Search

Nicotiana benthamiana is an important model plant for plant-microbe interaction studies. Here, we compared ribosome profiles and riboproteomes of healthy and infected N. benthamiana plants. We affinity purified ribosomes from transgenic leaves expressing a FLAG-tagged ribosomal large subunit protein RPL18B of Arabidopsis thaliana. Purifications were prepared from healthy plants and plants that had been infiltrated with Agrobacterium tumefaciens carrying infectious cDNA of Potato virus A (PVA) or firefly luciferase gene, referred to here as PVA- or Agrobacterium-infected plants, respectively. Plants encode a number of paralogous ribosomal proteins (r-proteins). The N. benthamiana riboproteome revealed approximately 6600 r-protein hits representing 424 distinct r-proteins that were members of 71 of the expected 81 r-protein families. Data are available via ProteomeXchange with identifier PXD011602. The data indicated that N. benthamiana ribosomes are heterogeneous in their r-protein composition. In PVA-infected plants, the number of identified r-protein paralogues was lower than in Agrobacterium-infected or healthy plants. A. tumefaciens proteins did not associate with ribosomes, whereas ribosomes from PVA-infected plants co-purified with viral cylindrical inclusion protein and helper component proteinase, reinforcing their possible role in protein synthesis during virus infection. In addition, viral NIa protease-VPg, RNA polymerase NIb and coat protein were occasionally detected. Infection did not affect the proportions of ribosomal subunits or the monosome to polysome ratio, suggesting that no overall alteration in translational activity took place on infection with these pathogens. The riboproteomic data of healthy and pathogen-infected N. benthamiana will be useful for studies on the specific use of r-protein paralogues to control translation in infected plants.

Viruses are the most abundant entities in the biosphere, the estimated amount of viruses is more than 10^30. The number is incomprehensible and exceeds the amount of host cells at least by one order of magnitude. Viruses are extremely diverse entities by means of morphologies, sizes, genomes and biochemical and biophysical properties. As obligate parasites, viruses can only be propagated in living cells. This sets challenges for the virus purification, since the starting material contains host and growth media derived impurities. Medical applications such as phage therapy, vaccine development, and gene therapy require large amounts of highly purified viruses and virus-like particles (VLPs). Nanotechnology utilizes viruses and VLPs as building blocks for nanoscale materials and devices and also requires virus purification methods which maintain the biophysical and biochemical properties of the particles. Viruses are often purified with combinations of different methods. The most common ones are precipitation and ultracentrifugation. Precipitation does not lead into high purities and is generally applied as a pre-step for purification. Ultracentrifugation leads to high purity but it exposes viruses to high shear forces possibly leading to losses of infectivity. The large size of many viruses may restrict utilization of traditional chromatography. However, monolithic matrices are applicable for virus purification. In this work asymmetrical flow field-flow fractionationation (AF4) method was developed for virus purification. AF4 is a highly versatile size-based separation method applicable for samples with sizes ranging between ~1‒500 nm. The separation in AF4 is conducted with the aid of liquid flows. Solid stationary phase is not applied at all, thus no strong interactions during the separation occur making the method gentle. Several parameters in the AF4 system are adjustable, making the method highly versatile and an attractive alternative for virus purification. In this study, AF4 conditions were optimized for purification of six prokaryotic viruses, having different morphologies and properties. Analytical sample channel and preparative UV-detector were utilized. Yields of infective viruses were high and purity levels comparable to the ones obtained with a method based on precipitation and ultracentrifugation. AF4 was proven to be applicable for all tested viruses, also the ones requiring high ionic strength conditions were amenable for AF4 purification. The AF4-method is fast and obtained virus preparations were homogenous. As the system is highly versatile, it is expected that it can be tailored for other viruses as well, to meet the further needs of virus purification. Virusten määrä ympäristössämme on tähtitieteellinen. Viruspartikkeleita on arvioitu olevan biosfäärissä jopa 10^30 kappaletta, näinollen ylittäen isäntäsolujen määrän jopa kymmenkertaisesti. Virukset ovat hyvin kirjava joukko niin morfologioiden, kokojen, genomien kuin biokemiallisten ja – fysikaalisten ominaisuuksiensa suhteen. Kuitenkin, virukset voivat lisääntyä ainoastaan elävissä soluissa. Tämä asettaa omat haasteensa viruspartikkelien puhdistamiselle, sillä lähtömateriaali sisältää isäntäsolusta ja kasvatusalusta peräisin olevia epäpuhtauksia. Lääketieteen sovellutukset, kuten faagiterapia, rokotekehitys ja geeniterapia tarvitsevat suuria määriä korkean puhtaustason viruksia ja viruksen kaltaisia partikkeleita. Nanoteknologiassa korkean puhtaustason viruksia ja viruksen kaltaisia partikkeleita käytetään rakennuspalikoina nanomittaluokan materiaaleissa. Lääketiede, nanoteknologia ja muut viruksia hyödyntävät alat tarvitsevat nopeita ja tehokkaita viruspuhdistusmenetelmiä, jotka säilyttävät viruksen ominaisuudet ja johtavat korkeisiin saantoihin. Useimmiten viruspuhdistuksessa yhdistellään eri menetelmiä. Yleisimpiä näistä menetelmistä ovat saostus ja ultrasentrifugaatio. Saostus ei yksin johda korkeaan puhtaustasoon ja sitä käytetäänkin tavallisesti puhdistuksen ensimmäisenä askeleena. Ultrasentrifugoinnilla sen sijaan saavutetaan korkea puhtausaste, mutta altistetaan virukset koville sentrifugointivoimille. Tämä saattaa johtaa partikkelien vahingoittumiseen ja infektiivisyyden menettämiseen. Virukset ovat makromolekulaarisia komplekseja, joten niiden koko rajoittaa useiden perinteisten kromatografiamenetelmien käyttöä niiden puhdistuksessa. Tässä työssä kehitettiin viruspuhdistusmenetelmä asymmetrista virtauskenttäfraktiointia (AF4) hyödyntäen. AF4 on hyvin monipuolinen, kokoon perustuva erottelumenetelmä näytteille kokoluokassa ~1‒500 nm. Erottelu saadaan aikaiseksi nestevirtauksilla eikä menetelmässä käytetä lainkaan kiinteä stationäärifaasia. AF4-erottelu onkin erityisen hellävarainen menetelmä, sillä voimakkaita vuorovaikutuksia näytteen ja laitteiston välillä ei synny. Lukuisat AF4-laitteiston ominaisuudet ovat säädettävissä näytteen erityispiirteille sopiviksi, tehden menetelmästä houkuttelevan vaihtoehdon viruspuhdistuksessa. Tässä projektissa AF4-olosuhteet optimoitiin viruspuhdistuksen tarpeisiin kuutta prokaryoottivirusta hyödyntäen. Optimointiin käytetyt virukset edustivat eri morfologiatyyppejä hyvin erilaisine ominaisuuksineen. Laitteistossa käytettiin analyyttista näytekanavaa ja preparatiivista UV-detektoria. Virussaannot olivat korkeita ja puhtaustaso vastasi saostuksen ja ultrasentrifugoinnin yhdistelmällä saavutettavaa puhtautta. Osoitimme AF4-menetelmän soveltuvan kaikille testatuille viruksille, myös niille, jotka vaativat korkeita suolapitoisuuksia säilyttääkseen infektiivisyytensä. AF4-menetelmä on nopea ja puhdistetut viruspreparaatit laadultaan homogeenisia. Perinteinen, saostukseen ja ultrasentrifugointiin pohjautuva puhdistusmenetelmä on työläs ja aikaa vievä. AF4-menetelmällä puhdistusaika lyheni merkittävästi ja korkeiden saantojen vuoksi lähtömateriaalin tarve väheni moninkertaisesti. Koska AF4-menetelmä on helposti muokattavissa, sen voi olettaa soveltuvan myös muille kuin työssä testatuille viruksille ja eri tieteenalojen viruspuhdistuksen tarpeisiin.