Search

VI ÖZET Toraganlı, B., Model Membranlarda Hidrofobik Peptit-Lipit Etkileşmelerinin İncelenmesi, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Farmasötik Biyoteknoloji Programı Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2005. Hidrofobik peptitlerin biyolojik membranlarla etkileştiği bilinmektedir, immünosüpresan aktivitesi ile organ transplantasyonu ve otoimmün hastalıkların tedavisinde kullanılan siklosporin A (CsA) hidrofobik peptitler arasında yer almakta ve CsA ile gözlenen toksik yan etkiler CsA'nın membranlar ve membran lipitleri ile etkileşmelerinin incelenmesinde sürekli bir ilgi alanını oluşturmaktadır. Bu çalışmanın amacı lipozomal model membranlarda CsA ile lipit etkileşmelerinin mikroplaka floresans spektroskopi ile incelenmesidir. Çalışmada, DPPC, DLPC, POPC, DLPG, DPPG, DLPC/DPPC (1:1 molar oran) yapısında farklı fosfolipit bileşimine sahip çok tabakalı veziküller (MLV) hazırlanmış ve model membran olarak kullanılmıştır. Lipozomal membranlara CsA'nın inkorporasyonundan sonra lipozomal membranlar floresans prob lordan ile işaretlenmiştir. Lordan'ın floresans özellikleri ortamın polaritesi ve jel-sıvı lipit paketlenme özelliklerine duyarlı olduğundan model membranların işaretlenmesinde tercih edilmektedir. Ancak bugüne kadar yapılmış olan çalışmalarda lordan'ın CsA-lipit etkileşmelerinin incelenmesinde floresans bildirici bir prob olarak kullanılması hakkında bir bilgi bulunmamaktadır. Bu tezin kapsamında CsA'nın lipozomal membranda yer alan fosfolipitlerie etkileşmesi sonucunda lordan'ın spektral özelliklerindeki değişimler ve lipozomal membranlarda lordan'ın genel polarizasyonu sıcaklık, CsA derişimi ve dalgaboyunun fonksiyonu olarak CsA içermeyen boş lipozomlar ile karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar CsA'nın jel veya sıvı kristal fazda bulunan lipozomal çift tabakaya yerleştiğini ve fosfolipitlerin yağ asiti zincirleri ile etkileştiğini göstermiştir. CsA'nınvıı lipozomal membrandaki fosfolipitler ile etkileşmesinin fosfolipitin yapısına, CsA derişimi ne ve sıcaklığa bağlı olarak farklılaştığı saptanmıştır. CsA'nın yağ asiti zincirlerinin konformasyonunu etkileyerek membran düzeni ve polaritede önemli değişimlere neden olarak, birarada bulunan jel ve sıvı kristal fazlar ile lipit yörelerin oluşumunda ve lipitlerin membrandaki lateral organizasyonunu değiştirmede etkili olduğu bulunmuştur. Bu çalışmada floresans prob lordan'ın lipozomal membranda CsA'nın lipitlerle etkileşmesinin incelenmesinde kullanılması ile elde edilen sonuçlar özgün olup, sonuçların CsA'nın lipozomal membranlarla etkileşmesinde literatürde bildirilen farklı yöntemlerin bulgularını desteklediği saptanmıştır. Çalışmada konvansiyonel floresans spektroskopik analiz yöntemlerinin 96 kuyucuktu mikroplaka formata uygulanması ile aynı anda yüksek sayıda numunenin hızlı ve 200 uL hacimdeki düşük miktarlarda analizi gerçekleştirilmiştir. Anahtar Kelimeler: Siklosporin A, Fosfolipitler, Lipozomal Model Membranlar, Hidrofobik Peptit-Lipit Etkileşmesi, Floresans Spektroskopi, Lordan, Genel Polarizasyon, Mikroplaka Floresans Analiz Destekleyen Kurumlar:. Bu tez çalışması Hacettepe Üniversitesi 02G047 kod numaralı alt yapı projesi tarafından desteklenmiştir.. Çalışmada Hacettepe Üniversitesi 02G018 kod numaralı alt yapı projesinde satın alınan aletler de kullanılmıştır. VM ABSTRACT Toraganlı, B., Investigation of the Hydrophobic Peptide-Lipid Interactions in Model Membranes, Hacettepe University Health Sciences Institute MSc Thesis in Pharmaceutical Biotechnology, Ankara, 2005. Hydrophobic peptides are known to interact with biological membranes. With its immunosupppresant activity Cyclosporine A (CsA), which is used for organ transplantations and for the treatment of autoimmune diseases, is also among hydrophobic peptides and due to its toxic side effects there has been a continued interest to elucidate its interactions with membranes and membrane lipids. To aim of this study was to investigate the interactions of CsA with lipids in liposomal model membranes by fluorescence spectroscopy. In this respect, multilamellar vesicles (MLV) having different phospholipid compositions such as DPPC, DLPC, POPC, DLPG, DPPG, DLPC/DPPC (1:1 molar ratio) were prepared and used as model membranes. After CsA incorporation the liposomal membranes were labeled with a fluorescent probe laurdan while laurdan fluorescence has been used in model membranes either for its sensitivity to the environment polarity or to gel-fluid lipid packing, but up to date there has been no report for its application in CsA-lipid interactions as a reporter fluorescence probe in literature. In the frame of this thesis the spectral changes of laurdan caused by the interactions of CsA with the phospholipids present in the liposomal membranes and the generalized polarization of laurdan in liposomal membranes were assessed as a function of temperature, CsA concentrations and wavelength and compared with that of CsA-free plain liposomes. The results indicated the localization of CsA in the liposomal bilayer either in gel or liquid-crystalline state and its interactions with the hydrocarbon chains ofIX phospholipids. The interactions of CsA with phospholipids in the liposomal membranes were found to be different depending on the phospholipid structure, CsA concentration and the temperature. It has been shown that CsA could induce significant variations in membrane order and polarity by influencing the fatty acid conformation and promote formation of co-existing lipid domains of gel and liquid-crystalline phases and alter lateral organization of lipids in membranes. As a consequence of using the fluorescent probe laurdan for examining the interactions of CsA with lipids in liposomal membranes, the results of this study were novel and found to support the findings of the other CsA-liposomal membrane interaction studies that were reported with different techniques. In this study the methods used in conventional fluorescence spectroscopic analysis were applied to 96 well microplate format and simultaneous and rapid analysis of high number of samples in 200 uL volume with low amounts were realized. Keywords: Hydrophobic Peptide-lipid Interactions, Cyclosporine A, Phospholipids, Liposomal Model Membranes, Fluorescence Spectroscopy, Laurdan, Generalized Polarization, Microplate Fluorescence Analysis Sponsored by:. A grant (Project Nr: 02G047) from Hacettepe University Scientific Research Unit.. During the study the equipments belong to the Project 02G018 (Hacettepe University Scientific Research Unit) were also used. 123

vıı ÖZET Yargan, A.P., Katyonik Lipozomlar ve Katyonik Lipozom-DNA Komplekslerinin Hücre Kültür Ortamı ile Etkileşmelerinin Partikül Büyüklüğü Analizi ve Jel Elektroforezi ile incelenmesi, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Farmasötik Biyoteknoloji Programı Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2005. Son yıllarda yapılan çalışmalar DNA'nın katyonik lipozomlar ile kondenzasyonunda sorumlu olan elektrostatik etkileşmelerin lipozomal yapıda değişiklere neden olduğunu ve bu etkileşimlerin in vitro ve in vivo koşullara göre farklılaşarak katyonik lipozom-DNA komplekslerin (lipopleks) biyolojik aktivitelerini etkilediğini göstermektedir. Bu nedenle katyonik lipozom-DNA komplekslerinin yapısı, fizikokimyasal veya kolloidal özelliklerinin kontrol edilmesi ve farklı biyolojik sıvılardaki etkileşme mekanizmalarının anlaşılması etkin ve güvenli viral- olmayan, lipit kökenli gen taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesinde kritik bir önem taşımaktadır. Bu bağlamda çalışmanın amacı katyonik lipozomlar ve katyonik lipozom-DNA komplekslerinin kompleks oluşturulan ortam, serum içeren hücre kültür vasatı ve tek tabaka oluşturmuş retina pigment epitel hücrelerden elde edilen koşullandırılmış vasat ile farklı ortamlardaki etkileşmelerinin incelenmesidir. Bu amaca ulaşmak için DC-CHOL/DOPE (3:2 molar oran) bileşiminde katyonik lipozomlar ekstrüzyon yöntemi ile hazırlanmış ve katyonik lipozomlar lipit içeriği ve partikül büyüklüğü açısından karakterize edilmiştir. Dört farklı lipit/DNA oranında (a/a) hazırlanan katyonik lipozom-DNA kompleksleri, inkübasyon zamanı ve kompleks oluşum hacminin fonksiyonu olarak incelenmiştir. Zamana bağlı kompleks oluşturma işlemi uygulanarak hazırlanan komplekslerin büyüklüğü dinamik ışın saçınımı (DLS) ve agaroz jel elektroforezi ile araştırılmış ve hazırlanan komplekslerin farklı biyolojik ortamlarla etkileşmeleri DLS ile irdelenmiştir. Elde edilen sonuçlar ile lipit/DNA oranının ve kompleks oluşum hacminin kompleks oluşumunda büyük bir etkiye sahip olduğu ve komplekslerde zamana bağlıvııı bir olgunlaşma süreci bulunduğu gösterilmiştir. Ayrıca etkileşmelerde kullanılan biyolojik sıvıların, kaynak ve bileşimine bağlı olarak, komplekslerin büyüklüklerini farklı şekilde değiştirme potansiyeline sahip olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmada elde edilen veriler ile katyonik lipozom-DNA kompleksleri ve farklı biyolojik sıvılar arasında, farklı tipte etkileşmelerin bulunduğu ve bu etkileşmelerin hedef kompartmanlara veya hücrelere göre incelenmesinin gerekli olduğu gösterilmiştir. Anahtar Kelimeler: DC-CHOL/DOPE, Katyonik Lipozomlar, Katyonik Lipozom-DNA Kompleksi, Lipopleks, Viral Olmayan Lipit Kökenli Gen Taşıyıcı Sistemler, Lipozom-Hücre Kültür Ortam Etkileşmesi, Koşullandırılmış Vasat (Retina Pigment Epitel Hücreleri), Partikül Büyüklüğü Analizi, Agaroz Jel Elektroforezi Destekleyen Kurumlar:. Bu tez çalışması Hacettepe Üniversitesi 02G047 kod numaralı alt yapı projesi kapsamında desteklenmiştir.. Çalışmada Hacettepe Üniversitesi 02G018 kod numaralı alt yapı projesinde satın alınan aletlerde kullanılmıştır.. Ayrıca tez kapsamındaki çalışmada gerekli olan koşullandırılmış hücre kültür vasatı, TÜBİTAK-SBAG 2119 araştırma projesinde, proje yürütücüsü tarafından sağlanan retina pigment epitel hücrelerinin kullanılması ile elde edilmiştir. IX ABSTRACT Yargan, A. P., Investigation of the Interactions of Cationic Liposomes and Cationic Liposome-DNA Complexes with Cell Culture Medium by Particle Size Analysis and Gel Electrophoresis, Hacettepe University Health Sciences Institute MSc Thesis in Pharmaceutical Biotechnology, Ankara, 2005. Recent studies indicate that the electrostatic interactions involved in condensation of DNA by cationic liposomes, result in changes in the liposomal structure and these interactions are influenced by in vitro and in vivo conditions which in turn effects the biological activity of the cationic liposome-DNA (lipoplex) complexes. In this respect, control of the structure and the physicochemical or colloidal properties of the cationic liposome-DNA complexes and understanding the mechanisms of these interactions in different biological fluids have critical importance for the development of effective and safe non-viral lipid based gene delivery systems. Consequently, the aim of this study was to investigate the interactions between cationic liposomes and cationic liposomes-DNA complexes in different mediums, such as the complexation medium, the complete cell culture medium supplemented with serum and the conditioned medium obtained from retinal pigment epithelial cells at confluence. In order to achive this goal DC-CHOL/DOPE (3:2 molar ratio) cationic liposomes were prepared by an established (extrusion) technique and characterised in terms of the lipid content and the particle size. The cationic liposomes-DNA complexes were prepared in four different lipid/DNA (w/w) ratios and the complex formation was investigated as a function of incubation time and volume used during complexation. After using a time dependent complex formation procedure, the size of the complexes was analysed by dynamic light scattering (DLS) and agarose gel electrophoresis. Furthermore the interactions of the complexes in different biological mediums were examined by DLS. The results showed that the lipid/DNA ratio and the volume ofcomplexation medium had great influence in complexation and there was a time-dependent maturation of the complexes. In addition the nature and the composition of the biological mediums tested had the potential to alter the size of the complexes in different manner. The data obtained within this study confirmed the existence of different types of interactions between cationic liposomes-DNA complexes and different biological fluids, and these interactions should be examined according to the target compertments or eels under investigation. Key words: DC-CHOL/DOPE, Cationic Liposomes, Cationic Liposomes-DNA Complexes, Lipoplex, Non-Viral Lipid Based Gene Delivery Systems, Liposome-Cell Culture Medium Interactions, Conditioned Medium (Retinal Pigment Epithelium Cells), Particle Size Analysis, Agarose Gel Electrophoresis Supported by:. A grant (Project Nr. 02G047) from Hacettepe University Scientific Research Unit.. During the study the equipments belong to the project 02G01 8 (Hacettepe University Scientific Research Unit) were also used.. The conditioned cell culture medium required in this study was obtained from the retinal pigment epithelium cells that were provided by the project manager in the frame of the TÜBİTAK-SBAG-21 19 project. 126

106 ÖZET Bu çalışmanın amacı ülkemizdeki bir çok klinikte farklı dozda, farklı infüzyon süresi ve uygulama sıklığında kullanıldığı bilinen AmBisome®'un hastalara uygulan dıktan sonra AB plazma derişiminin saptanması ve farmakokinetik parametrelerinin valide edilmiş bir analitik yöntem ile belirlenmesi şeklinde saptanmıştır. Bu nedenle öncelikle validasyon kriterlerinin sağlandığı, AmBisome®'dan AB'nin in vitro ve plaz madan in vivo HPLC ile miktar tayini gerçekleştirilmiştir. İn vitro analizde kantitatif tayin sınırı 0.5 ı^g/mL, deteksiyon sınırı 0.005 ng/mL olan bu yöntemin, 2.5-7.5 jıg/mL derişim aralığında doğrusal olduğu ve % geri kazanımın 99.6±0.1 olduğu bulunmuştur. AB'nin plazmadan miktar tayininde katı faz ekstraksiyonu ve internal standart kullanılarak plazmada 0.01-2 ı^g/mL derişim aralığında doğrusal olduğu gösterilen bu yöntem ile AB'nin % geri kazanımı 98.1+1.1 olarak saptanmıştır. Kan titatif tayin sınırı 0.01 ^ıg/mL, deteksiyon sınırı 0.005 fig/mL olan yöntem AmBisome® uygulanan hastalarda AB'nin plazma derişiminin saptanması için uygulanmıştır. AML ve MM tanısı ile 50 mg/gün dozda AmBisome® ile tedavi gören toplam üç hastanın AB plazma derişim zaman profilleri çıkarılmış ve elde edilen verilere alan ve moment analizi uygulanarak kompartmansız farmakokinetik analiz parametreleri (Cmax, Cmin, AUC, AUMC, MRT ve Vdss ) hesaplanmış ve sonuçlar değerlendirilmiştir. 107 SUMMARY It is well known that AmBisome® is in widely current use in the clinics of our country and administered to patients with different dosages, infusion rates and dosage intervals. The aim of this study was to analyze the plasma concentrations of amphotericin B after AmBisome® application and to estimate the pharmacokinetic parameters with an established and validated HPLC assay procedure. Since a validated assay has an utmost importance in pharmacokinetic studies, in vitro and in vivo quantitative analytical methods by HPLC were used in order to determine amphotericin B in AmBisome® and plasma and both of the methods were validated. The quantitation and detection limits of in vitro analytical method were found to be 0.5 ag/mL and 0.005 ng/mL respectively. The linearity was established at 2.5-7.5 ng/mL and the recovery was % 99.6+0.1 Quantitative determination of amphoterisin B in plasma was realized by using solid phase extraction for sample pretreatment and internal standard application and the assay was linear in the concentration range of 0.01-2 ig/mL. The recovery from the plasma was % 98.1 ±1.1 and the sensitivity of assay was shown to be 0.01 i^g/mL with a limit of detection at 0.005 l^g/mL. This validated in vivo assay was utilized to support our pharmacokinetic study. Amphotericin B plasma profiles were obtained from three patients diagnosed as acute myeloblastic leukemia and malignant melanoma who were treated with AmBisome® at a dosage of 50 mg/day by i.v. infusion. Noncompartmental parameters such as AUC, AUMC, MRT, Vdss and Cmax, Cmin were calculated from the plasma concentrations versus time data of patients by using area and moment anaysis and evaluated. 118