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Additional file of TRAM (Transcriptome Mapper): database-driven creation and analysis of transcriptome maps from multiple sources

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CYYR1 (Cysteine/tyrosine-rich 1) cloned on human chromosome 21 defines a new family of highly conserved vertebrate-specific genes1,2. The analysis of the human locus revealed the presence of a multitranscript-system that includes alternative spliced isoforms and one ncRNA gene overlapping CYYR1 in antisense orientation3. Original results suggest the need of further investigations in order to verify a putative role of CYYR1 in the tumorigenic process, caused by dysfunction of cell differentiation and possibly related to the Hh pathway4; to date, the specific function of the CYYR1 product is still unknown. The zebrafish cyyr1 is present in single copy and maintains almost 58% of identity with human protein therefore, we decided to perform a full characterization of cyyr1 expression and function using zebrafish as model system. WISH approach defined a broad expression in central nervous system (CNS), somites and muscles during somitogenesis and at 24-48 hpf. The cyyr1 knock-down with two different MOs targetting the ATG and the first splice-site of the transcript, affected both CNS and muscle development with a significant rescue in embryo co-injected with cyyr1 mRNA. Defects were also evident in ciliated cells of neuromast of the lateral line. Morphologically, the cyyr1-MOs injected embryos display some features of embryos inhibited for the Hh pathway through injection of the lefty mRNA and cyyr1 expression was significantly inhibited following Hh inhibition. Interestingly, the injection of cyyr1 mRNA was able to partially rescue Hh-defective phenotype in embryos at 24 hpf. Results obtained through immunofluorescent staining, qPCR and western blotting, support a role for cyyr1 in primary myogenesis probably downstream of Hh pathway. 1. Vitale L et al. Gene 2002, 290:141-51. 2. Casadei R et al. Gene Expr Patterns 2011, 11: 271-6. 3. Casadei R et al. Mol Biol Rep 2014, 41:6025-38. 4. Xu J et al. Genetics 2006, 174:735-52.

The understanding of the genetic basis of the PD and the correlation between genotype and phenotype has revolutionized knowledge about the pathogenetic mechanisms of neurodegeneration, opening up exciting new therapeutic and neuroprotective perspectives. Genomic knowledge for PD is still very open and can provide a good start for studies of the molecular mechanisms that underlie the gene expression variations and the epigenetic mechanisms that may contribute to the complex and characteristic phenotype of PD. Here we use the software TRAM (Transcriptome Mapper), to analyse publicly available microarray data of PD patients and controls substantia nigra, to identify chromosomal segments (Map mode) and gene clusters (Cluster mode) which are biologically relevant in the two different conditions. TRAM integrates original methods for parsing, normalizing, mapping and statistically analyzing expression data; in addition, it is able to easily generate maps showing differential expression between two sample groups, relative to two different biological conditions. We performed a systematic meta-analysis of 143 samples from pool A (patients with PD) and 119 samples from pool B (healthy controls), for a total of respectively 4,128,764 data points (gene expression value) and 3,417,633 data points, relative to 37,580 distinct loci for wich A/B ratio value was determinable. Results obtained included 5 significantly over-expressed segments and 90 over/under-expressed clusters. A list of statistically significant over/under-expressed genes has been generated, including coding genes, ncRNAs and uncharacterized transcripts. This study offers a new approach for the regional analysis of gene expression in neurodegenerative diseases.

Cysteine/tyrosine-rich 1 (CYYR1) is a gene we previously identified on human chromosome 21 (Hsa21). CYYR1 was initially characterized as a four-exon gene that predicts a 154-amino acid product. We provide the first detailed description of the human CYYR1 locus. It is composed of a multigene system, which includes at least seven CYYR1 alternative spliced isoforms and a new CYYR1 antisense gene. In particular, we cloned the following isoforms: CYYR1-1,2,3,4b and CYYR1-1,2,3b present a different 3´ transcripted region; CYYR1-1,2,4 lacks exon 3; CYYR1-1,2,2bis,3,4 presents an additional exon between exon 2 and exon 3; CYYR1-1b,2,3,4 presents a different 5´ untranslated region when compared to CYYR1. The meaningful differences in the protein isoforms of CYYR1 locus could indicate different functions and localizations of the predicted proteins. Moreover, we cloned a long transcript overlapping with CYYR1 as an antisense RNA, probably a non-coding RNA. In order to verify the Hsa21 locus expression profile in altered conditions such as cancer and aneuploidy, expression analysis was performed in different tumour cell lines and in trisomy 21 (CCL54) and euploid fibroblasts (CCL110). The results obtained indicate a bare expression of the multi-transcript CYYR1 in all the tumour cell lines studied, with the exception of U2OS, as well as in CCL110, while it is clearly detectable in CCL54. The characterization of the CYYR1 locus is a first step to clarify a possible role of the human locus related to tumorigenesis and Down syndrome disease. For this purpose, U2OS and CCL could be cell model systems useful to verify the real expression of the predicted proteins by studying the differences in the localization and/or the functional interaction and competition between each CYYR1 isoform. The results of the present study highlight the necessity to analyse thoroughly human gene loci that are still orphaned of role comprehension, but that could be related to complex diseases.

La didattica della Biologia è un percorso affascinante. Oggi le conoscenze scientifiche raggiunte in questo campo a livello molecolare, cellulare e degli organismi, ci propongono nuovi orizzonti. Le sempre maggiori informazioni scientifiche, d’altro canto, sfruttano molte risorse e fonti per raggiungere chiunque voglia conoscere nuovi aspetti del mondo biologico che lo circonda e che lo riguarda da vicino. L’approccio ad una materia così complessa può però comportare il rischio di una inutile dispersione di energia nel tentativo di approfondire ognuno dei tanti aspetti e contenuti, o viceversa, rendere banale e superficiale lo studio e dunque meno interessante ed incisivo il percorso conoscitivo degli studenti. In base a queste premesse, un buon libro deve essere necessariamente una sintesi aggiornata della materia, ma anche uno strumento in grado di aiutare i docenti ad insegnare e gli studenti ad apprendere. Questo testo nasce proprio dall’idea di rivisitare il testo di Campbell e Reece, Biologia 8/Ed., un ottimo testo americano, modulando le parti che più calzano ai programmi degli studi biomedici di molti corsi di laurea, centrando l’attenzione alla biologia umana. Il corpo del testo si sviluppa attraverso argomenti di biologia molecolare, citologia e fisiologia cellulare, nonché biologia animale con particolare riferimento ai processi endocrini, riproduttivi e di sviluppo. Un importante sforzo è stato fatto nell’originale inserimento di argomenti di Genetica medica. Questi contenuti rendono l’opera ancora più flessibile per i programmi che da anni integrano corsi di biologia applicata agli studi medici e la genetica formale da un lato, con la genetica umana e un’introduzione alla clinica dall’altro. Questa integrazione diventa un potente ausilio nello specifico in corsi di laurea come quello dell’Infermieristica e colma una lacuna da tempo sottolineata da studenti e docenti. Gli studenti troveranno in Biologia e genetica un utile sussidio alla propria preparazione nella chiarezza espositiva, nei contenuti aderenti ai programmi svolti a lezione e in puntuali verifiche di apprendimento. I docenti avranno modo di rimandare a un testo completo e organico nelle sue parti. Il testo si propone come possibile riferimento in corsi di laurea quali scienze motorie, farmacia, biologia e, in generale, nelle lauree delle professioni sanitarie.

Various tools have been developed to perform global gene expression profile data analysis, to search for specific chromosomal regions whose features meet defined criteria as well as to study neighbouring gene expression. However, most of these tools are tailored for a specific use in a particular context (e.g. they are species-specific, or limited to a particular data format) and they typically accept only gene lists as an input. TRAM (Transcriptome Mapper) is a new general software tool that allows the simple generation and analysis of quantitative transcriptome maps, starting from any source listing gene expression values for a given gene set (e.g. expression microarrays), implemented as a relational database. It includes a parser able to assign univocal and updated gene symbols to gene identifiers from different data sources, as well as to perform intra-sample and inter-sample data normalization methods, including an original variant of quantile normalization (scaled quantile) useful to normalize data from platforms with highly different numbers of investigated genes. When in 'Map' mode, the software generates a quantitative representation of the transcriptome of a sample (or of a pool of samples) and identifies if chromosomal segments of defined length are over/under-expressed compared to the desired threshold. When in 'Cluster' mode, the software searches the genome for a set of over/under-expressed consecutive genes. Statistical significance for all results is calculated with respect to genes localized on the same chromosome or to all genome genes. Transcriptome maps, showing differential expression between two sample groups, relative to two different biological conditions, may be easily generated. We present the results of a test biological model, based on a meta-analysis comparison between a human CD34+ hematopoietic progenitor cells sample pool and a megakaryocytic cells sample pool, identifying biologically relevant chromosomal segments and gene clusters with differential expression during the differentiation toward megakaryocyte. The large agreement with classical biological knowledge about megakaryocytopoiesis of TRAM results, obtained without any a priori specific assumption, shows that TRAM can perform integrated analysis of expression data from multiple platforms producing high confidence lists of over/under-expressed chromosomal segments and clustered genes. TRAM is the first complete software usable in a personal computer (Macintosh and Windows environments) designed to create, and statistically analyze, quantitative transcriptome maps, based on gene expression data from multiple sources. In conjunction with our previous implementation of a GenBank [1, 2] and UniGene [3] formats full parsing systems, TRAM may also contribute to the building of a novel, relational, multi-purpose, user-friendly and modular platform for the large-scale integrated analysis of genomic and post-genomic data.

Il genoma umano contiene migliaia di sequenze non codificanti altamente conservate tra specie diverse di vertebrati. Questi elementi altamente conservati non codificanti (CNEs) sono caratterizzati da una forte associazione spaziale con geni coinvolti nella regolazione trascrizionale e/o nello sviluppo embrionale. L’alto livello di conservazione di tali sequenze verosimilmente riflette un ruolo in funzioni chiave per l’organismo nonchè la presenza di meccanismi molecolari ugualmente conservati tra i vertebrati. Recentemente, per numerose CNEs, è stata dimostrata una attività di tipo “enhancer” tessuto-specifica, mediante saggi funzionali in vivo in embrioni di zebrafish. Nonostante la forte conservazione di sequenze tra vertebrati, non sono mai state individuate sequenze omologhe negli invertebrati. Mediante uno studio bioinformatico preliminare è stata realizzata una analisi comparativa di sequenze tra i genomi di due specie di Ciona (Ciona intestinalis e Ciona savignyi) che ha permesso di identificare CNEs conservate tra le due specie di invertebrato e localizzate nelle vicinanze degli stessi geni coinvolti nello sviluppo embrionale associati alle CNEs dei vertebrati. A partire da questa osservazione, abbiamo formulato l’ipotesi che esistano CNEs di invertebrati la cui funzione (ma non la sequenza) sia conservata anche nei vertebrati. Il lavoro sperimentale ha portato al clonaggio in vitro mediante PCR di 19 su 21 CNEs sinora descritte in Ciona. Allo scopo di verificare se tali sequenze potessero mantenere una funzione regolatoria nei vertebrati, abbiamo effettuato saggi funzionali per il monitoraggio di una eventuale attività enhancer in embrioni di zebrafish, co-iniettandoli con la CNE di interesse e un costrutto caratterizzato dalla presenza di un gene reporter (GFP, green fluorescent protein) posto sotto il controllo del promotore della beta-globina umana. Abbiamo individuato due elementi che mostrano una significativa attività enhancer tessuto-specifica, uno associato ai geni Meis e l’altro associato a Pax6. L’analisi bioinformatica e i saggi funzionali in vivo hanno quindi permesso di dimostrare una conservazione a livello funzionale, ma non di sequenza, di elementi regolatori tra vertebrati e invertebrati. Le CNEs potrebbero quindi rappresentare una famiglia di elementi regolatori conservati lungo l’evoluzione che utilizzano in parte un linguaggio che potrebbe non coincidere con la conservazione della sequenza, ma che viene riconosciuto dal macchinario regolativo all’interno della cellula.

Il gene umano RCAN3 (Regulator of Calcineurin 3, anche conosciuto come DSCR1L2), localizzato sul cromosoma 1 (1p36.11), appartiene alla famiglia genica RCAN, di cui gli altri membri sono i geni RCAN1 ed RCAN2. Recentemente il Comitato internazionale HUGO ha proposto per i geni e le proteine di questa famiglia la nomenclatura presentata per la prima volta in questo lavoro; nomenclatura che è stata ampiamente discussa anche nell’ambito di un “Forum article” in via di pubblicazione. Il gene RCAN3 è costituito da 5 esoni e ad oggi sono state identificate due isoforme alternative: RCAN3-2,3,4b,5, che manca di 30 nucleotidi all’inizio dell’esone 4 e codifica per una proteina priva di 10 amminoacidi nella sua porzione centrale (RCAN3-2,3,4b,5) ed RCAN3-2,5 che manca degli esoni 3-4 e codifica per una proteina di 115 amminoacidi, con una porzione proteica C-terminale diversa da RCAN3, a causa di uno scivolamento del modulo di lettura a partire dall’esone 5 (RCAN3-2,5). Ad oggi più di un centinaio di lavori sono stati pubblicati sulla famiglia RCAN e nella maggior parte sono presentati studi sulle funzioni di RCAN1 ed RCAN2. Solo due lavori si sono occupati dei possibili ruoli di RCAN3. Recentemente il nostro gruppo di ricerca, mediante un saggio dei due ibridi condotto in una genoteca di cDNA di cuore umano, ha dimostrato che RCAN3 ed RCAN3-2,5 sono in grado di interagire con la troponina inibitoria cardiaca (TNNI3), una delle principali componenti dell’apparato contrattile muscolare; inoltre Mulero e colleghi hanno identificato nella calcineurina, una fosfatasi calcio-calmodulina dipendente, un altro possibile interattore di RCAN3. Lo scopo del presente lavoro è stato condurre una analisi delle diverse isoforme di RCAN3 e delle rispettive proteine da un punto di vista molecolare, bioinformatico, di espressione genica e funzionale. In primo luogo sono state identificate grazie ad un clonaggio mediante RT-PCR due nuove isoforme di RCAN3, in accordo con l’elevato numero di splicing dimostrato nei geni umani: RCAN3-2,4,5 che manca dell’esone 3 ed RCAN3-2,3,5, che manca dell’esone 4. Sequenze di cDNA per le isoforme alternative di RCAN3 sono state identificate solo in Homo sapiens, utilizzando come strumenti per tale ricerca il programma BLASTN, ECgene Browser e Genome Browser; solo per l’isoforma RCAN3-2,4,5 sono state ritrovate 2 EST. In seguito è stata condotta una RT-PCR quantitativa relativa per analizzare il pattern di espressione delle 5 isoforme note in 7 tessuti umani normali (cuore, cervello, polmone, prostata, testicolo, leucociti, intestino tenue), basandosi su dati precedentemente raccolti che dimostravano come il gene RCAN3 fosse espresso in diversi tessuti.Tutte le isoforme sono risultate espresse nei singoli tessuti e in tutti i tessuti si è dimostrato che l’isoforma più espressa è RCAN3. Inoltre il livello di espressione dell’intero locus RCAN3 è risultato confrontabile in tutti i tessuti, dimostrandone l’ubiquitarietà. Infine, grazie ad un saggio di cotrasformazione in lievito e ad un saggio in vitro di legame alla GST, è stata dimostrata l’interazione delle due nuove isoforme identificate RCAN3-2,4,5 e RCAN3-2,3,5 con la TNNI3, così come si poteva ipotizzare grazie alla presenza dell’esone 2, il cui prodotto è ritenuto essere sufficiente per il legame a tale proteina cardiaca.

L’analisi del trascrittoma (l’insieme degli RNA trascritti) di un tessuto, o di un campione cellulare, è uno degli strumenti fondamentali per comprendere le proprietà biologiche globali del tessuto in esame (System Biology). Attualmente, la metodica più utilizzata per tale analisi è lo studio dei profili di trascrizione mediante microarray, che si basa sulla creazione di sonde specifiche per RNA noti da utilizzare per valutare la quantità degli RNA stessi presenti nel tessuto in esame. Le sonde possono essere costituite da cDNA oppure da oligonucleotidi creati tramite la tecnologia brevettata dalla ditta Affymetrix, che ne fornisce anche la piattaforma d’analisi. Uno degli scopi prioritari degli studi attuali dei profili di trascrizione è determinare quali regioni cromosomiche sono trascritte (mappe di trascrizione) al fine di comprendere i meccanismi di regolazione genica. Abbiamo sviluppato il software “TRAnscript Map Analizer” (TRAMA) per generare mappe di trascrizione genica umana da dati d’espressione, ottenuti da esperimenti sia mediante la piattaforma Affymetrix sia mediante array a cDNA. Il software richiede per funzionare la previa importazione delle informazioni riguardanti i cDNA umani noti, e se necessario quelle relative alle sonde Affymetrix del set umano U133, tutte prelevabili dal sito web “Genome Browser”. Inoltre, occorrono i dati aggiornati della banca dati UniGene, ottenibili anche utilizzando il software “UniGene Tabulator”. In seguito alla importazione dei dati di espressione da analizzare, il software genera una tabella per ogni tipo di cromosoma umano (per un totale di 24 tabelle) in cui ogni riga (record) contiene i dati di un segmento cromosomico di lunghezza fissata dall’utente, in bp, a cui sono associati i dati dell’espressione di quella regione e le informazioni sui geni in essa contenuti (indicati mediante il loro simbolo genico, o il relativo cluster di UniGene se il simbolo non è disponibile). L’espressione di ciascun segmento è visualizzabile come barra colorata dal verde al rosso proporzionalmente all’espressione media del cromosoma, rispettivamente più alta o più bassa. Successivamente, il software genera una seconda tabella per ogni cromosoma, contenente i segmenti con un’espressione pari ad almeno la media dell’espressione genica per quel cromosoma nell’esperimento analizzato. Inoltre il software genera, in una tabella separata, una singola mappa genomica virtuale che dispone in maniera contigua tutti i cromosomi umani, per analizzare l’espressione complessiva del genoma in un singolo esperimento. Il software può elaborare due diversi profili di espressione, generando in questo caso anche una mappa di trascrizione basata sul rapporto di espressione tra i due profili. In questo modo è possibile applicare il programma allo studio dei dati di espressione del genoma umano per la identificazione di "cluster" di geni coespressi (moduli funzionali) localmente definiti sulla mappa. Il software TRAMA è basato su FileMaker Pro 8.5, un gestore di basi di dati (databases) di semplice utilizzo, ed è distribuito come applicazione stand-alone per le piattaforme Macintosh e Windows corredato di una guida descrittiva per l’uso.

UniGene è un sistema sperimentale per ripartire in maniera non ambigua le sequenze nucleotidiche contenute in GenBank ed attribuirle a gruppi di sequenze (cluster) rappresentativi di geni trascritti. Nella costruzione di UniGene, ad ogni locus genico è assegnato un gruppo di sequenze di RNA che possono essere determinate sperimentalmente in modo accurato “finished”, etichette di sequenze espresse (EST) o sequenze predette. Come conseguenza, UniGene risulta fondamentale in tutte le analisi bioinformatiche che coinvolgono dati a partire da sequenze nucleotidiche, come l’attribuzione di sonde nucleotidiche utilizzate nell’analisi del profilo d’espressione genica, l’integrazione dei dati tra banche dati differenti, l’identificazione di nuovi geni e la predizione della funzione o, infine, l’analisi di profili d’espressione per specifici tessuti o per posizione di mappa genica. Esistono due modalità per l’accesso ai dati UniGene: la ricerca di specifiche schede attraverso il portale web “Entrez” selezionando UniGene tra la lista di banche dati, o il prelievo dell’intera banca dati dal sito “ftp” abilitato. In entrambi i casi, il risultato è l’ottenimento di un file di testo semplice (flat file) da cui le informazioni necessarie devono essere estratte appositamente per essere utilizzate. Il processo di estrazione dati da un file di testo (parsing) richiede l’applicazione di conoscenze informatiche complesse, come i linguaggi BioPerl, JAVA o C++ utilizzati per analizzare le banche dati MedLine (Oliver et al. 2004) ed Entrez Gene (Liu and Grigoriev, 2005), o l’utilizzo di pacchetti software mirati, ad esempio GeneRecords (D’Addabbo et al. 2004) per analizzare il formato GenBank. Tuttavia, ad oggi, non esistono pubblicazioni riguardanti algoritmi o applicazioni dedicati al parsing del formato UniGene. UniGene Tabulator è stato da noi sviluppato per gestire i dati contenuti nel formato UniGene: il file di testo semplice viene importato direttamente in una banca dati apposita, al cui interno avviene il parsing delle informazioni. La banca dati è costituita da sei tabelle, una per ogni tipo di informazione presente nella scheda UniGene (informazioni generali, somiglianze con altre proteine note, sequenze STS note, dati di relativi alla mappa di trascrizione ed informazioni sulle genoteche utilizzate per la creazione delle EST, associate nel cluster UniGene) relazionate tra loro mediante l’identificativo del cluster UniGene. Ogni “record” di una tabella contiene i dati di una singola sequenza, o di un cluster solo per le informazioni generali, ed è suddiviso in campi che contengono i valori estratti. Ogni campo è indicizzato per eseguire rapidamente ricerche specifiche ed il risultato può essere esportato in un file di testo per essere utilizzato per ulteriori analisi o altre ricerche. UniGene tabulator è basato su FileMaker Pro 8, un gestore di basi di dati di semplice utilizzo, ed è distribuito come applicazione stand-alone per piattaforme Macintosh e Windows corredato di una guida descrittiva delle operazioni utili ad importare il file UniGene con i dati per la specie animale in studio.

È noto che i metodi classici di clonaggio del cDNA sono influenzati da una potenziale incapacità di amplificare efficacemente la regione 5´ dell’mRNA. Dato che la sequenza amminoacidica dei prodotti genici è di norma dedotta dalla sequenza dei nucleotidi del relativo cDNA clonato, è importante verificare che una sequenza codificante identificata (o open reading frame, ORF) sia quanto più possibile completa al relativo 5´. In studi precedenti abbiamo dimostrato, mediante analisi bioinformatica accurata e successivo clonaggio del cDNA (reazione a catena della polimerasi dopo retrotrascrizione, RT-PCR), che in 4 su 109 geni noti localizzati sul cromosoma 21 umano, le ORF annotate erano incomplete all’estremità 5´. Scopo del presente lavoro è stato valutare la completezza nella regione 5´ delle sequenze ORF di mRNA di Danio rerio (zebrafish), organismo modello sempre più utilizzato in studi di genomica. Abbiamo sviluppato un innovativo metodo automatizzato che consente di: 1) confrontare in modo sistematico le EST (expressed sequence tags, etichette di sequenze espresse) disponibili con tutte le sequenze di mRNA conosciute di Danio rerio; 2) identificare eventuali tratti di sequenza da aggiungere nella regione 5´; 3) verificare la presenza di tutte le condizioni necessarie a dimostrare l’esistenza di una nuova ORF estesa. Queste condizioni sono, in breve, la presenza di un nuovo “primo codone AUG” in fase con quello precedentemente descritto e la mancanza di uno qualsiasi dei tre codoni di stop in fase tra il codone di recente identificazione e quello inizialmente annotato. Il nostro programma ha analizzato gli 8.528 mRNAs di Danio rerio estratti dal database RefSeq (disponibili al 31/12/2005) e ha permesso di identificare 265 (3,1%) mRNA con ORF potenzialmente incomplete nella regione 5´. Attraverso RT-PCR e sequenziamento automatico abbiamo dimostrato per tre geni (selt1a, unc119, nppa), scelti tra quelli candidati, che la regione codificante all'estremità 5' era stata caratterizzata in modo incompleto nelle descrizioni originali. La conoscenza delle ORF complete dell’mRNA assume una particolare valenza in zebrafish per gli studi di localizzazione del prodotto genico, di sovraespressione genica nonché per la realizzazione di organismi knockdown mediante oligonucleotidi morfolinici. Il metodo sviluppato, la cui utilizzazione è applicabile anche all’analisi di altri genomi, ha consentito di descrivere in questo lavoro la rilevanza del problema dell’incompleta caratterizzazione delle estremità 5´ degli mRNA e di sottolinearne le possibili conseguenze nell’ambito dell'annotazione genomica e degli esperimenti funzionali eventualmente progettati in zebrafish.

Tramite analisi di sequenze EST (Expressed Sequence Tags) è stato osservato che il gene umano CYYR1 (cysteine/tyrosine-rich 1) mostra un’alta espressione in cellule appartenenti al sistema APUD (Amine Precursor Uptake and Decarboxylation). E’ noto che anomalie del differenziamento cellulare in cellule APUD sono spesso alla base di alcuni tipi di tumore di origine neuroendocrina (APUDomi), come le neoplasie endocrine multiple, i tumori carcinoidi, il feocromocitoma e il melanoma. E’ stata analizzata, mediante RT-PCR specifica e successivo sequenziamento, l’intera sequenza codificante (CDS) dell’mRNA di CYYR1 umano in 32 tumori neuroendocrini (NE). In tutti i campioni analizzati la CDS di CYYR1 è risultata sovrapponibile a quella di riferimento con eccezione della sequenza ottenuta dall’unico tumore localizzato nel collo, un carcinoma scarsamente differenziato con aspetti neuroendocrini. In quest’ultimo caso, l’analisi ha evidenziato la presenza di una mutazione, in eterozigosi, in posizione 333 della CDS (T al posto di C) che porta alla sostituzione amminoacidica P111S. L’analisi di sequenza, inoltre, ha mostrato chiaramente l’esistenza di due isoforme di mRNA dovuta alla presenza di due possibili siti accettori di splicing all’estremo 3¢ dell’introne 3 che termina con la sequenza CAGCAG (splicing alternativo “sottile”). Tale splicing alternativo è presente anche nei tessuti normali. Le due isoforme di mRNA prodotte differiscono per una tripletta CAG (CAG-: assenza della tripletta, CAG+: presenza della tripletta); ne derivano due prodotti proteici putativi diversi per assenza o presenza di un residuo di alanina nel punto di giunzione fra esone 3 ed esone 4. E’ stata successivamente quantificata l’espressione relativa delle due isoforme messaggeriali (CAG- e CAG+) in 29 tumori NE e in 8 tessuti normali tramite un metodo che si basa su una RT-PCR condotta in condizioni altamente standardizzate e stringenti. Il metodo impiega la beta-2 microglobulina (B2M) come gene di riferimento e i risultati della elettroforesi dei prodotti di PCR sono elaborati con un analizzatore di immagini (Gel Doc 2000). Nei campioni tumorali è stata ritrovata una espressione significativamente più bassa della isoforma CAG- rispetto ai controlli normali in un rapporto di 2:3 (p=0,022). Infine abbiamo condotto un’analisi bioinformatica per verificare o meno la presenza delle due isoforme degli ortologhi di CYYR1 in altre specie: solo in Pan troglodites si può ipotizzare l’esistenza delle due isoforme per la presenza, nella sequenza genomica, di un confine introne-esone analogo a quello umano.

E’ di recente osservazione (Hiller et al., Nat Genet, 2005) la presenza, in almeno il 30% dei geni umani, di uno splicing alternativo “sottile”, causato da una sequenza NAGNAG situata al confine fra un sito accettore di splicing intronico e l’inizio dell’esone successivo. Questa breve sequenza offre all’apparato di splicing due punti di taglio distanti solo tre basi l’uno dall’altro con conseguente trascrizione di due isoforme di mRNA che differiscono per la presenza o assenza di una tripletta NAG. Ne derivano due proteine diverse per uno o al massimo due aminoacidi. Tale differenza è sufficiente per ipotizzare una diversa funzione delle due forme, sinora dimostrata in vitro solo per l'insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R). L’attivazione del sistema insulin-like growth factor 1 (IGF1)/IGF1R è un evento cruciale nei processi di trasformazione neoplastica in diversi tumori umani. Tale sistema è stato recentemente studiato in tumori carcinoidi che sono caratterizzati da ipersecrezione di amine biologiche e di neuropeptidi responsabili delle manifestazioni sintomatologiche. Sono stati descritti due trascritti del gene IGF1R, dovuti a splicing alternativo “sottile”, che differiscono per tre nucleotidi (CAG) nella sequenza codificante. L’assenza della tripletta CAG (isoforma CAG-) dà origine ad una proteina che rispetto alla forma originariamente descritta (codificata dalla isoforma CAG+) presenta una Arginina in sostituzione della coppia Treonina-Glicina nella porzione extracellulare della subunità beta del recettore. Trasfettando con entrambe le isoforme la linea cellulare CHO si è visto che la forma CAG-, rispetto alla forma CAG+, mostra un aumento della attività mitogenica di circa due volte in risposta a IGF1. Nel presente lavoro proponiamo un metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi dopo retrotrascrizione (reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) per lo studio semiquantitativo della espressione differenziale di mRNA che differiscono per poche basi, e lo applichiamo alla analisi della espressione relativa delle due isoforme di mRNA di IGF1R in un’ampia casistica di tumori neuroendocrini umani (32 campioni) e in tessuti normali (9 campioni). Il metodo prevede condizioni altamente standardizzate e stringenti, impiega la beta-2 microglobulina (B2M) come gene di riferimento e i risultati della elettroforesi dei prodotti di PCR sono elaborati con un analizzatore di immagini (Gel Doc). Nei campioni tumorali è stata ritrovata una espressione significativamente più alta (di circa 2 volte) di entrambe le isoforme rispetto ai controlli normali, mentre il rapporto fra le due isoforme CAG+/CAG- si mantiene costante sia nei tipi cellulari tumorali che in quelli normali studiati (circa 3:1). Lo studio filogenetico del locus IGF1R, condotto sulle sequenze disponibili di diverse specie animali, suggerisce che l’isoforma messaggeriale IGF1R CAG- sia, da un punto di vista evoluzionistico, più recente rispetto alla isoforma CAG+, per questa ragione l’apparato di splicing potrebbe utilizzare con minor efficienza il sito di splicing che la origina. Questo lavoro sottolinea la espressione differenziale di isoforme di splicing alternativo “sottile” per il locus IGF1R e rimanda alla necessità di evidenziare e caratterizzare, con metodi di bioinformatica e di biologia molecolare, analoghe forme di splicing sottile per i geni umani noti non ancora studiati sotto questo profilo e per tutti i nuovi geni via via identificati.

Nel corso dello studio del gene umano CYYR1 (Vitale et al., 2002), localizzato sul cromosoma 21, abbiamo isolato e clonato in vettore un cDNA corrispondente a una isoforma di splicing che differisce di 3 basi (CAG) dalla forma precedentemente da noi identificata e descritta. La sequenza del cDNA della isoforma permette di prevedere la codifica di un prodotto polipeptidico con un amminoacido aggiuntivo (alanina) inserito tra P111 e G112. Lo studio mediante RT-PCR (reazione a catena della polimerasi dopo retrotrascrizione) semiquantitativa ha permesso di dimostrare che le due isoforme sono espresse differenzialmente in diversi tessuti normali studiati. L’analisi genomica ha rivelato che l’origine dello splicing alternativo risiede nella sequenza terminale dell’introne 3 del gene CYYR1 (CAGCAG), che presenta due siti accettori di splicing canonici “AG” distanti tre basi tra loro ed entrambi utilizzabili dalla cellula. E’ stata quindi eseguita una revisione sistematica, basata su analisi bioinformatica e in alcuni casi anche sul clonaggio mediante RT-PCR, degli mRNA umani che si presentano in due possibili isoforme differenti per la presenza o l’assenza di una tripletta CAG. In particolare, abbiamo analizzato con uno specifico programma da noi sviluppato le sequenze di circa 30.000 introni umani (banca dati SRS), dimostrando che in 39 casi (0,13 %) un introne umano termina con la sequenza CAGCAG. In 10 casi, l’analisi della banca dati EST (expressed sequence tags, etichette di sequenze espresse) mostrava l’effettiva esistenza di mRNA differenti per la tripletta CAG. In alcuni casi, la tripletta aggiuntiva si trova nella regione codificante, permettendo la previsione di una sequenza amminoacidica del prodotto variante più lunga di 1 amminoacido. Abbiamo dimostrato la presenza di splicing alternativo, mediante RT-PCR, per i geni: SGNE1 (secretory granule, neuroendocrine protein 1), G6PD (glucose-6-phosphate dehydrogenase), PKD1 (polycystic kidney disease 1 gene). Nel caso di IGF1R (codificante il recettore per l’insulin-like growth factor 1), dati di letteratura precedenti hanno mostrato che i prodotti polipeptidici tradotti a partire dalle due differenti isoforme di mRNA e differenti per un singolo amminoacido possono svolgere una diversa funzione biologica (in termini di oncogenicità in saggi di trasfezione cellulare). La identificazione sistematica di isoforme di splicing minimamente differenti con produzione di catene polipeptidiche varianti, oltre ad aver permesso l’identificazione rapida di nuove isoforme di splicing di geni umani noti da tempo e svolgenti azioni biologiche fondamentali, amplia la nozione di variabilità dei prodotti di trascrizione genica che possono essere originati da un singolo locus e prelude alla ricerca di meccanismi simili operanti a livello dei siti donatori di splicing o di altre analoghe sequenze a livello dei siti accettori.

Il gene DSCR1L2 (1p35.3-p33), identificato e clonato nel nostro laboratorio, appartiene alla famiglia genica umana DSCR1L (Down Sindrome critical region 1-like) di cui fanno parte anche i geni DSCR1 (21q22.12) e DSCR1L1 (6p12.3). Le sequenze del cDNA di questi geni non presentano alcuna somiglianza con quelle di membri di famiglie geniche note. L’analisi genomica mostra che, mentre gli invertebrati contengono un solo gene di tipo DSCR1-like, nei vertebrati sono presenti tre membri della famiglia. Lo studio dei loci DSCR1, DSCR1L1 e DSCR1L2 mostra l’esistenza nel genoma umano di una nuova regione di paralogia segmentale di circa 500 kb che comprende l’1,4% del cromosoma 21, nella quale si trovano nello stesso ordine tre membri delle tre famiglie geniche DSCR1L, Runt (AML, acute myeloid leukemia) e CLIC (chloride intracellular channel). L’analisi filogenetica mostra una divergenza tardiva di DSCR1L1 e DSCR1L2 dal gene DSCR1 più ancestrale, e la conservazione della paralogia segmentale fin dai vertebrati inferiori. Lo studio dell’mRNA di DSCR1L2 mostra una espressione ubiquitaria del gene, con un livello molto alto di espressione nel tessuto muscolare, in particolare in quello cardiaco. L’analisi bioinformatica e mediante reazione a catena della polimerasi dopo retrotrascrizione (RT-PCR) ha permesso di identificare tre isoforme di mRNA generate da splicing alternativo. Una delle isoforme si ottiene per perdita degli esoni 2 e 3 del gene, con conseguente perdita della regione codificante per il dominio ricco in prolina caratteristico della famiglia, una seconda forma mostra la perdita dell’esone 2, mentre la terza si caratterizza per la mancanza di 30 basi codificanti per 10 amminoacidi nella regione centrale della proteina. E’ stato recentemente dimostrato da altri Autori che le proteine DSCR1 e DSCR1L1 si legano alla Calcineurina (CnA), una fosfatasi calcio-calmodulina dipendente che modula l’espressione genica nel muscolo scheletrico e cardiaco durante lo sviluppo e in condizioni di ipertrofia provocata da stress ambientali o da patologie. Da parte di più Autori è stato supposto il legame anche di DSCR1L2 con la CnA stessa nonostante l’assenza di prove sperimentali, solo sulla base dell’omologia di sequenza. Il test dei due ibridi in lievito da noi eseguito per individuare l’interazione proteina-proteina tra DSCR1L2 e una o più proteine tradotte a partire dai cDNA presenti in una genoteca di cuore umano non ha potuto tuttavia rilevare nessuna interazione con la CnA. E’ stata invece dimostrata l’interazione tra DSCR1L2 e la troponina I (TNNI3) cardiaca umana, la subunità inibitoria del complesso delle troponine coinvolte nella contrazione muscolare. L’interazione con TNNI3 della proteina DSCR1L2 mostra un caso interessante di divergenza funzionale nell’ambito della famiglia genica DSCR1L, e contribuisce alla chiarificazione dei complessi proteici implicati nella contrazione muscolare. Inoltre, abbiamo identificato un secondo interattore proteico di DSCR1L2, corrispondente a un cDNA tradotto secondo un modulo di lettura non fisiologico; questo polipeptide non naturale di 48 amminoacidi potrebbe risultare di interesse farmacologico per il suo eventuale ruolo nella modulazione della funzione di DSCR1L2. L’interazione tra DSCR1L2 e TNNI3 è stata confermata mediante cotrasformazione in lievito dei due plasmidi contenenti DSCR1L2 e TNNI3. Una ulteriore conferma di tale interazione viene da esperimenti di coimmunoprecipitazione in vitro. La zona di interazione è stata infine mappata mediante cotrasformazione del cDNA corrispondente alla isoforma di splicing di DSCR1L2 mancante degli esoni 2 e 3 e del cDNA di TNNI3. I risultati mostrano l’assenza di interazione, individuando la zona di interazione nei domini codificati dagli esoni 2 e 3.