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In this study, we aimed to identify molecular mechanisms involved in the specification of the 4d (mesentoblast) lineage in Platynereis dumerilii. We employ RT-PCR and in situ hybridization against the Platynereis dumerilii twist homolog (Pdu-twist) to reveal mesodermal specification within this lineage. We show that Pdu-twist mRNA is already maternally distributed. After fertilization, ooplasmatic segregation leads to relocation of Pdu-twist transcripts into the somatoblast (2d) lineage and 4d, indicating that the maternal component of Pdu-twist might be an important prerequisite for further mesoderm specification but does not represent a defining characteristic of the mesentoblast. However, after the primordial germ cells have separated from the 4d lineage, zygotic transcription of Pdu-twist is exclusively observed in the myogenic progenitors, suggesting that mesodermal specification occurs after the 4d stage. Previous studies on spiral cleaving embryos revealed a spatio-temporal correlation between the 4d lineage and the activity of an embryonic organizer that is capable to induce the developmental fates of certain micromeres. This has raised the question if specification of the 4d lineage could be connected to the organizer activity. Therefore, we aimed to reveal the existence of such a proposed conserved organizer in Platynereis employing antibody staining against dpERK. In contrast to former observations in other spiralian embryos, activation of MAPK signaling during 2d and 4d formation cannot be detected which questions the existence of a conserved connection between organizer function and specification of the 4d lineage. However, our experiments unveil robust MAPK activation in the prospective nephroblasts as well as in the macromeres and some micromeres at the blastopore in gastrulating embryos. Inhibition of MAPK activation leads to larvae with a shortened body axis, defects in trunk muscle spreading and improper nervous system condensation, indicating a critical function for MAPK signaling for the reorganization of embryonic tissues during the gastrulation process.

The precise organization of the sarcomeric pattern is evolutionarily conserved and critical for muscle function. Currently, the mechanisms underlying the stabilization of the whole muscle and the sarcomeric architecture are not fully understood. My thesis is focusing on elucidating the mechanisms of sarcomere stabilisation and is composed of two parts. In the first part, I investigated the functional importance of different domains in the Drosophila Mib2 protein. In the second part, I analysed the function of a new Drosophila muscle protein Abba (Another B-Box affiliate). (1) Published data identified Mib2 as an important protein for the maintenance of the integrity of larval muscles. The loss of Mib2 results in detached muscles as the consequence of apoptosis within the fully established larval musculature during embryogenesis. Previous genetic experiments also showed that mib2 function in stabilising the muscles does not require the RING fingers and by extrapolating its ubiquitin ligase activity. In my genetic analysis, I tested numerous constructs, which lack single or a combination of protein domains for their ability to rescue the abba mutant phenotype. I demonstrated that the ANK repeats, which likely constitute a protein-protein interaction domain, and the conserved MIB domains are critical for mib2 function, strongly suggesting that Mib2 functions as an adapter-type of protein in maintaining the integrity of the larval muscle. (2) Abba, a member of the TRIM/RBCC protein superfamily, was original identified as a Mib2 interacting protein. Based upon my thesis work, I can conclude that abba plays an essential role in maintaining the sarcomere structure. abba mutant larvae show thinner and shorter myofibers with disrupted muscle filaments, as well as compromised muscle function. The mutants die during early pupal stages, displaying morphogenetic defects during metamorphosis. Additional genetic analysis, showed that abba functionally interacts with mlp84B, sls/kettin and α-actinin, which encode for Z-disc associated proteins. Using RNAi technology, I was also able to analyse abba function during the adult stages. Flies with abba RNAi show aberrant myofibrils with unstable Z-discs and missing M-lines. Further studies indicate that presumed protein-protein interaction domains and RING fingers are functionally important, suggesting that Abba acts as a ubiquitin ligase and an adapter type of protein. Altogether, my data indicate that Abba has a pivotal role for ensuring the integrity of Z-discs and M-lines during muscle formation and remodeling phases in Drosophila. Die strukturelle Stabilisierung der kleinesten funktionellen Einheit innerhalb der Muskulatur, des Sarkomers, ist entscheidend für die Funktionsfähigkeit der Muskeln. Die Stabilisierungsprozesse, beziehungsweise die ihnen zugrundeliegenden Mechanismen, sind aber noch nicht ausreichend erforscht. Um diese Mechanismen näher zu charakterisieren habe ich mich in meiner Arbeit mit zwei Themen befasst: erstens, mit der funktionellen Analyse der einzelnen Proteindomänen von Mib2 und zweitens, der Charakterisierung des neuen muskelspezifischen Gens abba (another B-Box affiliate) in Drosophila melanogaster. (1) In der Literatur ist Mib2 als essentieller Faktor, der für den Erhalt der larvalen Muskulatur entscheidend ist, beschrieben. In mib2 Mutanten lösen sich die Muskeln aufgrund von Apoptose von ihren Anheftungsstellen und runden sich in den späten embryonalen Stadien ab. Genetische Analysen haben gezeigt, dass die Funktion von Mib2 beim Erhalt der Muskelstrukturen nicht von den funktionellen Eigenschaften der RING-Finger Domänen abhängt. Durch zusätzliche genetische Rettungsanalysen mit zahlreichen Proteindomänen Deletionskonstrukten, welche jeweils eine oder mehrere Domänen eliminieren, konnte ich aber zeigen, dass sowohl die konservierte MIB Domäne als auch die ANK repeats funktionell wichtig für die Funktionsweise von Mib2 sind. Beide Domänen fungieren als Protein-Protein Interaktionsdomänen und weisen auf eine mögliche Funktion als Adapter-Protein hin. (2) Abba gehört zur TRIM/RBCC Superfamilie und wurde als potentieller Interaktionspartner von Mib2 entdeckt. In Verlauf dieser Arbeit habe ich mit Hilfe eines „imprecise excision screen” zahlreiche spezifische mutante abba Allele identifiziert. In Larven, die homozygot für diese abba Allele sind, sind dünnere und schmalere Muskeln mit zerstörter Muskelfilamentanordnung erkennbar. Die mutanten Allele sind pupal lethal und zeigen morphologische Defekte während der Metamorphose. Durch weitere genetische Analysen konnte ich zeigen, dass abba funktionell mit Genen, die für Z-Scheiben Proteine codieren, wie mlp84B, sls/kettin und α-actinin, interagiert. Mit Hilfe der RNAi Technik ist es mir gelungen den Verlust von abba auch in den adulten Stadien phänotypisch zu untersuchen. Die Reduktion von abba resultiert hierbei in schmalen und dünnen Myofibrillen mit instabilen Z-Scheiben und dem Verlust von M-Linien. Des Weiteren konnte ich zeigen, dass alle Proteindomänen von Abba eine funktionelle Relevanz aufweisen, es wahrscheinlich Ubiquitin-Ligase Aktivität besitzt und/oder als Adapter-Protein fungiert. Zusammengefasst zeigen meine Analysen, dass Abba einen essentiellen Faktor bei den Prozessen der Sarkomerstabilisierung in der larvalen und adulten Muskulatur von Drosophila repräsentiert.