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Long-term climate change experiments are extremely valuable for studying ecosystem responses to environmental change. Examination of the vegetation and the soil should be non-destructive to guarantee long-term research. In this paper, we review field methods using isotope techniques for assessing carbon dynamics in the plant–soil–air continuum, based on recent field experience and examples from a European climate change manipulation network. Eight European semi-natural shrubland ecosystems were exposed to warming and drought manipulations. One field site was additionally exposed to elevated atmospheric CO2. We discuss the isotope methods that were used across the network to evaluate carbon fluxes and ecosystem responses, including: (1) analysis of the naturally rare isotopes of carbon (13C and 14C) and nitrogen (15N); (2) use of in situ pulse labelling with 13CO2, soil injections of 13C- and 15N-enriched substrates, or continuous labelling by free air carbon dioxide enrichment (FACE) and (3) manipulation of isotopic composition of soil substrates (14C) in laboratory-based studies. The natural 14C signature of soil respiration gave insight into a possible long-term shift in the partitioning between the decomposition of young and old soil carbon sources. Contrastingly, the stable isotopes 13C and 15N were used for shorter-term processes, as the residence time in a certain compartment of the stable isotope label signal is limited. The use of labelled carbon-compounds to study carbon mineralisation by soil micro-organisms enabled to determine the long-term effect of climate change on microbial carbon uptake kinetics and turnover. Based on the experience with the experimental work, we provide recommendations for the application of the reviewed methods to study carbon fluxes in the plant–soil–air continuum in climate change experiments. 13C-labelling techniques exert minimal physical disturbances, however, the dilution of the applied isotopic signal can be challenging. In addition, the contamination of the field site with excess 13C or 14C can be a problem for subsequent natural abundance (14C and 13C) or label studies. The use of slight changes in carbon and nitrogen natural abundance does not present problems related to potential dilution or contamination risks, but the usefulness depends on the fractionation rate of the studied processes. Comisión Europea-FTP7- ICT- 2008-1/227628 Gobierno español-CGL2016-79835-P Gobierno catalán-SGR2014-274 European Research Council (ERC)-SyG-610028 IMBALANCE Hungarian Scientific Research Fund-OTKA K112576

Memoria presentada para optar al grado de Doctora por la Universidad de Sevilla, Facultad de Química, Departamento de Cristalografía, Mineralogía y Química Agrícola del programa de Doctorado de Recursos Naturales y Medio Ambiente con la calificación de Sobresaliente Cum Laude, [EN]: The Guadiamar Green Corridor is an area contaminated by trace elements due to a mine spill in 1998. After this accident, a phytoremediation strategy was established with the aim of remediating and establishing a novel ecosystem. The first objective of this Doctoral Thesis was to evaluate the influence of the identity of the forested tree species in the Corridor on the composition and microbial activity. Soils were sampled under three tree species (wild olive, white poplar and stone pine) and in grassland soils, at two sites with different soil properties. Afforestation produced an increase in most microbial indicators. Each tree species produced specific effects on soil organic matter, pH and C:N ratio, with consequences on biomass and microbial activities. White poplar was the species that promoted a greater catabolic diversity, which could mean a greater mineralization of simple and complex carbon substrates in these soils. Furthermore, both stone pine and white poplar promoted greater enzymatic activity in these soils. The second objective of this Doctoral Thesis was to evaluate the effect of the different afforested tree species in the Corridor on the structure and composition of soil fungal communities. Afforestation of degraded soils with different plant species may promote the establishment of specific fungal diversity and functionality. Five different habitats were selected: under the canopy of three tree species (wild olive, white poplar and stone pine), on adjacent grassland soils and on non-remediated soils. We found that the phytoremediation measures promoted the fungal richness, diversity, taxonomy, and functionality along the Guadiamar Green Corridor, compared to non-remediated soils. White poplar was the tree species with the greatest diversity and richness compared to wild olive and stone pine. Ectomycorrhizal fungi were more dominant in the soils of the host species of these fungi, while saprotrophs were abundant in grassland and wild olive soils. The third objective of this Doctoral Thesis was to explore the functional changes based on the traits of the ectomycorrhizal fungal communities in symbiosis with the oak. The variation in the composition of ectomycorrhizal species was determined by C, Ca, and soil contamination; however, taxonomic diversity did not depend on the level of contamination. The values of the mean features of the ectomycorrhizal communities showed a decrease in the formation of rhizomorphs and emanating hyphae with increasing contamination, and the community converged towards species with less frequent development of rhizomorphs. This could mean a reduction in functional diversity in ectomycorrhizal fungal communities due to contamination with a potential effect on the functioning of the ecosystem. The fourth objective of this Doctoral Thesis was to evaluate the functional features of the ectomycorrhizal fungal species. In particular, how the composition of ectomycorrhizal fungi and their morphological features mediate the features of the holm oak were studied. The taxonomic and functional diversity of ectomycorrhizal fungi explained a high proportion of the variance of the functional features of the holm oak, both in roots and in leaves. The holm oaks that were dominated by the most abundant fungi Hebeloma cavipes and Thelephora terrestris showed conservative features in relation to the economic spectrum of the root, while the oaks colonized by rare ectomycorrhizal species presented an acquisitive strategy. The most conservative roots presented fungi with high formation of rhizomorphs and low melanisation. These results supported the potential of ectomycorrhizal fungi, both for their taxonomy and for their traits, in mediating the state of the host plant. The fifth and last objective of this Doctoral Thesis was to evaluate the ability of fungi to mobilize trace elements in the soil, by analysing their fruiting bodies (mushrooms). Soil-fungus relationships were explored through two wild mushrooms, the ectomycorrhizal species Laccaria laccata and the sapropharopic species Volvopluteus gloiocephalus. Isotopic analysis showed that Laccaria laccata mushrooms were 15N-enriched compared to Volvopluteus gloiocephalus mushrooms, possibly by transfer of 15N-depleted N to the host plant. Furthermore, Laccaria laccata mushrooms showed δ13C values indicating that C could come from their host, while the δ13C values of Volvopluteus gloiocephalus mushrooms were similar to those in their soil. Both species showed a high bioaccumulation of Cd and Cu in their fruiting bodies. Human consumption of these mushrooms could represent a toxicity risk due to the high concentration of Cd., [ES]: El corredor Verde del Guadiamar se trata de una zona contaminada por elementos traza tras un vertido minero en 1998. Tras este accidente se estableció una estrategia de fitorremediación con el objetivo de remediar y establecer un ecosistema novel. El primer objetivo de esta Tesis Doctoral fue evaluar la influencia de la identidad de las especies arbóreas forestadas en el Corredor en la composición y actividad microbianas. Se estudiaron los suelos bajo tres especies leñosas (acebuche, álamo blanco y pino piñonero) y en suelos de pradera, en dos sitios con diferentes propiedades edáficas. La forestación produjo un aumento en la mayoría de los indicadores microbianos. Cada especie leñosa produjo efectos específicos en la materia orgánica del suelo, el pH y la relación C:N, con consecuencias en la biomasa y la actividad microbianas. El álamo blanco fue la especie que promovió una mayor diversidad catabólica lo que podría suponer una mayor mineralización de sustratos simples y complejos de carbono en estos suelos. Además, tanto el pino piñonero como el álamo blanco promovieron una mayor actividad enzimática en estos suelos. El segundo objetivo de esta Tesis Doctoral fue evaluar el efecto de las diferentes especies arbóreas forestadas en el Corredor en la estructura y composición de las comunidades de hongos del suelo. La forestación de suelos degradados con diferentes especies de plantas puede promover el establecimiento de una diversidad y funcionalidad fúngicas determinadas. Se seleccionaron cinco hábitats diferentes: bajo la copa de tres especies leñosas (acebuche, álamo blanco y pino piñonero), en suelos de pradera adyacentes y en suelos no remediados. Encontramos que las medidas de fitorremediación promovieron la riqueza, diversidad, taxonomía y funcionalidad de hongos del suelo en el Corredor Verde del Guadiamar, en comparación con los suelos no remediados. El álamo blanco fue la especie leñosa con la mayor diversidad y riqueza en comparación con el acebuche y el pino piñonero. Los hongos ectomicorrícicos fueron más dominantes en los suelos de las especies hospedadoras de estos hongos, mientras que los saprótrofos fueron abundantes en suelos de pradera y bajo acebuche. El tercer objetivo de esta Tesis Doctoral fue explorar los cambios funcionales basados en los rasgos de las comunidades de hongos ectomicorrícicos en simbiosis con la encina. La variación de la composición de las especies ectomicorrícicas estuvo determinada por el C, el Ca y la contaminación del suelo; sin embargo, la diversidad taxonómica no dependió del nivel de contaminación. Los valores de los rasgos medios de las comunidades ectomicorrícicas mostraron una disminución en la formación de rizomorfos e hifas emanentes al aumentar la contaminación, y la comunidad convergió hacia especies con un desarrollo de rizomorfos menos frecuente. Esto supondría una reducción de la diversidad funcional en las comunidades de hongos ectomicorrícicos debido a la contaminación con un efecto potencial en el funcionamiento del ecosistema. El cuarto objetivo de esta Tesis Doctoral fue evaluar los rasgos funcionales de las especies de hongos ectomicorrícicos. En particular, se estudió cómo la composición de hongos ectomicorrícicos y sus rasgos morfológicos median en los rasgos de la encina. La taxonomía y la diversidad funcional de los hongos ectomicorrícicos explicaron una alta proporción de la varianza de los rasgos funcionales de la encina, tanto en raíces como en hojas. Las encinas que estuvieron dominadas por los hongos más abundantes Hebeloma cavipes y Thelephora terrestris mostraron unos rasgos conservadores en relación al espectro económico de la raíz, mientras que las encinas colonizadas por especies ectomicorrícicas poco abundantes presentaron una estrategia adquisitiva. Las raíces más conservadoras presentaron unos hongos con elevada formación de rizomorfos y baja melanización. Estos resultados apoyaron el potencial de los hongos ectomicorrícicos, tanto por su taxonomía como por sus rasgos, en la mediación del estado de la planta hospedadora. El quinto, y último, objetivo de esta Tesis Doctoral fue evaluar la capacidad de los hongos para movilizar los elementos traza del suelo, mediante el análisis de sus cuerpos fructíferos (setas). Se exploraron las relaciones suelo-hongo a través de dos setas silvestres, la especie ectomicorrícica Laccaria laccata y la especie saprótrofa Volvopluteus gloiocephalus. El análisis isotópico mostró que las setas de Laccaria laccata estaban enriquecidas en 15N en comparación con las setas de Volvopluteus gloiocephalus, posiblemente por la transferencia de nitrógeno poco enriquecido en 15N a la planta hospedadora. Además, las setas de Laccaria laccata mostraron unos valores δ13C que indicaban que el carbono podría provenir del hospedador mientras que los valores δ13C de las setas de Volvopluteus gloiocephalus fueron similares a los del suelo. Ambas especies mostraron una alta bioacumulación de Cd y Cu en sus cuerpos fructíferos. El consumo humano de estas setas podría representar un riesgo de toxicidad por la elevada concentración de Cd., Este trabajo de investigación ha sido financiado por: Beca para contrato predoctoral (FPI) dentro del Programa Estatal de Promoción del Talento y su Empleabilidad en I+D+i, en el marco del Plan Estatal de Investigación Científica y Técnica y de Innovación 2013-2016. Referencia: BES-2015-073882. Financiado por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades y el Fondo Social Europeo. Proyecto RestEco – Restauración y provisión de servicios ecosistémicos en suelos degradados en el Corredor Verde del Guadiamar (Sevilla, España). Proyecto Retos. Referencia: CGL2014 – 52858 - R. Financiado por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. Proyecto RECARE – Evaluación de las amenazas actuales de los suelos y búsqueda de soluciones para prevenir la degradación de los suelos en Europa. Caso de estudio: Contaminación del suelo por metales pesados en el Corredor Verde del Guadiamar (Sevilla, España). ENV.2013.6.2-4 ‘Sustainable land care in Europe’. Referencia: 603498. Financiado por el 7º Programa Marco de Investigación, Desarrollo Tecnológico e Innovación de la Unión Europea (FP7). Proyecto IntArSu – Interacciones árbol-suelo y recuperación de zonas degradadas. Proyecto Retos. Referencia: CGL2017 – 82254 – R. Financiado por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades.

Tras el accidente minero de la mina de ‘Los Frailes’ (complejo minero de Aznalcóllar, abril de 1998), en el que se vertieron cerca de 6 Hm3 de aguas ácidas y lodos mineros (muy ricos en elementos traza, ET) a las cuencas de los ríos Agrio y Guadiamar, comenzó uno de los mayores programas de recuperación y limpieza de aguas y suelos conocidos en el mundo. Las aguas tratadas, exentas de metales, fueron trasvasadas al río Guadalquivir, y los suelos fueron forestados con especies leñosas autóctonas, una vez retirados los lodos y añadido enmiendas orgánicas e inorgánicas, estableciéndose así lo que se conoce actualmente como ‘Corredor Verde del Guadiamar’ (CVG). Además de favorecer la conexión entre los espacios naturales de Sierra Morena, al norte, y Doñana, al sur, la creación de este paisaje protegido pretendía salvaguardar la imagen de la agricultura local (impidiendo toda actividad agrícola en una zona contaminada) y favorecer la calidad del agua de los ríos Agrio y Guadiamar, río, este último, que alimenta al Parque Nacional de Doñana. Una tarea de tamaña envergadura exigía el establecimiento de un amplio programa de investigación y monitorización, iniciado por la Consejería de Medio Ambiente de la Junta de Andalucía con los programas denominados PICOVER (Programa de Investigación del CVG, 1999-2003) y SECOVER (Seguimiento Eco-Regional del CVG, 2003-2006). El interés de la comunidad científica internacional por los trabajos que se realizaron en el marco de éstos y otros proyectos lo demuestran los numerosos registros referidos a este accidente minero, recogidos en repositorios internacionales como ISI WEB OF KNOLEDGE y SCOPUS, entre otros. En este Trabajo Fin de Grado se realiza una revisión bibliográfica de los principales trabajos publicados sobre el sistema suelo-planta en el CVG, desde el accidente hasta nuestros días. Se excluye la zona conocida como ‘Entremuros’ (donde fueron confinadas y tratadas las aguas ácidas) por tratarse de un medio acuático. Se hace una breve alusión a las líneas de investigación actualmente en curso, y a las medidas que podrían tomarse para mejorar la funcionalidad de este amplio paisaje protegido (CVG). La labor de limpieza de suelos liderada por el gobierno regional estuvo justificada a pesar de su extraordinario coste. Esto se reflejó en los estudios realizados en parcelas experimentales (dedicadas a investigación científica) en las que no se retiró el lodo ni se aplicaron enmiendas. En ellas se constató un intenso lixiviado de ET hacia capas más profundas del suelo, hasta el extremo de que en muchas zonas habrían acabado por contaminar los acuíferos, algunos de los cuales abastecen Doñana. En los suelos colindantes, limpiados y enmendados, no se produjo lixiviado de ET. Realmente, la generalidad de los suelos del CVG presenta hoy una contaminación residual que puede considerarse moderada, además de estabilizada (baja disponibilidad de ET, sobre todo en suelos calcáreos), y de distribución muy irregular. Sólo en los suelos más ácidos de la zona norte (desde la mina hasta, aproximadamente, el puente de ‘Las Doblas’, Sanlúcar la Mayor) aparecen suelos desnudos (las denominadas ‘calvas’), consecuencia, posiblemente, de la mayor presencia de restos de lodo en estos puntos, enterrados por la maquinaria pesada utilizada para la limpieza. Su oxidación periódica potencia las condiciones de acidez de los suelos, impidiendo así el establecimiento de una cubierta vegetal. También se han detectado recientemente mayores concentraciones de lodo residual en los taludes de ambos ríos y sus proximidades, escenarios de difícil accesibilidad para su limpieza. Esto crea condiciones especialmente graves en el tramo norte, donde, como en las calvas, la acidez generada facilita la solubilización del S (componente mayoritario de los lodos) y ET (algunos potencialmente tóxicos, como Al, Cd y Pb), que de esta forma pueden alcanzar la masa de agua y ser transportados a otros escenarios situados más al sur, incluido el Parque Nacional de Doñana. Pero según se ha indicado, la generalidad de artículos sobre suelos refleja la existencia de una contaminación moderada y estabilizada, aspecto ratificado por los estudios de la vegetación, cuyos contenidos de ET son muy bajos en las especies leñosas. La excepción serían los álamos y sauces, especies pertenecientes a la familia de las Salicáceas con capacidad para acumular Cd y Zn, que han sido ampliamente utilizados en las forestaciones del CVG, sobre todo el álamo blanco (Populus alba). Sobre esta especie se han realizado numerosos estudios que han reflejado, entre otros aspectos, su idoneidad como planta indicadora de la contaminación de los suelos por Cd y Zn. En general, la vegetación herbácea tiene contenidos mayores de ET, aunque, exceptuando algunas especies individuales (Brasicáceas, plantagos, compuestas), los pastos a base de gramíneas y leguminosas son perfectamente tolerables para su consumo por équidos, únicos animales permitidos actualmente en el CVG. No obstante, se desaconseja el pastoreo sobre pastos incipientes, por la posibilidad de que el animal consuma cantidades excesivas de suelo contaminado, adherido al pasto. La generalidad de trabajos consultados para la realización de esta revisión bibliográfica se centra, básicamente, en los efectos que ha tenido la contaminación de los suelos sobre los organismos vivos. En la actualidad, se están abordando nuevos aspectos, pero relacionados esta vez con el efecto que pueden tener las leñosas forestadas sobre el propio suelo, una de las líneas principales que contempla el Proyecto Europeo RECARE, en el que se enmarca este trabajo. Debido a lo incipiente de estos estudios, la información bibliográfica es todavía limitada. Se está evaluando la capacidad de las diferentes especies arbóreas para la “fitoestabilización” de los ET en el suelo, es decir para reducir su movilidad como contaminantes en los ecosistemas del CVG. Indicar finalmente que muchos de los artículos consultados aconsejan seguir monitorizando la contaminación residual existente, especialmente en aquellos escenarios donde la acidez y concentración de lodos resulta más problemática, hasta el punto de contemplar la posibilidad de nuevas limpiezas y, sobre todo, nuevos aportes de enmiendas, cuyos efectos positivos sobre la calidad del suelo y retención de metales han sido reflejados en numerosos trabajos realizados en el CVG. Por último, se abren nuevas expectativas sobre el efecto que pudiera tener la reapertura de la mina sobre los suelos, forestaciones ya establecidas, y, en general, sobre el CVG en su conjunto Universidad de Sevilla. Grado en Ingeniería Agrícola