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Eisen-Schwefel-Cluster sind wichtige Cofaktoren, die an der Redox- und Nicht-Redox-Katalyse beteiligt sind. Enzyme der Lyase-Familie wie Aconitase, Fumarase und DihydroxysäureDehydratase enthalten Cluster, die an drei Cystein-Liganden koordiniert sind. Das Eisenion, das an einen Nicht-Cysteinyl-Liganden koordiniert ist, wirkt als Lewis-Säure und interagiert mit dem Substrat über die Hydroxygruppe des dritten Kohlenstoffatoms und der Carboxygruppe. Das in dieser Arbeit untersuchte Enzym ist die Dihydroxysäure-Dehydratase (DHAD), welche an der Biosynthese der Aminosäuren Isoleucin, Leucin und Valin beteiligt ist. In dieser Arbeit wurden die kinetischen und spektroskopischen Eigenschaften von DHAD aus Streptococcus mutans, Streptococcus thermophilus, Saccharomyces cerevisiae und Escherichia coli untersucht. Zu diesem Zweck wurden ihre Gene kloniert und die Proteine in E. coli Zellen exprimiert. Nach der Proteinreinigung zeigten die UV-Vis-, ESR- und Mössbauer-Spektroskopie die Anwesenheit eines [2Fe-2S]2+-Clusters in der S. mutans DHAD, eines [4Fe-4S]2+-Cluster in E. coli DHAD und einer Mischung von [2Fe-2S]2+- und [4Fe-4S]2+ -Cluster in der S. cerevisiae DHAD. Darüber hinaus unterstützten die Ergebnisse der Sauerstoffstabilitätstests und des Eisen- und säurelabilen Sulfidgehalts die spektroskopischen Analysen. MössbauerSpektroskopie lieferte zusätzlich Information für das Vorhandensein eines nicht-cysteinyl-koordinierten Eisenions in den Clustern der S. mutans und in E. coli DHAD. Enzymaktivitätsmessungen mit dem Dinitrophenylhydrazin-Assay und den hier etablierten gekoppelten Assays mit NADH-abhängigen Ketoisovalerat-reduzierenden Dehydrogenasen wurden durchgeführt, um die spezifischen Aktivitäten und die kinetischen Parameter der DHAD zu bestimmen. Interaktionsstudien der S. mutans DHAD mit dem Substrat, dem Produkt, den substrat- und produktähnlichen Verbindungen mittels UV-Vis-, ESR-, Mössbauer- und FT-IR-Spektroskopie zeigten, dass nur das (2R)-Isomer des Substrats und 2-Ketosäuren (KIV, Kbut) mit dem Cluster der S. mutans DHAD interagierten. Das DHAD-Produkt (2-Ketoisovalerat) interagiert vermutlich über seine Enolform mit dem Cluster. Interessanterweise wurde starke Interaktion des Clusters mit der β-Mercaptogruppe von 3-Mercaptopropionat beobachtet. Diese Wechselwirkung wurde unabhängig durch Inhibitionsstudien verifiziert. Anschließend zeigte eine Gelfiltrationsanalyse die Reversibilität der Interaktionen. Insgesamt hat die vorliegende Arbeit unser Wissen über die biotechnologisch wichtigen DHAD-Enzyme erweitert.

Kleine Moleküle wie Treibhausgase, aber auch Distickstoff und Disauerstoff stehen im Fokus der chemischen Forschung. Solche Moleküle sind durch ihr Vorkommen in der Atmosphäre ubiquitär vorhanden, preiswert und könnten als Synthesebausteine für die Darstellung von komplexeren Molekülen verwendet werden. In dieser Arbeit wurde die Reaktion koordinativ ungesättigter Diketiminato-Nickelkomplexe ([LNi] Komplexe) mit kleinen Molekülen untersucht. Zunächst wurden die Mechanismen der N2-Aktivierung durch reduzierte [LtBuNiI]- und [LMe6NiI] Komplexe miteinander verglichen. Dabei konnte das distickstoffaktivierende Schlüsselintermediat identifiziert und strukturell charakterisiert werden. Weiter wurden die N2-Komplexe [(LtBuNiI)( 1 1 N2)] bzw. K2[(LtBuNiI)( 1 1 N2)], die Vorläufer für [LNiI]- und [LNi0]– Komplexfragmente darstellen, hinsichtlich ihrer Potentials zur Aktivierung der reaktionsträgen Treibhausgase SF6 und NF3 untersucht. Über Reaktionen von Übergangsmetallkomplexen mit NF3 war bis dahin noch nicht berichtet worden; zur Umsetzung von SF6 existierten wenige Publikationen, in denen aber sehr viele mechanistische Fragen offengeblieben sind. Die Mechanismen der SF6- und NF3-Aktivierung wurden durch Kombination einer Vielzahl von ex- und in situ Analysen beleuchtet. Im Falle der SF6 Aktivierung gelang es zudem, ein Nickel(I)-Intermediat zu isolieren. Ein Produkt beider Systeme war der Fluorido-Nickel(II)-Komplex [LtBuNiIIF], dessen Reaktionsverhalten ebenfalls studiert wurde. Doch nicht nur Komplexe mit Nickelatomen in niedrigen Oxidationsstufen erwiesen sich für die Aktivierung kleiner Moleküle geeignet, sondern auch kationische [LtBuNiII(D)]+-Komplexe. Diese Nickel(II)-Komplexe reagierten mit fluorierten Molekülen, N2O sowie O2, was bemerkenswert ist, da Nickel(II)-Komplexe üblicherweise inert gegenüber O2 sind. Im Zuge der O2-Studien wurde ein metastabiler Oranoperoxidkomplex isoliert und strukturell charakterisiert, was beispiellos in der Literatur ist. Current research focuses on the activation of small molecules like greenhouse gases, thermodynamically stable molecules like N2 and kinetically stabilized molecules like O2, which are all abundant in the atmosphere. Thus, it appears to be alluring to use them as cheap and readily available building blocks for the synthesis of value-added compounds. This dissertation deals with the reaction of low-coordinate diketiminate nickel complexes [LNi] and such small molecules. Initially, the mechanisms of the dinitrogen activation by reduced [LtBuNiI] and [LMe6NiI] complexes were studied. As a result, the key intermediate [(LtBuNiI)x(3 Br)xKx] (x > 1) was identified and structurally characterized. Subsequently, the nickel complexes [(LtBuNiI)( 1 1 N2)] and K2[(LtBuNiI)( 1 1 N2)], which represent sources for [LtBuNiI] and [LtBuNi0]– moieties, were applied to the activation of the inert, but very efficient greenhouse gases SF6 and NF3. Prior to these investigations, no transition metal complex had been reported to react with NF3. Publications dealing with the conversion of SF6 had been scarce, too, while at same time, the mechanisms involving its activation had been speculative. The mechanisms of the NF3 and SF6 activation reactions were deduced combining numerous ex-situ and in situ analytical methods. In case of the SF6 activation, even an intermediate could be isolated. In both systems, the nickel fluoride complex [LtBuNiIIF] was formed and its reaction behaviour was also studied. Furthermore, not only [LtBuNiI]- and [LtBuNi0]– moieties proved to be reactive towards small molecules, but also cationic [LtBuNiII(D)]+ complexes, which were specifically developed for this purpose. The reactions of [LtBuNiII(D)]+ complexes with fluorinated molecules (e. g. PhF, NF3), O2 and N2O were studied. In course of the O2 activation, a metastable organoperoxide complex was isolated and structurally characterized, which is unparalleled in the literature.

eingereicht von Stefan Böhmdorfer Zsfassung in dt. Sprache Wien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2009 OeBB

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese, dem Reaktionsverhalten und den elektrochemischen Eigenschaften neuartiger heterometallischer Übergangsmetallkomplexe. Die Verknüpfung der unterschiedlichen Übergangsmetalle erfolgt dabei durch verschiedene organische Bausteine wie z. B. 1-Diphenylphosphino-4-ethinylbenzen, 1-Diphenylphosphino- 3,5-diethinylbenzen und 1,3,5-Triethinylbenzen, sowie unter Verwendung diverser alkinylfunktionalisierter N-Donorliganden. Diese Moleküle besitzen unterschiedliche reaktive Positionen und bieten somit einerseits die Möglichkeit der Darstellung von Übergangsmetall-Alkinylkomplexen und besitzen andererseits mono- bzw. bidendate N- bzw. P-Donorfunktionen, welche die Koordination einer Vielfalt von Übergangsmetallkomplex- Fragmenten erlauben. Das weitestgehend konjugierte organische System sollte eine elektronische Kommunikation zwischen den entsprechenden Metallzentren gewährleisten, was mit Hilfe elektrochemischer Methoden an augewählten Vertretern untersucht wurde. Des Weiteren erlauben die verwendeten Syntheseprinzipien die erstmalige Synthese heteropenta-, heterohexa- und heteroheptametallischer Übergangsmetallkomplexe.

Es ist eine allgemein akzeptierte Tatsache, dass der Kontakt von Proteinen mit synthetischen Materialien üblicherweise zur Proteinadsorption an der Materialoberfläche führt. Über den stattfindenden Prozess, insbesondere das Zusammenspiel zwischen Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen und konformellen Änderungen der adsorbierten Proteine ist jedoch bisher nur wenig bekannt. In dieser Arbeit wird die ortsgerichtete Spinmarkierungstechnik (SDSL) auf die Strukturuntersuchung adsorbierter Proteine ausgeweitet. Diese nutzt das spezifische Einbringen einer spinmarkierte Seitenkette an gewünschte Positionen der Primärstruktur zur Analyse der Struktur und Dynamik diamagnetischer Proteine mittels der Elektronenspinresonanz(ESR)-Spektroskopie. Das globuläre Protein T4 Lysozym (T4L) wurde auf planare Modelloberflächen adsorbiert und strukturelle Änderungen in Abhängigkeit der physikalischen und chemischen Eigenschaften der Oberfläche verfolgt. Die spezifische Anbindung von T4L auf quarzgestützten zwitterionische Lipiddoppelschichten führt nur zu geringfügigen strukturellen Veränderungen des Proteins. Allerdings bildet sich eine makroskopisch geordnete Proteinschicht aus. Die Vorzugsrichtung der Proteine auf der Oberfläche kann durch Analyse der winkelabhängigen ESR-Spektren bestimmt werden. Die Wechselwirkung negativ geladener Oberflächen mit dem positiv geladenen T4L führt zu drastischeren Störungen der Proteinstruktur. Hierbei wird die Reaktion des Proteins auf den Kontakt mit einer fluiden quarzgestützten Lipiddoppelschicht, die das negativ geladenen Lipid Phosphatidylserin enthält, mit derer bei Adsorption auf einer ebenfalls negativ geladenen, jedoch rigiden Quarzoberfläche verglichen. Dass der Adsorptionsprozess auch das Substrat selbst beeinflussen kann, wird durch die Beobachtung einer Phasentrennung bei Proteinadsorption des Lipidgemischs aufgezeigt, das negativ geladene Lipide enthält. Although it is commonly accepted that the exposition of proteins to man-made materials typically results in protein adsorption on the material surface, little is known about the interplay between the protein-surface interactions involved and the resulting conformational changes of the adsorbing protein. In this study the site-directed spin labeling (SDSL) approach has been extended to the investigation of proteins adsorbed to planar surfaces. The method involves the selective introduction of an artificial spin-labeled side-chain to a predefined residue of the amino acid sequence and allows the determination of the structure and dynamics of proteins by analysis of the electron paramagnetic resonance (EPR) spectra. The globular protein T4 Lysozyme (T4L) has been adsorbed to planar model surfaces to study the correlation between conformational changes of the protein and the physical and chemical properties of the surfaces. Tethering T4L to a planar quartz-supported zwitterionic lipid bilayer shows only minor changes in the structure of the protein. Furthermore, a macroscopic order of the adsorbed protein layer is proven by angular-dependent EPR spectra which allow the determination of the protein orientation. Offering surfaces that are net negatively charged to the highly positively charged T4L leads to the observation of more drastic conformational changes. Here, the conformation of T4L adsorbing to a fluid quartz-supported lipid bilayer containing negatively charged lipids is compared to the structure of T4L adsorbed to the negatively charged but rigid quartz surface. The adsorption process may also influence the substrate itself. This can be shown by the phase separation of the negatively charged lipid bilayer upon protein adsorption.

Cytochrom ba3 ist die terminale Oxidase in der Elektronentransportkette des haloalkaliphilen Archaeon Natronobakterium pharaonis. Für eine detaillierte Charakterisierung der Reaktivität des Cytochrom ba3 sollte hier durch heterologe Expression in H. salinarum der Enzymkomplex in funktionaler Form isoliert werden. Die Entwicklung eines geeigneten Expressions- und Reinigungsverfahren sollte im weiteren das Studium von geeigneten Mutanten ermöglichen. Durch genomische Insertion über den homologen genomisch kodierten bop-Promotor konnten stabile Transformanden für alle Expressionvarianten des Cytochrom ba3 erhalten werden. Das Cytochrom ba3 konnte hier jedoch trotz Variation in der Untereinheitenzusammensetzung und der Fusion verschiedener Affinitäts-Tags nicht synthetisiert werden. Durch Western-Blot Analyse konnte weiterhin gezeigt werden, daß selbst für das Cytochrom ba3 in nativer Zusammensetzung der Untereinheiten ohne Affinitäts-Tag keine Proteinsynthese in H. salinarum stattfindet. In abschließenden RT-PCR-Experimenten konnten die Transkription der Sequenz des Cytochrom ba3 nachgewiesen werden. Unter den gewählten Expressionbedingungen wird somit eindeutig der bop-Promotor induziert. Für die fehlende Proteinsynthese bieten sich mehrere Erklärungsmodelle an. Das sensorische Rhodopsin I (SRI) vermittelt als Phototaxisrezeptor im Halobakterium salinarum sowohl die photophile Signalantwort auf orange-farbenes Licht als auch die photophobe Reaktion auf Blau/UV-Licht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte der Mechanismus des Signaltransfers im Verlauf der photophilen Reaktion vom SRI an seinen Transducer HtrI in ESR-Experimenten aufgeklärt und kinetisch analysiert werden. Für das Transducer-freie SRI konnten zusätzlich erstmals die einzelnen Photozyklen der verschiedenen Spezies des Grundzustandes getrennt voneinander kinetisch detailliert charakterisiert werden. Das SRI wurde in E. coli exprimiert und bis zur Homogenität über Affinitätschromatographie gereinigt. Durch eine Modifikation der Reinigungsbedingugen konnte hierbei die Stabilität des Proteins deutlich erhöht werden. Die Charakterisierung des SRIwt-His zeigte weiterhin, daß keine Unterschiede zu dem homolog in H. salinarum exprimierten Protein bestehen. In pH-Titrationsversuchen konnten die absoluten Absorptionsmaxima der drei Grundzustände des SRIwt-His mit 400 nm, 530 nm und 580 nm ermittelt werden und die pKa-Werte den Protonierungsgleichgewichten zugeordnet werden. Durch die Variation der Wellenlänge des Anregungslichtes in der Laserblitzlicht-Spektroskopie gelang hier erstmals eine Separierung der spezifischen Photozyklen des SRI587 und SRI530. Die Analyse des Aktionsspektrums des Transducer-freien SRI zeigte, daß die Bildung des M-Intermediates für das SRI530 bis zu 100mal schneller ist als die des SRI587. Das SRI400 konnte im Gegensatz dazu nicht angeregt werden. Es kann daher angenommen werden, daß diese Spezies keinen Photozyklus durchläuft. Zur Untersuchung der Wechselwirkung des SRI im Komplex mit HtrI wurde eine verkürzte Variante des Transducers mit dem SRI in E. coli koexprimiert. Die Synthese des SRI wurde jedoch hierbei stark inhibiert. Die Experimente in Hinsicht auf eine gemeinsame Reinigung bzw. Bildung des Komplexes nach Isolierung der einzelnen Proteine lassen vermuten, daß das SRI bereits in der Membran zumindest dimerisiert und so eine Komplexierung des Transducers inhibiert ist. Als Interaktionsfläche für das HtrI konnten in weiteren Experimenten die Helices F und G identifiziert werden. Die Expression des über einen Peptid-Linker fusionierten Rezeptor-Transducer-Komplexes war hingegen erfolgreich. Die Analyse bezüglich der Funktionalität des isolierten Fusionsproteins lieferten jedoch widersprüchliche Daten. Zur Identifizierung des Mechanismus der Signaltransduktion vom Rezeptor auf den Transducer wurden spinmarkierte Cysteinmutanten des SRI im Bereich der Helix F und G positionspezifisch mittels ESR-Spektroskopie untersucht. Die Charakterisierung der Orientierung der einzelnen Spinlabel der Mutanten und damit der ursprünglichen Aminosäuren bestätigten im zytoplasmatischen Bereich der Helix F das von Lin et al. (1997) berechnete Modell des SRI. Durch ESR-Differenzspektroskopie konnte im weiteren eine Auswärtsbewegung der Helix F im zytoplasmatischen Bereich identifiziert werden. Das photophile Signal wird somit im SRI durch eine Konformationsänderung an den Transducer weitergeleitet.

Das Ziel der vorliegender Arbeit war es, nähere Informationen über den Zusammenhang zwischen den Konformationsänderungen des Chaperonin-GroEL/ES-Systems und den einzelnen Schritten im Faltungsprozess zu erhalten. Dabei wurde die ESR-Spektroskopie als kon-formationssensitive Methode eingesetzt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Doppelmutant GroEL C138S/C519S, der nur noch in Position 458 jeder Untereinheit ein einzelnes Cystein enthält, mit drei verschiedenen thiol-spezifischen Spin-Labeln, nämlich 4-(3-Iodo-acetamido)-2,2,6,6- tetramethyl-piperidin-1-oxyl (IAAT), 4-Maleimido-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinoxyl (MAL) und 4-(3?Iodo-2? oxopropyliden-1)?2,2,3,5,5? pentamethyl-[d15]? imidazolidin-1-oxyl (IOPI) modifiziert und untersucht. Um genaue Aussagen für die nun modifizierten Mutanten dmEL-IAAT, dmEL-MAL und dmEL-IOPI zu machen, wurden diese biochemisch charakterisiert und mit dem nicht spin-gelabeltem Doppelmutant GroEL (dmEL) und dem Wildtyp GroEL (wtEL) verglichen. Die biochemische Charakterisierung des nicht spingelabeltem dmEL und der modifizierten Mutanten erfolgte durch die Bestimmung von ATPase-Aktivität und Rückfaltungsaktivität. Zusätzlich wurde die Umgebung der kovalent eingebrachten Spin-Labeln (IAAT, MAL, IOPI) in Gegenwart und Abwesenheit von GroES und Substratproteins untersucht. Die verschiedenen Untersuchungen am dmEL und die entsprechenden experimentell erhalte-nen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die ATPase-Aktivität des nicht spingelabelten dmEL leicht höher als die des wtEL ist, allerdings hat die Vorinkubation des dmEL mit ES in Anwesenheit von Nukleotiden keine Inhibierung der ATP-Hydrolyse im Falle des dmEL verursacht. Im Gegensatz dazu wurde im Falle des wtEL eine Inhibierung von etwa 25 % der ATP-Hydrolyse in Anwesenheit von ES im Vergleich zum wtEL-Wert in Abwesenheit von ES und Nukleotiden (wie auch in der Literatur [Viitanen et al., 1990; Langer et al., 1992; Chandrasekhar et al., 1986; Gray & Fersht, 1991; Jackson et al., 1993] beschrieben) bemerkt. Bei der Untersuchung der durch Chaperonin-GroEL unterstützten Rückfaltung von denaturierter LDH wurde eine deutliche Erhöhung der Ausbeute an zurückgefalteter LDH im vergleich zu der ?spontanen? nicht Chaperonin-abhängigen Rückfaltung von LDH bemerkt. Die ?spontane? nicht Chaperonin-abhängige Rückfaltung von LDH bei 25 °C zeigt eine Ausbeute an aktiven LDH von 23 %. In Gegenwart von dmEL und ATP wurden etwa 20 % der denaturierten LDH rückgefaltet. Die Zugabe von ES an dmEL in Anwesenheit von ATP hat die Ausbeute an Teil rückgefalteter LDH auf 42 % erhöht. Dies deutet auf eine direkte Interaktion zwischen GroES und GroEL hin. Die Experimente am wtEL unter gleichen Bedingungen wie beim dmEL haben eine deutliche Erhöhung der Ausbeute an rückgefalteter LDH in Anwesenheit von wtEL und ATP auf 52 % gezeigt (wie auch schon bei [Guhr, 2000] beschrieben). Die Anwesenheit von ES hat die Ausbeute auf 65 % erhöht. Betrachtet man sich in diesem Zusammenhang den Unterschied zwischen den Ausbeuten an rückgefalteter LDH durch dmEL und wtEL, so ist anzunehmen, dass die gerin-gere Rückfaltungsaktivität des dmEL an der eingeführten Doppelmutation C138S/C519S liegt. Es liegt nahe, dass eine für die Rückfaltung eines Substratproteins benötigte Konformationsübertragung von der Doppelmutation beeinflusst wird. Das GroEL:GroES-Verhältnis war bei allen verschiedenen Untersuchungen 1:2. In unserem Arbeitskreis wurde schon bereits von P. Guhr (2000) gezeigt, dass unterschiedliche GroEL:GroES-Verhältnisse von entweder 1:1 oder 1:2 weder bei LDH noch bei MDH-Rückfaltung einen Einfluss auf die Ausbeute rückgefalteten Substratprotein hat. Diese Beobachtungen lassen den Schluss zu, dass unter den verwendeten Reaktionsbedingungen nur die asymmetrischen GroEL/GroES-Komplexe ?bullet? als aktive Komponenten auftraten. Die Bestimmung von zugänglichen Nukleotidbindungsstellen am GroEL wurde mit Hilfe der ESR-Spektroskopie und C8-SL-ATP durchgeführt. Sowohl bei dmEL als auch bei wtEL konnten alle Nukleotidbindungsstellen besetzt werden. Im Gegensatz zum wtEL zeigt der dmEL eine sigmoidale Bindungskurve. Die Bestimmung von Nukleotidbindungstellen in Anwesenheit von ES zeigte kein sigmoidales Verhalten. Die Bildung des GroEL/ES-Komplexes in Gegenwart von C8-SL-ATP konnte von P. Guhr (2000) nicht erfolgreich nachgewiesen werden, da Versuche zum Nachweis des Komplexes mit Hilfe der nativen Gelelektrophorese scheiterten. Die chemische Modifizierung des dmEL mit IAAT-SL und die durchgeführten Untersuchun-gen zur biochemischen Charakterisierung des dmEL-IAAT-SL und deren Vergleich mit dem nicht spingelabelten dmEL haben die folgenden Schlüsse gelassen: Der IAAT-SL beeinflusst die ATPase-Aktivität des dmEL relativ wenig im Vergleich zum dmEL-Wert. Ebenso wurde die Nukleotidbindung an dmEL-IAAT-SL relativ wenig beeinflusst, allerdings zeigt die Nukleotidbindungskurve des dmEL-IAAT-SL kein sigmoidales Verhalten im Gegensatz zum dmEL. Auch bei der Bestimmung der Nukleotidbindungsstellen in Anwesenheit von ES wurden alle Nukleotidbindungsstellen besetzt. Die experimentell beobachtete Rückfaltungsaktivität des dmEL nach Modifizierung mit IAAT-SL wurde stark beeinflusst. Während etwa 20 % der denaturierter LDH durch dmEL in Anwesenheit von ATP rückgefaltet wurden, wurden nur etwa 5 % der denaturierten LDH durch dmEL-IAAT in Anwesenheit von ATP rückgefaltet. Allerdings hat die Anwesenheit von ES die Ausbeute an Teil rückgefalteter LDH im Falle des dmEL-IAAT-SL in Anwesenheit von ATP auf 8 % erhöht. Die beobachtete normale ATPase-Aktivität und die niedrige Rückfaltungsaktivität des dmEL-IAAT-SL deuten darauf hin, dass diese von einander abgekoppelt erfolgen. Die ESR-Untersuchungen am dmEL-IAAT-SL haben in Anwesenheit von verschiedenen Nukleotiden, GroES, und Substratprotein keine Konformationsänderungen in der Umgebung des modifizierten mit IAAT-SL C458 nachgewiesen. Es wurde nur in einem Fall in Abwesenheit von Substratprotein aber in Gegenwart von ATP und ES ein Effekt der ES-Bindung auf die ESR-Spektren gezeigt. Dies deutet darauf hin, dass die Bindung von ES die Übertragung von strukturellen Änderung im Bereich des C458 beeinflusst hat. Im Gegensatz zum IAAT-SL hat der MAL-SL die ATPase-Aktivität des dmEL relativ stark beeinflusst, so dass die ATPase-Aktivität des dmEL-MAL nur 50 % der des dmEL-Wertes erreicht hat. Es besteht die Möglichkeit, dass durch eine Störung der Struktur der Nukleotid-bindungsstellen eine gestörte Konformationsübertragung verursacht wurde, so dass die ATPase-Aktivität zu tief abgefallen ist. Die Rückfaltungs-Untersuchungen am dmEL-MAL haben gezeigt, dass etwa 15 % der denaturierten LDH in Anwesenheit von dmEL-MAL und ATP seiner Ausgangs-Aktivität zurückgewinnt. Dieser Anteil an rückgefalteter LDH steigt auf etwa 25 % in Anwesenheit von dmEL-MAL, ATP und ES. Diese Erhöhung der Ausbeute deutet auf eine direkte Interaktion zwischen GroES und GroEL hin. Die ESR-Untersuchungen an dmEL-MAL haben keine strukturellen Veränderungen im Bereich des mit MAL-SL modifizierten C458 des Proteins nachgewiesen. Der IOPI-SL hat bei der ATPase-Aktivität-Unteruschungen ein unterschiedliches Verhältnis im Vergleich zu IAAT-SL bzw. MAL-SL gezeigt. Bei Bestimmung der ATPase-Aktivität des dmEL-IOPI bei 30 °C wurde eine ATPase-Aktivität im selben Bereich wie beim dmEL gefunden. Bei 37 °C hat der dmEL-IOPI eine außergewöhnliche hohe ATPase-Aktivität mit fast 100 %iger Steigerung der des dmEL-Wertes gezeigt. Auch die ATPase-Aktivität des dmEL-IOPI nach Vorinkubation mit ATP oder ADP und in Anwesenheit von ES ist um etwa 166 % der des dmEL-Wertes gesteigert, anstatt abzufallen. Es konnten jedoch nur 4,8 % denaturierter LDH durch dmEL-IOPI in Anwesenheit von ATP rückfalten. Die Zugabe von ES hat diesen Anteil auf 21 % erhöht, jedoch liegt der Wert unterhalb der spontanen Rückfaltung (22 %). Wie in allen Fällen, wurde auch im Falle des dmEL-IOPI gezeigt, dass eine direkte Interaktion zwischen GroES und GroEL besteht. Auch die ATPase läuft zu schnell ab und kann den Faltungsprozess von Substratprotein nicht unter-stützen. Wenn man das Verhalten der drei modifizierten Mutanten in Bezug auf die ATPase-Aktivität und Rückfaltung betrachtet, deuten die Ergebnisse darauf, dass die ATPase-Aktivität und die Rückfaltungsaktivität von einander abgekoppelt erfolgen. Auch im Falle des dmEL-IOPI haben die ESR-Spektren keine strukturellen Änderungen im Bereich des C458 nachgewiesen. Ein weiterer Ansatzpunkt zur Untersuchung des Chaperonins GroEL wären die folgenden Doppelmutationen einzuführen: C138S/C458S bzw. C458S/C519S und die gleichen Unter-suchungen der vorliegender Arbeit durchzuführen. Anderer Vorschlag wäre die chemische Modifizierung des Substratproteins oder auch des Co-Chaperonin-GroES innerhalb des ?mobile loop? nach einer entsprechenden Cysteinmutation und mit Hilfe der ESR-Spektroskopie könnten noch genauen Aussagen über den Funktions-mechanismus gemacht werden. Einführung von Cysteinmutation innerhalb der apikalen Domäne des GroEL und mit Hilfe der ESR-Spektroskopie könnte auch ermöglichen, nähere Informationen über die GroES- bzw. Substratproteinbindung zu gewinnen.

In dieser Arbeit konnte erstmals ein Connexin, Cx43, stabil in Insektenzellen exprimiert werden. Dieses heterologe Expressionsystem ermöglicht die posttranslationale Aggregation der Connexine zu Halbkanalstrukturen. Die vergleichweise schnelle Etablierung stabiler, überexprimierender eukaryonter Transfektanten ist im Hinblick auf das für die ESR-Spektroskopie typische Cysteinscreening von großem Vorteil. Für dieses Cysteinscreening konnte eine erste Cysteinmutante, K146C, kloniert und in den Insektenzellen zur Expression gebracht werden. Es konnte eine neue Aufreinigungsmethode für Connexine etabliert werden, die Zwei-Schritt-Gelfiltration. Sie erlaubt die Isolation hochreiner Cx-Halbkanäle unter nativen Bedingungen. Erste ESR-Spektren von Wildtyp-Cx43-Halbkanälen konnten aufgezeichnet werden. Sie belegen, daß drei der neun nativen Cysteine des Cx43 für die Spinsonde zugänglich sind und diese kovalent binden. Dissertation, Universität Duisburg-Essen, 2001

Das Sensor-Rhodopsin II des Archaeons Natronobacterium pharaonis vermittelt als Phototaxisrezeptor die photophobe Reaktion gegenüber grünem und blauem Licht. Die Anregung des Rezeptors aktiviert ein Transducermolekül, pHtrII, das in weiten Teilen große Ähnlichkeiten mit der zytoplasmatischen Domäne eubakterieller Chemorezeptoren aufweist. Nach heterologer Überexpression von pSRII sowie von Teilen des pHtrII in E. coli gelang es die Ausbildung eines stabilen Komplexes in vitro und in vivo zu verfolgen und eine 1:1-Stöchiometrie festzustellen. Um die ersten Schritte der Signaltransduktionskette aufzuklären, wurden mit Hilfe positions-spezifischer Spinmarkierung und ESR-Spektroskopie die Topographie der Helices F und G im pSRII untersucht. Die ESR-spektroskopische Bestimmung transienter Mobilitätsänderungen erlaubten es, eine Auswärtsbewegung der Helix F zu identifizieren, die sich schon in den frühen Schritten des Photozyklus vollzieht. Durch die Analyse lichtinduzierter Abstandsänderungen konnte zum ersten Mal ein ursächlicher Zusammenhang zwischen der Lichtanregung des Photorezeptors und Konformationsänderungen innerhalb des Transducersdimers detailliert beschrieben werden. Basierend auf der relativen Verlagerung der zweiten transmembranen Helices ließ sich eine Mechanismus ableiten, bei dem das konformationelle Signal im Linkerbereich amplifiziert wird und so die Wechselwirkungen innerhalb der Signaldomäne steuert.

Die FoF1-ATP-Synthase katalysiert die Synthese von ATP aus ADP und Pi bei der oxidativen bzw. Photophosphorylierung. Der ATP-Synthase-Komplex läßt sich in zwei funktionelle Einheiten unterteilen: Fo ist ein integraler Membranproteinkomplex, der den Protonenkanal bildet. F1 hingegen ist ein wasserlöslicher Proteinkomplex, der die Nukleotidbindungsstellen trägt. Die ATP-Synthase aus Escherichia coli hat die Zusammensetzung alpha3beta3gamma delta epsilon für die F1 und ab2c9-12 für den Fo-Teil. "Native" (d.h. nicht nukleotidbefreite) F1 aus Escherichia coli (EF1) wurde mit verschiedenen spinmarkierten Adeninnukleotiden ESR-spektroskopisch vermessen. Es wurden Spektren mit zwei Signalen gemessen, ein Hinweis auf zwei verschiedene Konformationen der Bindungsstellen. Durch Titrationsexperimente wurden die Bindungsstöchiometrie und die Spektren für die verschiedenen verwendeten Nukleotide ermittelt. Die gleichen Experimente wurden mit einer Mutante, die in den nichtkatalytischen Bindungsstellen keine Nukleotide bindet, durchgeführt. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, daß zwei der drei katalytischen Bindungsstellen zum äußeren Signal beitragen, während die dritte das innere Signal hervorruft. Die Untereinheiten alpha; und beta der EF1, wurden isoliert und in gleicher Weise wie die F1 untersucht. Während alpha; 0,8 Moleküle SL-ATP binden konnte, zeigte beta keine Bindung. Mit 2',3'-SL-ATP in Komplex mit alpha; konnten ESR-Spektren mit zwei Signalen gemessen werden, die SL-ATP-Derivate, bei denen der Spin-Label entweder an der 2'- oder 3'-Position fixiert ist, zeigten lediglich ein Signal. Die beobachteten 2Azz-Werte unterscheiden sich stark in Abhängigkeit von der Position des Spin-Labels. Um die Bindung der F1 an den Fo-Teil und die Struktur des aus den b- und delta-Untereinheiten gebildeten zweiten Stiels zu untersuchen, wurden verschiedene Mutanten einer wasserlöslichen Form der b-Untereinheit (bsyn) mit dem Spin-Label IodacetamidTEMPO markiert. Das System F1/bsyn wurde mit den an unterschiedlichen Positionen markierten bsyn-Mutanten ESR-spektroskopisch untersucht. Dabei wurden Spektren von freiem bsyn sowie bsyn im Komplex mit F1 und F1-delta (alpha3beta3gamma epsilon) aufgenommen: Alle gelabelten b-Mutanten weisen ähnliche ESR-Spektren von stark mobilen Spin-Labeln auf. Die ähnlichen Werte lassen darauf schließen, daß der b-Dimer über weite Teile eine vergleichbare Struktur besitzt. Im Komplex mit F1 zeigen fast alle Mutanten eine stärkere Immobilisierung als die freien b-Mutanten. Tendenziell nimmt in Richtung des C-Terminus die Differenz der Hochfeld : Mittelfeld-Verhältnisse der Spektren von b und F1/b zu, was die Vermutung nahelegt, daß die Bindung von b an die F1 in Richtung des C-Terminus stärkeren Einfluß auf die Struktur hat. bsyn im Komplex mit F1-delta zeigt nur an einzelnen Positionen eine stärkere Immobilisierung des Spin-Labels. Es scheint somit wahrscheinlich, daß die b-Untereinheit außer über delta noch weitere Kontakte mit der EF1 hat.

Die Diphthalocyanine der Seltenerdmetalle werden durch Reaktion von Seltenerdmetallacetat mit o-Phthalsaeuredinitril hergestellt. Die Diphthalocyanine existieren in zwei Formen, die sich in der Existenz eines delokalisierten freien Elektrons (Radikalform) oder eines ¨zusaetzlichen¨ Wasserstoffatoms unterscheiden. Die Charakterisierung der beiden Diphthalocyaninformen erfolgt mittels der IR-Spektroskopie und UV/VIS/NIR-Spektroskopie. Detailliert wird das spektroskopische Verhalten der Diphthalocyanine in unterschiedlichen Loesungsmitteln untersucht. ESR-spektroskopisch ist das freie Elektron der Radikalform nachweisbar. Zur Untersuchung des elektrochromen Verhaltens der Diphthalocyanine werden Schichten durch Sublimationsverfahren oder durch LB-Technik hergestellt. Die Analyse der Schichtstruktur erfolgt mittels HRTEM. Das elektrochrome Verhalten wird unter Beruecksichtigung des Schichtherstellungsverfahrens, der Diphthalocyaninform und der Art des verwendeten Elektrolyten untersucht. Die beobachteten Farbaenderungen reichen von violett, blau, gruen, blass-gelb, orange nach rot. Die entsprechenden UV/VIS-Spektren werden im Zusammenhang mit den ablaufenden Oxidations- und Reduktionsreaktionen diskutiert.