 selvagem clonado previamente no vetor de expressão pPGKΔ3. Através de eletroforese em gel de agarose foi observado a construção de fragmentos com tamanho aproximado de 1500 pb, indicando que houve a fusão dos dois fragmentos produzindo uma quimera no tamanho esperado. As construções foram clonadas no vetor pGEM-T Easy e a correta construção dos insertos foi confirmada por digestão e análise de sequenciamento de DNA. Posteriormente, as quimeras foram subclonadas no vetor de expressão pSPααNEO, sendo a clonagem novamente confirmada mediante digestão enzimática. Os resultados demonstram que os cassetes de expressão foram corretamente construídos e podem ser utilizados em estudos futuros de avaliação da expressão proteica das quimeras no sistema de Leishmania tarentolae. The bovine papillomavirus (BPV) is a highly disseminated virus in the world capable of infecting cattle herds and causing the bovine papillomatosis infection that weakens the health and can result in death of those animals. Brazil has the largest commercial herd in the world, with great emphasis on the export of beef and milk production, but the lack of accurate data on the disease are scarce which makes difficult the development of control measures for the disease. The present work aimed at the production of cassettes for the expression of different BPV1 antigens in recombinant Leishmania tarentolae lines based on a non-commercial expression vector. The chimeras were constructed using fusion PCR from wild L1 gene previously cloned into the expression vector pPGKΔ3. Using agarose gel electrophoresis it was observed construction fragments with approximate size 1500 bp, indicating that there was a fusion of the two fragments producing a chimera with the expected size. The constructions were cloned into pGEM-T Easy vector and the correct construction of the inserts was confirmed by digestion and DNA sequence analysis. Later, the chimeras were subcloned into the pSPααNEO expression vector, and the cloning was again confirmed by enzymatic digestion. The results demonstrate that the expression cassettes were correctly constructed and could be used in future studies evaluating the protein expression of the chimeras in the Leishmania tarentolae system.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2017-11-21T15:24:13Z No. of bitstreams: 1 Luiz Cosme da Silva Junior.pdf: 2262385 bytes, checksum: 934698e0a82f5115f0317ed2075d1c57 (MD5) Made available in DSpace on 2017-11-21T15:24:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luiz Cosme da Silva Junior.pdf: 2262385 bytes, checksum: 934698e0a82f5115f0317ed2075d1c57 (MD5) Previous issue date: 2017-08-30 Financiadora de Estudos e Projetos - Finep The economic impact caused by Aujeszky's disease (AD) has decreased with the use of vaccines deleted for the gE gene of the AD Virus and diagnostic tests for the detection of antibodies specific to the protein corresponding to the deleted gene for differentiation of infected animals from the vaccinated - DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated individuals). The goal of this work was to clone and express the gene related to the extramembrane portion of the gE glycoprotein of the DA virus in E. coli expression system using synthetic gene with optimized codons and thioredoxin fused protein (Trx), and to evaluate its potential use in ELISA. After cloning, expression and identification of recombinant gE protein (gErec*Trx) in Western blotting with anti-His antibody, gErec*Trx (approximately 60 kDa) was used as antigen in ELISA (ELISAgErec) using Protein G peroxidase as conjugate. Samples previously tested in virus neutralization (VN) and in commercial ELISA were tested in ELISAgErec, and the cutoff point (> 0.13) was defined by ROC curve analysis. A total of 599 sera from pigs were used, of which 208 were positive VN and 391 negative in commercial ELISA for the detection of antigE antibodies from the DA virus, of which 300 originated from Certified Porcine Breeding Farms (GRSCs) and 91 from Technological properties of the State of Pernambuco. ELISAgErec presented sensitivity of 97.6% and specificity of 96.4%. To evaluate the analytical sensitivity and limit of detection, the international reference serum for AD was used, and for analysis of the analytical specificity were tested sera from pigs Pathogen-Specific Free (SPF) vaccinated with the main vaccines used in pigs. ELISAgEr showed greater sensitivity than the commercial ELISA thus demonstrating its ability to distinguish healthy and vaccinated animals from infected animals. In addition, to showing good solubility, gErec remained immunoreactive in the same titre in ELISAgErec after several months stored at 4 °C, and even after thermal stress at 70 °C it presented the same results. O impacto econômico causado pela Doença de Aujeszky (DA) tem diminuído com uso de vacinas deletadas para o gene gE do Vírus da DA e testes diagnósticos para detecção de anticorpos específicos para a proteína correspondente ao gene deletado, para diferenciação dos animais infectados dos vacinados - DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated individuals). O objetivo com este trabalho foi clonar e expressar o gene referente a porção extramembranar da glicoproteína gE do vírus da DA em sistema de expressão E. coli utilizando gene sintético com códons otimizados e proteína fusionada a tiorredoxina (Trx), e avaliar seu potencial uso em ELISA. Após a clonagem, expressão e a identificação da proteína gE recombinante (gErec*Trx) em Western blotting com anticorpo anti-His, a gErec*Trx (aproximadamente 60 kDa) foi usada como antígeno em ELISA (ELISAgErec) utilizando Proteina G peroxidase como conjugado. Amostras previamente testadas em virusneutralização (VN) e em ELISA comercial foram testadas no ELISAgErec, e o ponto de corte (>0,13) foi definido por análise da curva ROC. Foram utilizados 599 soros de suínos, sendo 208 positivos virusneutralização (VN) e 391 negativos em ELISA comercial para detecção de anticorpos antigE do vírus da DA, sendo 300 oriundas de Granjas de Reprodutores Suínos Certificadas (GRSCs) e 91 de propriedades tecnificadas do estado de Pernambuco. O ELISAgErec apresentou sensibilidade de 97,6% e especificidade de 96,4%. Para avaliar a sensibilidade analítica e o limite de detecção foi testado o soro internacional de referência para a DA, e para avaliação da especificidade analítica foram testados soros de suínos Livre de Patógenos Específicos (SPF) vacinados com as principais vacinas usadas em suínos. O ELISAgEr apresentou maior sensibilidade que o ELISA comercial demonstrando assim sua capacidade de distinguir animais sadios e vacinados dos animais infectados. Além de apresentar boa solubilidade a gErec se manteve imunorreativa no mesmo título no ELISAgErec após vários meses estocada a 4 °C, e mesmo após estresse térmico a 70 °C apresentou mesmos resultados.

Diretamente associado ao surto de casos de malformações fetais e ao aumento de casos de adultos afetados com a Síndrome de Guillain-Barré na América Latina, e especialmente no Brasil, o Zika vírus (ZIKV) é alvo de diversas pesquisas em todo mundo. Assim como o vírus da Dengue e da Febre Amarela, o ZIKV pertence a família Flaviviridae e tem como principais vetores de transmissão os mosquitos do gênero Aedes, mas pode ser transmitido por outras vias tais como por relações sexuais e fluídos corporais. Desse modo, e frente a sua rápida disseminação, o desenvolvimento de estratégias profiláticas e terapêuticas contra a infecção por ZIKV é de fundamental importância. Atualmente, não há ainda nenhuma vacina profilática disponível contra o ZIKV. Assim, neste trabalho foram desenvolvidos candidatos a vacinas de DNA baseados nos genes prM e Envelope que foram selecionados em razão da resposta imune humoral que são capazes de elicitar. Três construções foram desenvolvidas neste estudo: a primeira contendo a sequência completa do Envelope (E), a segunda contendo apenas os últimos 34 aminoácidos da região C-terminal de prM e a sequência completa do Envelope (prM34.E), e a terceira trata-se do Envelope com uma deleção de seus os últimos 108 aminoácidos da região C-terminal (EnvΔ108). Todas as construções foram clonadas no vetor pGEM-T easy, subclonadas no vetor de expressão para células de mamíferos pVAX1 e transfectadas em culturas de células Vero. Após as transfecções, a detecção das proteínas de interesse foi realizada por western blot e a verificação da transcrição gênica por meio de RT-PCR. Os resultados obtidos demonstraram a expressão de E, mas não foi possível a detecção da expressão de prM34.E e EnvΔ108. De modo similar, apenas foi possível a detecção da proteína E. Sendo, portanto, necessárias otimizações aos protocolos para futuras detecções. A eficiência da construção E como candidato vacinal deve ser avaliada em futuros ensaios imunológicos em animais. Directly associated with the outbreak of fetal malformations and the increase of cases of adults affected with Guillain-Barré Syndrome in Latin America, and especially in Brazil, Zika virus (ZIKV) is the subject of several researches worldwide. Like Dengue and Yellow Fever viruses, ZIKV belongs to the Flaviviridae family and has as main transmission vector the mosquitoes from the genus Aedes. But also, it can be transmitted by other routes such as sexual relations and body fluids. Thus, in view of its rapid spread, the development of prophylactic and therapeutic strategies against ZIKV is extremely important. Currently, there are no prophylactic vaccines available against ZIKV. In this sense, in this work we developed candidates for DNA vaccines based on the prM and Envelope genes of ZIKV, which were selected for the humoral immune response that they can elicit. Three constructs were developed in this study: the first containing the complete Envelope (E) sequence, the second containing only the last 34 amino acids of the C-terminal region of prM and the complete Envelope sequence (prM34.E), and the third was Envelope with a deletion of the last 108 amino acids of the C-terminal region (EnvΔ108). All constructs were cloned into the pGEM-T easy vector, and then subcloned into the expression vector for mammalian cells pVAX1 and transfected into Vero cell cultures. After the transfections, detection of proteins of interest was performed by western blot and the verification of gene transcription was done by RT-PCR. The results obtained demonstrated expression of E, although expression of prM34.E and EnvΔ108 was detected. Similarly, only E protein detection was possible, and protocol optimizations are required for future detection. The efficacy of the E-construct as a vaccine candidate should be evaluated in future animal immunological assays.

CAPES A hematúria enzoótica bovina (HEB) é uma doença crônica inflamatória e neoplásica da bexiga urinária de bovinos. A doença evolui durante um longo período de tempo, sendo caracterizada pelo desenvolvimento da hematúria intermitente e está associada ao consumo prolongado de Pteridium aquilinum, planta conhecida popularmente como samambaia. A infecção pelo Papilomavírus bovino tipo 2 (BPV-2) e o consumo de samambaia têm sido relacionadas ao desenvolvimento da HEB e lesões neoplásicas da bexiga de bovinos. Ainda não se sabe o real papel da infecção pelo BPV-2 no desenvolvimento da HEB. Desta forma, o presente trabalho, consiste na avaliação da infecção pelo BPV-2 no desenvolvimento da HEB. Para isto, foi investigada a presença do BPV-2 no sangue, urina e lesões, seguido de avaliações clínicas e laboratoriais e a relação destes, com o desenvolvimento ou não de HEB. Foram selecionados 16 animais da raça Girolando 5/8, fêmeas, com idades entre 2-5 anos, com ou sem lesões. As amostras sanguíneas foram coletadas através de punção venosa da jugular, para a extração de DNA e análises bioquímicas. As amostras de sangue para a extração de DNA foram armazenadas em tubos com anticoagulante (EDTA), e as amostras para análise bioquímica foram armazenadas em tubo sem anticoagulante. As amostras de urina foram coletadas através de micção espontânea, para a realização da urinálise. Para extração de DNA do sangue, urina e lesão, foi utilizado o kit Blood and Tissue (Qiagen, Alemanha). Em seguida foi feita a detecção e tipificação, por PCR, das sequências de DNA. Para detecção foram utilizados os primers consenso MY11/09 e primers específicos de BPV-2 para a tipificação. Todas as análises foram realizadas a cada 4 meses, durante o período de um ano. Os resultados obtidos demonstraram a detecção do BPV-2 em 100% (16/16) das amostras de sangue, 87,5% (14/16) na urina e 100% (13/13) nas lesões. Os resultados das análises bioquímicas e de urinálise se mostraram dentro da normalidade em todos os animais. Nenhum animal apresentou qualquer característica clínica de HEB. Conclui- se que, o vírus não é per si, capaz de desenvolver a HEB. Bovine enzootic hematuria (HEB) is a chronic inflammatory and neoplastic disease of the urinary bladder of cattle. The disease evolves over a long period of time, characterized by the development of intermittent hematuria and is associated with prolonged consumption of Pteridium aquilinum, a plant popularly known as fern. Bovine papillomavirus type 2 (BPV-2) infection and fern consumption have been related to the development of HEB and neoplastic lesions of the bovine bladder. The role of BPV-2 infection in the development of HEB is not yet known. Thus, the present study consists of the evaluation of BPV-2 infection in the development of HEB. For this purpose, the presence of BPV-2 in the blood, urine and lesions was investigated, followed by clinical and laboratory evaluations and their relation with the development of HEB. Sixteen Girolando 5/8 females, aged 2-5 years, with or without lesions were selected. Blood samples were collected through venous puncture of the jugular, for DNA extraction and biochemical analyzes. Blood samples for DNA extraction were stored in tubes with anticoagulant (EDTA), and the samples for biochemical analysis were stored in tube without anticoagulant. Urine samples were collected through spontaneous urination to perform the urinalysis. For DNA extraction from blood, urine and injury, the Blood and Tissue kit (Qiagen, Germany) was used. PCR detection and typing of the DNA sequences was then performed. For detection, MY11 / 09 consensus primers and BPV-2 specific primers were used for typing. All analyzes were performed every 4 months for a period of one year. The results demonstrated the detection of BPV-2 in 100% (16/16) of the blood samples, 87.5% (14/16) in the urine and 100% (13/13) in the lesions. The results of biochemical and urinalysis tests were within normal limits in all animals. No animal had any clinical features of HEB. It is concluded that, the virus is not per se, capable of developing HEB.

CAPES Cervical e um subconjunto de cânceres de cabeça e pescoço são causados pela infecção persistente por papilomavírus humano (HPV) de alto risco. A oncogenicidade do HPV está fortemente associada a fatores ambientais, a exemplo dos tipos virais e suas variantes, e também tem sido associado a presença de polimorfismos em oncogenes virais, os quais podem estar envolvidos no risco de progressão maligna. O conhecimento sobre como a variância genética é bem distribuído entre diferentes populações e sua relação com lesões de alto grau pode ser crucial para o diagnóstico e estratégias terapêuticas contra doenças relacionadas ao HPV. Os polimorfismos podem levar à alteração da função biológica com conseqüências clínicas. Além de prejudicar o controle do ciclo celular mediado por pRB, as atividades de E7 incluem perturbação da via NF-κB afetando uma importante via crítica celular anti-viral. Em pacientes do Nordeste do Brasil, nosso estudo descreveu a presença de tipos de HPV e variantes de amostras cervicais por técnica de PCR e sequenciamento e realizou uma das primeiras análises funcionais baseadas na atividade NF-κB dos polimorfismos E7 de HPV-16. Adicionalmente, para se ter acesso aos níveis de expressão de mRNA de E7 a partir de culturas de células. O HPV-16 foi encontrado como o tipo mais prevalente, seguido por HPV-31 e HPV-58. Entre as variantes do HPV-16, as linhagens C e D foram detectadas principalmente em lesões cervicais de alto grau. Além disso, identificamos quatro polimorfismos do gene E7 do HPV-16. Um polimorfismo não-sinônimo foi localizado em epítopos preditos de células T e B, que estão sob seleção positiva. Este polimorfismo também está localizado em uma região de loop próximo ao domínio da hélice LXCXE, que é responsável pela interação da proteína E7 e pRb, passo crucial no desenvolvimento do câncer. Novas mutações adaptativas podem levar o vírus a evadir o sistema imunológico do hospedeiro e aumentar a patogenicidade. Sobre os resultados da via NF-kB, estes mostraram que as variantes do gene E7 do HPV-16 nas quais os três polimorfismos estão presentes podem exercer um forte efeito supressor nos pacientes infectados com HPV com implicações na persistência da infecção e na sua progressão. No entanto, as alterações resultantes dos polimorfismos podem não estar necessariamente relacionadas com os níveis de expressão diferencial das variantes. Estes resultados adicionam dados importantes para os estudos sobre a variabilidade de E7, o que poderia contribuir para uma melhor compreensão da diversidade e infecção do HPV. Cervical and a subset of head and neck cancers are caused by high-risk human papillomavirus (HPV) persistent infection. HPV oncogenicity is strongly associated with environmental factors, viral types, and their variants, where even polymorphisms in viral oncogenes may be involved in malignant progression risk. Knowledge about how genetic variance is distributed among populations and its relationship with high-grade lesions may be critical to diagnosis and therapeutic strategies against HPV-related diseases. Polymorphisms may lead to altered biological function with clinical consequences. Besides impairing pRB-mediated cell cycle control, E7 activities include NF-κB disturbing, which affects an anti-viral cellular critical pathway. In Brazilian Northeastern patients, our study described the presence of HPV types and variants from cervical cells by PCR technique and sequencing and performed one of the first NF-κB activity-based functional analysis of HPV-16 E7 polymorphisms. In addition, in order to access E7 mRNA expression levels from cell cultures. HPV-16 was found as the most prevalent type, followed by HPV-31 and HPV-58. Among HPV-16 variants, C and D lineages were detected mostly from high-grade cervical lesions. Furthermore, we have identified four HPV-16 E7 gene polymorphisms. A non-synonymous polymorphism was located into predicted T and B-cell epitopes, which are under positive selection. This polymorphism is also located in a loop region next to LXCXE helix domain, which is responsible for the interaction of E7 protein and pRb, critical step in cancer development. Novel adaptive mutations could lead the virus to evade host immunological system and increase pathogenicity. About the NF-kB pathway, results have shown that HPV-16 E7 gene variants in which the three polymorphisms are present may perform a strong suppressive effect on the in HPV-infected patients with implications for infection persistence and its progression. However, the changes resulting from polymorphisms may not necessarily be related to the differential expression levels of the variants. These results add important data on E7 variability studies, which could contribute to a better understanding of HPV diversity and infection.

CAPES Os papilomavírus incluem vírus de DNA circular, geralmente envolvidos em lesões benignas do epitélio e mucosas. No entanto, alguns papilomavírus apresentam potencial oncogênico levando ao desenvolvimento de doenças como a papilomatose bovina. Atualmente, é sabido que a proteína L2 que compõe a estrutura do capsídeo, e alguns de seus epítopos são capazes de induzir a produção de anticorpos neutralizantes. Além disso, a oncoproteína E5 é responsável pelo crescimento e transformação celular, sendo o principal gene de transformação em bovinos. Entretanto, não existe disponível vacina comercial eficaz contra a infecção pelo BPV. Dessa forma, o presente trabalho consiste na construção de candidatos vacinais por meio de vacina de DNA contra a infecção por BPV. Para tal, tivemos como objetivo específico a construção de vetores vacinais a partir do plasmídeo pCI-neo e avaliamos in vitro a expressão dos respectivos antígenos em células de mamíferos. Os genes escolhidos para o estudo, L2 selvagem e o seu epítopo contido entre os aminoácidos 11 a 200, além do oncogene E5 selvagem, foram amplificados por PCR, clonados individualmente no vetor plasmidial pGEM-T easy e propagados em Escherichia coli (linhagem DH5α). Em seguida, os genes de trabalho foram previamente digeridos e subclonados no vetor pCI-neo para expressão em células de mamífero, incluindo o gene E5 sintético códon otimizado. Ambas as sequências foram avaliadas por digestão enzimática e por sequenciamento. A avaliação da funcionalidade das construções foi realizada pela expressão das mesmas em cultura de células embrionárias do Rim Humano (HEK-293 - Human embrionic kidney cell) seguida por análise da expressão gênica via RT-PCR e dos extratos proteicos por SDS-PAGE e Western-Blot. Os resultados obtidos apresentaram a expressão dos genes L2ʷᵗ, L2¹¹⁻²⁰⁰ e E5ᵒᵗⁱᵐⁱᶻᵃᵈᵒ confirmada por RT-PCR. No entanto, a produção das respectivas proteica não foi detectada pela análise via immunoblotting, demonstrando que melhorias no protocolo são necessárias. Papillomaviruses are circular DNA viruses, generally involved in benign lesions of the epithelium and mucous membranes. However, some papillomaviruses present oncogenic potential leading to the development of diseases such as bovine papillomatosis. Currently, it is known that the viral capsid L2 protein and some of its epitopes are capable of inducing the production of neutralizing antibodies. In addition, the E5 oncoprotein is responsible for cell growth and transformation, being the main transformation gene in cattle. However, no effective commercial vaccine against BPV infection is available. Thus, the present work consists of the construction of vaccine candidates by means of DNA vaccine against BPV infection. For this propose, we specifically aimed to construct vaccine vectors from the plasmid pCI-neo and evaluated the expression of the respective antigens in vitro in mammalian cells. The genes chosen for the study, the entire L2 sequence and its epitope contained between the amino acids 11 to 200 and the wild-type E5 oncogene, were amplified by PCR, individually cloned into the pGEM-T easy vector and propagated in Escherichia coli (strain DH5α). Then, the working genes were pre-digested and subcloned into the pCI-neo vector for expression in mammalian cells, including the synthetic codon optimized E5 gene. Both sequences were evaluated by enzymatic digestion and sequencing. The evaluation of the functionality of the constructs was performed by gene expression in Human Kidney embryo cell (HEK-293) followed by analysis of the gene transcription via RT-PCR and of protein extract via SDS-PAGE and Western Blot. The results obtained showed the expression of the genes L2ʷᵗ, L2¹¹⁻²⁰⁰ and E5ᵒᵖᵗⁱᵐⁱᶻᵉᵈ confirmed by RT-PCR. However, production of the respective proteins was not detected by immunoblotting analysis, demonstrating that improvements in the protocol are required.

A papilomatose bovina é uma doença infecto-contagiosa causada pelo Papillomavírus Bovino (BPV). Existem relatos na literatura de bovinos infectados com mais de um tipo de BPV, além de animais que não apresentam os sintomas da doença O estudo tem como objetivos, genotipar os animais quanto à infecção pelo BPV e ao desenvolvimento da papilomatose cutânea; analisar a presença de co-infecções em lesões cutâneas e em tecido sanguíneo, avaliar a associação de polimorfismos dos genes MBL2 e TNF-alfa com a papilomatose bovina. Foram coletadas 127 amostras de sangue de bovinos e 35 amostras de lesões cutâneas, realizada a tipificação dos BPVs por PCR e o estudo de associação dos SNPs dos genes TNF-alfa e MBL2, por PCR e sequenciamento. Os tipos de BPV mais encontrados nas amostras de sangue foram: BPV 10 (97,75%), BPV 12 (92,13%), BPV 2 e BPV 9 com (88,76%). Os tipos de BPV mais encontrados nas lesões foram: BPV 2 e BPV 3 (100%), BPV 11 (97,1%), BPV 10 (94,2), BPV 12 (91,42%), BPV 4 (82,85%), BPV 6 (80,0 %). A co-infecção foi detectada em 99% das amostras de sangue. Nas amostras de lesões foi constatado a co-infecção em 100% das amostras. As sequências obtidas para o gene MBL2 apresentaram 245 sítios conservados e 02 variáveis, o gene TNF-alfa apresentou 638 sítios conservados e um variável. Nas amostras avaliadas, não foram encontradas associações com os SNPs dos genes MBL2 (exon1) com um p-value de 0.837, TNF-alfa (-1044 a -406) com um p-value de 0.782 e a papilomatose bovina. Bovine papillomatosis is an infectious disease caused by Bovine Papillomavirus (BPV). There are reports in the literature of infected cattle with more than one type of BPV, and animals that do not show symptoms of the disease The study aims, genotyping animals as the BPV infection and the development of cutaneous papillomatosis; analyze the presence of co-infections in skin lesions and blood tissue, evaluate the association of polymorphisms of genes MBL2 and TNF-alpha with bovine papillomatosis. 127 were collected bovine blood samples and 35 samples of skin lesions, carried out the characterization of BPVs PCR and SNP association study of TNF-alpha and MBL2 by PCR and sequencing. The BPV types most commonly found in blood samples were BPV 10 (97.75%), BPV 12 (92.13%), BPV 2 and 9 with BPV (88.76%). The BPV types most commonly found in lesions were BPV BPV 2 and 3 (100%), BPV 11 (97.1%), BPV 10 (94.2), BPV 12 (91.42%), BPV 4 (82, 85%), BPV 6 (80.0%). Co-infection was detected in 99% of the blood samples. In lesions of the samples was found to co-infection in 100% of the samples. The sequences obtained for the MBL2 gene are conserved sites 245 and 02 variables, TNF-alpha gene showed 638 and a variable conserved sites. In the analyzed samples, associations were found with the SNPs of the MBL2 (exon1) with a p-value of 0.837, TNF-alpha (-1044 to -406) with a p-value of 0782 and bovine papillomatosis.

CAPES O Papilomavírus (PV) é um reconhecido agente de lesões hiperproliferativas benignas que, sob determinadas circunstâncias, podem evoluir para lesões cancerosas. Em humanos, o HPV está relacionado ao desenvolvimento do câncer cervical e anogenital, enquanto o BPV é o agente de cânceres em bovinos e equinos. Atualmente, duas vacinas estão licenciadas para profilaxia contra o HPV, as quais se baseiam em partículas semelhantes ao vírus (VLPs, virus-like particles) obtidas a partir da produção da proteína L1 em sistemas de expressão heteróloga. Apesar de comprovadamente eficazes, ambas as vacinas apresentam importantes limitações relacionadas ao baixo espectro de proteção e elevado custo, o que impede sua implementação sobretudo nos países em desenvolvimento. Neste trabalho, apresentamos o desenvolvimento de duas plataformas biotecnológicas para produção de candidatos vacinais contra o HPV e BPV. Uma das plataformas emprega um sistema genético baseado no promotor constitutivo do gene PGK1 da levedura Pichia pastoris para expressão intracelular da proteína L1 de HPV16. Em paralelo, diferentes candidatos vacinais do HPV e BPV foram desenvolvidos para expressão em Leishmania tarentolae através do emprego de distintos sistemas genéticos. As análises de expressão por dot blotting e western blotting com anticorpos monoclonais demonstram a presença dos candidatos vacinais no lisado das leveduras recombinantes, enquanto evidências obtidas por microscopia eletrônica de transmissão sugerem a formação de VLPs no citoplasma dos clones cultivados. Em contrapartida, as análises por ultracentrifugação e purificação com resina de heparina-sepharose evidenciaram a formação de capsômeros e VLPs quiméricas a partir dos candidatos vacinais produzidos em L. tarentolae. Interessantemente, nossos ensaios apresentam evidências de uma modificação pós-traducional ainda não revelada em espécies de Leishmania, denominada SUMOilação. Demonstramos por diferentes abordagens que tal modificação, ao ser realizada na proteína L2, ocorre através de um padrão semelhante ao descrito em células de mamíferos. Futuros ensaios focarão na determinação dos níveis de produção a partir de cultivos em biorreator e na imunogenicidade de candidatos vacinais desenvolvidos. Esses resultados demonstram a viabilidade do emprego de P. pastoris e L. tarentolae como plataforma vacinal para o desenvolvimento de abordagens potencialmente mais econômicas e de largo espectro contra a papilomatose humana e animal. Infection by Papillomavirus (PV) is a well-known cause for the establishment of hyperproliferative and benign lesions (warts) that can evolve to carcinoma under specific circumstances. In human, HPV is related to cervical and other anogenital cancer, while BPV is the causal agent of different types of cancer in cattle. The current HPV vaccines licensed for prophylaxis against cervical cancer are based on virus-like particles (VLPs) obtained through the expression of major capsid L1 protein in heterologous expression systems. Although highly effective, both vaccines present important limitations related to their low spectrum of protection and high cost, which compromises their implementation worldwide, mainly in developing countries. Herein, we present the development of two biotechnologic platforms for production of vaccine candidates against HPV and BPV. The first one employs a genetic system based on the Pichia pastoris PGK1 constitutive promoter for intracellular expression of HPV16 L1 protein. In parallel, we designed different HPV16 and BPV1 vaccine candidates for expression in the protozoan Leishmania tarentolae through distinct genetic systems. Expression analysis by dot blotting and western blotting using monoclonal antibodies demonstrated the detection of L1 protein in the total protein lysate of recombinant yeasts, in addition to the electron microscopy evidences suggesting VLP assembling within the cytosol of the clones. In the other hand, ultracentrifugation and purification on heparin-sepharose resin evidenced the assembling of capsomeres and VLP by expressing of L1-based candidates in L. tarentolae. Interestingly, our set of data indicates the occurrence of a post-translational modification by small ubiquitine-like modifier (SUMO) still not revealed in Leishmania species. For the first time, we demonstrate that such modification (SUMOylation), when presented in the L. tarentolae-expressed HPV16 L2 protein, takes place in a mammalian-like pattern. Future studies will focus on immunogenicity assays with the vaccine candidates developed here. The data presented here demonstrated the feasibility of P. pastoris PGK1-based system and L. tarentolae as platforms for the developing of low cost and large spectrum vaccine strategies against human and animal papillomatosis.

CAPES O câncer da mama é o tipo de câncer que mais acomete mulheres em todo o mundo. Diversos fatores estãoassociados ao desenvolvimento desta neoplasia, dentre elas as infecções virais. Entre os três vírus mais estudados como causa de carcinogênese mamária está oPapillomavirus humano (HPV). Assim, oobjetivo foi detectar e analisar o HPV emcarcinomasmamáriosde mulheres do Nordeste do Brasil. A detecção do DNA viral foi realizada PCR, as amostras positivasforam tipificadas por sequenciamento. A quantificação da carga viral e a determinação do status físico por qPCR, e a detecção as oncoproteínas de E6 e E7 de HPV por imunohistoquímica. O DNA de HPV foi detectado em 46,7% dos carcinomas de mama HPV-positivos. O HPV16foi omais prevalente, 92% dos casos. A carga viral do HPV apresentou uma média de 14,2 cópias em 104 células, noscarcinomas de mama. Além disso, em 57,2% dos carcinomas mamáriosHPV-positivas apresentaram o DNA viral integrado ao genoma do hospedeiro. Altas taxas de detecção das oncoproteínas E6(89,5%) e E7(90%) foram identificadas nos carcinomas de mama HPV-positivos. Já as proteínas supressoras de tumor, p53 e p16INK4A, apresentaram taxas menores 95,7% e 92,3% respectivamente. Os resultados deste estudo sugerem que o vírus esteja em atividade nas células tumorais e provavelmente desempenhem papel na carcinogênese mamária. Breast cancer is the type of cancer that affects more women around the world. Several factors are associated with the development of cancer, among which viral infections. Of the three most-studied virus as a cause of mammary carcinogenesis is the Human papillomavirus (HPV). The objective was to detect and analyze HPV in breast carcinomas of women in northeastern Brazil. The detection of viral DNA was performed PCR positive samples were typed by sequencing. The quantification of viral load and to determine the physical status by qPCR, and detection of the oncoproteins E6 and HPV E7 by immunohistochemistry. HPV DNA was detected in 46.7% of HPV-positive breast carcinomas. HPV16 was the most prevalent, 92% of cases. The HPV viral load averaged 14.2 copies in 104 cells in breast carcinomas. Furthermore, 57.2% of HPV-positive breast carcinomas showed the integrated viral DNA into the host genome. High rates of detection of E6 (89.5%) and E7 (90%) were identified in HPV-positive breast tumors. Already the tumor suppressor protein p53 and p16INK4a, had lower rates 95.7% and 92.3% respectively. The results of this study suggests that the virus is active in tumor cells and probably play role in breast carcinogenesis.

CNPQ O HPV é o principal fator transformadordo câncer cervical. No seu ciclo viral é expressa a oncoproteína E5, responsável por várias alterações na célula hospedeira e,foi sugerido in vitro, que ela altera a proliferação celular através da regulação negativa do microRNA-203, que em condições normais atua inibindo a proliferação e condicionando a diferenciação dos queratinócitos. Entretanto os mecanismos que envolvem E5 e o microRNA-203 ainda não estão bem elucidados. Este estudo tem como objetivo avaliar o perfil de expressão da oncoproteína E5 e do microRNA-203 em biópsias de colo uterino, observando a existência de correlação entre ambos. A expressão gênica relativa do microRNA-203 e E5 nas amostras clínicas (n=90), referente a todas as etapas da carcinogênese cervical (Normal, NIC I, NIC II, NIC III e câncer), foi obtida por qPCR.As análises mostraram uma diminuição do perfil de expressão do microRNA-203 no câncer em comparação com amostras normais (p

CNPQ A infecção pelo Papilomavírus Humano, além de representar uma doença sexualmente transmissível altamente disseminada, é responsável por 5% dos cânceres em humanos, destacando o câncer cervical com altos índices de incidência e mortalidade. Embora comprovadamente eficazes, as vacinas vigentes não combatem infecções já estabelecidas e apresentam um elevado custo de produção. Esse cenário revela a necessidade de estratégias vacinais alternativas. O presente trabalho propõe a expressão de diferentes genes recombinantes em Escherichia coli, uma plataforma biotecnológica econômica, de fácil manipulação e de alto rendimento. Os genes recombinantes utilizados foram: L1 de HPV16 e construções quiméricas basedas na substituição de epítopos da oncoproteína E5 na alça h4 e na região C-terminal de L1, com potencial para geração de antígenos profiláticoterapêuticos e na substituição de epítopos da proteína L2 na região da alça h4 para avaliação de possível neutralização cruzada. Após subclonagem em pGEM-T, esses genes foram clonados em vetor de expressão pAE e linhagens de Escherichia coli BL21 e Rosetta foram transformadas com os vetores de expressão gerados. A confirmação da produção das proteínas se deu por Western blot, a partir de extratos de culturas induzidas com IPTG. Otimizações nos protocolos de indução, lise e preparo das amostras foram realizadas ao longo dos experimentos. Os resultados obtidos demonstraram a produção dos antígenos recombinantes, e deverão ser validados em futuros ensaios imunológicos quanto à capacidade de induzir respostas imunes em animais desafiados. Human papillomavirus infection, besides to represent a widespread sexually transmitted disease, is responsible for 5% of cancers in humans, highlighting cervical cancer with high rates of incidence and mortality. Although proven effective, the existing vaccines do not eliminate infections already established and have a high cost of production. This scenario shows the need for alternative vaccine strategies. This study proposes the expression of different recombinant genes in Escherichia coli, an economic, easy handling and high performance biotechnology platform. Recombinant genes used were: L1 of HPV16 and chimeric basedas constructions in replacement E5 oncoprotein epitopes on h4 loop and L1 C-terminal region, with the potential to generate prophylactic-therapeutic antigens and replacing L2 protein epitopes in loop region h4 for evaluation of possible cross-neutralization. After subcloning in pGEM-T, these genes were cloned into vector pAE expression and Escherichia coli BL21 and Rosetta were transformed with the expression vectors generated. Confirmation of protein production was performed by Western blot from extracts of cultures induced with IPTG. Optimizations in the induction protocols, lysis and preparation of the samples were carried out throughout the experiments. The results demonstrated the production of recombinant antigens and should be validated in future immunological assays for the ability to induce immune responses in challenged animals.

FACEPE Os Papilomavírus humano (HPV) infectam mucosas e epitélio contribuindo para o desenvolvimento de tumores benignos como também malignos. São amplamente conhecidos como causadores do câncer cervical, contudo, atualmente, vem apresentando evidências de associação com diversos outros tipos de canceres, como o câncer de pulmão. Sendo assim, o presente estudo avaliou a presença do DNA do HPV em tumores de pulmão de pacientes do Estado de Pernambuco bem como a expressão de suas oncoproteínas E6 e E7. Para isto, a detecção foi feita em amostras de tecidos de tumores frescos e parafinados de 63 pacientes. HPV estava presente em 52% das amostras, sendo detectados os tipos 16 e 18 com frequências de 81 e 19%, respectivamente. Quanto a presença do vírus nos diferentes tipos histológicos dos tumores, foi detectado HPV em 40% dos carcinomas escamosos, 33% dos adenocarcinomas, 18% dos carcinomas de células pequenas e 9% em carcinoma de células grandes. Através da técnica de imunohistoquimica detectou-se a presença das oncoproteinas virais E6 (anticorpo anti-HPV 16 e anti-HPV 18) e E7 (anticorpo anti-HPV 16 e anti-HPV 18) com frequências de 85 e 75%, respectivamente. Tal resultado confirma os resultados obtidos molecularmente quanto à presença do HPV e é sugestivo de que o vírus esteja em atividade nas células tumorais e provavelmente esteja desempenhando um papel na carcinogênese de pulmão. No entanto, mais estudos são necessários para se ter um maior esclarecimento sobre interação de E6 e E7 com proteínas celulares na tumorigenese pulmonar. Small DNA viruses - Human Papillomavirus (HPV) - infect oral mucosa and the epthelium, which leads to the development of both benign and malign tumors. They are widely known as the principal causes of cervical cancer although currently there is evidence to show that they are associated with several other types of cancer, such as lung cancer. In the light of this, this study evaluated the presence of HPV in the tumors of lungs of patients from the State of Pernambuco, as well as the E6 and E7 oncoproteins expression. This involved carrying out the detection in tumor tissue samples that were fresh and paraffin-embedded and taken from 63 patients. HPV was found to be present in 52% of the samples, and types 16 and 18 were detected with frequencies of 81% and 19% respectively. With regard to the presence of the vírus in different histological types of tumors, HPV was detected in 40% of the squamous carcinomas, 33% of the adenocarcinomas, 18% of the small cell carcinomas and 9% in large cell carcinomas. The presence of the E6 (antibody anti-HPV 16 and anti-HPV 18) and E7 (antibody anti-HPV 16 and anti-HPV 18) oncoproteins was detected by means of the immunohistochemical technique and this confirmed the results obtained from a molecular analysis with regard to the presence of the virus and it is suggestive that the virus is active in tumor cells and is probably playing a role in lung carcinogenesis. However, further studies are required to have a clearer understanding of the interaction of E6 and E7 with the cell proteins in pulmonary tumorigenesis.