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La sepsis es un síndrome complejo que provoca una respuesta inmunitaria exacerbada como resultado a una infección, lo que puede causar disfunción orgánica y, en última instancia, la muerte. La sepsis puede avanzar a shock séptico (SS), caracterizado por una disfunción orgánica aguda que puede provocar una insuficiencia circulatoria y metabólica grave, aumentando el riesgo de mortalidad. Los pacientes con sepsis o SS ingresados durante al menos 7 días en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) que presentan disfunción orgánica y necesidad de ventilación mecánica se clasifican como enfermos críticos crónicos (ECC), los cuales, si están ingresados al menos 14 días y cumplen una serie de características inmunológicas y metabólicas específicas, se clasifican como pacientes con PICS (Síndrome de inflamación persistente, activación del catabolismo e inmunosupresión). Por lo tanto, la detección temprana de la sepsis es fundamental para el manejo de la enfermedad, y comprender los mecanismos moleculares que llevan a los diferentes fenotipos clínicos ayudará a predecir su evolución. La identificación de nuevos biomarcadores permite establecer protocolos de seguimiento adecuados para estos pacientes, con el objetivo de reducir la elevada mortalidad y mejorar la calidad de vida de los pacientes sépticos que sobreviven a una sepsis. En esta tesis doctoral se caracterizó, en un modelo de células endoteliales humanas, cómo afectan las histonas citrulinadas. Estas histonas son liberadas al torrente sanguíneo mediante procesos de la inmunidad innata, como la ETosis, siendo el tejido endotelial el primero en entrar en contacto con las histonas. Así mismo, se correlacionaron los niveles plasmáticos de histonas circulantes y citrulinadas con las características clínicas de los pacientes con sepsis y SS supervivientes y no supervivientes. Así, se identificó que las histonas citrulinadas no causan daño a las células endoteliales, aunque sí son capaces de activar respuestas inmunitarias mediadas por el endotelio, facilitando la respuesta inmune. Además, en los pacientes con SS, observamos que las histonas circulantes se relacionaron con factores de coagulación e inmunomodulación, mientras que las histonas circulantes citrulinadas correlacionaron negativamente con los eventos de coagulación. Por otro lado, se caracterizó cómo están involucrados los cambios de expresión de microRNAs y los patrones de metilación del DNA en la evolución de los pacientes con sepsis, ECC y PICS. Se observó que los niveles circulantes del miR-10395-3p, miR-122, let-7a-5p y miR-133a, así como los cambios de metilación de los genes IL12RB2, LEF1, TCF7, CD3G, PDCD1, DEFA4, IL10, TNFSF4 a tiempos iniciales indican qué pacientes evolucionarán a estos subgrupos clínicos. Así mismo, los microRNAs miR-150-5p y miRNA-335-5p sugieren una inflamación persistente, mientras que los microRNAs miR-27b y miR-4512, junto a los cambios de metilación de los genes PRTN3, CLEC2D, CD3D, PRF1 podrían ayudar a discernir qué pacientes sufrirán una inmunosupresión a largo plazo. Sepsis is a complex syndrome that causes an exaggerated immune response as a result of infection, which can lead to organ dysfunction and ultimately death. In some cases, sepsis can progress to septic shock, which is characterized by acute organ dysfunction that can result in severe circulatory and metabolic failure, increasing the risk of mortality. Patients with sepsis or septic shock who are admitted to the Intensive Care Unit (ICU) and experience organic dysfunction and need for mechanical ventilation for at least 7 days are classified as chronically critically ill (CCI). If they are hospitalized for at least 14 days and meet a series of specific immunological and metabolic characteristics, they are classified as patients with PICS (Persistent Inflammation, Activation of Catabolism, and Immunosuppression Syndrome). Therefore, early detection of sepsis is essential for disease management, and understanding which molecular and epigenetic mechanisms are altered in each group of patients can help predict their evolution. The identification of new biomarkers will allow the establishment of adequate follow-up protocols for these patients to reduce high mortality and improve the quality of life of septic patients who survive sepsis. In this doctoral thesis, the effect of citrullinated histones was characterized in a model of human endothelial cells. These histones are released into the bloodstream by innate immunity processes, such as ETosis (extracellular traps), and the endothelial tissue is the first to come into contact with the histones. Likewise, circulating and citrullinated histone levels were analyzed in plasma samples and correlated with the clinical characteristics of surviving and non-surviving patients with sepsis and SS. Thanks to this, we identified that citrullinated histones do not cause damage to endothelial cells, especially in comparison with those histones without induced modifications, and are capable of activating endothelium-mediated immune responses. In addition, we observed that in patients, histones were related to coagulation and immunomodulation factors, while citrullinated histones were negatively correlated with coagulation events. On the other hand, we characterized which microRNA expression changes and DNA methylation patterns are involved in the evolution of septic patients, CCI, and PICS. Thanks to this, we observed that the analysis of miR-10395-3p, miR-122, let-7a-5p, and miR-133a, or the gene methylation changes of IL12RB2, LEF1, TCF7, CD3G, PDCD1, DEFA4, IL10, and TNFSF4 will allow us to predict at early stages which patients will evolve into these clinical subgroups. Likewise, miR-150-5p and miRNA-335-5p will help discern which patients will present persistent inflammation, while miR-27b and miR-4512, together with the methylation changes of the PRTN3, CLEC2D, CD3D, PRF1 genes, would help discern whether patients who develop PICS will suffer long-term immunosuppression.

[ES] La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una entidad de presentación heterogénea. Por ello, se han intentado perfilar diferentes fenotipos y endotipos, que permitirían un manejo más diferenciado. El objetivo del proyecto Biomarcadores en la EPOC (BIOMEPOC) es identificar biomarcadores sanguíneos útiles para tipificar mejor a los enfermos. Se analizarán datos clínicos y muestras sanguíneas en un grupo de pacientes y controles sanos. El proyecto constará de fases de prospección y de validación. Se realizarán determinaciones analíticas sanguíneas con técnicas convencionales y de diversas ciencias «ómicas» (transcriptómica, proteómica y metabolómica). Las primeras se realizarán orientadas por hipótesis, mientras que con las segundas se realizará una exploración sin dicho condicionante. Finalmente se realizará un análisis multinivel. En el momento actual se han reclutado 269 pacientes y 83 controles, y se está iniciando el procesamiento de muestras. Con los resultados obtenidos se espera identificar nuevos biomarcadores que, en solitario o combinados, permitan una mejor tipificación de los pacientes., [EN] Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is an entity with a heterogeneous presentation. For this reason, attempts have been made to characterize different phenotypes and endotypes to enable a more individualized approach. The aim of the Biomarkers in COPD (BIOMEPOC) project is to identify useful biomarkers in blood to improve the characterization of patients. Clinical data and blood samples from a group of patients and healthy controls will be analyzed. The project will consist of an exploration phase and a validation phase. Analytical parameters in blood will be determined using standard techniques and certain ‘omics’ (transcriptomics, proteomics, and metabolomics). The former will be hypothesis-driven, whereas the latter will be exploratory. Finally, a multilevel analysis will be conducted. Currently, 269 patients and 83 controls have been recruited, and sample processing is beginning. Our hope is to use the results to identify new biomarkers that, alone or combined, will allow a better characterization of patients.

Tese de doutoramento em Ciências da Saúde (Pré-Bolonha), Ramo de Medicina, especialidade de Medicina Interna (Pneumologia), apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Introdução A asma é uma doença heterogénea, expressando-se por vários fenótipos, que novos métodos de análise, tipo cluster, têm tentado distinguir. Contudo, biomarcadores, nomeadamente identificadores de gravidade, são escassos. O conhecimento dos seus endótipos através de técnicas avançadas como a metabolómica pode ser útil, como já demonstrámos com a identificação de marcadores de exacerbação pelo estudo do perfil metabolómico urinário de asmáticos. No entanto, a translação de resultados da metabolómica para a clínica necessita validação. Objectivos 1. Caracterizar clinicamente uma população portuguesa de asmáticos, com enfoque nos doentes graves, com suporte em parâmetros funcionais respiratórios e laboratoriais imunoinflamatórios e nas suas correlações. 2. Identificar fenótipos celulares da expectoração e correlacioná-los com os parâmetros determinados. 3. Identificar factores preditores de ocorrência dos fenótipos clínicos. 4. Distinguir clusters de asmáticos. 5. Determinar a relevância da metabolómica na identificação de biomarcadores de gravidade e na distinção de clusters. 6. Correlacionar características clínicas de gravidade e dos clusters identificados com biomarcadores urinários de peroxidação lipídica. Métodos A amostra foi recrutada nos Serviços de Pneumologia e Alergologia dos Hospitais da Universidade de Coimbra, até se obterem cem doentes com asma. Dos procedimentos realizados destacam-se: a avaliação clínica, o estudo funcional respiratório e as colheitas de sangue, expectoração e urina para estudo analítico. O tratamento estatístico foi feito com o programa SPSS, versão 20.0 ®, usando métodos como a regressão logística. Os clusters foram identificados pelo método Ward. A análise metabolómica foi feita pela técnica de microextracção de fase sólida seguida de cromatografia gasosa bidimensional, a análise desses dados foi multivariada e as correlações estabelecidas usaram o método de regressão dos mínimos quadrados parciais. Em todos os testes foram considerados significativos valores inferiores a 0.05. Resultados e Conclusões Os resultados dos parâmetros avaliados foram amplamente coincidentes com os de outros estudos, tendo-se identificado como mais inovador, no grupo grave, a maior frequência de história de pneumonia e o carácter discriminativo do questionário de gravidade utilizado. Nas correlações estabelecidas destacaram-se: as negativas da função respiratória com o questionário de gravidade da asma e a do FeNO com os valores basais de FEV1 (nos graves); as positivas da eosinofilia periférica com a gravidade da doença, o seu início tardio e a pior qualidade de vida. Nos fenótipos da expectoração, o eosinofílico foi mais prevalente, observando-se correlação negativa entre a percentagem de neutrófilos e o FEV1 basal. Nos fenótipos clínicos estudados destacamos: Atópicos, têm idade de início de doença mais precoce, menor ocorrência de história de pneumonia e melhor qualidade de vida; Asmáticos com início após 12 anos, são mais obesos, menos atópicos, com pior controlo e qualidade de vida e maior gravidade da doença; Nos com hipersensibilidade a AINE’s é maior a prevalência de polipose nasal e pior a qualidade de vida; Os pré-obesos, apresentam menor controlo da doença, pior qualidade de vida e maior gravidade; Os obstrutivos persistentes têm menor controlo da doença e maior coexistência de outras doenças obstrutivas; Os graves, maior ocorrência de pneumonia e de outra doença obstrutiva, pior controlo da doença, de qualidade de vida, de função respiratória e maior uso de terapêutica e grau de eosinofilia periférica. Foram factores favoráveis à ocorrência dos fenótipos: Atópico − início precoce da doença, melhor controlo da doença, menor grau de terapêutica. Asma após 12 anos – género masculino, obstrução fixa da via aérea, maior percentagem de eosinófilos no sangue e da pontuação SOA. Hipersensibilidade a AINE’s – polipose nasal e maior gravidade da doença. Obstrução persistente da via aérea – género masculino, maior intensidade de terapêutica, pior função respiratória, maior gravidade da doença e inflamação neutrofílica da via aérea. Grave – eosinofilia no sangue periférico. Foram desfavoráveis para essa ocorrência: Atópico − história de pneumonia, presença de outra doença obstrutiva, doença grave. Asma com início após 12 anos − atopia. Obstrução persistente da via aérea – início da doença antes dos 12 anos. Nos 5 clusters foi evidente a sobreposição de C1, C2 e C5 com outros estudos. C3 correspondeu a asmáticos intermitentes, cuja gravidade dependeu da ocorrência de exacerbações graves; C4, a um grupo com provável alteração de fenótipo inicial (eosinofílico) pela presença de obesidade. Algumas das características com significado na separação dos clusters (idade, excesso de peso, gravidade e eosinofilia periférica) foram relevantes por permitirem a adaptação dos resultados aos endótipos actualmente descritos na literatura. A análise metabolómica do perfil de peroxidação lipídica mostrou relevância, quer na separação dos doentes por gravidade, quer na distinção dos diferentes clusters, tendo sido identificado o grupo de metabolitos responsáveis pelas separações. Em relação à gravidade, a separação foi clara entre grupos, consoante a faixa etária. Em relação aos clusters, a distinção foi clara para os grupos C1, C3 e C5, passíveis de serem organizados pela extensão da peroxidação lipídica (C1>C3>C5). Demonstramos ainda que os níveis de peroxidação lipídica patentes nos perfis metabolómicos urinários destes doentes podem prever a função respiratória (FEV1), o tipo de inflamação Th2 (FeNO) e o grau de gravidade (SOA). Assim, endótipos obtidos pela metabolómica urinária mostraram que alguns clusters e características da asma podem ser associados com metabolitos específicos da peroxidação lipídica. Introduction Asthma is a heterogeneous disease, expressed by several phenotypes, for which new analysis methods, like cluster approaches, have been trying to establish a distinction. Nevertheless, biomarkers, namely those of severity, are scarce. Understanding its endotypes, particularly through advanced techniques such as metabolomics, can be useful, as we have already shown with the identification of asthma exacerbation biomarkers by the urinary metabolomics profile study of asthmatics. However, the translation of metabolomics results into clinical practice still needs validation. Objectives 1. Clinically characterize a Portuguese asthmatic population, with particular attention to severe patients, supported in lung function, immune-inflammatory parameters and their correlations. 2. Identify the sputum cellular phenotypes and correlate them with evaluated parameters. 3. Identify predictors for the clinical phenotypes. 4. Cluster the asthmatic population. 5. Evaluate the importance of metabolomics in the identification of severity urinary biomarkers and in cluster distinction. 6. Correlate severity´s clinical characteristics and identified clusters with urinary biomarkers of lipidic peroxidation. Methods The sample was recruited from outpatient clinic of Pulmonology and Allergology Unit of Hospitais da Universidade de Coimbra, consecutively, until reaching one hundred patients with asthma. From the procedures, we point out the clinical and lung function evaluation, the immunephenotypic analysis of sputum cells and the urinary metabolomics analysis. Statistics was performed using SPSS, version 20.0 ® and data were analysed by methods such as logistic regression. Clusters were identified using Ward´s clustering method. Metabolomics was carried out using solid phase microextraction followed by comprehensive two-dimensional gas chromatography–time-of-flight mass spectrometry, multivariate data analysis was applied and correlations were studied using partial least squares regression. In all statistical tests, p values were significant when