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Tesis de Doctorado en Biología Molecular y Biotecnología El desarrollo de resistencia a drogas durante la quimioterapia es una de las principales causas de recurrencia y mortalidad en cáncer. Las células tumorales modifican su microambiente (MAT) favoreciendo su crecimiento y diseminación, donde la matriz extracelular (MEC) induce señales intra e intercelulares anormales que modulan el comportamiento tumoral. El ácido hialurónico (AH) es el principal glicosaminoglicano que conforma dicha matriz. Su síntesis se incrementa durante el desarrollo tumoral y predominan las formas de bajo peso molecular (BPM), alterando mecanismos como la angiogénesis y la resistencia a drogas. El objetivo del trabajo fue analizar el rol del AH como modulador de la respuesta a drogas usadas en esquemas de quimioterapia. Específicamente, se buscó modificar el entorno tumoral con la adición de AH de BPM, o por alteración de su síntesis endógena durante el tratamiento con doxorrubicina (DOX) y epirrubicina (EPI) en distintos modelos tumorales. Un MAT con alta proporción de AH de BPM activó señales de sobrevida y progresión tumoral que afectaron la eficacia del tratamiento con DOX en modelos de linfoma T y adenocarcinoma mamario. Se observó también un efecto adicional sobre la angiogénesis y la remodelación de la MEC de cada tumor. El tratamiento con AH de BPM y DOX sobre las células tumorales activó señales pro-angiogénicas que aumentaron la migración de células endoteliales y la formación de vasos in vitro e in vivo. Este efecto fue independiente de la modulación de la secreción del VEGF, pero podría guardar relación con un aumento en la expresión de FGF-2 y de vías de señalización relacionadas. Por otro lado, la combinación de AH de BPM y DOX aumentó la secreción de AH endógeno en el modelo de linfoma T, resultado que no se observó en las células de adenocarcinoma mamario. Estos resultados indicarían que el rol modulador del AH sobre el tratamiento antitumoral sería diferencial considerando el origen y el entorno en el cual se desarrolla cada tipo de neoplasia. Por otro lado, estudiamos el rol de la enzima UDP-glucosa deshidrogenasa (UGDH) sintetiza el ácido-UDP-glucurónico, precursor necesario para la síntesis del AH y reacciones de inactivación de drogas como la EPI. Al silenciar la expresión de UGDH durante el tratamiento con EPI, las células de adenocarcinoma mamario acumularon más EPI en su interior, sin embargo, los niveles de apoptosis no se modificaron. Estos resultados estuvieron en concordancia con un aumento en la migración, angiogénesis y autofagia, mecanismos relacionados con fenotipos tumorales agresivos y la resistencia a drogas. Además, en tales condiciones, las células tumorales mostraron un aumento en su matriz pericelular principalmente compuesta por AH, asociado a con un desbalance entre la expresión de las enzimas que sintetizan y degradan el AH. Este trabajo presenta clara evidencia que un estroma tumoral adverso dado por la alteración de los niveles de AH, no solo afecta a las propias células tumorales, sino que puede modular el comportamiento de las células endoteliales asociadas y alterar la eficacia de los tratamientos quimioterapéuticos. Por lo tanto, modular la acumulación de AH en la MEC tumoral, utilizando fármacos que alteren su metabolismo, resultaría clave para evadir los mecanismos de “resistencia estromal” que a su vez promueven el desarrollo de resistencia a drogas y, así incrementar la eficacia de los tratamientos antitumorales. Fil: Vitale, Daiana Lujan. Universidad Nacional de San Martín. Escuela de Bio y Nanotecnologías. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; Buenos Aires, Argentina.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia Com o passar dos anos, as doenças cancerígenas tornaram-se um dos maiores e mais letais problemas de saúde em todo o mundo. No entanto, os tratamentos convencionais contra o cancro têm vindo a ser caracterizados como muito invasivos e prejudiciais para os pacientes, devido aos efeitos secundários indesejáveis e à alta toxicidade, uma vez que não apresentam especificidade para células tumorais. Numa tentativa de superar essas limitações, a nano e a biotecnologia surgiram como ferramentas inteligentes para transportar e entregar agentes terapêuticos no tratamento do cancro e torná-los mais eficientes.As nanopartículas mesoporosas de sílica (MSN) são um nanossistema de entrega promissor com propriedades físico-químicas notáveis, que podem oferecer uma abordagem interessante para a atual investigação no tratamento do cancro e para a prática clínica. Assim, este trabalho tem como objetivo desenvolver e caracterizar um novo sistema de entrega, baseado em MSN, para uma potencial terapia combinada contra Carcinoma Hepatocelular (CHC), utilizando um Interferon α-2b humano recombinante (IFNα-2b) e Epirrubicina (Epi) como agentes terapêuticos.Durante este projeto, as MSN foram sintetizadas e modificadas com (3-Aminopropil) trietoxisilano (APTES) para serem funcionalizados com ácido hialurónico (HA), o que permite que as partículas se liguem especificamente às células tumorais. As nanopartículas obtidas (MSN-HA) apresentaram uma superfície carregada negativamente e um diâmetro hidrodinâmico médio de 467 nm, determinado pelas leituras de LDV e DLS.O IFNα-2b recombinante foi produzido e purificado com sucesso, resultando num grande stock de proteína para ensaios de carregamento e citotoxicidade. Ambos os agentes terapêuticos foram carregados nas MSN-HA, apresentando resultados de alta eficiência e capacidade de carregamento, quando comparados com estudos anteriores.Finalmente, a biocompatibilidade das nanopartículas e o potencial terapêutico do nanossistema carregado foram avaliados em células HepG2. O resultado final foi bastante promissor, uma vez que o MSN-HA provou ser biocompatível quando descarregado, e as nanopartículas carregadas com Epi e IFNα-2b mostraram um efeito antitumoral sinergístico. Over the years, cancer diseases have become one of the biggest and most lethal health problems worldwide. However, conventional cancer treatments have shown to be too invasive and harmful for patients, due to undesirable side effects and high toxicity since they don’t present specificity for tumour cells. In order to try to overcome these limitations nano and biotechnology emerged as smart tools to transport and deliver therapeutic agents in cancer treatment and making them more efficient. Accordingly to that, mesoporous silica nanoparticles (MSN) are a promising delivery nanosystem with remarkable physicochemical properties that can offer an interesting approach for the current cancer treatment research and clinical practice. Thus, this work aims to develop and characterize a new delivery system, based on MSN’s, to a potential combination therapy against Hepatocellular Carcinoma (HCC), using a recombinant human Interferon α-2b (IFNα-2b) and Epirubicin (Epi) as therapeutic agents.During this project, MSN were synthesized and modified with (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) to be functionalized with hyaluronic acid (HA), which allowed them to specifically bind to tumour cells. The obtained nanoparticles (MSN-HA) presented a negatively charged surface and an average hydrodynamic diameter of 467 nm, determined by Laser Doppler Velocimetry (LDV) and Dynamic Light Scattering (DLS) readings. Recombinant IFNα-2b was successfully produced and purified resulting in a great protein stock for loading and cytotoxicity assays. Both therapeutic agents were loaded in MSN-HA presenting high loading efficiency and capacity results when compared with previous studies.Finally, nanoparticles’ biocompatibility and the therapeutic potential of the loaded nanosystem were evaluated in HepG2 cells. The outcome was very promising, since MSN-HA were proven to be biocompatible when unloaded, and the loaded nanoparticles with Epi and IFNα-2b have shown a synergistic antitumour effect.

Esse trabalho consiste no estudo da interação entre o biopolímero quitosana e o quimioterápico epirrubicina através de analise de resultados de simulações efetuadas no programa GROMACS. A realização da revisão da literatura forneceu as bases que motivaram o uso da dinâmica molecular e a escolha da quitosana e da epirrubicina para modelar nossos sistemas. Os procedimentos adotados envolveram a geração da topologia das moléculas no campo de força OPLS-AA (Optimized potentials for liquid simulations-all-atom), o qual é um campo de força robusto tendo a vantagem, oferecida pela opção (AA), de tratar os átomos separadamente. Toda metodologia empregada foi ajustada para esse campo de força. Primeiramente, a atribuição de cargas dos átomos foi feita calculando cargas RESP (Restrained Eletrostatic Potential). Posteriormente, as cargas de átomos de hidrogênio negativos foram substituídas por valores consultados no campo de força atribuindo o mesmo valor de carga a grupos idênticos. As curvas de microespécies da epirrubicina obtida no programa MARVINSKETCH forneceu a estrutura majoritária a pH (7,4; 9; 10). Após o preparo dos arquivos PDB das estruturas foi feito o cálculo de ancoragem molecular no progrrama autodock. Em seguida foram modelados três sistemas formados por um filamento de quitosana e uma molécula de epirrubicina. Os cálculos de dinâmica molecular para esses sistemas tiveram em vista a caracterização da forma como a quitosana interage com a epirrubicina. Porem, os resultados mostraram que as moléculas são inertes e os sistemas são muito instáveis. A discussão dos resultados foi reforçada por cálculos do número de ligações de hidrogênio e de mínima distancia entre a quitosana e a epirrubicina. A fim de aprofundar a análise dos resultados foi feita a modelagem de um sistema com massa de quitosana quatro vezes maior. Os resultados confirmaram que o complexo não se forma e mostraram a importância da realização de uma caracterização prévia por dinâmica molecular, antes da execução de procedimentos experimentais. This work is part of the study of the interaction between the chitosan biopolymer and the epirubicin chemotherapy through the analysis of the results of simulations performed in the GROMACS program. The literature review provided the basis for the use of molecular dynamics and the choice of chitosan and epirubicin to model our systems. The procedures adopted involved the generation of the topology of molecules in the OPLS-AA (Optimized potentials for liquid simulations-all-atom) force field, which is a robust force field having the advantage, offered by the option (AA), of treating the atoms separately. All methodology used has been adjusted for this force field. First, the assignment of atom loads was made by calculating loads RESP (Restrained Eletrostatic Potential). Later, the loads of negative hydrogen atoms were replaced by values consulted in the force field assigning the same load value to identical groups. The micro-species curves of epirubicin obtained in the MARVINSKETCH program provided the majority structure at pH (7.4; 9; 10). After the preparation of the PDB files of the structures it was made the calculation of molecular anchorage in the autodock progrgram. Then three systems formed by a chitosan filament and an epirubicin molecule were modeled. The molecular dynamics calculations for these systems were aimed at characterizing how chitosan interacts with epirrubicin. However, the results showed that the molecules are inert and the systems are very unstable. The discussion of the results was reinforced by calculations of the number of hydrogen bonds and the minimum distance between the chitosan and the epirrubicin. In order to deepen the analysis of the results, a system with four times the chitosan mass was modelled. The results confirmed that the complex is not formed and showed the importance of performing a previous characterization by molecular dynamics, before the execution of experimental procedures. Dissertação (Mestrado)

Clinical Trial, Phase III; Comparative Study; Journal Article; Randomized Controlled Trial; Research Support, Non-U.S. Gov't; BACKGROUND Taxanes are among the most active drugs for the treatment of metastatic breast cancer, and, as a consequence, they have also been studied in the adjuvant setting. METHODS After breast cancer surgery, women with lymph node-positive disease were randomly assigned to treatment with fluorouracil, epirubicin, and cyclophosphamide (FEC) or with FEC followed by weekly paclitaxel (FEC-P). The primary endpoint of study-5-year disease-free survival (DFS)-was assessed by Kaplan-Meier analysis. Secondary endpoints included overall survival and analysis of the prognostic and predictive value of clinical and molecular (hormone receptors by immunohistochemistry and HER2 by fluorescence in situ hybridization) markers. Associations and interactions were assessed with a multivariable Cox proportional hazards model for DFS for the following covariates: age, menopausal status, tumor size, lymph node status, type of chemotherapy, tumor size, positive lymph nodes, HER2 status, and hormone receptor status. All statistical tests were two-sided. RESULTS Among the 1246 eligible patients, estimated rates of DFS at 5 years were 78.5% in the FEC-P arm and 72.1% in the FEC arm (difference = 6.4%, 95% confidence interval [CI] = 1.6% to 11.2%; P = .006). FEC-P treatment was associated with a 23% reduction in the risk of relapse compared with FEC treatment (146 relapses in the 614 patients in the FEC-P arm vs 193 relapses in the 632 patients in the FEC arm, hazard ratio [HR] = 0.77, 95% CI = 0.62 to 0.95; P = .022) and a 22% reduction in the risk of death (73 and 95 deaths, respectively, HR = 0.78, 95% CI = 0.57 to 1.06; P = .110). Among the 928 patients for whom tumor samples were centrally analyzed, type of chemotherapy (FEC vs FEC-P) (P = .017), number of involved axillary lymph nodes (P < .001), tumor size (P = .020), hormone receptor status (P = .004), and HER2 status (P = .006) were all associated with DFS. We found no statistically significant interaction between HER2 status and paclitaxel treatment or between hormone receptor status and paclitaxel treatment. CONCLUSIONS Among patients with operable breast cancer, FEC-P treatment statistically significantly reduced the risk of relapse compared with FEC as adjuvant therapy. Yes

The resistance to chemotherapy and the tumor escape from host immunosurveillance are the main causes of the failure of anthracycline-based regimens in breast cancer, where an effective chemo-immunosensitizing strategy is lacking. The clinically used aminobisphosphonate zoledronic acid (ZA) reverses chemoresistance and immunoresistance in vitro. Previously we developed a nanoparticle-based zoledronic acid-containing formulation (NZ) that allowed a higher intratumor delivery of the drug compared with free ZA in vivo. We tested its efficacy in combination with doxorubicin in breast tumors refractory to chemotherapy and immune system recognition as a new combinatorial approach to produce chemo- and immunosensitization. NZ reduced the IC50 of doxorubicin in human and murine chemoresistant breast cancer cells and restored the doxorubicin efficacy against chemo-immunoresistant tumors implanted in immunocompetent mice. By reducing the metabolic flux through the mevalonate pathway, NZ lowered the activity of Ras/ERK1/2/HIF-1α axis and the expression of P-glycoprotein, decreased the glycolysis and the mitochondrial respiratory chain, induced a cytochrome c/caspase 9/caspase 3-dependent apoptosis, thus restoring the direct cytotoxic effects of doxorubicin on tumor cell. Moreover, NZ restored the doxorubicin-induced immunogenic cell death and reversed the tumor- induced immunosuppression due to the production of kynurenine, by inhibiting the STAT3/indoleamine 2,3 dioxygenase axis. These events increased the number of dendritic cells and decreased the number of immunosuppressive T-regulatory cells infiltrating the tumors. Our work proposes the use of nanoparticle encapsulating zoledronic acid as an effective tool overcoming at the same time chemoresistance and immunoresistance in breast tumors, thanks to the effects exerted on tumor cell and tumor-infiltrating immune cells.

Some drugs, such as doxorubicin, among other mechanisms act by triggering apoptosis, which not only affects the tumor but also normal cells in the body. Therefore, the study of the side effects of chemotherapy, seeking a less aggressive treatment for cancer patients, justifies this work. The objective was to investigate the hematological and gastrointestinal effects of doxorubicin and tamoxifen when used alone or in combination in male mice with or without the Ehrlich ascites tumor, with or without hormone therapy with estradiol cypionate. A total of 40 Balb / C male mice were divided into groups of 5 animals each, making 8 groups. At the end of 21 days, blood samples were collected for CBC (Complete Blood Count), aiming at evaluating parameters such as RBC count and hematocrit, hemoglobin, white blood cells count and platelets count. Samples of the stomach and intestines of the animals treated with hydrochloride doxorubicin, were also collected for histopathologic analysis, evaluating when present, the degree of damage to the epithelium and the degree of necrosis and apoptosis glands. The evaluation of the number of erythrocytes and the hematocrit value was significantly decreased (p

Dissertação de mestrado em Bioquimica apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra O cancro da mama é uma doença heterogénea e é a maior causa de morte por cancro entre as mulheres. A quimioterapia é um tipo de tratamento essencial à sobrevivência e à qualidade de vida dos pacientes com cancro da mama. Contudo, a quimioterapia pode estar associada a uma toxicidade em células não cancerígenas sendo, deste modo, limitada por efeitos secundários severos. Por outro lado, o seu efeito terapêutico pode ser temporário e, muitas vezes, os pacientes acabam por desenvolver resistência a muitos agentes de quimioterapia. Os sistemas de transporte e entrega de fármacos foram propostos como uma estratégia para combater estas limitações. Os nanosistemas, quando desenvolvidos com base em estratégias de direcionamento passivo e activo, têm o potencial de aumentar a concentração intracelular dos fármacos no tumor e evitar a toxicidade nos outros tecidos. Neste contexto, vários estudos têm sido realizados por forma a desenvolver formulações de lipossomas que possam ser utilizadas como sistemas de transporte e entrega de agentes de quimioterapia. O objectivo deste trabalho consistiu no desenvolvimento de uma nova formulação de lipossomas, para transporte e entrega de fármacos, que tivesse a capacidade de direcionar e libertar a epirrubicina especificamente nas células do cancro da mama, através da utilização de um Affibody® contra o EGFR. Desta forma, esta estratégia poderia aumentar substancialmente a eficiência dos tratamentos do cancro da mama disponíveis actualmente. Para isso, foram desenvolvidas novas formulações de lipossomas, a partir de lipossomas convencionais compostos por HSPC e colesterol, aos quais se acrescentou DSPG (lípido aniónico) e DSPE-PEG (lípido modificado com um polímero hidrofílico). Após a encapsulação do fármaco, realizou-se a caracterização das formulações tendo em conta a eficiência de encapsulação do fármaco, o tamanho e estabilidade dos lipossomas. Os resultados obtidos mostraram que a incorporação de DSPG nos lipossomas aumentou a eficiência de encapsulação da epirrubicina. Por sua vez, a inclusão de DSPE-PEG nos lipossomas resultou num aumento de libertação do fármaco durante o armazenamento. Contudo, este efeito foi anulado na presença de 10% de FBS. A formulação de lipossomas composta por HSPC:Chol:DSPG:DSPE-PEG (6:3:0,6:0,4 razão molar) combina a elevada capacidade de encapsulação de epirrubicina com características de superfície e tamanho (perto de 150nm) favoráveis ao seu direcionamento passivo e acumulação nos tumores sólidos. Os estudos de actividade antitumoral in vitro, realizados numa linha celular de cancro da mama do tipo triplo-negativa (células MDA-MB-231), mostraram que existiam apenas pequenas diferenças, em termos de morte celular, entre as diferentes formulações de lipossomas desenvolvidas. Verificou-se também que a epirrubicina livre apresentou uma citotoxicidade muito superior à epirrubicina encapsulada nas formulações de lipossomas. Este facto deve-se, muito provavelmente, à associação celular reduzida das formulações de lipossomas desenvolvidas. Neste sentido, uma estratégia de vectorização específica para o cancro da mama poderá ser solução para aumentar a internalização celular dos liposomas contendo epirrubicina e, consequentemente, a sua eficácia terapêutica. Por outro lado, o conteúdo do lipossoma pode ser libertado no microambiente tumoral em resposta a um estímulo específico, nomeadamente em resposta à degradação causada pela enzima sPLA2 (sobrexpressa no cancro da mama). Os resultados obtidos demostraram que a sPLA2 é capaz de induzir a libertação da epirrubicina contida nos lipossomas, sendo a sua actividade dependente da composição dos lipossomas. A incorporação de DSPG nos lipossomas resultou num aumento significativo da actividade da sPLA2. Os resultados obtidos sugerem que os lipossomas HSPC:Chol:DSPG:DSPE-PEG (6:3:0,6:0,4) apresentam um grande potencial para serem utilizados no desenvolvimento de um sistema de transporte e entrega de fármacos que tenha a capacidade de libertar a epirrubicina, nas células de cancro da mama, de forma específica e eficiente. Breast Cancer is a heterogeneous disease and a leading cause of death in women. Chemotherapy is a crucial treatment to improve survival and quality of life of breast cancer patients. However, chemotherapy is limited by severe and harmful toxic effects to normal cells and its effect is not long lasting. Moreover, patients can develop resistance to many different types of chemotherapeutic agents. Regarding this, drug delivery systems have been attempted to overcome these problems. By using both passive and active targeting strategies, nanocarriers can enhance the intracellular concentration of chemotherapeutic agents in cancer cells while avoiding toxic effects on healthy tissues. Moreover, they have the potential to overcome drug resistance. In this context, liposome-based technology has been widely studied and evolved to overcome chemotherapeutic needs. The purpose of this work was to develop a novel liposomal-based drug delivery approach that had the ability to target and release epirubicin specifically to breast tumors, by using an anti-EGFR Affibody® as a targeting moiety, in order to improve the current breast cancer chemotherapeutic strategies. Regarding this goal, several liposomal formulations were developed. A conventional liposome formulation of HSPC and cholesterol was enriched with a steric stabilizer, DSPE-PEG, and an anionic lipid, DSPG. Formulations were characterized according to their size, entrapment efficiency and drug release. The obtained results showed that the incorporation of DSPG into liposomes improved the epirubicin entrapment efficiency. On the other hand, inclusion of DSPE-PEG in liposomes resulted in an increased release of epirubicin during storage. However, this effect was abolished in the presence of 10% FBS. The HSPC:Chol:DSPG:DSPE-PEG (6:3:0.6:0.4 molar ratio) liposome formulation combined high epirubicin encapsulation efficiencies with the surface characteristics and the size (near 150nm) favorable to passively target solid tumors. The in vitro antitumoral activity studies, performed in a triple-negative breast cancer cell line (MDA-MB-231 cells), showed only slight differences, in terms of cell death, between the developed formulations. It was also observed that free epirubicin presented a higher cytotoxicity than the developed liposomal-epirubicin formulations. This fact is most probably due to the reduced cell association registered with these formulations. Therefore, an active targeting strategy would be a promising approach to enhance cellular association and, consequently, the therapeutic efficacy of the epirubicin-containing liposomes. On the other hand, epirubicin could be released from liposomes specifically in the tumor microenvironment in response to a sPLA2 (an enzyme overexpressed in breast tumors) stimulus. The obtained results demonstrated that sPLA2 has the ability to induce the leakage of epirubicin, this sPLA2-mediated drug release being dependent on the liposomes composition. The incorporation of DSPG in the liposomes resulted in a significant increase in the sPLA2 activity. Overall, the obtained results suggest that HSPC:Chol:DSPG:DSPE-PEG (6:3:0.6:0.4 molar ratio) liposomes present a great potential to be used in the development of a drug delivery system that has the ability to specifically and efficiently release epirubicin in breast cancer cells.

Case Reports; Journal Article; A 75-year-old man diagnosed with lower esophageal adenocarcinoma suffered from epirubicin extravasation during the second cycle of neoadjuvant chemotherapy with epirubicin and oxaliplatin. A full recovery was achieved after treatment with dexrazoxane (Cardioxane® ). This is the first time in our hospital that extravasation of an anthracycline has been treated with dexrazoxane. We used Cardioxane® , approved for the prevention of anthracycline-induced cardiotoxicity, while Savene® is indicated for the treatment of anthracycline extravasation. The treatment was effective, and the selection of Cardioxane® (seven-fold cheaper than Savene® ) yielded a cost saving. Consequently, Cardioxane® has been included in our guidelines for anthracycline extravasation. Yes