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Les immunoglobulines sont des glycoprotéines. De multiples facteurs, génétiques, pathologiques ou physiologiques tels que l’âge, influencent leur profil de glycosylation qui affecte leurs fonctions et le déclenchement d'une réponse anti-inflammatoire ou pro-inflammatoire. Il est proposé que l’analyse des N-glycanes des immunoglobulines G soit utile comme indicateur de la présence d'une pathologie, de son évolution ou de la réponse aux traitements et pourrait être utilisé comme biomarqueur dynamique dans la perspective de la médecine prédictive, préventive et personnalisée. Les variations, sous l’influence de différents enzymes, des N-glycanes peuvent modifier significativement leur capacité à activer le complément et leur interaction avec les récepteurs pour le fragment Fc des immunoglobulines, exprimés par les cellules immunes et participer à la régulation de la réponse immunitaire comme CD16a exprimé par les NK ou les macrophages et impliqué dans la cytotoxicité dépendante des anticorps. Ce document bibliographique passe en revue la structure des différents anticorps, leurs fonctions effectrices et l’impact des différents phénotypes de glycosylation sur ces fonctions. Dans le cadre des pathologies auto-immunes, la recherche d’auto-anticorps présente un intérêt diagnostique. Dans certains cas, les auto-anticorps ne sont que des marqueurs de la pathologie. Dans d’autres cas, les auto-anticorps sont impliqués dans les processus lésionnels. Notre hypothèse de travail est que des variations de N-glycosylation influencent la pathogénicité et puissent ainsi être des biomarqueurs prédictifs de la sévérité de la pathologie. Le projet porte sur des auto-anticorps anti-GM1, anti-HNK-1 et anti-neurofascine 155 impliqués dans la physiopathologie respectivement de neuropathies motrices aiguës ou chroniques, de neuropathies sensitives et de polyradiculonévrites chronique sévères. Pour tester le profil de N-glycosylation et leur fonctions effectrices, nous proposons des approches en cytométrie en flux sur des billes magnétiques recouvertes d’antigènes et incubées avec des auto-anticorps, des lectines, du C1q, de la mannose binding lectine (MBL) ou du CD16a.

La myopie est un problème majeur de santé publique dans le monde. L’instillation de collyres faiblement dosés en atropine constitue l’un des traitements les plus efficaces et sûrs. Cependant, en l’absence de spécialité pharmaceutique industrielle disponible sur le marché français, la fabrication de ces collyres est réalisée dans les unités de pharmacotechnie des pharmacies à usage intérieur. Afin de réaliser le contrôle de teneur directement dans les locaux de la pharmacie, nous avons développé une méthode de dosage de l’atropine en collyre par électrophorèse capillaire. Cette méthode tend à répondre aux exigences des Bonnes Pratiques de Préparation, mais aussi des lignes directrices de l’ICH. Nous avons développé une méthode de dosage par électrophorèse capillaire, fiable et rapide, qui permet de contrôler en routine nos collyres d’atropine à 0,01%, en raison de l’absence de référentiels pour cettetechnique. Ce travail a montré que l’électrophorèse capillaire est utilisable dans le dosage de composés pharmaceutiques, et pourrait constituer une alternative à l’HPLC. Le développement de cette méthode de dosage était une étape indispensable pour passer à une production en série, mais une étude de stabilité sera nécessaire pour finaliser cette transition, puis envisager de l’appliquer à d’autres molécules.

Extracellular vesicles (EVs) are important intercellular messengers that may be exploited as prognostic or diagnostic biomarkers. However, owing to technical limitations in purifying and assessing EV subpopulations, knowledge on individual EVs is still in its infancy. The goal of the thesis is therefore to develop novel analytical approaches for EVs isolation and detection, and analysis of internal and targeted proteins. First, we present a new capillary electrophoresis (CE), method coupled with laser-induced fluorescent (LIF) detection for identification and quantification of EVs after their purification. Then, Taylor dispersion analysis (TDA) was investigated to determine the size of isolated EVs. Finally, we present a novel approach for the isolation of EVs using polyethylene glycol (PEG) to precipitate EVs on the surface of magnetic beads. To improve the performance, we further translated this method into a droplet microfluidic protocol using a purpose-made droplet platform., Les vésicules extracellulaires (EVs) sont d'importants messagers intercellulaires qui peuvent être exploités comme biomarqueurs pronostiques ou diagnostiques. Cependant, isoler, enrichir et caractériser les EVs à partir de fluides biologiques reste un défi. L'objectif de la thèse est de développer de nouvelles approches analytiques pour l'isolement et la détection des EVs, et l'analyse de protéines internes. Dans un premier temps, nous présentons une nouvelle méthode d'électrophorèse capillaire (CE), couplée à une détection fluorescente induite par laser (LIF) pour l'identification et la quantification des EVs. Ensuite, l'analyse de dispersion de Taylor (TDA) a été étudiée pour déterminer la taille des EVs. Enfin, nous présentons une nouvelle approche pour l'isolement des EVs à l'aide de polyéthylène glycol (PEG) pour précipiter les EVs à la surface de billes magnétiques. Pour améliorer les performances, nous avons transféré cette méthode dans un système microfluidique de gouttes.

The isotopic and elemental compositions of nuclear samples were determined with the hyphenation of capillary electrophoresis (CE) to multicollector inductively coupled plasma mass spectrometry (MC-ICP-MS). A single step separation method by CE of the key elements of a spent nuclear fuel sample was developed. This method was optimized using an inactive sample by hyphenation with a quadrupole ICP-MS (Q-ICP-MS). It was then applied to a real spent nuclear fuel sample by hyphynation with a nuclearised Q-ICP-MS. Uranium, plutonium, minor actinides (Am, Cm) and fission products (Nd, Sm, Eu, Gd) were separated. The CE-MC-ICP-MS hyphenation allowed the determination of isotope ratio for these elements (except uranium) with uncertainties of a few per-mil and with sample quantities of a few hundreds of pg. Liquid waste production was in the µL range. Those values were notably inferior to the ones obtained with a routinely used offline protocol which were respectively in the µg and the hundreds of mL range. The age of a uranium sample was determined by CE-MC-ICP-MS with the 234U/230Th radiochronometer. The 230Th concentration in the sample was determined with the isotope dilution method using a 232Th spike. A preconcentration method associated with detection by a secondary electron multiplier allowed to measure the few hundreds of fg of 230Th present in the sample. The developments carried out throughout this PhD will be applied and adapted to analytical microsystems.; La composition isotopique et élémentaire d'échantillons nucléaires a été déterminée par couplage de l'électrophorèse capillaire (CE) à la spectrométrie de masse à source plasma et à multicollection (MC-ICP-MS). Une méthode de séparation des éléments d'intérêt d'un échantillon de combustible nucléaire usé en une étape de CE a été développée. Cette méthode a été optimisée sur un échantillon inactif par couplage avec un ICP-MS quadripolaire (Q-ICP-MS). Elle a ensuite été appliquée à un échantillon réel de combustible nucléaire usé, par couplage avec un Q-ICP-MS nucléarisé. L'uranium, le plutonium, les actinides mineurs (Am, Cm) et les produits de fission (Nd, Sm, Eu, Gd) ont été séparés. Le couplage CE-MC-ICP-MS a permis la détermination des rapports isotopiques des éléments précités (à l'exception de l'U) avec des incertitudes de l'ordre du pour-mille et des quantités d'échantillons de l'ordre de la centaine de pg. Le volume des effluents est de l'ordre du µL. Ces valeurs sont nettement inférieures à celles mises en jeu par le protocole utilisé en routine dans le laboratoire qui sont respectivement de l'ordre du µg et de la centaine de mL. Un échantillon d'uranium a été daté avec le radiochronomètre 234U/230Th par couplage CE-MC-ICP-MS. La concentration en 230Th de l'échantillon a été déterminée par la méthode de la dilution isotopique avec un traceur de 232Th. Le développement d'une méthode de pré-concentration par complexation associée à une détection avec un multiplicateur d'électrons secondaires a permis la mesure du 230Th présent à hauteur de quelques centaines de fg. Les développements effectués durant cette thèse seront transposés sur des microsystèmes analytiques.

The isotopic and elemental compositions of nuclear samples were determined with the hyphenation of capillary electrophoresis (CE) to multicollector inductively coupled plasma mass spectrometry (MC-ICP-MS). A single step separation method by CE of the key elements of a spent nuclear fuel sample was developed. This method was optimized using an inactive sample by hyphenation with a quadrupole ICP-MS (Q-ICP-MS). It was then applied to a real spent nuclear fuel sample by hyphynation with a nuclearised Q-ICP-MS. Uranium, plutonium, minor actinides (Am, Cm) and fission products (Nd, Sm, Eu, Gd) were separated. The CE-MC-ICP-MS hyphenation allowed the determination of isotope ratio for these elements (except uranium) with uncertainties of a few per-mil and with sample quantities of a few hundreds of pg. Liquid waste production was in the µL range. Those values were notably inferior to the ones obtained with a routinely used offline protocol which were respectively in the µg and the hundreds of mL range. The age of a uranium sample was determined by CE-MC-ICP-MS with the 234U/230Th radiochronometer. The 230Th concentration in the sample was determined with the isotope dilution method using a 232Th spike. A preconcentration method associated with detection by a secondary electron multiplier allowed to measure the few hundreds of fg of 230Th present in the sample. The developments carried out throughout this PhD will be applied and adapted to analytical microsystems.; La composition isotopique et élémentaire d'échantillons nucléaires a été déterminée par couplage de l'électrophorèse capillaire (CE) à la spectrométrie de masse à source plasma et à multicollection (MC-ICP-MS). Une méthode de séparation des éléments d'intérêt d'un échantillon de combustible nucléaire usé en une étape de CE a été développée. Cette méthode a été optimisée sur un échantillon inactif par couplage avec un ICP-MS quadripolaire (Q-ICP-MS). Elle a ensuite été appliquée à un échantillon réel de combustible nucléaire usé, par couplage avec un Q-ICP-MS nucléarisé. L'uranium, le plutonium, les actinides mineurs (Am, Cm) et les produits de fission (Nd, Sm, Eu, Gd) ont été séparés. Le couplage CE-MC-ICP-MS a permis la détermination des rapports isotopiques des éléments précités (à l'exception de l'U) avec des incertitudes de l'ordre du pour-mille et des quantités d'échantillons de l'ordre de la centaine de pg. Le volume des effluents est de l'ordre du µL. Ces valeurs sont nettement inférieures à celles mises en jeu par le protocole utilisé en routine dans le laboratoire qui sont respectivement de l'ordre du µg et de la centaine de mL. Un échantillon d'uranium a été daté avec le radiochronomètre 234U/230Th par couplage CE-MC-ICP-MS. La concentration en 230Th de l'échantillon a été déterminée par la méthode de la dilution isotopique avec un traceur de 232Th. Le développement d'une méthode de pré-concentration par complexation associée à une détection avec un multiplicateur d'électrons secondaires a permis la mesure du 230Th présent à hauteur de quelques centaines de fg. Les développements effectués durant cette thèse seront transposés sur des microsystèmes analytiques.

Post-transcriptional modifications are fundamental in different aspects to ensure the biological roles of ribonucleic acids (RNA) in the translation process. The chemical characterization of the modifications is therefore essential in order to understand their influences. The work presented in this thesis manuscript describes the implementation of a new approach based on the coupling of capillary electrophoresis to high resolution mass spectrometry (CE-MS) for the investigation of RNA modifications. Here, a two-level strategy has been developed. The first level of analysis enable to determine the nature of the modifications contained on an RNA. The second level of this strategy, inspired by the "bottom-up" approach, permit to map the modifications onto the primary structures of RNA. The methodology developed allows to characterize, without ambiguity, a large number of modifications on different types of RNA and particularly on transfer RNA, paving the way to CE-MS as a new analysis tool for the characterization of RNA modifications., Les modifications post-transcriptionnelles sont fondamentales dans différents aspects pour assurer les rôles biologiques des acides ribonucléiques (ARN) dans le processus de traduction. La caractérisation chimique des modifications est par conséquent essentielle afin de permettre la compréhension des intérêts de ces modifications. Les travaux, présentés dans ce manuscrit de thèse, décrivent la mise en œuvre d’une nouvelle approche basée sur le couplage de l’électrophorèse capillaire à la spectrométrie de masse de haute résolution (CE-MS) au service de l’étude des modifications d’ARN. Ici, une stratégie sur deux niveaux a été développée. Le premier niveau d’analyse a permis de déterminer la nature des modifications présentes sur un ARN. Le second niveau, s’inspirant d’une stratégie « bottom-up », a permis de localiser les modifications sur les structures primaires des ARN. La méthodologie développée a permis de caractériser, sans ambiguïté, un grand nombre de modifications sur différents types d’ARN et notamment des ARN de transfert, ouvrant la voie à la CE-MS comme un nouvel outil d’analyse pour la caractérisation de modifications d’ARN.

The main objective of this thesis is to study different approaches for the modification of the electrophoresis capillary intern wall to enhance separation efficiency and reproducibility for biomolecules (model peptides and/or proteins) in acidic conditions. The first chapter (outside of bibliographic study) is dedicated to superhydrophobic coatings study. The goal is to prevent analytes adsorption by suppressing any interaction between the superhydrophobic wall and the analytes (anti-wettability). An original coating process has been developed to obtain superhydrophobic capillaries by studying the influence of layers number, coating nature, and filling and flushing pressure during layers deposition. Superhydrophobic coatings have been obtained, for the first time, with diameters from 50 µm to 180 µm. Hydrodynamic and electrokinetic characteristics have been studied, giving slipping length of 23 µm and efficiency separation increased twofold compared to fused silica capillary in the same electrophoretic conditions. The second chapter studies an air microbubbles generation process using superhydrophobic capillaries. The experimental parameters (voltage, UV ray, marker, superhydrophobic coating) needed to obtain those bubbles have been identified. Those bubbles have been characterized (diameter ~35-39 µm; length ~10 mm; zeta potential ~ -62.6 mV). The third chapter offer an experimental methodology, based on the electrochromatography theory, allowing to evaluate the residual adsorption of proteins on the capillary wall. This approach have two interesting points: (i) allowing to compare separative performances of different coatings via residual adsorption, and (ii) optimizing the experimental parameters (length, internal diameter, applied voltage) to minimize the impact of adsorption on the separation efficiencies.; L’objectif de cette thèse est d’étudier différentes approches pour la modification de la paroi interne des capillaires d’électrophorèse capillaire pour améliorer les efficacités de séparation de biomolécules (peptides et/ou protéines modèles) en milieu acide. Le premier chapitre (hors étude bibliographique) est consacré à l’étude des revêtements superhydrophobes, dans le but d’empêcher l’adsorption des analytes en supprimant toute interaction entre la paroi superhydrophobe et les analytes (absence de mouillage). Un protocole de greffage original a été développé pour obtenir des capillaires superhydrophobes en étudiant l’influence du nombre de couches déposées, la nature du revêtement, et les pressions de remplissage et de rinçage du capillaire lors du dépôt des couches. Des capillaires superhydrophobes ont pu être obtenus, pour la première fois, avec des diamètres internes allant de 50 µm à 180 µm. Les caractéristiques hydrodynamiques et électrocinétiques de ces capillaires ont été étudiées, donnant une longueur de glissement de 23 µm et des efficacités de séparation électrophorétique 2 fois supérieures à celles obtenues sur un capillaire de silice vierge dans les mêmes conditions électrophorétiques. Le second chapitre étudie la génération de microbulles d’air dans des capillaires superhydrophobes. ). Les paramètres expérimentaux (tension, rayonnement UV, marqueur, revêtement superhydrophobe) nécessaires à l’obtention de ces microbulles ont été identifiés). Ces bulles ont été caractérisées (diamètre ~35-39 µm ; longueur ~10 mm ; potentiel zeta ~ -62.6 mV). Le troisième chapitre propose une méthodologie expérimentale, basée sur la théorie de l’électrochromatographie, permettant d’évaluer l’adsorption résiduelle de protéines sur la paroi des capillaires. Cette nouvelle approche présente deux intérêts : (i) pouvoir comparer les performances séparatives sur différents greffages via l’adsorption résiduelle, et (ii) optimiser les paramètres expérimentaux (longueur, diamètre interne, tension appliquée) afin de minimiser l’impact de l’adsorption sur les efficacités de séparation.

The main objective of this thesis is to study different approaches for the modification of the electrophoresis capillary intern wall to enhance separation efficiency and reproducibility for biomolecules (model peptides and/or proteins) in acidic conditions. The first chapter (outside of bibliographic study) is dedicated to superhydrophobic coatings study. The goal is to prevent analytes adsorption by suppressing any interaction between the superhydrophobic wall and the analytes (anti-wettability). An original coating process has been developed to obtain superhydrophobic capillaries by studying the influence of layers number, coating nature, and filling and flushing pressure during layers deposition. Superhydrophobic coatings have been obtained, for the first time, with diameters from 50 µm to 180 µm. Hydrodynamic and electrokinetic characteristics have been studied, giving slipping length of 23 µm and efficiency separation increased twofold compared to fused silica capillary in the same electrophoretic conditions. The second chapter studies an air microbubbles generation process using superhydrophobic capillaries. The experimental parameters (voltage, UV ray, marker, superhydrophobic coating) needed to obtain those bubbles have been identified. Those bubbles have been characterized (diameter ~35-39 µm; length ~10 mm; zeta potential ~ -62.6 mV). The third chapter offer an experimental methodology, based on the electrochromatography theory, allowing to evaluate the residual adsorption of proteins on the capillary wall. This approach have two interesting points: (i) allowing to compare separative performances of different coatings via residual adsorption, and (ii) optimizing the experimental parameters (length, internal diameter, applied voltage) to minimize the impact of adsorption on the separation efficiencies., L’objectif de cette thèse est d’étudier différentes approches pour la modification de la paroi interne des capillaires d’électrophorèse capillaire pour améliorer les efficacités de séparation de biomolécules (peptides et/ou protéines modèles) en milieu acide. Le premier chapitre (hors étude bibliographique) est consacré à l’étude des revêtements superhydrophobes, dans le but d’empêcher l’adsorption des analytes en supprimant toute interaction entre la paroi superhydrophobe et les analytes (absence de mouillage). Un protocole de greffage original a été développé pour obtenir des capillaires superhydrophobes en étudiant l’influence du nombre de couches déposées, la nature du revêtement, et les pressions de remplissage et de rinçage du capillaire lors du dépôt des couches. Des capillaires superhydrophobes ont pu être obtenus, pour la première fois, avec des diamètres internes allant de 50 µm à 180 µm. Les caractéristiques hydrodynamiques et électrocinétiques de ces capillaires ont été étudiées, donnant une longueur de glissement de 23 µm et des efficacités de séparation électrophorétique 2 fois supérieures à celles obtenues sur un capillaire de silice vierge dans les mêmes conditions électrophorétiques. Le second chapitre étudie la génération de microbulles d’air dans des capillaires superhydrophobes. ). Les paramètres expérimentaux (tension, rayonnement UV, marqueur, revêtement superhydrophobe) nécessaires à l’obtention de ces microbulles ont été identifiés). Ces bulles ont été caractérisées (diamètre ~35-39 µm ; longueur ~10 mm ; potentiel zeta ~ -62.6 mV). Le troisième chapitre propose une méthodologie expérimentale, basée sur la théorie de l’électrochromatographie, permettant d’évaluer l’adsorption résiduelle de protéines sur la paroi des capillaires. Cette nouvelle approche présente deux intérêts : (i) pouvoir comparer les performances séparatives sur différents greffages via l’adsorption résiduelle, et (ii) optimiser les paramètres expérimentaux (longueur, diamètre interne, tension appliquée) afin de minimiser l’impact de l’adsorption sur les efficacités de séparation.

Antisense oligonucleotides (ASO) have the ability to inhibit or modulate the expression of a target gene by various mechanisms. Bioconjugation of ASO with a lipid is a very promising approach which has shown an improvement in the delivery of the antisense sequence and therefore, in the therapeutic efficacy of the oligonucleotide. These new therapeutic agents, lipid oligonucleotides (LON), are amphiphilic molecules and are able to self-assemble to form supramolecular objects. Their pharmaceutical development requires suitable analytical methods to study the purity of the LONs synthesized and to be able to quantify them in the formulations but also to characterize the supramolecular assemblies formed.In this work, different methods were investigated in ion-pairing reversed-phase HPLC and hydrophilic interaction chromatography, capillary electrophoresis (CE) and size exclusion chromatography (SEC) for LON analysis with various chemical structures. Despite the different parameters studied, the asymmetry of the peaks obtained by HPLC limits its use for assays. On the other hand, a quantitative method has been developed and validated in CE in the presence of cyclodextrins (CD). The complexation constant between free LON and CDs as well as the electrophoretic mobility of the complex were determined. Finally, the potential of SEC and CE for the characterization of supramolecular objects of LON was assessed., Les oligonucléotides antisens (ASO) ont la capacité d’inhiber ou de moduler l’expression d’un gène cible par différents mécanismes. La bioconjugation de l’ASO avec un lipide est une approche très prometteuse qui a montré une amélioration de la délivrance de la séquence antisens et par conséquent, de l’efficacité thérapeutique de l’oligonucléotide. Ces nouveaux agents thérapeutiques, les oligonucléotides lipidiques (LON), sont des molécules amphiphiles capables de s’auto-assembler sous forme d’objets supramoléculaires. Leur développement pharmaceutique requiert des méthodes analytiques adaptées pour évaluer la pureté des LON synthétisés et pouvoir les quantifier dans les formulations mais aussi pour caractériser les assemblages supramoléculaires formés.Dans ce travail, différentes méthodes ont été évaluées en chromatographie liquide (HPLC) à polarité de phase inversée par appariement d’ions et à interactions hydrophiles, en électrophorèse capillaire (CE) et en chromatographie d’exclusion stérique (SEC) pour l’analyse de LON de structures chimiques variées. Malgré les nombreux paramètres étudiés, l’asymétrie des pics obtenus en HPLC, limite son utilisation à des fins de dosage. En revanche, une méthode quantitative a été développée et validée en CE en présence de cyclodextrines (CD). La constante de complexation entre le LON libre et les CD ainsi que la mobilité électrophorétique du complexe ont été déterminées. Enfin, le potentiel de la SEC et de la CE pour la caractérisation des objets supramoléculaires de LON a été évalué.

Manufacturing and manipulation of therapeutic monoclonal antibodies (mAb) in the hospital before administration to patient is prone to induce their physical degradations (e.g., denaturation, aggregation). This may impact their efficacy and safety. To study the stability of mAbs, capillary zone electrophoresis (CZE) and size exclusion chromatography (SEC), coupled to native mass spectrometry (MS) have been developed. CZE-native MS method using a triple-layer coating was developed to detect and separate different conformational states (unfolded monomer, dimer) of Infliximab in a single analysis. In-depth study with digested infliximab confirmed that dimer formation was related to the Fab fragment. We also focused on covalent coatings in order to find the more adapted coating to analyze mAbs by CZE-UV and CZE-MS. We also developed for SEC a simultaneous coupling with MS and a fluorescence detector to detect the degraded mAbs. We have identified the biases inducing conformational changes (e.g. dimerization, denaturation) that may arise during native MS. We also successfully characterized aggregates and denatured monomer in stressed Trastuzumab sample. In addition, the orthogonal method SEC-ion mobility-MS has been employed to separate and measure the denatured monomers compared to their related native conformations. Moreover, the developed system enables the detection of a very low levels of degraded mAbs in infusion bags. It allows to define the critical parameters to be controlled during the reconstitution and manipulation of therapeutic mAbs in hospital.; La manipulation des anticorps monoclonaux thérapeutiques (Acm) reconstitués avant administration aux patients est susceptible d’entraîner leurs dégradations physiques (e.g. dénaturation, agrégation). Ceci peut avoir un impact sur leur efficacité et sécurité. Afin d’étudier la conformation et la stabilité des Acms reconstitués, nous avons développé des méthodes séparatives couplées avec la spectrométrie de masse (MS) en conditions non-dénaturantes (« native »). Une méthode de CZE-native MS utilisant un revêtement constitué d’une triple-couche ionique a été développée pour séparer et détecter les différentes conformations (monomère natifs, dénaturés, dimères) d’Infliximab. Une étude approfondie réalisée en analysant de l’infliximab digéré a permis d’établir que la formation du dimère était liée à la dénaturation du fragment Fab. L’intérêt des revêtements statiques (commerciaux et préparés in situ) ont été étudiés pour analyser les Acms par CZE-UV et CZE-MS. Nos résultats ont montré l’intérêt d’un nouveau revêtement monolithique. Un couplage simultané de la SEC avec la MS et un détecteur de fluorescence a été développé. Nous avons ainsi identifié les conditions expérimentales qui entraînaient des dénaturations et des dimérisations artificielles. Cette méthode a ensuite été également appliquée avec succès pour la caractérisation d’un échantillon de Trastuzumab stressé. Une méthode orthogonale en utilisant la SEC-mobilité ionique-MS a été employé pour évaluer la proportion de monomères dénaturés par rapport aux monomères natifs. La méthodologie ainsi développée permettra la détection de très faibles taux d'anticorps dégradés dans des poches d'infusion. Ceci permettra de définir les paramètres critiques à maîtriser lors de la reconstitution et la manipulation d’anticorps à usage hospitalier.

The objective of the present work was to evaluate the relevance of capillary electrophoresis (CE) method for the quantification of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in human plasma in the context of TDM. Four TKIs were selected for this study: imatinib mesylate, erlotinib hydrochloride, lapatinib ditosylate and sorafenib.A fast, simple and cost effective CZE-UV methodology for the quantification of imatinib in plasma was first developed using simply ACN precipitation as sample preparation before analysis. A complete study was performed to understand the electrophoretic behavior of imatinib in the presence of salt (from plasma) and ACN in the sample matrix. Then, a thorough study was performed to optimize an easy to use and performing sample pretreatment methodology based on salting-out assisted liquid-liquid extraction (SALLE) for the four TKIs from human plasma. SALLE, which is based on adding high concentration of salt to two miscible liquids, allows to extract in one step TKIs from plasma in an ACN phase with high recovery. The extracted TKIs can then be directly injected for further CZE-UV analysis. The use of ACN as extraction solvent allows to inject up to 80% of the capillary effective volumes. This allows in-line sample concentration through electrophoretic stacking mechanisms. In the perspective of routine use, the SALLE-CZE-UV methodology was fully automated. The analytical performances obtained for the four TKIs are fully suitable with TDM requirements. Finally, the SALLE-CZE-UV was successfully applied for the extraction and analysis of the four TKIs directly from human blood. All the present developments prove that CE is a relevant technique to address many TDM issues., L'objectif de ce travail de thèse était d’évaluer l’apport de l'électrophorèse capillaire (EC) comme technique analytique pour la quantification des inhibiteurs de la tyrosine kinase (ITKs) présents dans des échantillons plasmatiques humains dans le contexte du STP. 4 ITKs ont été sélectionnés pour cette étude: mesylate d’imatinib, chlorhydrate d’erlotinib, ditosylate de lapatinib et sorafenib. Tout d’abord, une méthode simple, rapide et peu couteuse a été développée par électrophorèse capillaire de zone (CZE) avec détection UV. Cette méthode reposait sur l’utilisation d’une méthode de préparation d’échantillon par précipitation des protéines à l’ACN avant l’analyse par CZE-UV. Une étude approfondie a également été réalisée pour comprendre le comportement électrophorétique de l’imatinib en présence de sels et d’ACN dans l’échantillon plasmatique. Ensuite, une seconde étude a été réalisée pour optimiser une méthode de préparation d’échantillon simple, rapide et efficace basée sur le principe d’extraction liquide-liquide en présence de sel (SALLE). Cette méthode SALLE reposait sur l’ajout de sels en grande concentration dans deux solvants immiscibles permettant ainsi d’extraire en une seule étape les ITKs du plasma vers la phase ACN avec des rendements d’extraction élevés. Les extraits étaient ensuite analysés directement par CZE-UV. L’utilisation de l’ACN comme solvant d’extraction permettait d’injecter des volumes d’échantillon allant jusqu’à 80% du volume effectif du capillaire. Les ITKs étaient donc concentrés en tête du capillaire grâce à l’existence de mécanisme de préconcentration électrophorétiques. Dans la perspective d'une utilisation en routine, la méthodologie SALLE-CZE-UV a été entièrement automatisée. Les performances analytiques obtenues pour les quatre ITKs sont parfaitement adaptées aux exigences du STP. Enfin, la méthode SALLE-CZE-UV a été appliquée avec succès pour l'extraction et l'analyse des quatre ITKs directement à partir de sang humain. Tous les développements actuels prouvent que la CE est une technique pertinente pour résoudre de nombreux problèmes rencontrés dans le contexte du STP.

Monoclonal antibodies (mAbs) are therapeutic biomolecules employed as treatment against cancer and other pathologies. These glycoproteins are subject to numerous micro-heterogeneities which cou Id affect treatment efficiency. Hence, mAbs variants analysis requires powerful, rapid and accurate analytical methods to elucidate their structure. ln this thesis, works have been done to develop methods leaning on a capillary electrophoresis - mass spectrometry coupling (CE-MS) to get a multi-level mAbs isoforms analysis. First, method assessment and validation of glycosylation forms analysis by CE-MS have been done to characterize and set up a relative quantitation of these modifications. ln order to avoid potential artifactual modifications due to the sample preparation process, higher order analyses have been performed at tougher analytical levels. For that purpose, methods involving partial and total enzymatic digestion have been developed and optimized to assess the plenty of post-translational modification linked to the protein structure. Finally, whole protein analyses have been completed to get a more accurate illustration from variants heterogeneity of the medication administered. The comprehensive analysis of mAbs and their variants should help to guide the manufacturing process and go a step further in treatment optimization.; Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des biomolécules complexes utilisées pour traiter divers cancers et autres pathologies. Ce sont des glycoprotéines qui possèdent de nombreuses micro hétérogénéités pouvant altérer l'efficacité des traitements. De ce fait, l'analyse de ces variants nécessite le développement de méthodes analytiques rapides et précises afin d'élucider la structure des mAbs. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur le développement du couplage électrophorèse capillaire - spectrométrie de masse (CE-MS) afin d'obtenir une caractérisation des variants de mAbs à différents niveaux. D'abord, une validation de la méthode CE-MS au niveau bottom-up a été réalisée pour caractériser les structures des glycosylations et les quantifier relativement. Afin d'éviter les modifications artéfactuelles produites lors des étapes de préparation d' échantillon, des analyses ont été réalisées à des niveaux plus complexes de ces molécules. Pour cela, des méthodes ont été développées afin d'analyser les mAbs partiellement digérés via une enzyme spécifique pour confirmer les résultats et obtenir une répartition des modifications post traductionnelles. Enfin, des séparations des mAbs intacts ont été effectuées afin d'avoir une représentation la plus proche possible de la répartition des variants dans les échantillons. La caractérisation fine des variants permettra alors d'orienter les processus de fabrication des mAbs afin d'optimiser les traitements.

Glycosylation is one of the most main types of post-translational modifications of proteins. Disease-associated modifications in protein glycosylation have been observed for various pathologies such as cancer, rheumatoid arthritis, or «Congenital disorders of glycosylation» (CDGs). They are often exploited for diagnosis, prognosis and monitoring of these diseases. This thesis work focused on the glycosylation study with the aim to allow the screening of different pathologies: CDGs, Alzheimer’s disease and retinal degeneration diseases. Different strategies based on capillary electrophoresis (CE) were considered to fulfil this goal. First, the developement of a CZE analysis of intact apolipoprotein C-III (ApoC-III), an O-glycoprotein implied in the screening of O-glycosylation disorders, allowed the separation of its glycoforms according to their sialylation degree. The MALDI-TOF mass spectrometry (MS) analysis of standard ApoC-III batches from different standard ApoC-III batches from different suppliers highlighted an additonnal heterogeneity due to (unexpected) carbamylated species. A plasma pretreatment based on an immunocapture of apoC-III followed by protein derivatization on magnetic beads using a fluorophore allowed to separate its glycoforms by CZE. Second, a glycomic analysis of biologicial fluids using a new sample treatment method that we adjusted to plasma and cerebrospinal fluid samples was performed by CGE-LIF on controls and Alzheimer’s patients. It allowed to highlight some modifications of N-glycans for this disease. Finally, the combination of both strategies of glycosylation analysis (intact glycoprotein and released N-glycans) allowed the detection of intact transferrin present in vitrous humor but also of its released N-glycans for the screening of retinal degeneration disease. CE-QTOF-MS was also investigated for the analysis of released N-glycans derivatized by a new fluorophore which increases MS sensitivity.; La glycosylation est l’une des principales modifications post-traductionnelles des protéines. La glycosylation des protéines est fortement modifiée lors de diverses pathologies comme le cancer, la polyarthrite rhumatoïde ou les troubles congénitaux de la glycosylation («Congenital disorders of glycosylation», CDGs). Ainsi, la nature et les proportions relatives des oligosaccharides liés aux protéines peuvent être utilisées pour dépister, pronostiquer voire suivre l’évolution de pathologies. Les travaux de cette thèse se sont focalisés sur l’étude de la glycosylation pour permettre le dépistage de certaines pathologies : les CDGs, la maladie d’Alzheimer (MA) et la dégénérescence rétinienne. Plusieurs stratégies fondées sur l’électrophorèse capillaire (EC) ont été envisagées pour répondre à cet objectif. Tout d’abord, le développement d’une méthode par EC de zone (ECZ) l’apolipoprotéine C-III (ApoC-III) intacte, une O-glycoprotéine impliquée dans le dépistage des troubles de la O-glycosylation, a permis de séparer les différentes glycoformes selon leur degré de sialylation. L’analyse d’échantillons d’ApoC-III standard provenant de différents fournisseurs par spectrométrie de masse (MS) MALDI -TOF a mis en évidence une hétérogénéité liée à la présence (inattendue) de formes carbamylées. Un traitement du plasma basé sur une immunocapture de l’ApoC-III suivie d’une dérivation sur billes magnétiques de la protéine par un fluorophore a permis de séparer ses différentes glycoformes en ECZ. Ensuite, une analyse N-glycomique de fluides biologiques employant une nouvelle technique de préparation d’échantillon que nous avons adaptée au plasma et au liquide céphalorachidien, a été réalisée par EC en gel couplée à une détection par fluorescence induite par laser (ECG-LIF) sur des patients sains et atteints de la MA. Cette étude a permis de mettre en évidence quelques modifications des N-glycanes chez ces patients. Enfin la combinaison des deux stratégies d’analyse de la glycosylation (glycoprotéine intacte et glycanes libérés), a permis de détecter la transferrine intacte présente dans le liquide vitré à des concentrations faibles ainsi que ses N-glycanes libérés, dans le cadre du dépistage d’une maladie oculaire. L’EC-QTOF-MS a également été explorée pour l’analyse de N-glycanes dérivés avec un nouveau fluorophore permettant d’améliorer la sensibilité en MS.

In the field of environmental control, the behavior of plutonium in various media and particularly in surface waters is relevant taking into account its radiotoxicity. Carbonate ions widely present in these media mainly complex pentavalent plutonium. In this field, CE-ICP-MS coupling, which was already used for actinides speciation, has been considered for the determination of thermodynamic constants associated to plutonium carbonate complexes.The study developed on plutonium (VI) allowed determining the stability constants at 25°C. From these values, the specific interaction coefficients based on the values recommended by the NEA have been reevaluated. The speciation diagram of Pu(VI) in aqueous carbonate solution has been established and shows the complexation of the plutonyl form by carbonates complex beyond pH=3.The works realized on the complexation of actinides (V) (Np and Pu) by carbonate ions at different temperatures allowed determining both the stability constants and the molar enthalpies and entropies of reaction. Experimentally, the analogy between neptunium and plutonium has been observed and allowed the determination of values which are more precise and consistent with those of the literature. For a better understanding of the plutonium behavior in surface waters, the determination of enthalpies and entropies has been necessary. The speciation diagrams established from these values show a near similarity in the chemical distribution of plutonium species without any further consideration of the analyzed surface water location.; Dans le cadre de la surveillance environnementale, le devenir du plutonium au sein des différents milieux et en particulier au sein des eaux de surface est important notamment en raison de sa radiotoxicité. Dans ces milieux, la forme pentavalente du plutonium est prédominante et est fortement complexée par les carbonates. Le couplage EC-ICP-MS, technique ayant déjà été éprouvée pour la spéciation des actinides, a été retenu pour déterminer les constantes thermodynamiques associées à la formation de ces complexes.L’étude menée sur le plutonium (VI) a permis d’obtenir des constantes de stabilité à 25°C. A partir de ces valeurs, les coefficients d’interaction spécifique ont été ré-évalués par rapport à celles reportées par l’AEN. Le diagramme de spéciation en solution du Pu(VI) en présence d’ions carbonate a été établi. Il suggère la complexation de la forme plutonyle par les ions carbonate dès pH=3.Les travaux réalisés sur les actinides (V) (Np et Pu) ont permis de déterminer à la fois les constantes de stabilité des complexes carbonates puis les enthalpies et entropies molaires de réaction à partir de l’étude menée en température. Expérimentalement, l’analogie entre le neptunium et le plutonium a été confirmée. Afin de mieux comprendre le comportement du plutonium au sein d’eaux de surface, la détermination des enthalpies et entropies a été nécessaire. Les diagrammes de spéciation établis à partir de ces données montrent une quasi similarité dans la répartition chimique des espèces du plutonium pentavalent sans considération de la localisation de l’eau de surface analysée.

International audience; La détermination précise des compositions élémentaires et isotopiques dans des échantillons nucléaires est indispensable pour la gestion des combustibles nucléaires et des déchets radioactifs. Cette détermination isotopique et élémentaire porte notamment sur l'uranium, le plutonium et les lanthanides et est effectuée par spectrométrie de masse après séparations chimiques afin d’éliminer les interférences isobariques. L'Électrophorèse capillaire est une technique séparative particulièrement attractive pour ces applications, du fait des très hautes efficacités, des courts temps d'analyse et des micro volumes mis en jeu. Des études menées précédemment au laboratoire ont démontré la faisabilité de séparations U/Pu/Lanthanides et de séparations U/Th en utilisant un électrolyte d'acide acétique et en couplage direct avec un spectromètre de masse Multi-collecteurs a source plasma. La complexité et la diversité des échantillons nucléaires imposent un suivi de la spéciation des éléments d’intérêts dans les conditions développées afin de garantir le succès des analyses. L’étude de spéciation qui sera présentée ici a permis d'expliquer les facteurs influençant le comportement électro-optique des éléments d’intérêt. Ces études de spéciation peuvent être étendues a d'autres électrolytes afin de développer des séparations pour les éléments présents dans les échantillons nucléaires.

En Afrique, la population a souvent recours à la médecine traditionnelle pour soigner des maux courants tels que la toux et la fièvre, classiques lors de tuberculose(TB). Ce travail a identifié des plantes médicinales utilisées pour traiter la TB au Sénégal. Il a consisté en une enquête ethnopharmacologique, une évaluation de l'activité des préparations et l'identification des composés avec un effet antimycobactérien. Une sélection guidée par les essais biologiques sur un modèle novateur in vitro a permis d'identifier les extraits/composés les plus actifs. Les extraits de Combretum aculeatum et de Guiera senegalensis ont montré des activités intéressantes. En étudiant les aspects de biodisponibilité, un certain rationnel quant à l'usage traditionnel de ces plantes a été montré. Des méthodes de contrôle de qualité analytique de préparations médicamenteuses utilisant l'électrophorèse capillaire ont été appliquées pour le dosage d'un ellagitanin actif,dansC. aculeatum. Cette méthode a aussi été utilisée pour analyser les médicaments antituberculeux de première ligne.

International audience; Precise isotopic and elemental characterization of spent nuclear fuel is a major concern for the validation of the neutronic calculation codes and waste management strategy in the nuclear industry. Generally, the elements of interest, particularly U and Pu which are the two major elements present in spent fuel, are purified by ion exchange or extractant resins before off-line measurements by thermal ionization mass spectrometry. The aim of the present work was to develop a new analytical approach based on capillary electrophoresis (CE) hyphenated to a multicollector inductively coupled plasma mass spectrometer (MC-ICPMS) for online isotope ratio measurements. An electrophoretic separation protocol of U, Pu and the fraction containing fission products and minor actinides (Am and Cm) was developed using acetic acid as the electrolyte and complexing agent. The instrumentation for CE was designed to be used in a glove box and a laboratory-built interface was developed for hyphenation with MC-ICPMS. The separation was realized with only a few nL of a solution of spent nuclear fuel and the reproducibilities obtained on the U and Pu isotope ratios were on the order of a few which is comparable to those obtained by thermal ionization mass spectrometer (TIMS). This innovative protocol allowed a tremendous reduction of the sample amounts classically required for analysis sample masses from et956;g to ng and sample volumes from et956;L to nL. also a drastic reduction of the liquid waste production from mL to et956;L. In addition, the measurement process was shorted by at least three orders of magnitude. All of these improved parameters are of major interest for nuclear applications.

Transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP) is a hereditary rare disease with an autosomal dominant transmission, related to the production of mutant forms of transthyretin (TTR). These mutations lead to a conformational change of the protein whose in vivo form is a tetramer. As a consequence, this tetramer is destabilized and evolves towards the formation of amyloid fibrils that aggregate on the autonomic nervous system, peripheral nerves, and organs. These deposits are responsible for the pathology. In order to evaluate the efficiency of possible therapies, we developed analytical strategies aiming at designing a “point of care” system for hospital use, which would enable the quantification of circulating mutant and native forms of TTR. The methodology that we developed consists in undertaking the electrokinetic separation of targeted TTR fragments obtained through the enzymatic digestion of the protein. This analytical approach has been developed while focusing on a frequent mutation in France: the TTR Thr49Ala mutation in which a threonine is substituted by an alanine in position 49. In this thesis, two types of enzymatic microreactors have been studied, i.e. (i) a fluidized bed containing magnetic particles functionalized by trypsin molecules and (ii) a thiol-ene-based monolithic chip also functionalized by trypsin. The catalytic power of these microsystems has been compared by measuring the digestion efficiency of BApNA (model substrate) and TTR through analytical methods such as UV-visible absorption spectrophotometry, capillary electrophoresis with UV detection (CE-UV), and liquid chromatography with mass spectrometry detection (UHPLC-MS). The results showed that the thiol-ene-based monolithic enzymatic microreactor was the most efficient system to digest TTR. Besides, during this study, we undertook the optimization of a CE-UV method which is adapted to the analysis of digested sample collected directly out of the microreactor. This allowed us to isolate and quantify the peptides of interest to measure the ratio of mutant TTR (Thr49Ala) versus the wild one.; La polyneuropathie amyloïde familiale à transthyrétine (FAP-TTR) est une maladie rare héréditaire à transmission autosomique dominante liée à la production de formes mutantes de la transthyrétine (TTR). Ces mutations sont à l’origine d’un changement de conformation de la protéine qui, in vivo, se présente sous forme de tétramère. Celui-ci est alors déstabilisé et évolue vers la formation de fibrilles amyloïdes qui s'accumulent au niveau du système nerveux autonome, des nerfs périphériques et des organes. Ces dépôts sont responsables de la pathologie. Dans le but d’évaluer l’efficacité des thérapies pouvant être mises en œuvre, nous avons développé des stratégies analytiques visant à concevoir un système « point of care » à usage hospitalier permettant de quantifier les formes mutante et native circulantes de la TTR. La méthodologie développée consiste à réaliser la séparation électrocinétique de fragments ciblés de la TTR, obtenus par digestion enzymatique de la protéine. Cette approche analytique a été développée en se focalisant sur une mutation fréquente en France : la TTR Thr49Ala où une thréonine est remplacée par une alanine en position 49. Au cours de cette thèse, deux types de microréacteurs enzymatiques ont été étudiés, i.e. (i) un lit fluidisé contenant des particules magnétiques fonctionnalisées par des molécules de trypsine et (ii) une puce monolithique à base de thiol-ène fonctionnalisée également par la trypsine. Le pouvoir catalytique de ces microsystèmes a été comparé en mesurant l’efficacité de digestion du BApNA (substrat modèle) et de la TTR à l’aide de méthodes analytiques telles que la spectrophotométrie d’absorption UV-Visible, l’électrophorèse capillaire couplée à une détection UV (EC-UV) et la chromatographie liquide couplée à la détection par spectrométrie de masse (UHPLC-SM). Les résultats obtenus ont montré que le microréacteur enzymatique monolithique à base de thiol-ène était le plus performant pour digérer la TTR. Par ailleurs, nous avons réalisé, au cours de cette étude, l’optimisation d’une méthode EC-UV, adaptée à l’analyse des digestats recueillis en sortie de microréacteur. Elle a permis de séparer et de quantifier les peptides d’intérêt pour déterminer le rapport de TTR mutante (Thr49Ala) sur TTR native.

Aptamers are oligomers of small single-stranded DNA or RNA which can have strong and specific interactions with some targets when they fold into three-dimensional structures. The objective of this thesis was to complete existing studies on the use of capillary electrophoresis in order to develop a method for the selection of aptamers by CE coupled to laser induced fluorescence and Illumina high-throughput sequencing. In a first step, we developed a method of detection and separation by capillary electrophoresis coupled with the double detection UV-LEDIF of a DNA library interacting with a target: thrombin. It is a model already studied and for which two aptamers have been published. We used aptamer T29 as part of our study because it has the best affinity. Capillary Electrophoresis is a powerful analytical tool that facilitates the selection efficiency of aptamers and specifies the determination of the interaction parameters. We thus were able to determine the affinity constant KD by CE-UV-LEDIF on the basic model: thrombin. Moreover, we also show how the use of Tris buffer can degrade single-stranded DNA during capillary electrophoresis and we propose as an alternative the use of a dibasic sodium phosphate buffer which avoids the phenomenon of degradation. Finally, we explain the difficulty of amplification by qPCR and PCR of an aptamer such as T29 with a G-quadruplex structure. We showed that the Illumina high-throughput sequencing allowed us to find a correlation between the number of sequenced molecules and the number of sequences obtained. Analysis of the sequences obtained shows a significant amount (20%) of T29 sequences which do not correspond to the sequence of this aptamer. This shows that the PCR and high-throughput sequencing steps for the detection of G-quadruplex can induce bias in the identification of these molecules.; Les aptamères sont des oligomères d'ADN ou d'ARN simple brin qui, en se repliant sous forme de structures tridimensionnelles peuvent avoir des interactions fortes et spécifiques envers un certain nombre de cibles. L'objectif de cette thèse a été de compléter les études existantes sur l'utilisation de l'électrophorèse capillaire (CE) et les aptamères afin de mettre au point une méthode de sélection d'aptamères par CE couplée à la fluorescence induite par laser et le séquençage haut-débit Illumina. Dans un premier temps, nous avons mis au point une méthode de détection et de séparation par électrophorèse capillaire couplée à la double détection UV-LEDIF d'une banque d'ADN en interaction avec une cible : la thrombine. C'est un modèle déjà étudié pour lequel deux aptamères ont fait l'objet de publications. Nous avons utilisé l'aptamère T29 dans le cadre de notre étude car c'est celui qui présente la meilleure affinité. L'électrophorèse capillaire est un puissant outil analytique qui facilite l'efficacité de sélection des aptamères et précise la détermination des paramètres d'interactions. Nous avons ainsi pu déterminer la constante d'affinité KD par CE-UV-LEDIF sur le modèle de base : la thrombine. Par ailleurs, nous montrons également comment l'utilisation du tampon Tris peut dégrader un ADN simple brin en électrophorèse capillaire et nous proposons comme alternative l'utilisation d'un tampon sodium phosphate dibasique qui évite ce phénomène de dégradation. Enfin, nous expliquons la difficulté d'amplification par qPCR et PCR d'un aptamère comme le T29 ayant une structure en G-quadruplex. Nous avons montré que le séquençage haut-débit Illumina nous a permis de trouver une corrélation entre le nombre de molécules séquencées et le nombre de séquences obtenues. L'analyse des séquences obtenues montre une quantité importante (20%) de séquences de T29 qui ne correspondent pas à la séquence de cet aptamère. Cela prouve que les étapes de PCR et de séquençage haut débit pour la détection de G-quadruplex peuvent induire un biais dans l'identification de ces molécules.

Monoclonal antibodies (mAbs) are highly complex glycoproteins having a lot of micro-heterogeneities which can influence their effectiveness. As a consequence, it is necessary to develop robust analytical methods, sensitive and specific to characterize them with high accuracy. The purpose of this thesis was to develop analytical methods allowing the multi-level characterization of monoclonal antibody (cetuximab), and antibody drug conjugates (brentuximab vedotin), using on-online or off-line capillary electrophoresis – mass spectrometry coupling. In the first section, a middle-up proteomic approach of cetuximab was carried out using Off-line CZE-UV/MALDI-MS coupling to separate and to characterize Fc/2 and F(ab)’2 charge variants. A top-down characterization of Fc/2 fragments was also employed. Then a new strategy off-line CZE-UV/nanoESI-MS was used to allow the characterization of this partially digest mAbs. Finally, an online coupling by CESI-MS was developed to allow the fast and accurate analysis of middle-up cetuximab. In a second part, the combination of intact, middle-up and bottom-up proteomic carried out on CZE-UV/nanoESI-MS and CESI coupling allowed the most exhaustive characterization of brentuximab vedotin. This methodology allowed the analyze of DAR, the identification of fragments drug conjugates, the simultaneous characterization of the complete structure of antibody, a significant number of post-translational modifications, all peptides drug conjugates and the identification of diagnostic ions.; Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des glycoprotéines complexes possédant de nombreuses micro-hétérogénéités qui peuvent influencer leur efficacité dans l’organisme. Il est par conséquent nécessaire de développer des méthodes analytiques robustes, sensibles et spécifiques pour les caractériser avec la plus grande précision. L’objectif de cette thèse a été de développer des méthodes analytiques permettant la caractérisation fine et à différents niveaux d’un anticorps monoclonal, le cetuximab, ainsi qu’un anticorps monoclonal conjugués à un principe actif, le brentuximab vedotin, sur des couplages direct ou indirect de l’électrophorèse capillaire et la spectrométrie de masse. Dans une première partie, une approche middle-up protéomique du cetuximab a été réalisé sur le couplage indirect CZE-UV/MALDI-MS afin de séparer et caractériser les variants de charges du fragment F/2 et F(ab)’2 ainsi que la caractérisation top-down des fragments Fc/2. Ensuite une nouvelle stratégie indirecte CZE-UV/nanoESI-MS a été développée pour permettre la caractérisation fine de ce mAbs partiellement digéré. Enfin un couplage direct par CESI-MS a été développé pour permettre l’analyse rapide et précise du cetuximab middle-up. Dans une deuxième partie, la combinaison d’analyse de mAbs d’intact, middle-up et bottom-up protéomique a été réalisée sur le couplage CZE-UV/nanoESI-MS et CESI-MS. Cela a permis la caractérisation à différent niveau du brentuximab vedotin. Cette méthodologie a permis l’analyse du DAR, l’identification de fragments conjugués, la caractérisation simultanée de la séquence complète de l’anticorps, d’un grand nombre de modifications post-traductionnelles, la caractérisation des peptides conjugués ainsi que l’identification d’ions diagnostiques du principe actif.

Tous les modèles théoriques, mathématiques et empiriques utilisés pour l’évaluation de la mobilité électrophorétique de peptides regroupent trois paramètres de base : la masse du peptide, son nombre de résidus (sa longueur) et sa charge. Or, ces modèles ont une faiblesse commune qui est le paramètre de charge (q). Lors de l’estimation de cette variable, l’usage d’approximation pour les constantes de dissociation acide (pKa) des groupes ionisables des peptides entraîne une erreur sur ce calcul. Une solution utilisée par plusieurs auteurs est de développer les modèles pour la mobilité à bas pH seulement en assumant la protonation complète de tous les groupes acides et basiques. Afin de comprendre l’effet du résidu acide aminé (a.a.) voisin sur l’ionisation des groupes carboxyles et amines terminaux (Cʹ et Nʹ) d’un peptide, les valeurs de pKa de plusieurs séries de peptides ont été déterminés par CE suite à l’optimisation d’une méthode. Les peptides étudiés étaient de type Z-X et X-Z où X est un ou plusieurs résidus voisins variable tandis que Z est un résidu invariable tel la phénylalanine, la glycine et l’alanine. L’objectif primaire de ce projet consistait à déterminer les valeurs réelles du pKa des groupes Cʹ et Nʹ de 69 peptides afin d’élucider l’effet de leur environnement immédiat, i.e., le résidu voisin. Ce travail systématique de compilation des pKa est une approche rarement utilisée. En ayant accès à ces valeurs, la source d’incertitude sur les constantes d’ionisation des peptides auquel font face beaucoup d’auteurs est éliminée. Ceci permet une analyse plus approfondie de leur comportement électrophorétique. Pour la série de dipeptides étudiés, nous avons observé que plus l’hydrophobicité du résidu X augmentait, plus les pKa Cʹ et Nʹ baissait selon le résidu Z. Les résidus X hydrophiles possèdent des chaines latérales chargées ou très polaires qui influencent de façon plus importante le processus d’ionisation que les résidus X hydrophobes. Les données analysées ont aussi permis de déterminer que plus la distance du résidu X au Cʹ ou Nʹ est grande, plus son influence sur le pKa diminue. Également, le prolongement d’un peptide de 1 à 6 résidus, tel les oligoglycines, fait augmenter le pKa-Cʹ et diminuer le pKa-Nʹ via un processus expliqué par la réduction des interactions électrostatiques entre les fonctions Cʹ et Nʹ. Ces résultats illustrent que les pKa Cʹ et Nʹ de peptides ne sont pas exacts lorsqu’ils sont basés uniquement sur l’identité de l’acide aminé terminal, comme c’est le cas pour l’approche classique de modélisation. Les valeurs de pKa de dipepides obtenus par titrages potentiométriques ont été comparés aux pKa déterminés par CE. Des écarts importants ont été obtenus ce qui a mis en lumière la nécessité de contrôler les protocoles expérimentaux de manière rigoureuse pour mieux comparer les résultats provenant de deux techniques. Par la suite, à l’aide des mobilités de peptides obtenus expérimentalement à haut et bas pH, nous avons comparé les résultats de modélisations calculés pour les pKa expérimentaux à ceux de la littéraire afin d’évaluer les avantages du modèle d’Offord. Enfin, des simulations de séparations par CE de 9 peptides obtenues avec les programme informatique PeakMaster ont été comparées avec les résultats expérimentaux. Ceci a démontré l’utilité et la supériorité des pKa expérimentaux comparativement aux pKa les plus communément utilisés avec les approches traditionnelles., All theoretical, mathematical and empirical models used to evaluate the electrophoretic mobilities of peptides use three basic parameters: the peptide mass, its number of residues (its length) and its charge. However, all models have a common flaw: the charge parameter (q). When estimating this variable, the use of approximations for the ionization constants (pKa) leads to imprecise values for the calculation. One solution is to limit the development of mobility models to only low pH and assume full protonation of all acidic and basic groups. In order to understand the effect of the neighboring amino acid (a.a.) residue on the terminal carboxylate and amine functions of a peptide (Cʹ et Nʹ), the pKa values of multiple series of peptides were determined by capillary electrophoresis (CE) using an optimized method. The peptides studied were of the form Z-X and X-Z, where X was one or multiple variable residues and Z was an invariable residue such as phenylalanine, glycine or alanine. The core of this project consisted of determining the actual Cʹ and Nʹ pKa values for 69 peptides to elucidate the effect of their immediate microenvironment. i.e., the effect of their nearest neighbor. This systematic compilation of pKa’s is an approach that is rarely used. With these values on hand, the uncertainty of the ionisation constant that most authors face is almost eliminated and the analysis of the electrophoretic behavior of peptides can be enhanced. For the peptides studied, we observed that increasing the hydrophobicity of residue X lead to a decrease in Cʹ and Nʹ pKa values, but to different degrees depending on the terminal residue (Z) studied. Hydrophilic X residues possess charged or highly polar side-chains, which influenced Cʹ and Nʹ ionisations to a greater degree than hydrophobic X residues. Additionally, the elongation of a peptide from one to six residues, such as the oligoglycine series studied, lead to an increase in pKa-Cʹ and a decrease in pKa-Nʹ, which might be explained by a diminishing electrostatic interaction between the Cʹ and Nʹ functional groups. These results illustrate that the Cʹ and Nʹ pKa values for peptides are not accurate when based solely on the identity of the Cʹ and Nʹ a.a. residues, which is the classical way peptide charge is estimated for modeling not only mobilities but also chemical and biological reactivity. Potentiometric titration of dipeptides produced pKa values that were compared to pKa’s determined by CE. Significant discrepancies were obtained which brought to light the necessity of rigorously controlling experimental protocols when comparing results obtained with two techniques. Mobility data for high and low pHs were calculated using experimental and literature tabulated pKa values to estimate charge and to therefore understand the benefit gained when applying the Offord mobility model. Finally, simulations of separating 9 peptides by CE were carried out with the computer program PeakMaster and compared with experimental results. This showed the utility and superiority of our cumulated pKa values versus the most widely cited approximate pKa values from the literature.

Amyloidosis is the generic word to name a group of diseases that are caused by the misfolding and extracellular accumulation of various proteins. Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder linked to oligomerization and fibrillization of amyloid β peptides, with Aβ 1-42 being the most aggregative and neurotoxic one. To date, the exactly cause of the Alzheimer's disease is not still known and so there is no effective treatment of the disease.An attractive strategy for treating AD could be the inhibition of the oligomerization of soluble Aβ monomers, by stabilizing the native unstructured conformation of the peptide, using compounds able to prevent the formation of β-sheets. Indeed, few structural studies of oligomeric species and fibrils revealed that the aggregation involves β-sheet structures.A large number of small molecules have been proposed for their ability to inhibit or modulate Aβ1-42 aggregation and toxicity. However, the aggregation process is highly complex, and extremely difficult to control. Recent studies indicate that soluble transient oligomers preceding fibril formation are highly toxic species. Thus, the development of inhibitors targeting both oligomerization and fibrillization remains challenging despite its therapeutic significance. Peptides are today reasonable alternatives to small molecule pharmaceuticals. In particular, inhibition of Aβ-aggregation has been targeted using self-recognition elements (SREs), which are key amino acid sequences involved in the different aggregated species. To our knowledge, the use of small acyclic β-hairpins has been very rarely explored as β-sheet binders and inhibitors of aggregation.As Aβ-aggregation is a dynamic and complex process, we hypothesized that flexible β-hairpins could adapt themselves in the interaction with the different Aβ1-42 conformations present during the aggregation process, and in particular in the early stages of oligomerization. We designed acyclic β-hairpin mimics based on a piperidine-pyrrolidine semi-rigid scaffold developed recently as a flexible β-turn inducer, and on different SREs of Aβ1-42. The choice of the SREs was based on oligomer and fibril structures.The ability of all compounds to influence the Aβ 1-42 fibrillization process was evaluated by thioflavin-T fluorescence spectroscopy, used as an evaluation tool to define the inhibitory activity. The obtained results were successively supplemented by transmission electron microscopy. The most promising compounds were also studied by Capillary Electrophoresis (CE) using a method we recently proposed to monitor the very early steps of the oligomerization process overtime. The best inhibitors were investigated to determine their ability to reduce the toxicity of aggregated Aβ1-42 to SH-SY5Y neuroblastoma cells.Together with the evaluation of these molecules, we report in this thesis the conformational studies performed by NMR. These structure investigations were performed to investigate and confirm the β-hairpin conformational preference of the compounds in solution.Finally, we performed a practical synthetic pathway to obtain new peptidomimetic chains composed by aza-amino acid residues. In the literature only peptide sequence, with just one aza-amino acid residue in the middle, are known, but the hydrogen-bonding properties of 2:1 [Aza/α]-tripeptides have not yet, to our knowledge, been exploited in the design of the inhibition of protein-protein interactions. We present in this thesis the conformational studies of the 2:1 [Aza/α]-tripeptide sequence by NMR analyses, X-ray crystallography and molecular modelling.In conclusion, the structural elements made in this thesis provide valuable insights in the understanding of the aggregation process of Aβ 1-42 peptide and to explore the design of novel acyclic β-hairpin targeting amyloid-forming proteins.; La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative liée à l’oligomérisation et à la fibrillation du peptide bêta amyloïde, avec Abêta 1-42 étant le plus agrégeant et neurotoxique. La cause exacte de la maladie d'Alzheimer n’est pas encore connue et donc il n'y a pas de traitement efficace contre cette maladie.Une stratégie prometteuse pourrait être l'inhibition de l'oligomérisation de monomères solubles d'Abêta;, en stabilisant la conformation non structurée native du peptide, à travers l’utilisation de composés capables d'empêcher la formation de feuillets bêta. En effet, les peu d'études structurales des espèces oligomériques et des fibrilles ont révélé que l'agrégation implique des structures en feuillet bêta.De nombreuses petites molécules ont été proposées pour leur capacité à inhiber ou moduler l'agrégation de Abêta 1-42 et sa toxicité. Cependant, le processus d'agrégation est très complexe et difficile à contrôler. Des études récentes indiquent que les oligomères solubles transitoires précédant la formation de fibrilles sont les espèces les plus toxiques. Ainsi, le développement d'inhibiteurs ciblant à la fois l’oligomérisation et la fibrillation reste difficile en dépit de son importance thérapeutique. Les peptides sont des alternatives raisonnables aux autres produits pharmaceutiques chimiques. En particulier, l'inhibition de l'agrégation de Abêta; a été ciblée en utilisant des éléments d'auto-reconnaissance (SRE), qui sont des séquences d'acides aminés clés impliqués dans les différentes espèces agrégées. À notre connaissance, l'utilisation de petites "bêta-hairpins" acycliques a été très rarement explorée comme ligands de feuillets-bêta et comme inhibiteurs de l'agrégation.Comme l’agrégation de Abêta est un processus dynamique et complexe, nous avons supposé que les "bêta-hairpins" flexibles pourraient mieux s'adapter dans l'interaction avec les différentes conformations de Abêta 1-42 présents pendant le processus d'agrégation, et en particulier dans les premiers stades de l'oligomérisation. Nous avons conçu des mimes de feuillets bêta acycliques basés sur un squelette semi-rigide de type pipéridine-pyrrolidine comme inducteur flexible de coude bêta, et sur différents SREs de Abêta 1-42. Le choix des SREs a été basée sur les structures d'oligomères et fibrilles.La capacité de tous les composés a été évaluée par spectroscopie de fluorescence à la thioflavine-T pour déterminer l'activité inhibitrice. Les résultats obtenus ont été complétés par microscopie à transmission électronique. Les composés les plus prometteurs ont également été étudiés par électrophorèse capillaire (EC) pour suivre les étapes très précoces du processus d'oligomérisation. Les meilleurs inhibiteurs ont été étudiés afin de déterminer leur capacité à réduire la toxicité de Abêta 1-42 sur des cellules de neuroblastome SH-SY5Y.Nous rapportons également dans cette thèse les études conformationnelles, effectuées par RMN et réalisées pour étudier et confirmer la capacité de composés de se structurer en solution comme des "bêta-hairpins".Enfin, nous avons développé une voie de synthèse pour obtenir de nouvelles chaînes peptidomimétiques composées par des résidus aza-aminoacides. Dans la littérature, seules des séquences peptidiques comportant un seul résidu aza-aminoacide au milieu, sont connues, mais les propriétés de liaison hydrogène d’un 2:1 [aza/alpha]-tripeptide ne sont pas encore, à notre connaissance, étudiées ni exploitées dans la conception d’inhibiteurs des interactions protéine-protéine. Nous présentons dans cette thèse les études conformationelles réalisées par RMN, cristallographie aux rayons X et modélisation moléculaire.On peut conclure que les éléments structurels décrits dans cette thèse fournissent des indications précieuses dans la compréhension du processus d'agrégation du peptide Abêta 1-42 et dans la conception de nouveaux " bêta-hairpins" acycliques ciblant des protéines amyloïdes.

Amyloidosis is the generic word to name a group of diseases that are caused by the misfolding and extracellular accumulation of various proteins. Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder linked to oligomerization and fibrillization of amyloid β peptides, with Aβ 1-42 being the most aggregative and neurotoxic one. To date, the exactly cause of the Alzheimer's disease is not still known and so there is no effective treatment of the disease.An attractive strategy for treating AD could be the inhibition of the oligomerization of soluble Aβ monomers, by stabilizing the native unstructured conformation of the peptide, using compounds able to prevent the formation of β-sheets. Indeed, few structural studies of oligomeric species and fibrils revealed that the aggregation involves β-sheet structures.A large number of small molecules have been proposed for their ability to inhibit or modulate Aβ1-42 aggregation and toxicity. However, the aggregation process is highly complex, and extremely difficult to control. Recent studies indicate that soluble transient oligomers preceding fibril formation are highly toxic species. Thus, the development of inhibitors targeting both oligomerization and fibrillization remains challenging despite its therapeutic significance. Peptides are today reasonable alternatives to small molecule pharmaceuticals. In particular, inhibition of Aβ-aggregation has been targeted using self-recognition elements (SREs), which are key amino acid sequences involved in the different aggregated species. To our knowledge, the use of small acyclic β-hairpins has been very rarely explored as β-sheet binders and inhibitors of aggregation.As Aβ-aggregation is a dynamic and complex process, we hypothesized that flexible β-hairpins could adapt themselves in the interaction with the different Aβ1-42 conformations present during the aggregation process, and in particular in the early stages of oligomerization. We designed acyclic β-hairpin mimics based on a piperidine-pyrrolidine semi-rigid scaffold developed recently as a flexible β-turn inducer, and on different SREs of Aβ1-42. The choice of the SREs was based on oligomer and fibril structures.The ability of all compounds to influence the Aβ 1-42 fibrillization process was evaluated by thioflavin-T fluorescence spectroscopy, used as an evaluation tool to define the inhibitory activity. The obtained results were successively supplemented by transmission electron microscopy. The most promising compounds were also studied by Capillary Electrophoresis (CE) using a method we recently proposed to monitor the very early steps of the oligomerization process overtime. The best inhibitors were investigated to determine their ability to reduce the toxicity of aggregated Aβ1-42 to SH-SY5Y neuroblastoma cells.Together with the evaluation of these molecules, we report in this thesis the conformational studies performed by NMR. These structure investigations were performed to investigate and confirm the β-hairpin conformational preference of the compounds in solution.Finally, we performed a practical synthetic pathway to obtain new peptidomimetic chains composed by aza-amino acid residues. In the literature only peptide sequence, with just one aza-amino acid residue in the middle, are known, but the hydrogen-bonding properties of 2:1 [Aza/α]-tripeptides have not yet, to our knowledge, been exploited in the design of the inhibition of protein-protein interactions. We present in this thesis the conformational studies of the 2:1 [Aza/α]-tripeptide sequence by NMR analyses, X-ray crystallography and molecular modelling.In conclusion, the structural elements made in this thesis provide valuable insights in the understanding of the aggregation process of Aβ 1-42 peptide and to explore the design of novel acyclic β-hairpin targeting amyloid-forming proteins.; La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative liée à l’oligomérisation et à la fibrillation du peptide bêta amyloïde, avec Abêta 1-42 étant le plus agrégeant et neurotoxique. La cause exacte de la maladie d'Alzheimer n’est pas encore connue et donc il n'y a pas de traitement efficace contre cette maladie.Une stratégie prometteuse pourrait être l'inhibition de l'oligomérisation de monomères solubles d'Abêta;, en stabilisant la conformation non structurée native du peptide, à travers l’utilisation de composés capables d'empêcher la formation de feuillets bêta. En effet, les peu d'études structurales des espèces oligomériques et des fibrilles ont révélé que l'agrégation implique des structures en feuillet bêta.De nombreuses petites molécules ont été proposées pour leur capacité à inhiber ou moduler l'agrégation de Abêta 1-42 et sa toxicité. Cependant, le processus d'agrégation est très complexe et difficile à contrôler. Des études récentes indiquent que les oligomères solubles transitoires précédant la formation de fibrilles sont les espèces les plus toxiques. Ainsi, le développement d'inhibiteurs ciblant à la fois l’oligomérisation et la fibrillation reste difficile en dépit de son importance thérapeutique. Les peptides sont des alternatives raisonnables aux autres produits pharmaceutiques chimiques. En particulier, l'inhibition de l'agrégation de Abêta; a été ciblée en utilisant des éléments d'auto-reconnaissance (SRE), qui sont des séquences d'acides aminés clés impliqués dans les différentes espèces agrégées. À notre connaissance, l'utilisation de petites "bêta-hairpins" acycliques a été très rarement explorée comme ligands de feuillets-bêta et comme inhibiteurs de l'agrégation.Comme l’agrégation de Abêta est un processus dynamique et complexe, nous avons supposé que les "bêta-hairpins" flexibles pourraient mieux s'adapter dans l'interaction avec les différentes conformations de Abêta 1-42 présents pendant le processus d'agrégation, et en particulier dans les premiers stades de l'oligomérisation. Nous avons conçu des mimes de feuillets bêta acycliques basés sur un squelette semi-rigide de type pipéridine-pyrrolidine comme inducteur flexible de coude bêta, et sur différents SREs de Abêta 1-42. Le choix des SREs a été basée sur les structures d'oligomères et fibrilles.La capacité de tous les composés a été évaluée par spectroscopie de fluorescence à la thioflavine-T pour déterminer l'activité inhibitrice. Les résultats obtenus ont été complétés par microscopie à transmission électronique. Les composés les plus prometteurs ont également été étudiés par électrophorèse capillaire (EC) pour suivre les étapes très précoces du processus d'oligomérisation. Les meilleurs inhibiteurs ont été étudiés afin de déterminer leur capacité à réduire la toxicité de Abêta 1-42 sur des cellules de neuroblastome SH-SY5Y.Nous rapportons également dans cette thèse les études conformationnelles, effectuées par RMN et réalisées pour étudier et confirmer la capacité de composés de se structurer en solution comme des "bêta-hairpins".Enfin, nous avons développé une voie de synthèse pour obtenir de nouvelles chaînes peptidomimétiques composées par des résidus aza-aminoacides. Dans la littérature, seules des séquences peptidiques comportant un seul résidu aza-aminoacide au milieu, sont connues, mais les propriétés de liaison hydrogène d’un 2:1 [aza/alpha]-tripeptide ne sont pas encore, à notre connaissance, étudiées ni exploitées dans la conception d’inhibiteurs des interactions protéine-protéine. Nous présentons dans cette thèse les études conformationelles réalisées par RMN, cristallographie aux rayons X et modélisation moléculaire.On peut conclure que les éléments structurels décrits dans cette thèse fournissent des indications précieuses dans la compréhension du processus d'agrégation du peptide Abêta 1-42 et dans la conception de nouveaux " bêta-hairpins" acycliques ciblant des protéines amyloïdes.