Search

ÖZETAmaç: Preimplantasyon Genetik Tanı (PGT)’da tek gen hastalıkları taraması ile kombine HLA doku tiplemesi tayini TalasemiMajör gibi yaşamı tehdit eden ve kordon kanı ve /veya kemik iliği nakli ile tam olarak tedavi edilebilen genetik hastalıklarasahip çocuklar için etkin bir yöntemdir. Bu çalışmada, Sağlık Bilimleri Üniversitesi Dışkapı Yıldırım Beyazıt Eğitim AraştırmaHastanesi Genetik Tanı Merkezi Preimplantasyon Genetik Tanı Laboratuvarında 2014-2017 Mayıs döneminde çalışılanvakaların verileri sunulmuştur.Gereç ve Yöntem: Laboratuvarımıza Sağlık Bilimleri Üniversitesi Etlik Zübeyde Hanım Kadın Hastalıkları Tüp BebekMerkezinden gelen 6-8 blastomer aşamasındaki 3. Gün embriyolarından alınan biyopsi örneklerinde preimplantasyongenetik tanı uygulamaları yapılan 91 vakanın genetik analiz sonuçları, mutasyon tipleri, implantasyon ve gebelik başarısı ilecanlı doğum oranları değerlendirildi. Biyopsi örneklerine uygulanan lizis işleminin ardından REPLI-g Advanced DNA SingleCell Kit (Qiagen, USA) ile Whole Genom Amplification (Biorad T100, USA) gerçekleştirildikten sonra mutasyonu taşıyanDNA fragmentlerinin ve HBB geni ile ilişkili 11 markırın belirlenebilir seviyeye kadar multiplex Polimeraz Zincir Reaksiyonu(PZR) ile çoğaltılması yapıldı. Amplifikasyondan sonra DNA, normal DNA fragmentlerini mutasyonu taşıyan fragmentlerdenayırt etmeye olanak sağlayan mini-sekanslama tekniği ile kapiller elektroforez kullanılarak analiz edildi. Seçilmiş LinkedMarkerlar (STR: Short Tandem Repeat/ Kısa tekrar dizileri) mutasyonun tanısı için bir destek oluşturma ve bazı DNAkontaminasyonlarının belirlenmesi amacıyla kullanıldı. HLA tipleme analizlerinde uyumlu HLA genotiplerinin belirlenmesiiçin HLA kompleksi ile ilişkilendirilen 32 markır, multipleks PZR ile çalışılarak DNA fragmentleri kapiller elektroforezkullanılarak analiz edildiBulgular: 86 vaka Beta Talasemi (HBB geni) , bir vaka Orak Hücreli Anemi (HBB geni), bir vaka Blackfan Diamond Anemisi(RPS19 geni), bir vaka akut lenfoblastik lösemi, bir vaka Ağır Konjental Nötropeni (HAX1 geni) ve bir vaka Fankoni AplastikAnemisi (FANCA geni) olmak üzere toplamda 91 vaka çalışıldı. Toplam çalışılan blastomer sayısı 328, transferi yapılan vakasayısı 41, gebelik gerçekleşen vaka sayısı 12, gerçekleşen canlı doğum sayısı 8 ve kemik iliği nakil işlemi yapılan vaka sayısı 6olarak saptandı. Canlı doğumların tümünde gerçekleştirilen ikinci genetik analizde sağlıklı/taşıyıcı gen ve HLA tipinde hastakardeş ile tam uyum görüldü.Sonuç: Sonuçlarımız kemik iliği nakli ile tam kür sağlanan genetik hastalıkların tedavisinde ailede sağlıklı ve HLA uyumluçocuk varlığının önemi açısından anlamlıdır. Diğer preimplantasyon genetik test uygulanan hastalıklarla karşılaştırıldığındatransfer edilebilir blastomer bulma oranının düşük olduğu görülmüş ve bunun blastomerde iki farklı genetik seçilimyapılması gerekliliğinden kaynaklandığı düşünülmüştür.Anahtar Kelimeler: Preimplantasyon genetik tanı; HLA uyumu; Tek gen hastalığı; Multipleks polimeraz zincir reaksiyonu;Kısa tekrar dizileri markırı; DNA sekans analiziABSTRACTPurpose: Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) of single gene disorders combined with HLA typing is an effectivemethod for life-threatening genetic diseases such as Beta thalassemia major which can be treated with bone marrowtransplantation. The aim of this study is to present the data of the cases evaluated between May 2014-May 2017 in the PGDLaboratory of Genetic Diagnosis Center, Dışkapı Yıldırım Beyazıt and Research Hospital, Health Sciences Faculty.Material and Methods: We evaluated the results of genetic analysis, the success of implantation and pregnancy, and therate of live births of 91 cases which was biopsied from blastomeres of 6-8 stage of the 3th day embryos. After the WholeGenome Amplification with REPLI-g Advanced DNA Single Cell Kit (Qiagen, USA) preceded by the lysis of biopsy samples,DNA fragments and HBB related 11 markers were amplified until the predicted level with polymerase chain reaction (PCR).After the amplification, DNA was analyzed with mini-sequencing technique using capillary electrophoresis in order todistinguish normal DNA fragments from the mutated ones. Selected linked markers were used to support the diagnosisof mutation and determinate DNA contaminants. HLA complex related 32 markers were studied with multiplex PCR andDNA fragments were analyzed using capillary electrophoresis in order to determinate compatible HLA genotypes in HLAtyping analyses.Results: We studied a total of 91 cases consisting of 86 cases of beta thalassemia (HBB gene), one case of sickle celldisease (HBB gene), one case of acute lymphoblastic lymphoma, one case of severe congenital neutropenia (HAX1 gene)and one case of Fanconi aplastic anemia (FANCA gene). The total number of blastomeres studied were 328, 41cases weretransferred, and there were 12 successful pregnancies with 8 live births. There were also 6 cases which were treated withbone marrow transplantation. The second genetic analysis of all live births revealed that healthy/carrier gene and HLAtyping of affected sibling was full matched.Conclusion: Our results have significant importance for the treatment of genetic disease which cure is possible with bonemarrow transplantation in the presence of HLA matched sibling. The rate of transferable blastomere were lower than othergenetically tested diseases; however, the reason of this difference was probably the necessity of making two differentgenetic selections.Key words: Preimplantation Genetic Diagnosis, HLA Matching, Single Gene Disorder, Multiplex polimeraz chain reaction,Short Tandem Repeat Marker, Sequence analysis DNA

Tip 2 diyabet etiyolojisinde birçok genin birbiriyle etkileşmesi ve poligenik doğasına ilaveten obezite, fiziksel aktivite gibi çevresel faktörler bulunmaktadır. Multifaktöryel kalıtım özelliği olması, tip 2 diyabette bir genin fenotip üzerindeki etkisinin belirlenmesini zorlaştırmaktadır. PPAR? geni tip 2 diyabette en önemli aday genlerdendir ve tip 2 diyabetle ilişkili farklı mutasyonları gösterilmiştir. Ancak bugüne kadar PPAR? geninde tip 2 diyabetle ilişkili büyük delesyon ve/veya duplikasyon bildirilmemiştir.Pamukkale Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik AD'da gerçekleştirilen bu çalışmada Üniversitemiz Sağlık Araştırma ve Uygulama Merkezi Endokrinoloji ve Metabolizma Hastalıkları polikliniğinde, klinik ve biyokimyasal çalışmalarla Tip 2 diyabet tanısı almış 150 olguda Tip 2 DM hastalarına yönelik olarak dizayn edilmiş Salsa MLPA Probemix P224 PPAR? kitleri kullanılarak, PPAR?1 transkriptini kodlayan 8 ekzondaki delesyon ve/veya amplifikasyonlar incelendi. MLPA yöntemiyle Tip 2 diyabet gelişiminde PPAR? geninde delesyon ve/veya duplikasyon varlığına ilişkin bir veri elde edilmedi. Buna neden olabilecek faktörler gözden geçirildi ve sonuçlar literatürdeki PPAR? ve diyabet ilişkisini açıklamış olan veriler eşliğinde tartışıldı. Ayrıca ticari olarak MLPA'da kullanılmak üzere hazırlanmış olan probmiks kitinin, PPAR? genindeki mutasyonların saptanmasında yeterli olmadığı düşünüldü.Tip 2 diyabet'li olguların demografik özellikleri incelendiğinde, bu çalışmadaki olguların birçoğunun vücut kitle indeksine göre kilolu ya da obez olduğu görülürken, erkek olgu sayısının kadınlara oranla daha fazla olduğu saptandı. Tip 2 diyabetli olguların akrabalarında da tip 2 diyabet görülme sıklığının arttığı ve olguların %52,6'sının birinci derece akrabasında tip 2 diyabet olduğu saptandı.Sonuç olarak tip 2 diyabette PPAR? genindeki dengesiz büyük yeniden düzenlenmelerin tespiti için ticari olarak hazırlanmış probmiks kiti yeterli değildir ve ileride yapılacak çalışmalarda farklı probların yer aldığı probmiks ile PPAR? geni incelenebilir. Bununla birlikte tip 2 diyabette PPAR?'da büyük delesyon ve duplikasyon bulunmayabilir. Ayrıca tip 2 diyabet ile ilişkili olabilecek başka genlerin dengesiz büyük genomik yeniden düzenlenmeleri de söz konusu olabilir. In addition to its polygenic nature and interactions of multiple genes, environmental factors such as obesity and physical activity are also considered to be underlying etiology of type 2 diabetes mellitus. The difficulty in determining the effect of a gene on phenotype is because of multifactorial inheritance in type 2 diabetes. PPAR? is one of the important genes in type 2 diabetes, in which different mutations related to type 2 diabetes have been demonstrated. To date, however, neither large deletion nor duplication have been reported in PPAR? gene in type 2 diabetes.This study was conducted in department of Medical Genetics, Pamukkale University School of Medicine. Salsa MLPA Probemix P224 PPAR? kit, which is designed for type 2 diabetes, were used to analyze deletions and/or amplifications in 8 exons that codes PPAR?1 transcript in 150 patients who were diagnosed as type 2 diabetes in Endocrinology and Metabolic Disorders department. No deletion and/or duplication was detected by MLPA method. The factors that could be associated with this finding were reviewed. The results were discussed with the reports in literature about association between PPAR? and type 2 diabetes. Furthermore, the commercial MLPA probmix kit was considered to be insufficient in detecting the mutations in PPAR? gene.We analysed the demographic characteristics of the patients with type 2 diabetes. Body mass index of most of the patients were in overweighted and obesity range. Male to female ratio was higher. It is revealed that positive family history confered an increased risk for type 2 diabetes and 52,6% of first degree relatives of our patients had type 2 diabetes.In conclusion, commercial probmix kit designed for the detection of large genomic rearrangements in PPAR? gene for type 2 diabetes was insufficient. For the future studies PPAR? gene can be investigated with different probmix probes. But it is probable that there is neither deletion nor duplication in PPAR? gene and furthermore large genomic rearrangements in different genes can be associated with type 2 diabetes. 92