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Orientador: Christine Hackel Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A região de Passo Fundo no Planalto Médio do Rio Grande do Sul caracteriza-se pela produção de grãos (trigo, soja) e também hortigranjeiros. No combate as pragas destas culturas, os agricultores fazem uso de grandes quantidades de agroquímicos (fungicidas, inseticidas e herbicidas). Para testar a possível atividade genotóxica destes produtos, utilizou-se a técnica de micronúcleos, que consiste na identificação de pequenos núcleos visíveis em células binucleadas, resultantes da perda de parte ou de cromossomos inteiros pela célula, durante a divisão celular. Para a análise dos micronúcleos, foram coletados 2 mL de sangue periférico heparinizado de trinta trabalhadores expostos, relacionados diretamente com a aplicação e manuseio destes produtos e trinta indivíduos não expostos. Dados relativos ao hábito de fumar, consumo de bebida alcoólica, sexo, idade e tempo de exposição foram também identificados. Culturas de linfócitos de sangue periférico foram tratadas com citocalasina B por um período de 24 horas antes de completar o tempo total de cultura. Após a contagem de 1000 células binucleadas a freqüência de micronúcleos de ambos os grupos foi avaliada e aplicado o teste de "t" Student, indicando diferença altamente significativa entre expostos (14,4/1000) e não expostos (7,211000). Outros fatores relacionados com a instabilidade cromossômica como tabagismo, sexo, idade e tempo de exposição, não influenciaram de modo significativo em ambos os grupos. Finalmente, podemos concluir que o teste do micronúcleo mostrou-se eficiente como ensaio biológico para monitorar populações expostas a misturas de agroquímicos Abstract: Much of grain cultivation (wheat and soybean) in the Rio Grande do Sul state is carried out in the region of Passo Fundo. For crop pest control, great amounts of agrochemicals (fungicides, insecticides, herbicides ) are used. To evaluate the genotoxicity of these products, the micronucleus test was applied in the study of rural workers directly exposed to these chemicals. The micronuclei are small nuclei resulting from the loss of whole chromosomes or a centric fragments during cell division that can be identified in binucleated cells. Heparinized blood samples were drawn by venepuncture from 30 exposed workers and 30 non-exposed controls. To perform micronuclei analysis on Lymphocyte cultures , Cytochalasin B was added to block cytokines is after 44h incubation at 3-,0 C, resulting in t!1e formation of multinucleated cells. Data about smoking and drinking habits, sex, age and exposure duration were also identified. Micronuclei frequency was evaluated by counting 1000 binucleated cells in both groups. Statistical analysis showed significantly higher mean number levels of binucleated cells with micronuclei in exposed individuals (14,4/1000) than in controls (7,2/1000). Other factors related to chromosome instability, such as smoking habits, age and exposure duration, showed no effect on the frequency of micronuclei in both groups. Finally, we can conclude that the micronuclei test is an efficient biological assay for monitoring population exposure to mixtures of agrochemicals Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Angelo Luis Cortelazzo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: No presente trabalho, foram utilizadas sementes de Eugenia uniflora (pitanga) e Campomanesia xanthocarpa (guabiroba), coletadas em matas nativas do município de Carazinho - RS, e armazenadas em vidros a 4°C. As sementes quiescentes foram colocadas para germinar e caracterizadas citoquímica e bioquimicamente quanto as suas principais reservas. A cada quinze dias foram realizados novos testes de germinação, com respectivo processamento do material para análises microscópicas e dosagens das reservas. Sementes de E. uniflora permaneceram viáveis durante todo o período analisado (105 dias), mantendo índices de germinação superiores a 70%. C. xanthocarpa apresentou-se viável apenas nos primeiros quinze dias, indicando característica fortemente recalcitrante. As duas espécies apresentaram-se com mais de 40% de umidade em seus frutos maduros. Para a pitanga elas têm massa 3 vezes maior do que para guabiroba e tem como principal reserva o amido (36%), seguido de proteínas (20%). Nesta última ocorre praticamente o inverso, com proteínas representando mais de 37% da matéria seca e quantidades consideráveis de carboidratos (18%). Os resultados indicaram ainda um elevado teor lipídico nas sementes de guabiroba. Em nível celular, as principais alterações observadas em guabiroba durante a perda de viabilidade foram devidas à fusão do material protéico e aumento do poder redutor do material fenólico presente nas células cotiledonares. Em pitanga, apesar de não ter havido perda de viabilidade, observou-se uma diminuição significativa dos grãos de amido e maior reatividade do material protéico ao longo do tempo de estocagem decorrente de um aumento na disponibilidade de radicais amina. Verificou-se ainda um aumento significativo no conteúdo de açúcares livres e solúveis, provavelmente decorrente da hidrólise do amido presente nas células das sementes de pitanga. Em termos comparativos, além das características apontadas, foi observada uma maior disponibilidade de material péctico nas paredes celulares das sementes de guabiroba Abstract: Seeds of Eugenia uniflora (pitanga) and Campomanesia xanthocarpa (guabiroba) were colected in native forest of district Carazinho - RS, and stored in glass at 4°C. Germination tests of quiescent seeds were carried out every 15 days. The viability of E. uniflora continued for the investigation period of 105 days, with germination index above 70%, while in C. xanthocarpa the viability was 15 days, characteristic of recalcitrant seeds. Moisture content of seeds was mainteinad around 40% in mature fruits. The main storage component of pitanga is starch (36%). Another important reserve is protein (20%), while guabiroba presents more than 37% of their fresh weight in proteins and considerable quantity of carbohydrates (18%). These seeds contain high lipid content. The cellular alterations of guabiroba during the loss of viability were the fusion of protein material and increase the reductibility of phenolic material present in cotyledon cells. Pitanga with continued viability, showed a significant reduction of starch grains and increase of protein reativity during storage.An increase in free and soluble sugar was detected, as a result of the starch hydrolysis of pitanga cells. Wall cells of guabiroba seeds showed more disponibility of pectic material in pitanga Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Shirlei Maria Recco-Pimentel Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia Resumo: A família Dendrobatidae é formada por cerca de 230 espécies agrupadas em 9 gêneros. Colostethus é o maior deles com 128 espécies descritas. Alguns grupos de espécies foram propostos para o gênero, os quais, embora utilizados, foram bastante criticados devido à ausência de apomorfias que suportassem tais agrupamentos. Assim, as relações de parentesco intragenéricas continuam incertas. Neste trabalho, algumas espécies do gênero Colostethus foram estudadas através da análise citogenética e da ultra-estrutura do espermatozóide, a fim de contribuir para um melhor entendimento das relações de parentesco intragenéricas, bem como taxonômicas. Os cariótipos das espécies Colostethus brunneus, C. marchesianus, C. caeruleodactylus, Colostethus sp. 1 (aff. marchesianus), Colostethus sp. 2 (aff. marchesianus), Colostethus sp.(aff. trilineatus) e Colostethus sp. foram analisados pelos métodos de coloração convencional, bandamento C e impregnação por prata. Quando necessário, a técnica de hibridação in situ com sonda de DNAr também foi empregada. A análise da ultra-estrutura do espermatozóide foi realizada em C. nidicola, C. stepheni e em todas as espécies mencionadas acima, com exceção de Colostethus caeruleodactylus e Colostethus sp. 2 (aff. marchesianus). Os dados citogenéticos revelaram a presença de 24 cromossomos em C. brunneus, enquanto as outras espécies apresentaram 22 cromossomos. Diferenças no padrão de heterocromatina foram observadas nos cariótipos das espécies analisadas. No entanto, as espécies de Colostethus com 2n = 22 apresentaram uma banda fracamente corada no braço longo do par 7, a qual possivelmente seja uma homeologia entre estas espécies. A região organizadora do nucléolo (NOR) foi localizada no braço longo do par 4 das espécies C. marchesianus, Colostethus sp. 1 (aff. marchesianus), C. caeruleodactylus e no braço curto de Colostethus sp. (aff. trilineatus). Em C. brunneus, foi encontrada no braço longo do par 3, o qual possui a mesma morfologia do par 4 das referidas espécies. Colostethus sp. 2 (aff. marchesianus) e Colostethus sp., apresentaram a NOR em pares distintos. NORs adicionais e heteromorfismo de tamanho também foram observados em algumas das espécies, os quais puderam ser confirmados após a hibridação in situ com sonda de DNAr. Porém, em um indivíduo de Colostethus sp. 42 (aff. marchesianus) esta técnica evidenciou um sítio adicional, homólogo à sonda de DNAr, nunca observado pelo método AgNOR. As diferenças no número de cromossomos, distribuição de heterocromatina e localização da NOR, possibilitaram a distinção entre as espécies estudadas. A análise da ultra-estrutura do espermatozóide revelou a presença de espermatozóides biflagelados em todas espécies, com exceção de C. stepheni. Considerando-se as estruturas do complexo acrossomal e do aparato flagelar, os espermatozóides das espécies analisadas assemelham-se aos dos bufonóides. Além da presença de um único flagelo, o espermatozóide de C. stepheni também diferiu do padrão observado nas outras espécies, por apresentar mitocôndrias dentro da membrana ondulante, a qual juntamente com a bainha axial mostraram-se bastante dilatadas. Os resultados obtidos através da análise citogenética foram úteis na distinção entre as espécies estudadas, uma vez que estas possuem grande similaridade morfológica, o que dificulta a identificação. Por outro lado, a análise ultra-estrutural contribuiu para o esclarecimento de questões intragenéricas, pois C. brunneus. C. marchesianus, Colostethus sp. 1 (aff. marchesianus) e Colostethus sp. (aff. trilineatus), pertencentes ao grupo ¿brunneus¿ possuem espermatozóides biflagelados, enquanto que em C. stepheni (grupo ¿alagoanus¿) é uniflagelado. Essas espécies estudadas do grupo ¿brunneus¿, são, possivelmente, proximamente relacionadas à Allobates femoralis, cujo espermatozóide também possui dois flagelos, enquanto C. stepheni está mais distante, o que está de acordo com estudos de filogenia molecular. Portanto, dados ultra-estruturais obtidos até o momento não concordam com a criação do grupo ¿trilineatus¿, recentemente proposto, a partir da união dos grupos ¿brunneus¿ e ¿alagoanus¿ Abstract: The family Dendrobatidae consists of approximately 230 species that are grouped in nine genera. Colostethus is the largest genus with 128 nominal species. Some Colostethus species groups have been proposed and, although used, have been criticized because of the lack of apomorphic characters to support the species groupings. In this work, we examined the cytogenetics and sperm ultrastructure of Colostethus as part of an investigation into the taxonomic and intrageneric relationships of this genus. The karyotypes of Colostethus brunneus, C. marchesianus, C. caeruleodactylus, Colostethus sp. 1 (aff. marchesianus), Colostethus sp. 2 (aff. marchesianus), Colostethus sp. (aff. trilineatus) and Colostethus sp. were analyzed using conventional Giemsa staining, C-banding and Ag-NOR techniques. Fluorescence in situ hybridization (FISH) with an rDNA probe was also used when necessary. The ultrastructure of spermatozoa from all species, except for Colostethus caeruleodactylus and Colostethus sp. 2 (aff. marchesianus) and including C. nidicola and C. stepheni, were also examined. Cytogenetic analysis showed that C. brunneus had 24 chromosomes whereas the other species had 2n = 22 chromosomes. Variations in the Cbanding patterns of the karyotypes were seen in all of the species. However, the Colostethus species with 2n = 22 showed a faintly stained band on the long arm of pair 7, which probably represent a homeology among these species. The nucleolus organizer region (NOR) was located on the long arm of pair 4 of C. marchesianus, Colostethus sp. 1 (aff. marchesianus) and C. caeruleodactylus and on the short arm of the same pair of the Colostethus sp. (aff. trilineatus). In C. brunneus, the NOR was located on the long arm of pair 3, which was morphologically similar to pair 4 in the other species. In Colostethus sp. 2 (aff. marchesianus) and Colostethus sp. the NOR was located on different chromosomal pairs. Additional NOR sites and size heteromorphism were also seen in some species, and were confirmed by FISH with an rDNA probe. However, in one specimen of Colostethus sp. 2 (aff. marchesianus), FISH revealed an additional site that was never seen by silverstaining. The difference in chromosomal number, heterochromatin distribution and NOR localization, made it possible to distinguish among the species. Ultrastructural analysis of the spermatozoa showed the presence of biflagellated spermatozoa in all species, except for C. stepheni. The acrosomal complex structure and flagellar apparatus of the spermatozoa of the species examined resembled those of bufonoids. In contrast to the flagella of the other species, the single flagellum of C. stepheni spermatozoa contained mitochondria in the undulating membrane and a very thickened axial sheath. The results of the cytogenetic analysis were useful for distinguishing among these morphologically similar species. Similarly, ultrastructural analysis of the spermatozoa helped to elucidate intrageneric relationships since C. brunneus, C. marchesianus, Colostethus sp. 1 (aff. marchesianus) and Colostethus sp. (aff. trilineatus), which belonged to the ¿brunneus¿ group, had biflagellate spermatozoa, whereas C. stepheni (¿alagoanus¿ group) had a spermatozoa with a single flagellum. The species in the ¿brunneus¿ group, were probably closely related to Allobates femoralis, which has biflagellate spermatozoa, whereas C. stepheni was not closely related, in agreement with molecular phylogenetic studies. The ultrastructural data obtained so far do not support the creation of the ¿trilineatus¿ group recently proposed based on the unification of the ¿brunneus¿ and ¿alagoanus¿ groups Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Antonio Marcos Orsi Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O epitélio de revestimento do epidídimo do hamster dourado Mesocricetus auratus foi estudado nas regiões de segmento inicial, cabeça, corpo e cauda distal. As análises histológicas permitiram identificar células principais, basais, claras, halo e delgadas formando o epitélio de revestimento epididimário. As células principais predominaram na constituição do epitélio epididimário, apresentando contribuição relativa de 67,8% a 74,9% em sua formação. Células claras estavam presentes apenas na cauda distal, enquanto que as células delgadas não ocorreram apenas na cauda epididimária. As análises morfométricas mostraram que a altura epitelial variou ao longo do dueto epididimário, sendo que a maior altura ocorreu no segmento inicial (46,4mm) e a menor, na cauda distal (12,6 mm). As análises bioquímicas mostraram que as enzimas lactato desidrogenase e fosfatase alcalina apresentaram maior atividade na cauda epididimária. A maior concentração de proteínas totais ocorreu no segmento inicial com redução progressiva ao longo dos segmentos tubulares mais distais. Entre as células principais, claras e basais da cauda distal foram observados grandes espaços intercelulares, preenchidos com restos de membrana, estruturas semelhantes a figuras de mielina, vesículas, corpos multivesiculares ou material floculento. A observação destes espaços entre as células epiteliais da cauda distal sugere que há ocorrência de transcitose na cauda epididimária do hamster dourado, com possível passagem de água, entre outras substâncias, a partir do lúmen. A transcitose, possivelmente, influencia a formação do microambiente luminal epididimário. Os achados permitiram inferir que as regiões de cabeça e corpo do epidídimo estão envolvidas com as atividades iniciais de maturação dos espermatozóides e a cauda, além de armazenar os espermatozóides, deve ser o principal sítio para aquisição do potencial de fertilização Abstract: The epididymis epithelium of the Golden hamster Mesocricetus auratus was studied at the initial segment, caput, corpus and distal cauda regions. The histological analyses identified principal, basal, clear, halo and narrow cells forming the epithelial lining of the epididymis. The principal cells predominated in the epididymis epithelium, contributing from 67.8% to 74.9% in its constitution. Clear cells were present only in the distal cauda, while the narrow cells did not appear only in the epididymal cauda. The morphometric analyses showed that the height of epithelial cells varied along the epididymal duct; the highest were observed at the initial segment (46.4 mm) and the lowest in the distal cauda (12.6 mm). The biochemical analyses showed that the lactate dehydrogenase and alkaline phosphatase were more activite in the epididymis cauda. The highest concentration of total proteins was verified in the initial segment with progressive reduction along the more distal segments. Among the principal, clear and basal cells of the distal cauda large intercellular spaces were observed, being filled with membrane remains, structures like myelin figures, vesicles, multivesicular bodies or flocculent material. The observation of these spaces among the epithelial cells of the distal cauda suggested that transcytosis occurred in the epididymal cauda of the Golden hamster, with possible transit of water and other substances from the lumen. Transcytosis possibly influenced the formation of the epididymis luminal microenvironment. From these observations it can be deduced that the caput and corpus regions of the epididymis were related to specific activities of spermatozoa maturation and the cauda, besides storing of spermatozoa, could be the main site to acquise of the fertilization ability Doutorado Anatomia Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador : Mary Anne Heidi Dolder Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Mestrado

Orientador: Mary Anne Heide Dolder Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Foram realizados sete experimentos de cultura de túbulo seminíferos abrangendo variações das condições de fragmentação, manipulação e de cultura. As variações aplicadas à cultura visaram minimizar os sinais de desorganização e degeneração tecidual. Verificou-se que as técnicas de fragmentação introduziram alterações na organização do epitélio seminífero, como o deslocamento de populações celulares germinativas em direção ao lúmen tubular. Como conseqüência desta movimentação celular apareceram também espaços intercelulares no epitélio germinativo. Esta desorganização tecidual interfere na integridade das interações entre as populações celulares presentes, necessárias para seu desenvolvimento. Apareceram sinais de degeneração celular progressivos como a descaracterização das células de Sertoli, acúmulo de gotículas de Iipídios, vacuolização nuclear e citoplasmática e presença de resíduos celulares. As alterações não puderam ser revertidas. O teste de complementos no meio de cultura (soro fetal bovino-SFB, e hormônio folículo estimulante-FSH) objetivou o aprimoramento da técnica. A presença de SFB ativou populações celulares inespecíficas, as células mióides, causando alterações morfológicas nestas cél ulas, como o arredondamento nuclear. Estas células cresceram desordenadamente e a parede tubular apresentou-se espessada. Já a presença de FSH teve efeito positivo, retardando o aparecimento dos sinais de degeneração. Foi importante estabelecer quais as condições ideais de cultura, meio HAMFlO:DMEM, na presença de HEPES(15mMlml), bicarbonato de sódio (1,2g/1), BSA(1g/I), MIX(O,lmMll), FSH(O,4ug/ml) e gentamicina(lOO/-lg/ml), em estufa a 32°C, por um período de 3 dias. Nestas condições obtivemos o mínimo possível de alterações do epitélio seminífero. Estabelecemos então um padrão das alterações introduzidas através da técnica de cultura em si. Frente a este controle foram realizados dois experimentos de aplicação do cádmio às culturas de túbulos seminíferos. Estes experimentos foram realizados num período de três dias, com fixações diárias, utilizando as condições de cultura pré-estabelecidas. Foram testadas três concentrações do metal (1;10 e IOO/-lM) durante uma hora de exposição. Também foi realizado um controle com exposição direta dos túbulos seminíferos em cultura ao cádmio I/-lM. Foi constatada a intensificação e o aceleramento dos sinais de degeneração devido à presença do metal no meio de cultura Abstract: Cultures of seminiferous tubules were made according to seven experiments including variations of fragmentation conditions, of manipulation and of culture medium. Tubule fragmentation and manipulaÍion introduced disturbances of the eminiferous epithelium, such as the dislocation of germ cells directed towards the tubular lumen. As a consequence of this movement there were intercellular spaces. The epithelial integrity is fundamental for cellular interactions necessary for cellular development. During the culture period cellular degeneration occurred progressively. Morphological disturbances of the Sertoli cells, marked accumulation of lipid droplets, nuclear and citoplasmatic vacuolization and the presence of cellular debris were observed. The addition of calffetal serum (CFS) to the medi um activated myoid cell populations and caused morphological alterations of these cells (such as nuclear rounding). These changes were accompanied by the thickening of the tubular wall. On the other hand the presence ofFSH in the culture medium was very positive, delaying and reducing degeneration signs. It was important to establish the disturbances caused by the culture techniques and the period during which the seminiferous tubules can be maintained with minimum alterations to be used as a control situation. Two experiments were made wíth cadmium applied to the semíníferous tubules cultures. These experiments were based on culture conditions established by the previous experiments and they were monitored with daily fixations during a three day period. Three concentrations of this metal (1, 10 e 1O0_M) were tested during a one hour period of exposition. A control of direct exposition oftubules to the metal (l_M) was carried out entire culture período As a consequence of cadmium present ín the culture, degeneration was intensified and accelerated. It was established that cadmium can act directly on germ cells causing degenerative alterations Mestrado Biologia Celular Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Ernesto Jose Doltaviano Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Embora seja do conhecimento geral que os hormônios tireoidianos estão envolvidos no desenvolvimento e manutenção de vários órgãos, ainda, existem aspectos contraditórios sobre seu papel na fisiologia testicular. Com a proposta de melhor compreender a influência dos hormônios tireoidianos na manutenção testicular, este estudo teve como objetivo avaliar parâmetros biométricos, morfológicos e hormonais em ratos de várias idades, que foram induzidos experimentalmente ao hipotireoidismo com doses diárias de 0,05 mg de Methimazole, confirmado pelas dosagens de Tiroxina (T4). Neste estudo utilizaram-se 68 ratos brancos (Rattus no veraicus, variedade albino), machos e 12 fetos. Estes animais foram sub divididos em 6 grupos experimentais, de acordo com o tempo de tratamento e a data do sacrifício e denominados: Hipotireoidismo materno-fetal (19º dia de vida fetal), 8 dias de idade, 21 dias de idade, 35 dias de idade, 50 dias de idade e 90 dias de idade. Os resultados mostraram que a indução do hipotireoidismo no oitavo dia de prenhez, que corresponde ao início da organogênese do rato, não resulta em aumento da incidência de reabsorção fetal ou de malformações congênitas e também não leva a alterações no comportamento dos animais com hipotireoidismo. Em todos os grupos experimentais analisados, os animais tratados apresentaram redução significativa (p

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O cádmio é um elemento químico, reconhecido atualmente como perigoso devido sua alta toxicidade e os efeitos deletérios que provoca nos seres vivos. Recentemente também tem sido investigadas com maior interesse e atenção, algumas drogas vendidas sem prescrições médicas como por ex. o paracetamol, cujos efeitos tóxicos são pouco informados aos usuários. O presente trabalho tem por objetivos analisar e avaliar os efeitos do cádmio (sob forma de CdCI2.H20), do paracetamol (na forma de Tylenol @ - gotas) e destas substâncias administradas simultaneamente, sobre os testículos de ratos. Neste estudo foram utilizados 44 ratos, do sexo masculino (adultos-jovens) da linhagem Wistar. Realizaram-se estudos histológicos qualitativos e quantitativos à microscopia de luz. Os animais foram submetidos à diferentes dosagens do cádmio (2,5; 7,5; 10 e 15 IJmols I kg), do paracetamol (4,4 e 8,8 mmols I kg) e do cádmio associado ao paracetamol (2,5 IJmols I kg + 4,4 mmols I kg; 7,5 IJmols I kg + 8,8 mmols I kg; 15 IJmols I kg + 8,8 mmols I kg). As observações histológicas revelaram, para os animais submetidos ao cádmio nas doses de. 10 IJmols I kg (com duração de 83 dias) ou 15 IJmols I kg (duração de 06 dias), alterações morfológicas graves em todo o parênquima testicular. Estas alterações são caracterizadas por necrose coagulativa do epitélio seminífero, espessamento da túnica albugínea e degeneração do tecido intersticial. Para os animais tratados com 15 IJmols I kg, houve perda de peso corporal e os resultados quantitativos demonstram valores significativos pela redução dos diâmetros de túbulos seminíferos. Para. os animais tratados com 10 Jjmols I kg, os resultados qualitativos revelaram uma diminuição dos pesos testiculares. Nas doses do cádmio com 2,5 e 7,5 Jjmols I kg e do paracetamol com 4,4 e 8,8 mmols I kg respectivamente, não se observou efeitos lesivos graves nos testículos dos animais investigados. Entretanto quando estas duas substâncias foram administradas simultaneamente, observou-se o efeito aditivo que provocou alterações testiculàres, detectadas à microscopia de luz. A administração do cádmio (7,5 e 15 Jjmols I kg) com o paracetamol (8,8 mmols I kg), leva a uma potencialização dos efeitos deletérios, sendo evidenciada pela redução altamente significativa dos diâmetros dos túbulos seminíferos Abstract: Cadmium is a chemical element recognized today as dangerous due to its high toxicity and harmful effects toward life. Also recently, drugs sold freely without prescription, such as paracetamol, are being investigated for their toxic effects, of which the public is frequently not aware. This study was undertaken to analyse and evaluate the effects on rat testicles of cadmuim (CdCI2.H20), of paracetamol (in the form of Tylenol @ ­drops) and of these two substances administered simultaneously. For this work, 44 male rats (young adults) of the Wistar lineage were used. Quantitative and qualitativ.e evaluations were made with light microscopy. The animais received various dosages of cadmium (2.5, 7.5,10 and 15 I-Imols I kg), of paracetamol (4.4 and 8.8 mmols I kg) and of cadmium associated with paracetamol (2.5 I-Imols I kg + 4.4 mmols I kg; 7.5 I-Imols I kg + 8.8 mmols I kg; 15 I-Imols I kg + 8.8 mmols I kg). Histological observations showed severe alterations of the testicles for animais that received cadmium in the dose of 10 I-Imols I kg (followed for a 83 day period) or 15 I-Imols I kg (for 06 days). These alterations were classified as coagulative necrosis of the seminal epithelium, tunica albuginea thickening and degeneration of the interstitial tissue. Animais treated with 15 I-Imols I kg lost body weight and the reduction in diameter of the seminal tubules was highly significant. Animais which received 10 I-Imols I kg had a reduction in weight of their testicles. In the cadmium doses of 2.5 and 7.5 I-Imols I kg and of paracetamol in doses of 4.4 and 8.8 mmols I kg no serious lesions were encountered in the animais studied. However, when these substances were administered simultaneously, an additive effect was shown to cause slight. testicular alterations, observed with the light microscope. Higher cadmium doses (7.5 and 15 I-Imols I kg) and the larger paracetamol dose (8.8 mmols I kg) resulted in a potentiation of the harmful effects, measured by the highly significant reduction _n diameter of the seminal tubules Mestrado Biologia Celular Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Isntituto de Biologia Resumo: Imagos machos e fêmeas de Alabama ahg_lla_ea foram dissecados para o estudo da morfologia de seus aparelhos re­ produtores. Os espermatozóides nesses aparelhos foram subm_ tidos ao processo de contrastação negativa e a diferentes me todos de fixação para microscopia eletrônica de transmissão. Os objetivos básicos de nosso trabalho foram: a) caracterizar ultra-estruturalmente, ao nivel do testicu­ 10, os 2 tipos normais de espermatozóides (eupirenes e apire nes) b) descrever, ao nIvel de 6rgãos extra-testiculares dos tra tos genitais de mariposa macho e fêmea, a estrutura fina das modificações sofridas pelos espermatozóides tIpicos e atipi­ coso Ao nivel do testiculo, os espermatozóides eupirene_ (nucleados) e apirenes (anucleados) apresentam-se dispostospa ralelamente em feixes organizados no interior de cistos sep_ rados e bem distintos entre si. Os espermatocistos possuem, em geral, 256 _ 1 espermatozóides, porém há cistos ar:Ürenes com 2 a 3 vezes mais espermatozóides que os eupirenes. Os espermatozóides apirenes intra-testiculares, me nores que os eupirenes, são verdadeiros aparatos flagelares. Suas porções anteriores anucleadas apresentam-se sob a forma de um tronco de cone, com um capuz elétron-denso diferencia­ do que envolve 1 a 2 coroas de microtúbulos. O flagelo dos espermatozóides anucleados é constituido por: a) axonema do tipo 9+9+2, tipico de insetos em geral, com mi crotúbulos acessórios e centrais de conteúdo pouco elétron­ denso; b) 2 pequenos derivados mitocondriais dispostos ao longo da cauda, de tamanho e estrutura semelhantes (região medular com área de natureza paracristalina), que terminalizam jun­tos antes da porção terminal; c) membrana plasmática trilaminar envoltória. Cada um dos espermatozóides eupirenes (nucleados) intra-testiculares é recoberto, total ou parcialmente, por uma coroa radial de apêndices laciniados, desde a cabeça a­ té porções mais posteriores da cauda. Ao longo de todo es­ permatozóide, existe um outro tipo de apêndice, bem diferen ciado dos anteriores, chamado reticular ou corpo satélite. A porção cefálica dos espermatozóides típicos é composta de: a) um núcleo longo, delgado e muito elétron-denso; b) uma estrutura tubular de paredes elétron-densas adjace_ te ao núcleo; e c) um corpúsculo basal atípico abaixo da vesícula tubulare adjacente ã porção basal do núcleo. Não foi identificada ne nhuma estrutura acrosômica. o flagelo de espermatozóides eu pirenes é formado por um axonema de padrão organizacional 9+9+2, como o dos apirenes, porém os 2 microtúbulos cen­ trais são mais elétron-densos que aqueles do axonema de es­ permatozóides atípicos, e os 9 microtúbulos acessórios apre sentam conteúdo fortemente elétron-denso que se cora mais tensamente com vermelho de rutênio, o que indica a presença de glicoproteínas e/ou glicosaminaglicanas. Ao longo do a xonema, dispõem-se 2 derivados mitocondriais de tamanhos di ferentes com arranjo periódico de "cristas" na camada corti­ cal. o maior se estende por quase todo o flagelo, enquanto que o menor e encontrado somente em regiões mais posteriores e terminaliza antes do maior. Na porção terminal, sem a pré sença de derivados mitocondriais, o axonema se desorganiza completamente. A membrana plasmática envoltória possui es­ trutura trilaminar típica. Ao serem liberados do testículo para os ductos g_ nitais, os espermatozóides eupirenes são mantidos em feixes, ao redor dos quais se dispõem os apirenes. Os apêndices la­ ciniados não são mais detectados ao redor dos espermatozói­ des típicos, mas persiste o reticular situado por fora de u­ ma complexa bainha envoltória. Os espermatozóides apirenes extra-testiculares também apresentarn bainha envoltória com nu mero variado de camadas, recoberta por pequenos filarnentos e mais simples que a dos eupirenes. Em órgãos (bursa copulatrix e espermateca) do tra­ to genital de fêmeas inseminadas, os espermatozóides anuclea dos apresentam estrutura semelhante àquela observada nos duc tos genitais do macho, mas os nucleados não mais se dispõem em feixes e nota-se a total ausência do apêndice reticularna região da placa densa na bainha. externa, bem como evidente desvio de todo envoltório em relação ao espermatozóide. Os esperma tozóides apirenes permanecem ao nível da espermateca, onde de eneram, sem sair de seus envoltórios. Os eupirenes abando­ nam suas bainhas e saem da espermateca para fertilizar os ó vulos. O papel dos espermatozzides apirenes parece estar re lacionado com o transporte dos eupirenes nos duetos genitais masculinos e da bursa copulatrix att a espermateca da ffmea Abstract: Male and female moths of Alabama a_gillaeea were dissected out for studying the reproductive systems morphology. The spermatozoa were negative stained and fixed by different methods to transmission electron microscopy. The basic aims of our study were the ultrastructure description of the two normal morphological types of spermatozoa - eupyrene and apyrene - in the testes and the differentiaton of the both types of sperm during the passage through the male and female ducts. In the testis, the eupyrene and apyrene sperrnatozoa are closely associated and aligned in bundles into distinct cysts. The spermatocyst have, in general, 256_ 1 spermatozo_ but some apyrene cysts have a double or triple number of sperm. The intratesticular atypical spermatozoa are smaller than the typical ones. Their anucleated anterior regions seem like truncated cones with amost anterior electron dense cap envolving one or two concentric rnicrotubules rows. The flagellun of anucleated sperm shows an insect typical axoneme 9+9+2 which central and accessory rnicrotubules have a slighter electron dense lumen. The two small mi tochondrial derivatives along the tail have similar size and structure and finish together before the endpiece tail. A typical unit membrane is observed around the axoneme. The eupyrene testicular spermatozoa are surrounded by a radial mantle of lacinate appendages along almost alI their length. There is another type of appendage that runs along the nucleated sperm denominated reticular appendage or satellite body. The head region of the eupyrene sperm has along, slender and very electron dense nucleus, atubular structure with electron dense wall lying near to the nucleus and an atypical basal body below the tubular structure and adj acent to the nucleus basal region. None acrosome s.tructure was observed. The eupyrene flagellun has an axoneme 9+9+2 like that one from apyrene sperrn.The two axoneme central tubules have more electron dense lumina than the ones of the atypical sperm and the electron dense cores of the nine accessory microtubules stain strongly with ruthenium red, probably indicating the presence of glycoproteins andjor glycosaminoglicans. There are two mitochondrial derivatives along the axoneme with different sizes and lengths which . show periodic arranged and modified cristae in their cortical region. One of mitochondrial derivatives is larger and extends further posteriorly than the other. In the endpiece tail, without mitochondrial derivatives, the axoneme is completely disorganized. The plasma membrane has a typical trilaminar organization. After releasing from the testis to the genital ducts,the eupyrene spermatozoa of the same cyst remain associated in bundles. The apirene sperm are randomly arranged between the eypirene bundles. The lacinate appendages are lacking, but the reticular one is still observed along a new complex sheath around the nucleated sperm. The anucleated spermatozoa are surrounded by a less elaborated sheath with different number of concentric rings of material recovered by small filamentous extensions. In the bursa copulatrix and receptaculum seminis of inseminated females, the anucleated spermatozoa are similar to those ones observed in the male genital tract. The nucleated sperm are now disassociated and the reticular appendage is completely lacking on the dense region in the outer sheath, which has óndergane a rotation from its previous position in regard to the internal components of the typical sperm. The atypical spermatozoa remain in the spermatheca where theydegenerate, withaut leaving their awn sheaths.The typical anes hatch from their sheaths and fertilize the eggs. The role af apyrene spermatozoa seems to be related with the transpart af the eupyrene sperm in the male genital ducts and from compulatory pouch to the female spermatheca Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Sonia Nair Bao Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Percevejos fitófagos (Hemiptera, Pentatomidae) são as principais pragas de colheitas economicamente importantes ao redor do mundo. Entre os pentatomídeos pragas de leguminosas, o percevejo verde Nezara viridula talvez seja o mais importante, bem como as espécies do gênero Acrosternum. Portanto, a caracterização estrutural e ultraestrutural do espermatozóide destes insetos poderá ser importante futuramente para programar e direcionar o controle bioquímico destas pragas, bem como para a manipulação genética de populações através de machos estéreis e semi-estéreis. A espermiogênese assim como o espermatozóide de Acrosternum aseadum e Nezara viridula são muito semelhantes e portanto, foram descritos conjuntamente. A espermiogênese envolve a elongação nuclear, a condensação da cromatina, a formação do acrosoma, e o desenvolvimento flagelar, com a formação do axonema bem como dos derivados mitocondriais. Durante as fases iniciais da espermátide, o núcleo se parece com o núcleo de uma célula somática. O citoplasma circundante apresenta um complexo de Golgi bem desenvolvido, o qual é impregnado por tetróxido de ósmio - iodeto de potássio no "cis Golgi network", em cisternas cis e em várias vesículas do "trans Golgi network". O produto de reação de atividade fosfatase ácida e glicose-6-fosfatase é observado principalmente na porção "1rans network" do complexo de Golgi. O complexo de Golgi contribui para a formação do acrosoma. Primeiro um grânulo pró-acrosomal é formado pela fusão de vesículas oriundas do Golgi. Este grânulo se ancora no núcleo e sofre diferenciação simultaneamente com o núcleo e o flagelo. O núcleo sofre uma condensação gradual da cromatina com um aumento em sua ele1rondensidade. Durante a sua compactação a cromatina apresenta um aspecto fibrilar, o qual evolui para um arranjo paracristalino e então se toma muito compactada e ele1ron densa. Em espermátides jovens pode ser visto o adjunto do centriolo localizado posteriormente ao núcleo, na região de implantação do flagelo. Próximo ao adjunto do centriolo observamos um bastão ele1ron denso, o qual apresenta marcação positiva com anticorpos para as tubulinas a, J3 e total, e cuja a marcação desaparece nos estádios finais da espermiogênese, sugerindo uma função como cen1ro organizador de microtúbulos. O axonema da espermátide contém uma variedade de elementos tubulares que persistem no espermatozóide. O axonema apresenta o padrão de 9+9+2 microtúbulos que mos1ram produtos de reação de atividade fosfatase ácida, glicose 6-fosfatase e tiamino pirofosfatase. Dois derivados mitocondriais, contendo duas es1ruturas paracristalinas flanqueiam o axonema. Esses derivados mitocondriais são conectados ao axonema por pontes, que juntamente com as estruturas paracristalinas são características sinapomórficas dos espermatozóides dos Heteroptera. Nas fases iniciais da espermiogênese pode ser observado o produto de reação da atividade enzimática para glicose-6-fosfatase no nebenkem e para cito cromo C oxidase nas cristas dos derivados mitocondriais. Nos estádios finais de diferenciação algum produto de reação da atividade enzimática para tiamino pirofosfatase é observado nas estruturas paracristalinas. Assim, podemos observar que durante a espermiogênese de Acrosternum aseadum e Nezara viridula as espermátides sofrem modificações morfofuncionais que têm a participação do sistema complexo de Golgi-retículo endoplasmático, bem como de várias fosfatases e oxidases Abstract: Phytophagous stink bugs (Hemiptera, Pentatomidae) are the main pests of economicaly important crops throughout the world. Among the several pentatomid pests of legume crops, the southem green stink bug Nezara viridula is perhaps the most imp0l1ant ones as well as the specie A. aseadum of the genus Acrosternul11. Thus, the structural and ultrastructural characterization of these insects spenl1atozoa will be velY imp0l1ant to programmes directed towards the biochemical control of insect pests and genetic manipulation of populations through sterile and semi-sterile males. The spelmiogenesis as well as the spennatozoon of Acroslernul11 aseadul11 and Nezara viridula were found to be very similar and were described together. The spenniogenesis involves nuclear elongation, chromatin condensation, acrosomal fOlmation, and flagellar development, along with fonnation of the axoneme as well as mitochondrial derivatives. During the early spennatid phase, the nucleus resembles that of a somatic cell. The sUITounding cytoplasm contained a well developed Golgi complex which was impregnated with tetroxide osmium potassium iodide on the cis Golgi network, cis cistemae and in several vesicles of the trans Golgi network. The acid phosphatase and glucose-6-phosphatase reaction products were observed mainly in the trans-most pOl1ion of the Golgi complexo The Golgi complex contributes to the formation of the acrosome. Initially, a proacrosomal granule is formed; it is attached to the nucleus and undergoes differentiation simultaneously with the nucleus and the flagellum. The nucleus undergoes a gradual chromatin condensation with an increase in its electron density. During its condensation the chromatin presents a fibrillar aspect which turns into a paracristalline arrangement and then becomes very compact and electron dense. In ear1y spennatids the centriolar adjunct could be seen located posterior to the nucleus in the region of flagellum implantation. Near the centriolar adjunct we observed an electron dense rod that presents positive labelling to antibodies against a, J3 and total tubulin, and this labelling disappears in the final stages of spermiogenesis, suggesting that this structure could be a microtubule organizing center. The spennatid axoneme contained a variety of tubular elements that persists in the spennatozoon. The axoneme has a 9+9+2 microtubular pattern that is reactive to acid phosphatase, glucose-6-phosphatase and thiamine pyrophosphatase. Two mitochondrial derivatives, containing two paraclystalline structures, flanked the axoneme. These mitochondrial derivatives are connected to the axoneme by bridges that together with the paracrystalline structures are synapomorphic characteristics of Heteropteran spermatozoa. ln the early phase of spenniogenesis the glucose-6 phosphatase reaction product was found on the N ebenkem; and cytocht.ome-C oxidase reaction product occurs on the cristae of the mitochondrial derivatives. Ln the final stages of differentiation some reaction product for thiamine was observed on the paracrystalline structures. In conclusion, it is clear that during spermiogenesis of AcroslernU111 aseadum and Nezara viridula, the spermatids undergo morphofunctional modification involving participation of the Golgi complex-endoplasmic reticulum system, as well as of several phosphatases and oxidases Mestrado Mestre em Biologia Celular

Orientador: Lúcia Elvira Alvares Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A miogênese é um processo que envolve mudanças progressivas a partir de células progenitoras localizadas nos somitos dos embriões de vertebrados. Estas células, conhecidas como mioblastos, passam por uma etapa inicial de intensa proliferação celular para, em seguida, diferenciar-se formando miócitos que se fundem para compor fibras musculares contráteis. O sucesso destas diferentes etapas depende de um complexo panorama de expressão gênica, que envolve a atividade de marcadores moleculares com funções bem estabelecidas. Dentre eles, estão marcadores associados com: 1) o comprometimento da linhagem miogênica e proliferação das células progenitoras (Pax3 e Myf-5), 2) início da diferenciação celular (MyoD, Miogenina, Miostatina), 3) diferenciação terminal e formação das fibras musculares contráteis (cadeia pesada da miosina ¿ MyHC) e 4) marcadores reguladores do ciclo celular (p21), bem como o gene endógeno GAPDH. No presente estudo utilizou-se amostras de tecido da musculatura peitoral de embriões de galinha nos estádios 8, 11, 14 e 17 do desenvolvimento embrionário e células de cultura primária de mioblastos de galinha. Dada a carência de informações sobre a expressão dos marcadores moleculares clássicos da miogênese, o objetivo deste trabalho foi estabelecer o padrão de expressão gênica da Miostatina (Mstn), a distribuição espacial e o conteúdo proteico da MSTN, importante regulador do crescimento e desenvolvimento da musculatura esquelética, e dos demais marcadores selecionados nesse estudo ao longo das diferentes etapas da miogênese esquelética. Para tanto, a atividade dos marcadores selecionados foi definida, primeiramente, por RT-PCR e, em seguida, foi feita a quantificação da expressão gênica por qRT-PCR, tanto em tecidos, modelo in vivo, quanto em células, modelo in vitro. Posteriormente, realizou-se um estudo da distribuição espacial da proteína MSTN, em tecidos e em células, bem como a análise do conteúdo proteico, em tecidos. Além disso, realizou-se uma caracterização morfológica da miogênese fetal em galinha (dias 8, 11, 14 e 17) para observar as modificações que ocorrem ao longo do desenvolvimento. Os resultados confirmaram a expressão gênica da Mstn durante todas as etapas da miogênese fetal em galinha, tanto em tecidos (dias de desenvolvimento embrionário 8, 11, 14 e 17) quanto em cultura primária de mioblastos (cinco dias de diferenciação celular). Quanto aos marcadores moleculares, no modelo in vivo, ocorreu aumento gradual do p21 em consonância com o aumento da expressão da Mstn; Pax3 apresentou indução no dia 11 e teve uma queda acentuada no dia 17; Myf-5 manteve-se constante ao longo dos dias; Myod e Miogenina apresentaram aumento da expressão no dia 11, precedendo o pico de expressão da Mstn no dia 14; MyHC aumentou sua expressão nas etapas mais avançadas do desenvolvimento, com destaque para o dia 17. Em contrapartida, no modelo in vitro, o p21 teve aumento progressivo de sua expressão ao longo dos 5 dias de cultura, em oposição à Mstn; Pax3 e Myf-5 apresentaram maior expressão nos dias 1 e 2 da cultura; Myod e Miogenina tiveram maior expressão nos primeiros dias de cultura; MyHC apresentou-se muito mais expresso nos dias 4 e 5 de cultura celular. Em tecidos, os estudos de expressão gênica corroboraram com os dados obtidos nas etapas seguintes, onde foi observado, por imuno-histoquímica, a distribuição espacial da proteína e a confirmação do conteúdo proteico da MSTN. Enquanto que em células, o resultado obtido por meio da imunocitoquímica não foi conforme o esperado, visto que as células da cultura celular não apresentaram níveis detectáveis da proteína MSTN. O último ensaio produzido neste trabalho, com co-cultura de mioblastos primários fetais com organoides de fibroblastos de galinha, revelou que podem ser os fibroblastos, presentes na co-cultura, que parecem expressar a MSTN, contudo, por ser um achado inédito, serão necessários estudos futuros para comprovar essa hipótese levantada Abstract: Myogenesis is a process that progressively evolves into the development of progenitor cells in vertebrate embryos. These cells, known as myoblasts, undergo a first stage of cell proliferation and then differentiate into myocytes that fuse together to form contractile muscle fibers. The success of these steps depends on a complex panorama of gene expression, which involves the activity of function markers with well-established functions. Among them, markers associated with: 1) the impairment of myogenic taxation and proliferation of progenitor cells (Pax3 and Myf-5), 2) onset cell differentiation (MyoD, Myogenin, Myostatin), 3) terminal differentiation and formation of fibers (MyHC), and 4) markers regulators of the cell cycle (p21), as well as the endogenous gene GAPDH. Tissue samples from the pectoral muscles of chicken embryos were used in stages 8, 11, 14 and 17 of the embryonic development and primary culture cells of chicken myoblasts. The aim of this study was to establish the gene expression pattern of Myostatin (Mstn), the spatial distribution and protein content of MSTN, an important regulator of skeletal muscle growth and development, and the lack of information on the expression of classical molecular markers of myogenesis and the other selected markers mentioned above, along the different stages of skeletal myogenesis. The activity of the selected markers was firstly defined by RT-PCR and then the quantification of the gene expression by qRT-PCR, in tissues, in vivo model, and in cells, in vitro model. Subsequently, a study of the spatial distribution of MSTN protein in tissues and cells, as well as the analysis of the protein content, was carried out in tissues. In addition, a morphological characterization of fetal myogeny in chicken (days 8, 11, 14, and 17) was performed to observe the changes occurring throughout development. The results confirmed the gene expression of Mstn during all stages of fetal chicken myogenesis in both tissues (embryonic development days 8, 11, 14 and 17) and in myoblast primary culture (five days of cell differentiation). As for the molecular markers, of the in vivo model, there was a gradual increase of p21 in consonance with the increase of Mstn expression; Pax3 presented induction on day 11 and had a sharp drop on day 17; Myf-5 remained constant throughout the days; Myod and Myogenin showed increased expression on day 11, preceding the Mstn expression peak on day 14; MyHC increased its expression in the more advanced stages of development, especially on day 17. In contrast, in the in vitro model, p21 had progressive increase of its expression during the 5 days of culture, as opposed to Mstn; Pax3 and Myf-5 showed higher expression on days 1 and 2 of the culture; Myod and Miogenina had greater expression in the first days of culture; MyHC showed much more expression on days 4 and 5 of cell culture. In tissues, gene expression studies corroborated the data obtained in the following steps, where the spatial distribution of the protein and the confirmation of the protein content of MSTN were observed by immunohistochemistry. However in cells, the result evidenced by immunocytochemistry was not as expected, since cells from the cell culture did not have detectable levels of the MSTN protein. The last assay produced in this work, using co-culture of fetal primary myoblasts with organoids of chicken fibroblasts, revealed that the presence of MSTN may be due to the fibroblasts, present in the co-culture, that seem to express MSTN. Since this is an unprecedented finding, future studies should be carried out to prove this hypothesis Mestrado Biologia Tecidual Mestra em Biologia Celular e Estrutural CNPQ 130213/2017-9

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O efeito de Maytenus llicirolia Mart ex. Reiss ("espinheira-santa") e AchiDea milleColium L. ("milfolhas") sobre a espennatogênese de camundongos albinos "Swiss" foi estudado a nfvel morfológico (microscopia de luz e eletrônica). Essas espécies são plantas medicinais, de uso popular e são utilizadas como reguladoras da fertilidade. Extratos alcoólicos de folhas de M.llicifolia fonun administrados em doses diárias de 200 mgtkg, por 20 dias, por via intraperitoneal e em doses de 800 mgtkgldia. por 30 dias, por via oral. Extrato alcoólico de flores de A.millelolium foi administrado em doses diárias de 200 mgIkg, por 20 dias, por via intraperitoneal , e extrato hidroalcoólico, em doses de 300 mgtkgldia, por 30 dias, por via oral. As alterações observadas nos testículos dos animais tratados com M.ilicifolia e com A.millefolium foram: esfoliação de células genninativas imaturas, necrose de células genninativas (constatada através de núcleos picnóticos e hipertróficos) e vacuolização de túbulos seminíferos. Essas alterações variavam em intensidade nos diferentes experimentos. Em alguns controles, também foram encontrados núcleos picnóticos e alguns túbulos vacuolizados ou com somente células de Sertoli. A nível estrutural. os testículos de animais tratados com 200 mg'kgIdia e 800 mgIkgI dia de M.llicifolia não diferiram dos controles. Entretanto, a nível ultra-estrutural for3Ill observados gotfculas lipidicas de grande tamanho nas células de Sertoli e acrossomos defonnados e dilatados nas espennátides jovens dos animais tratados com a maior dose. A maioria dos túbulos seminfferos dos animais tratados por M.i1icifolia apresentava espennatogênese nonnal, resultando na produção de espermatozóides, indicando que o seu extrato alcoólico não continha substâncias, qualitativa ou quantitativamente, capazes de inteITomper o processo espermatogênico. Os túbulos seminfferos dos animais tratados com 200 mgtkg!dia de A.millefolium, por via intraperitoneal, por 20 dias, foram os mais prejudicados. Muitos apresentavam descamação de células genninativas imaturas, que preenchiam a sua luz.. e tinham epitélio germinativo reduzido. Naqueles de animais tratados com 300 mwkg/dia do extrato (por via oral). fonun encontradas muitas células em metáfase. que podem ser decoITentes de um bloqueio no ciclo celular ou de um estimulo à proliferação celular, provocados por substâncias nela presentes. O fato dos testiculos dos animais tratados por via intraperitoneal terem sido mais afetados sugere que as substâncias responsáveis por essas ações ou estio em baixa concentração no extrato hidroalcoólico ou são degradadas dm1mte a absorção oral Abstract: The effect af Maytf'DJli Wdtolbt Mart. ex. Reiss and AcbIDea mllIetollum (Y9n'ow) was tested on the spennatogenesis of Swiss albino mice, evaluating morphological characteristics with the light gnd electron microscopes. These species are medicinal plams which have been used in popular medicine tor various cures and tor fertitity regtllator. A daily dose of 200 mg/kg of the alcoholic _.xtract of MJ1ldfoJia leaves Wasl administered intraperitonealty, for 20 days, and a daily dose of 800 rnglkg. orally, for 30 days. The alcohotic extract of A..miHefoUum flowers was daily administered aí doses of 200mglkg, intraperitoneally, for 20 daya and 30Omgrkg ofthe hydroalcoholic extract, orally, for 30 days. The alterntions observed in testes treated with M.illcifolia and A.miBefolium included immature genn ceUs, germ cell necrosis (recognised as picnotic and hypertrophic nuelei) and vacuolized seminipherous tubules. These variations were not the same in the di.fferent experiments. In some controls, were algO fO Mestrado Biologia Celular Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores: Mary Anne Heidi Dolder, Selma Candelaria Genari Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Alguns fármacos apresentam potencial quimioterápico contra neoplasias, por inibirem a proliferação celular e induzirem a morte celular. Muitos desses agentes podem apresentar efeitos citotóxicos em tecidos normais como linfopenia, devido à indução de apoptose com diminuição das células T CD4, podendo levar a implicações na resposta imune. O tamoxifeno (T AM) é um agente não esteróide antiestrógeno utilizado como quimioterápico coadjuvante no tratamento de câncer de mama. Trabalhos recentes têm demonstrado que o T AM pode causar câncer endometrial em pacientes pós-menopausa, como sério efeito colateral. O presente trabalho objetivou investigar a capacidade do T AM de induzir apoptose em linfócitos humanos cultivados in vitro. Para tanto, amostras de sangue de voluntárias jovens (grupo A= 25 a 30 anos;n=3) e idosas (grupo B= 58 a 77 anos;n=3), foram centrifugadas em gradiente de densidade de Percoll (percoll-50%) para separação de linfócitos e monócitos. Os monócitos foram excluídos por cultura dependente de adesão por 2 horas. O sobrenadante contendo linfócitos controle foram cultivados em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino por 24 e 48 horas, enquanto linfócitos, denominados tratados, receberam 20J.1M de T AM no meio de cultura. Após a cultura, as células foram: 1) contadas em hemocitômetro, sendo estipulado a porcentagem de células viáveis para o total de células analisadas, utilizando-se o método de exclusão pelo Azul Tripan; 2) incubadas com anexina-biotina, que possui alta afinidade pela fosfatidilserina, seguido de incubação com anti-biotina conjugada à fluoresceína, para marcação das células em apoptose e analisadas ao microscópio de fluorescência; 3) fixadas em formaldeído e coradas com Leishman para estudos em microscopia de luz (ML); 4) depositadas em lamínulas, fixadas em glutaraldeído seguido de pós-fixação com tetróxido de ósmio e analisadas ao microscópio eletrônico de varredura (MEV); 5) fixadas em solução de glutaraldeído, ácido pícrico e formaldeído seguido de pós-fixação com tetróxido de ósmio e analisadas ao microscópio eletrônico de transmissão (MET); 6) a análise estatística foi realizada a partir de análise de variância one-way ANOV A com p< 0,05. As culturas tratadas demonstraram menor viabilidade celular e maior índice apoptótico que seus controles. Ainda, culturas controle e tratadas de linfócitos de mulheres idosas apresentaram maior porcentagem de células em apoptose quando comparadas com linfócitos de mulheres jovens. Os estudos em ML e MET revelaram maior condensação cromatínica e redução do volume celular, e ainda, ao MET foram observados vacúolos autofágicos no citoplasma. A MEV revelou células com perda de microvilosidades e perda da morfologia arredondada após 48 horas de tratamento. Conclui-se, então que os linfócitos foram afetados pelo tratamento com o TAM em ambos os grupos, embora o grupo de mulheres idosas se mostrou mais susceptível a apoptose Abstract: Some drugs have a chemotherapic potential against neoplasms, through inhibition of proliferation and cell death induction. Many of these agents can display cytotoxic effects in normal tissues such as lymphopeny due apoptosis induction with a consequent decrease of T CD4 cells and its implications in the immune response. Tamoxifen is a synthetic non steroidal antiestrogenic drug which is currently being widely employed in the treatment of female breast cancer. Recent studies have shown that TAM can cause endometrial cancer in postmenopausal patients, considered a serious side effect. The purpose of this work was to investigate the capacity of T AM to induce apoptosis in human lymphocytes cultivated in vitro. Samples of peripheral blood were obtained from young (group A= 25-30 years 0Id;n=3) and old (group B= 58-77 years 01d;n=3) women and centrifuged in a Percoll density gradient, to separate lymphocytes and monocytes (percoll-50%). Monocytes were excluded by culturing for 2 hours. The supernatant with control lymphocytes was cultivated in RPMI containing 10% fetal bovine serum, for 24 and 48 h as controls, whereas treated lymphocytes received TAM (20JlM) added to the culture medium. After the culture, the cells were: 1) counted in a hemocytometer, and the viable cell number for each sample was obtained through an exclusion test of intact cells by using 1 % Tripan Blue and establishing the percentage of unstained, alive cells for the total of ressuspended cells; 2) incubated with annexin-biotin, which has high affinity for phosphatidilserine (PS), followed by incubation with FITC conjugated anti-biotin, to target apoptotic cells and examined by fluorescence microscopy; 3) fixed in formaldehyde and stained with Leishman and examined by light microscopy (LM); 4) placed on coverslips, where the cells were fixed, post fixed in osmium tetroxide and examined with the scanning electron microscope (SEM); 5) fixed in in glutaraldehyde, formaldehyde and picric acid, post fixed in osmium tetroxide, and examined in a transmission electron microscope (TEM); 6) statistical analysis was performed using one-way analysis of variance (ANOV A) with p< 0.05. The treated cultures showed less viable cells and more apoptotic cells than control cultures. Moreover, group B showed more apoptotic cells in comparison with group A, in both control and treated cultures. LM and TEM showed treated cells with more condensed chromatin and reduction of cell volume. In TEM some autophagic vacuoles in the cytoplasm were observed. SEM showed loss of microvilli and loss of spherical shape at 48 h, when compared with the controls. Thus, a response to TAM was observed in both groups, although group B was more susceptible to apoptosis Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Espermátides em diferentes fases de maturação e espermatozóide de Ceratitis capitata, provenientes dos testículos dos machos ou das espermatecas das fêmeas deste inseto, foram preparados segundo as técnicas usuais em microscopia eletrônica, contrastada positiva e negativamente e observados em microscópio eletrônico de transmissão. Algumas variações técnicas como a estocagem do mateiral sem prévia fixação, por 7 a 15 dias, a ¿10 GRAUS¿, em glutaraldeido a 0,25%; fixação em glutaraldeido a 3% adicionado de 2% de ácido tânico; pós-fixação em mistura de tetróxido de ósmio adicionado de 0,05M de ferricianeto de potássio ou de 0,5% de ácido- tânico; desidratação em etanol 95% contendo 2% de ácido fosfotúngstico (EPTA) sem e com contrastação por uranila e chumbo, também foram empregadas no preparo dos espécimes em estudo. As observações da espermiogênese em C. capitata mostraram que esta, como nos insetos em geral, caracteriza- se pela formação do "Nebenkern" ou complexo mitocondrial, formação do flagelo, alongamento celular, condensação do material nuclear e eliminação do citoplasma. As espermátides em fase inicial de diferenciação apresentam núcleo e cromatina com aspecto similar ao das células soma ticas e grande quantidade de mitocôndrias no citoplasma. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: Spermatids in various stages of maturation and spermatozoa of Ceratitis capitata) were obtained from the testis of males and the spermathecae of females. Routinely prepared for transmission electron microscopy) they were positively and negatively stained. A few variations of the basic techniques were also employed, namely: Maintaining spermatozoa w ithout previous fixation in a solution of 0,25% glutaraldehyde for 7 to 14 days, at ¿10 DEGREES¿; fixation in 3% glutaraldehyde to which 2% tannic acid was added; post-fixation in a mixture of 1% osmium tetroxide to which either 0,05M potassium ferricianide or 0,5% tannic acid was added; dehydration in 95%.ethanol) containing 2% phosphotungstic acid (EPTA), with or without staining of the sections. The observations on the spermatogenesis of C. capitata are quite similar to the description of this process for insects in general. It may be defined .by the following steps: .Formation of the "Nebenkern", development of the flagellum, celular elongation, nuclear condensation) and elimination of the excess cytoplasm. Spermatids iniciating their differention have a nucleus and chromatin very similar to somatic cells) as well as a large number of mitochondria dispersed in'the cytoplasm. In the next step) these mitochondria fuse to form the "Nebenkern". ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Mestrado Biologia Celular Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder, Sergio Luis Pinto da Matta Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: TA ciclosporina A (CsA) possui potentes propriedades imunossupressivas e tem sido amplamente usada na terapia de transplantes de órgãos, aumentando as taxas de sobrevivência dos enxertos, e no tratamento de algumas doenças auto-imunes. Apesar de ser um importante medicamento, diversas reações colaterais são verificadas, entre elas a toxicidade testicular, levando à infertilidade masculina. Heteropterys aphrodisiaca é uma planta com indicações de estimulante e potente afrodisíaco, que aumenta o peso corporal e testicular e o volume das células de Leydig nos testículos de ratos adultos. Assim o efeito da associação dessas drogas foi estudado em ratos Wistar em idade reprodutiva, com avaliação da morfometria, estrutura e ultra-estrutura testicular. Foram utilizados 30 ratos divididos em 5 grupos: I- controle; II- tratamento com CsA; III- concomitante uso de CsA e H. aphrodisiaca; IV- pré-tratamento com H. aphrodisiaca por 30 dias, seguido de CsA por 26 dias; V- tratamento com H. aphrodisiaca. CsA foi administrada na dose de 15 mg/kg/dia e H. aphrodisiaca na dose de 0.5 ml de infusão preparada com 25g de raízes secas/100 ml água fervente. Os tratamentos foram administrados diariamente por gavagem, durante 56 dias. Aumento do peso corporal foi observado em todos os grupos, mas os grupos II e III tiveram menor ganho de peso. O peso dos testículos e dos órgãos sexuais acessórios, assim como a proporção e o volume dos compartimentos tubular e intersticial não alteraram nos grupos tratados. Com a administração de CsA houve aumento na proporção de tecido conjuntivo e redução na proporção de células de Leydig que, além disso, eram menores e com citoplasma mais denso que as células dos animais de outros grupos tratados. Por outro lado, a infusão de H. aphrodisiaca resultou em aumento do volume nuclear das células de Leydig. Os níveis de testosterona plasmáticos, o número de células de Leydig por testículo e por grama de testículo aumentou significativamente nos animais do grupo III. CsA causou degeneração das células germinativas, vacuolização nas células de Sertoli, espermátides arredondadas anormais e atrofia das organelas envolvidas na síntese de esteróides nas células de Leydig. H. aphrodisiaca causou vacuolização nas células de Sertoli, perda do contato e espaçamento entre as células germinativas e aumento de retículo endoplasmático liso e mitocôndrias nas células de Leydig. O tratamento concomitante e sequencial com CsA e H. aphrodisiaca foi efetivo em manter a ultra-estrutura das células de Leydig. Nesses tratamentos, as alterações observadas no epitélio seminífero foram a combinação das modificações observadas em cada tratamento separadamente. Entretanto, H. aphrodisiaca exerceu um efeito protetor no epitélio germinativo, uma vez que as modificações encontradas nesses grupos foram menos severas em relação ao grupo tratado somente com CsA Abstract: Cyclosporine A (CsA) has potent immunosuppressive properties and it has markedly improved the ability of transplant patients to survive grafts and is also used in some autoimmune diseases. However, the drug has several side effects, including testicular toxicity, leading to male infertility (and temporary impotence?). Stimulant and aphrodisiac properties has been attributed to the plant, Heteropterys aphrodisiaca. Data from other experiments suggests that the root extract can increase body and testicular weight and the volume of Leydig cells in rat testis. Thus, the present work was undertaken to study the association of the drug and the medicinal herb in Wistar rats, evaluating testicular morphometry, structure and ultrastructure. Thirty adult rats were used, divided into five groups: I- control; II¿ CsA; III¿ simultaneous use of CsA and H. aphrodisiaca; IV- H. aphrodisiaca for 30 days and CsA sequentially for another 26 days; V- H. aphrodisiaca. CsA was administered at a dose of 15 mg/kg/day and/or H. aphrodisiaca at a dose of 0.5 ml of the infusion prepared with 25g of roots/100ml boiling water, daily by gavage, during 56 days. Increased body weight was observed for all groups, but the animals that received CsA for 56 days showed the smallest body weight gain. The testis and accessory sex organs weights were unchanged. The volume and volumetric proportion of seminiferous tubules and interstitial compartments did not alter in all treated groups. Morphometry showed increased connective tissue volumetric proportion and decreased Leydig cell volumetric proportion in CsA-treated rats. The Leydig cells of CsA-treated animals were smaller and more dense than other groups. On the other hand, the H. aphrodisiaca infusion resulted in an increase in Leydig cell nuclear volume. The plasma testosterone levels and number of Leydig cells per testis increased significantly in group III. Using transmission electron microscopy, it was possible to ascertain that CsA caused germ cell degeneration, Sertoli cell vacuolization, abnormal round spermatids and atrophy of the organelles involved in steroid synthesis in Leydig cells. H. aphrodisiaca caused Sertoli cell vacuolization, loss of germ cell attachment and expanded intercellular spaces between germ cells and Leydig cells with more mitochondria and smooth endoplasmic reticulum. The simultaneous and sequential treatment with H. aphrodisiaca and CsA was effective in maintaining the Leydig cell ultrastructure. In these treatments, the seminiferous epithelium alterations were a combination of the modifications observed for each isolated treatment. However it can be stated that H. aphrodisiaca had a protective effect on the testicular tissue, since less severe modifications were found for this group in relation to the rats that received only CsA Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador : Mary Anne Heidi Dolder Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O presente trabalho teve como objetivo caracterizar os aspectos ultra-estruturais da espermiogenese de Chrysomya megacephaça. Para isto empregou-se técnicas usuais de preparo e estudo de material biológico para a microscopia eletrônica. Os resultados obtidos revelam que os eventos da espermiogenese em C. megacephala são semelhantes aos descritos para outras espécies de dípteros. As espermatides passam por um processo de alongamento e perda do material nuclear e citoplasmático. Os núcleos passam ainda por uma crescente compactação cromátinica, revelada por mudanças ultra-estruturais que culminam em núcleos com a cromatina fortemente compactada nos espermatozóides. Um pequeno acrossomo de estruturas simples e aposto ao núcleo da espermátide é organizada pelo complexo de Golgi justa-nuclear. Na fomação do flagelo, observa-se que as mitocôndrias da espermatide fundem-se e originam o complexo mitocondrial que, por sua vez, divide-se em dois derivados mitocondriais. Estas estruturas associam-se lateralmente ao axonema, que é organizado a partir de um centríolo único implantado em uma depressão do envelope nuclear. O axonema na célula madura possui uma estrutura no padrão 9+9+2. Embora caracteristicamente as espermátides desenvolvam-se sincronicamente no interior dos cistos, foram observados aspectos de desenvolvimento não sincrônico das espermátides e espermatozóides aberrantes. Sugere-se que alguns fatores estressantes possam ser responsáveis pela ocorrência destas anomalias Abstract: The objective of this research was to characterize the ultrastructural aspects of the spermiogenesis of the diptera Chrysomya megacephala. The normal techniques for electronic miscroscopy were employed. The results showed that the sequence of events which occurs during spermiogenesis in C. megacephala was similar to that describe for other dipterans. The spermatids undergo a process of lengthening and loss of both cytoplasmic a nuclear material. In addition, the nucleo complex ultrastructural changes, which culminate in highly compacted chromatin in the spermatozoids. A small acrossome of simple structure is organized by the Golgi complex alongside the nucleus of the spermatid. In the formation of the flagellum, it was observed that the mitocrhondia of the spermatids undergo a process of fusion forming the mitochondrial complex, which in the turn divides into two mitochondrial derivatives. These structures connect themselves laterally to the axoneme, which is organized starting from a single centriole implanted in a depression of the nuclear envelop. In the mature cell, the axoneme has a structure with a 9+9+2 pattern. Characteristically the spermatids develop within the cysts in a synchronous manner. However, in some cysts the spermatid development ahowed non-synchronous aspects. The presenced of some aberrant spermatids and spermatozoids was also observed. It is suggested that some stress factors my have influenced the appearance of these anomalies Mestrado Biologia Celular Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: o estudo do conjunto de características estruturais, ultra-estruturais e citoquímicas das fases iniciais da espermatogênese, assim como das células presentes nos canais condutores de esperma durante um ciclo reprodutivo podem contribuir de forma significativa para o entendimento da morfologia e fisiologia da reprodução, do processo de maturação dos espermatozóides e de aspectos comportamentais e ecológicos de populações de lagartos. Com o objetivo de contribuir para essas diferentes áreas do conhecimento, o presente trabalho traz novos dados do lagarto Tropidurus itambere, sobre o ciclo reprodutivo testicular e epididimário, a espermatogênese, diferenciação das espermátides e dos espermatozóides analisados com o uso de técnicas de citoquímica estrutural e ultra-estrutural e com o uso de imunocitoquímica ultra-estrutural. Além disso, espermatozóides testiculares e espermatozóides presentes no receptáculo seminal de remeas foram observados com a utilização de lectinas, para localização de açúcares específicos. Também são caracterizados os aspectos morfológicos e histoquímicos (localização de glicoproteínas, polissacarídeos, glicosaminoglicanos ácidos) dos canais condutores de esperma em machos e fêmeas. Esses dados foram obtidos para animais durante o ciclo reprodutivo anual, capturados num fragmento de Mata Atlântica do estado de São Paulo. O ciclo reprodutivo é anual, com breve período de descontinuidade, dados muito semelhantes aos estabelecidos em outros trabalhos prévios de ecologia. A espermatogênese é mostrada pela primeira vez em lagartos desde suas fases iniciais da diferenciação celular. Algumas variações puderam ser notadas quanto à ultra-estrutura do espermatozóide deste lagarto Tropidurídeo e outros das famílias Iguanidae e Agamidae, reforçando a revisão sistemática proposta recentemente. O oviduto é constituído por três regiões distintas, das quais a mais distal é responsável pela estocagem dos espermatozóides por um curto período do ciclo anual. Foram detectados em eventos da espermatogênese, durante o ciclo anual proteínas básicas (principalmente no cone subacrosomal, centríolos da peça intermediária, corpos densos, proteínas periféricas do axonema e bainha fibrosa do flagelo), polissacarídeos (célula de Sertoli e sua organização durante os picos do ciclo reprodutivo, e na formação do complexo acrosomal), glicogênio (formação do complexo acrosomal), fosfatase ácida (em regiões claras do complexo acrosomal e em volta de espermatozóides em degeneração no período quiescente) e lipídeos (na vesícula pró-acrosomal e em vesículas espalhadas no citoplasma da célula de Leydig), áçucares específicos (durante a formação do complexo acrosomal em espermátides e em quase todas as estruturas do espermatozóide). Taís dados inexistiam para o grupo de Lacertílio_ e guardam algumas semelhanças, principalmente quanto à formação do acrosomo, com alguns anuros e aves. Foi detectada através de imunocitoquímica a presença de actina no cone subacrosomal e perforatório do complexo acrosomal, o que confirma a homologia destas organelas quanto à estrutura e função no espermatozóide de lagartos Abstract: The study of the structural, ultrastructural and cytochemical characteristics of the initial phases of spermatogenesis was undertaken, also including the cells present in the sperm throughout the reproductive cycle. This data brings significant contributions toward a better understanding of the morphology and physiology of reproduction, of the maturation process of the spermatozoa and the behavior and ecology of lizard populations. With this objective, this study brings new data on the lizard, Tropidurus itambere, its testicular and epididymal characteristics during the reproductive cycle, its spermatogenesis showing the differentiation of spermatid and spermatozoon structure and ultrastructure, as analyzed by cytochemical techniques and with ultrastructural immunocytochemistry. A comparison of testicular spermatozoa and those found in the female's seminal receptical was made using lectins to locate specific sugars. Morphological and histochemical methods located glycoproteins, polisaccharides, acid glycosaminoglycans in the sperm ducts of males and females. This data was studied throughout the reproductive cycle of animals obtained from a fragment of the Atlantic forest in the state of São Paulo. The cycle is annual with a brief descontinuous period, as previously very similar of the established by ecological studies. Spermatogenesis is shown for the first time in a lizard, including the first stages of cell differentiation. Some variations were observed for the spermatozoon of this Tropiduridae lizard in relation to the Iguanidae and Agamidae, which reinforces recent revision of their systematic positions. The oviduct is divided into three portions, the most distal one being responsible for spermatozoon storage during a short period in the annual cycle. Basic proteins were detected in specific structures during the annual cycle (especially the subacrosomic cone, centrioles in the midpiece, dense bodies, peripheral proteins of the axoneme and fibrous sheath of the flagellum). Polisacchaddes were found in the Sertoli cell, showing peak organization of this cell during the reproductive period and its disorganization in quiescence, as well as occurring during acrosomal complex formation, while glycogen was identified only in the acrosomal complex.. Acid phosphatase was verified in the clear regions of the acrosomal complex and surrounding the degenerating sperm cells of the quiescent period. Lipids are plentiful in the Leydig cells of this period and in the pro acrosomic vesicle. Specific sugars were verified during the acrosomic complex formation in spermatids and mark almost all structures in the spermatozoon. This data is new among lizards and can be compared with anurans and birds, especially for acrosome formation. Actin was detected with an immunocytochemical method in the subacrosomic cone and the perforatorium of the acrosomic complex, thus confirming their homology as to structure and function Doutorado Histologia Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Borboletas e mariposas apresentam um dos casos mais evidentes de polimorfismo espermático, com a produção de dois tipos de espermatozóides: os apirenes e os eupirenes, que diferem em morfologia e função. Estudos ultra-estruturais descreveram a morfologia e organização de ambos os tipos de espermatozóides ao longo dos tratos reprodutores masculino e feminino da borboleta Euptoieta hegesia. Os espermatozóides apirenes extratesticulares adquirem membranas concêntricas externas provenientes do rearranjo da membrana plasmática. Já os eupirenes, adquirem um complexo envoltório que sofre modificações ao longo dos tratos reprodutores e parece ser parcialmente resultante do rearranjo dos apêndices laciniados. Foram usados também métodos citoquímicos, à saber: ácido fosfotúngstico-etanólico, ácido tânico, cuprolinic blue, vermelho de rutênio, tiosemicarbazida/proteinato de prata e lectinas. Apirenes e eupirenes apresentaram, diferencialmente, proteínas e carboidratos no lúmen dos microtúbulos e nos elementos de ligação do axonema, nas membranas e principalmente nas estruturas extra-celulares. Nos espermatozóides apirenes ainda foram detectados esses componentes no capuz anterior e nas regiões paracristalinas dos derivados mitocondriais. Nos espermatozóides eupirenes, os apêndices laciniados apresentaram, principalmente, componentes protéicos, enquanto os apêndices reticulados apresentaram carboidratos. Ambos os tipos de apêndices apresentaram organização paracristalina, formada por estruturas cilíndricas. Além disso, por meio da técnica de ácido tânico, foi verificada significativa similaridade entre os envoltórios apirenes e eupirenes, indicando uma possível origem comum. Com o uso de lectinas, os apêndices laciniados e os envoltórios apirenes e eupirenes apresentaram os mesmos glicoconjugados, sugerindo que os envoltórios se originaram do rearranjo destes apêndices. O método imunocitoquímico para detecção de tubulinas mostrou que os apêndices laciniados não são compostos microtubulares. No trato reprodutor feminino foram descritas as morfologias da espermateca e dos espermatozóides apirenes e eupirenes armazenados. O epitélio espermatecal, desconhecido na literatura, apresenta morfologia similar àquela encontrada em outras ordens de insetos Abstract: Butterflies and moths present one of the most evident examples of sperm polymorphism, with the production of two types of spermatozoa: the apyrene and the eupyrene, that differ in functional and morphological characteristics. Ultrastructural studies were carried out to describe the morphology and organization of both sperm types along the male and female reproductive tracts of the butterfly Euptoieta hegesia. The extra-testicular apyrene spermatozoa acquire external concentric membranes as a result of the plasma membrane rearrangement. The eupyrene spermatozoa acquire a complex coat that is modified along the reproductive tracts and is apparently originates from the rearrangement of the lacinate appendages. Different cytochemical methods were applied: ethanol fosfotungstic acid, tannic acid, cuprolinic blue, ruthenium red, tiosemicarbazide/silver proteinate and lectins. Both sperm types presented differences in the proteins and carbohydrates found in the microtubule lumens and in the links binding the axoneme, in the cellular membranes and, principally, in the extracelullar structures. In apyrene sperm these components were detected in the anterior cap and in the paracrystalline cores of the mitochondrial derivatives. In the eupyrene sperm, the lacinate appendages were predominant1y protein in composition, while the reticular appendages seem to be composed principa11y of carbohydrates. Both appendage types presented paracrystalline organization, made up of small cylindrical structures. With the tannic acid technique, a significant similarity was verified between the coats of both sperm types, indicating a possible common origin. With t he lacinate technique, the lacinate appendages and the c oat of both sperm types were shown to contain the same glycoconjugates, suggesting that the coats are originated by reorganization of these appendages. The immunocytochemical method for tubulin detection demonstrated that the lacinate appendages are not microtubular structures. In the female reproductive tract, the morphology of the spermatheca was described as well as the apyrene and eupyrene spermatozoa, stored in this organ after mating. The morphology of the spermatheca epithelium, which had not been previously investigated for Lepidoptera, presented a somewhat similar organization to what is known for other insect Doutorado Biologia Celular Doutor em Ciências Biológicas

Orientadores : Mary Anne Heidi Dolder, Sonia Nair Bao Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A enorme diversidade morfológica dos espermatozóides tem levado a um extensivo número de estudos taxonômicos e filogenéticos feitos a partir da ultra-estrutura dessas células em diversos grupos animais. Os insetos constituem o maior e mais diverso grupo do reino animal. Sua diversidade está também expressa na morfologia de seus espermatozóides, os quais apresentam um número de variações ultra-estruturais não observado em nenhum outro grupo. Por isso a análise filogenética a partir da morfologia dessas células tem despertado o interesse também de entomologistas sistematas e muitos trabalhos têm sido produzidos em vários grupos de insetos usando esta nova fonte de caracteres. Além da alta diversidade, dados morfológicos a partir dos espermatozóides assume uma maior importância em estudos filogenéticos e taxonômicos por serem de natureza mais conservativa do que aqueles considerados tradicionais. O presente trabalho tem como objetivo fornecer informações morfológicas dos espermatozóides de algumas espécies dessa ordem. Para tanto usamos a microscopia de luz e eletrônica para descrever a estrutura e ultra-estrutura dos espermatozóides de três espécies de Trichogrammatidae, uma de Eurytomidae e duas de Scelionidae. Também fornecemos novos dados ultra-estruturais da região de transição núcleo-flagelo do espermatozóide de Apis Mellifera. Embora, o total de famílias de Hymenoptera cujos espermatozóides estão descritos ainda seja muito pequeno para se fazer uma análise filogenética, nós acreditamos que este estudo confirma a presença de uma variedade de caracteres nestas células que poderão contribuir para o. entendimento das relações evolutivas dos Hymenoptera Abstract: The almost unlimited morphological diversity of the spermatozoa has led to many taxonomic and phylogenetic studies based on the ultrastructure of these cells in various animal groups. The insects constitute the largest and most diverse group of the animal kingdom and their diversity is also very well expressed by their spermatozoa, which present ultrastructural variations not found in any other group. For this reason, a phylogenetic analysis based on the morphology of these cells has called the attention of systematic entomologists and many studies have been produced in the various insect groups, using this new source of characters. Besides their great diversity, the morphologic data obtained from spermatozoa is particularly important in phylogenetic and taxonomic studies, since in these cells their ultrastructure is more highly conserved than the morphologic characters traditionally considered. In an attempt to contribute to the understanding of hymenopteran phylogeny, the present thesis aims to fumish morphological information of the spermatozoa of some species of this order. Considering this objective, we used the light and electron microscopes to describe the sperm structure and ultrastructure ofthree species ofTrichogrammatidae, one ofEurytomidae and two ofScelionidae. We also fumish new ultrastructural data of the nucleus-flagellum transition zone of Apis mellifera spermatozoa. Although the total number of hymenopteran spermatozoa as yet described is still toa small to permit a phylogenetic study, we believe that this research demonstrates the large variety of characters found in these cells, which will surely contribute towards the understanding of evolutionary relationships ofthe Hymenoptera Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Angelo Luiz Cortelazzo Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O cádmio é considerado um elemento tóxico, pois afeta severamente a vida de muitos organismos, mesmo em baixas concentrações. Na célula, ele interage com proteínas e ácidos nucléicos e com isso, enzimas elou membranas são afetadas, interferindo em várias vias metabólicas importantes. Com o intuito de verificar os efeitos desse metal pesado na morfologia de células vegetais, foram utilizadas suspensões celulares de cana-de-açúcar e laranja, que receberam soluções de cloreto de cádmio 8f.1M durante 4 a 72h de incubação. Os materiais foram fixados para a microscopia de luz, microscopia eletrônica de transmissão e de varredura. Foram ainda retiradas amostras para dosagens de proteínas e açúcares em cada experimento. As suspensões celulares de cana apresentaram os maiores danos em conseqüência do tratamento sendo nítida a presença de duas regiões: uma denominada região A, com células que tiveram contato direto com o agente estressante. Nela foram observados núcleos picnóticos, paredes celulares lignificadas ou com má formação. Na outra região, denominada B e correspondente a células que se desenvolveram na presença do metal, foram notados vacúolos compartimentalizados e outras vesículas, núcleos mais descompactados e com aumento no número de nucléolos. Houve ainda um aumento aparente no tamanho e quantidade de mitocôndrias. O complexo de Golgi foi observado com maior freqüência e o retículo endoplasmático apresentou dilatação de suas cisternas. Na superfície das paredes celulares da região B foram notadas desfibrilações bastante evidentes à microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura, sendo ainda bem contrastadas ao microscópio eletrônico de transmissão. O tratamento com cádmio provoca alterações significativas no conteúdo de proteínas, açúcares livres e solúveis, mas não na quantidade de amido presente nas células. Essas alterações em tratamentos mais longos tendem a retomar aos valores inicialmente obtidos, indicando uma resposta das células à situação imposta. Nos tempos de tratamento e nas concentrações de cádmio utilizadas, as respostas obtidas foram mais evidentes nas células de cana-deaçúcar do que nas de laranja, tanto no que diz respeito aos danos provocados nas células, quanto às respostas das mesmas ao agente estressante Abstract: The cadmium is considered a toxic element, because it affects severely the life of many organisms, even in low concentrations. In the cell, it interacts with proteins and nucleic acids and with this characteristic, enzymes and/or membranes are affected, interfering in several important metabolic pathways. With the intention of verifying the effects of this heavy metal on the morphology of vegetable cells, cellular suspensions of sugar-cane and orange were used, which received solutions of cadmium chloride 8J.1M during 4 to 72 hours of incubation. The materiais were fixed for light microscopy, transmission electron microscopy and scanning electron microscopy. Samples were also removed samples for protein and sugars dosages in each experimento The cellular suspensions of sugar cane presented the largest damages and as a consequence of the treatment, the presence of two clearly differentiated areas: one, denominated A area, with cells that had direct contact with the stressful agent and showed picnotic nuclei, lignified or with malformed cell walls. In the other area, denominated B and corresponding to cells that grew in the presence of the metal, with compartmentalized vacuoles and other vesicles, non-compacted and on increased number of nucleoli. There was still an apparent increase in the size and amount of mitochondria, Golgi complex, and endoplasmic reticule presenting dilation of their cisterns. On the surface of the cell walls in this area, a quite evident fibrillation was noticed with light and scanning electron microscopy, also being strongly contrasted with the transmission electron microscopy. Cadmium treatments lead to significant alterations in protein content, free and soluble sugars, but not in the quantity of starch. The alterations, found in longer treatments, tend to return to the initial values, which indicates an adaptation to the culture conditions. For the treatment periods and cadmium concentrations used, the adaptation mechanisms are more evident in sugarcane cells then in orange, not only in relation to the alterations produced but also their adaptations to the stress agent Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O termo "espermiocladística" defini a utilização de características estruturais e ultra-estruturais dos espermatozóides na composição de matrizes de caracteres para estudos filogenéticos. Estudos realizados, inclusive com insetos, têm fornecido dados consistentes e úteis para este fim, pelo menos para táxons superiores. Neste sentido, propusemos para este trabalho de tese, caracterizar detalhadamente a morfologia dos espermatozóides nas tribos Meliponini, Euglossini e Bombini, buscando identificar caracteres potenciais que pudessem contribuir para o entendimento das relações filogenéticas do grupo. Para tanto, utilizamos as metodologias usuais de (1) microscopia de luz, contraste de fase e fluorescência com DAPI e (2) Microscopia Eletrônica de Transmissão, convencional e citoquímica com ácido tânico e E-PTA. Ainda, comparamos nossos dados com o descrito na literatura para a tribo Apini, para que pudéssemos compor uma matriz consistente de caracteres. Nossas análises filogenéticas, embora incipientes, sugerem (Meliponini (Euglossini (Bombini + Apini))). Entretanto, acreditamos que nossos dados devam ser associados aos dados de morfologia somática, comportamento e biologia molecular, para que as análises filogenéticas futuras sejam mais conclusivas. Este trabalho originou 2 manuscritos em fase de submissão, um já aceito para publicação e um artigo já publicado: Zama, U.. Uno-Neto, J. & Dolder, H. 2001 . Ultrastructure of spermatozoa in Plebeia (Plebeia) droryana Friese (Hymenoptera: Apidae: Meliponina). Journal of Hymenoptera Research, 10 (2): 261-270 Abstract: The term "spermiocladistics" express the use of structural and ultrastructural charcteristics to compose character matrices for phylogenetic studies. Such studies, carried out for different animais, including insects, have been shown to be consistent and useful, at least for higher taxa. Therefore, we proposed, in this thesis, to carry out a detailed ultrastructural analysis of the spermatozoa of the tribes: Melliponini, Euglossini and Bombini, in order to identify characters that could potentially contribute to the understanding of phylogenetic relationships in this group. For this study, we employed the methods: (1) light microcopy using phase contrast, DAPI fluorescence and (2) transmission electron microscopy with conventional preparations and cytochemistry (EPT A). Our data were compared with those described in the literature for the Apini tribe, so as to compose a consistent character matrix. Phylogenetic analysis of our data suggested (Meliponini (Euglossini (Bombini + Apini»). However, we believe that our data should be considered together with the data obtained with research on somatic morphology, behavior and molecular biology, in an effort to develop more consistent results. This thesis includes two manuscripts that are being submitted for publication, one was accepted and one article already published: : Zama, U., Uno-Neto, J. & Dolder, H. 2001. Ultrastructure of spermatozoa in P/ebeia (P/ebeia) droryana Friese (Hymenoptera: Apidae: Meliponina). Journal of Hymenoptera Research, 10 (2): 261-270 Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Luis Antonio Violin Dias Pereira, Lúcia Elvira Alvares Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A albumina e sua família gênica desempenham importantes funções de manutenção no organismo, não sendo alvos comuns da seleção natural. O provável envolvimento dessa molécula na reprodução de mamíferos, no entanto, parece destoar dessa premissa. Testando sua condição constitutiva, esse estudo priorizou a análise de abordagens integrativas do sistema testículo-epidídimo-ducto deferente e se propôs a realizar, em camundongos adultos C57Bl6, via experimentações cirúrgicas (orquidectomia, ligadura de túbulos eferentes, criptorquidismo e orquidopexia) e intervenções farmacológicas (flutamida e finasterida) a indução de microambientes, os quais permitiram a emersão de cenários de sinalização e da expressão de fatores-chave ao contexto da fertilidade. Tais interpretações foram mensuradas via investigação transcricional (RT-PCR e PCR quantitativo), traducional (imuno-histoquímica, morfometria e immunoblotting) e funcional (fertilização in vitro; FIV). O cenário induzido pela interferência da orquidectomia evidenciou que os eventos de síntese e secreção da albumina no epidídimo e ducto deferente são regulados pela disponibilidade de testosterona bioativa, ainda que, isoladamente, esse estímulo não seja suficiente para manutenção do padrão total de expressão gênico e proteico da albumina nas orquidectomias unilaterais (estímulo androgênico endógeno) ou nas bilaterais com reposição de cipionato de testosterona injetável (estímulo androgênico exógeno), sinalizando provável dependência de fatores luminais testiculares e/ou testosterona por ação parácrina. Outros metabólitos, além da testosterona, influenciaram na síntese e secreção de albumina, como a diidrotestosterona (cenário de modulação hormonal por finasterida), principalmente em epidídimo e ducto deferente. Houve falha no papel antagonista exercido pela flutamida, no cenário da expressão/presença da albumina. Evidenciado pelo contexto da ligadura de túbulos eferentes, sinalizou-se a dependência da albumina da presença ipsilateral de fluido luminal advindo do testículo, principalmente pela alteração da expressão/presença de albumina no segmento inicial do epidídimo. Soma-se a esse cenário de dependência, a presença de espermatozoides (ausentes no contexto do criptorquidismo) e/ou estresse térmico (hipertermia), nos quais, apesar da manutenção de estímulos androgênicos, testículo e fatores luminais, a expressão/presença de albumina mostra-se alterada em todos os órgãos analisados, sendo somente parcialmente restaurada após o retorno da espermatogênese à normalidade (orquidopexia). Ademais à orquestração dos eventos de espermatogênese, experimentos de FIV demonstraram a capacidade da albumina de transcender sua usual atribuição constitutiva, relacionando-se à interação espermatozoide-zona pelúcida (possivelmente via reação acrossômica) e operando como agente potencializador mesmo em contextos de variação androgênica. Com seu evidente papel carreador e a caracterização da dependência de sua expressão gênica e presença proteica frente aos cenários testados nessa tese, desperta-se o interesse para estudos futuros que busquem a compreensão da integração de estímulos autócrinos, parácrinos e endócrinos na espermatogênese, projetando-se uma perspectiva de uso futuro da albumina para a dispensabilidade de fármacos de ação específica no contexto da aquisição de capacidade fértil. Ademais, ao se relacionar a processos espécie-específicos, cria-se um vínculo direto entre a evolução da albumina de vertebrados e a perpetuação gênica desse grupo Abstract: Albumin and its gene family perform important maintenance functions in the body, not being common targets of natural selection. The probable involvement of this molecule in mammals reproduction, however, seems to run counter to this premise. Testing its constitutive condition, this study prioritized the analysis of integrative approaches of the testis-epididymis-vas deferens system and proposed to carry out in adult C57Bl6 mice, through surgical experiments (orchidectomy, efferent tubule ligation, cryptorchidism and orchidopexy) and pharmacological interventions (flutamide and finasteride), the induction of microenvironments, which allowed the emergence of signaling scenarios and the expression of key factors in the context of fertility. These interpretations were measured through transcriptional (RT-PCR and quantitative PCR), translational (immunohistochemistry, morphometry and immunoblotting) and functional (in vitro fertilization, IVF) investigations. The scenario induced by the orchidectomy showed that the events of albumin synthesis and secretion in the epididymis and vas deferens are regulated by the availability of bioactive testosterone, although this single stimulus is not sufficient to maintain the total pattern of gene and protein expression in unilateral orchidectomy (endogenous androgenic stimulus) or bilateral orchidectomy with replacement of injectable testosterone cypionate (exogenous androgenic stimulus), signaling a probable dependence of testicular luminal factors and/or testosterone by paracrine action. Other metabolites, in addition to testosterone, influenced the synthesis and secretion of albumin, such as dihydrotestosterone (scenario of hormonal modulation by finasteride), especially in the epididymis and vas deferens. Flutamide exerted an antagonistic role in the albumin expression/presence scenario. The albumin dependence on the ipsilateral presence of luminal fluid coming from the testis was evidenced in the context of efferent tubule ligation, mainly by the alteration of expression/presence of albumin in the initial segment of the epididymis. It is added to this scenario of dependence, the presence of spermatozoa (absent in cryptorchidism) and/or thermal stress (hyperthermia), in which, despite the maintenance of androgenic stimuli, testis and luminal factors, albumin expression/presence was altered in all analyzed organs, being only partially restored after the return of spermatogenesis to normality (orchidopexy). In addition to the orchestration of spermatogenesis events, IVF experiments demonstrated the ability of albumin to transcend its usual constitutive attribution, relating to the spermatozoa-zona pellucida interaction (possibly via acrosome reaction) and operating as a potentiating agent even in contexts of androgenic variation. With its evident carrier role and the characterization of the dependence of its gene expression and protein presence against the scenarios tested in this thesis, draws out the interest for future studies that seek the understanding of the integration of autocrine, paracrine and endocrine stimuli in spermatogenesis, to the prospect of future albumin use for the dispensability of specific drugs¿ action in the context of the acquisition of fertile capacity. In addition, when relating to species-specific processes, a direct link is created between the evolution of vertebrate albumin and the genetic perpetuation of this group Doutorado Biologia Celular Doutora em Biologia Celular e Estrutural CNPQ 140808/2014-0

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A regionalização do epidídimo de búfalos das raças Mediterrânea (Me), Murrah (Mu) e mestiços Me x Mu foi estudada entre as idades de quatro a trinta e seis meses. Os animais foram agrupados em duas faixas etárias: pré e pós-púberes e os epidídimos foram divididos em 7 sub-regiões denominadas de A a G. Cada sub-região foi analisada sob microscopia de luz e eletrônica de transmissão. A microscopia de luz inclui técnica de rotina para coloração com Hematoxilina e Eosina, histoquímica com P AS e análise morfométrica para diâmetros de túbulo e lúmen e alturas de epitélio e estereocílios. À microscopia eletrônica foram analisados os aspectos ultraestruturais dos tipos celulares do epitélio epididimário e duetos eferentes. Ao longo do epidídimo, à microscopia de luz, observou-se em ambas as faixas etárias, células Principais (P), Basais (B), Apicais (A) e leucócitos intraepiteliais (LI). Figuras mitóticas no terço apical do epitélio também estavam presentes, sendo mais numerosas nas sub-regiões B e C, principalmente em búfalos prépúberes. A análise histoquímica revelou a existência de atividade secretória a partir dos 5 meses de idade, principalmente na sub-região A, a qual contém os duetos eferentes e nestes a atividade se torna cada vez maior com o amadurecimento do animal. Através da análise morfométrica, observou-se que os búfalos em pré-puberdade já possuem bem definidas as variações dos diâmetros tubular e lurninal e das alturas de epitélio e estereoecílios, que se mostraram semelhantes ao observado nos animais pós-púberes. Os diâmetros tubular e lurninal são crescentes entre as sub-regiões A e G, enquanto as alturas de epitélio e estreocílios apresentam um comportamento contrário; mais, em ambos os aspectos morfométricos existe uma diferença significativa (p

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Este estudo investigou os efeitos da infusão de Heteropterys aphrodisiaca no músculo esquelético, tendão e osso de ratos submetidos ao treinamento de endurance. Ratos Wistar machos foram agrupados da seguinte maneira: CS-controle sedentário, HS-H. aphrodisiaca sedentário, CT-controle treinado, HT-H. aphrodisiaca treinado. O protocolo de treinamento consistiu de corrida em esteira motorizada, cinco vezes por semana, com aumento semanal de velocidade e duração. Os animais dos grupos controle receberam água, enquanto HS e HT receberam infusão de H. aphrodisiaca, diariamente, por gavagem durante 8 semanas, correspondente ao período de treinamento. O sangue foi coletado para dosagem de testosterona. O músculo extensor longo dos dedos (EDL), tendão calcanear e a tíbia foram congelados para análises histoquímicas, bioquímicas, biomecânicas e para Western Blot, ou preservados em fixador Karnovsky, sendo posteriormente processados para análises morfométricas e estereológicas utilizando microscopia de luz e eletrônica. O conteúdo de hidroxiprolina, a tensão máxima e o módulo de elasticidade aumentaram (p

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder, Mary Ann Foglio Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Cádmio (Cd) é um metal pesado associado a graves danos em vários órgãos, incluindo órgãos reprodutivos e fígado. Estudos farmacológicos indicam que Arctium lappa possue atividade hepatoprotetora, sequestradora de radicais livres e antiproliferativa. O objetivo deste trabalho foi avaliar: (1) as modificações nos túbulos seminíferos causadas por pequenas doses de Cd, (2) as propriedades antioxidantes de diferentes extratos de A. lappa, (3) a capacidade de A. lappa em atenuar os danos induzidos por cádmio no testículo, epidídimo e fígado. A capacidade sequestradora de radicais livres e quantidade de compostos fenólicos totais foram analisados nos extratos da raiz de A. lappa para determinação da capacidade antioxidante. A propriedade antiproliferativa in vitro de cada extrato foi avaliada em células tumorais. O extrato hidroetanólico apresentou alto rendimento e capacidade sequestradora de radicais livres, e juntamente com os diclorometânicos, maior teor de compostos fenólicos. Somente os extratos diclorometânicos apresentaram atividade antiproliferativa contra células tumorais. espectroscopia de massa revelou a presença dos compostos arctigenina, quercetina, ácido clorogênico e ácido caféico no extrato hidroetanólico. O extrato hidroetanólico liofilizado foi escolhido para os estudos in vivo. Para estudar os efeitos de Cd e A. lappa, ratos Wistar adultos foram distribuídos em quatro grupos: controle (C), extrato de A. lappa (Al), cádmio (Cd) e cádmio e extrato de Al (CdAl). Os animais receberam água ou extrato de Al (300 mg/Kg BW) por gavagem e dose única i.p. de salina ou 1,2 mg/kg de cloreto de cádmio. Os animais foram sacrificados após 7 e 56 dias. O Cd causou redução do peso do testículo, epidídimo e vesícula seminal, na proporção dos túbulos seminíferos (TS), no comprimento total dos TS e no diâmetro dos TS. Células germinativas degeneradas e células gigantes multinucleadas foram observadas nos TS e os danos progressivos resultaram em túbulos preenchidos apenas com células de Sertoli. Nos grupos Cd e CdAl, houve diminuição da proporção tubular e aumento da altura do epitélio no epidídimo após 56 dias. Cd causou aumento no nível plasmático de TGO e TGP após 56 dias, mas o extrato de A. lappa amenizou estes efeitos. Nenhuma alteração relevante foi observada para as transaminases hepáticas. No grupo Cd 7 dias, a proporção de hepatócitos diminuiu, a de sinusóides aumentou e o número de núcleo de hepatócito reduziu, entretanto após 56 apenas o número de núcleos de hepatócitos diminuíram. Após 7 dias, nos grupos Al e CdAl, a proporção nuclear aumentou e a citoplasmática diminuiu, sem alteração dos capilares sinusóides. Após 56 dias, nos grupos Al e CdAl, a proporção nuclear aumentou e a proporção dos capilares sinusóides reduziu. Houve aumento na densidade de núcleos nos grupos Al e CdAl. Conclui-se que doses baixas de Cd causam alterações morfológicas e morfométricas no testículo e que o Cd tem sutil limiar tóxico. Os extratos diclorometânicos apresentaram atividade antiproliferativa contra as linhagens tumorais K562, MCF-7 e 786-0. O extrato hidroetanólico apresentou alto conteúdo fenólico e atividade antioxidante, portanto foi escolhido para os estudos in vivo. O extrato de A. lappa foi ineficaz na proteção do testículo e epidídimo contra danos induzidos pelo Cd, porém protegeu o tecido hepático. Abstract: Cadmium (Cd) is a heavy metal associated with severe damage in various organs, including male reproductive organs and liver. Arctium lappa is widely used in popular medicine for treating hypertension, gout, hepatitis and other inflammatory disorders. Pharmacological studies indicated that A. lappa roots have hepatoprotective, free radical scavenging and antiproliferative activities. The objectives of this work were evaluate: (1) histomorphometrically the threshold modifications of seminiferous tubules caused by single acute low doses of Cd, (2) antioxidant properties of different A. lappa extracts to choose the best one for "in vivo" study, (3) the ability of A. lappa to attenuate cadmium-induced damage to the testis, epididymis and liver of male rats. Dichloromethanic, ethanolic, aqueous extracts, hydroethanolic and total aqueous extract of A. lappa roots were investigated regarding radical scavenging activity and the total phenolic content. The extracts were tested for their antiproliferative activity in vitro using human cancer cell lines. The higher radical scavenging activity and yield were found in the hydroethanolic extract. Higher phenolic contents were found in the dichloromethanic and hydroethanolic extracts. Only the dichloromethanic extracts exhibited activity against cancer cell lines. Highresolution electrospray ionization mass spectroscopy for the hydroethanolic extract demonstrated the presence of: arctigenin, quercetin, chlorogenic acid and caffeic acid. The hydroalcoholic lyophilized extract was chosen for the experiments in vivo. To study the association of Cd and A. lappa, adult Wistar rats were assigned to four groups: control (C), A.lappa extract (Al), cadmium (Cd) and cadmium plus A. lappa (CdAl). The animals received water or A. lappa hydroethanolic extract (300 mg/Kg BW) by gavage and i.p. injections of saline or 1.2 mg/Kg BW of cadmium chloride. The animals were sacrificed after 7 and 56 days of treatment. The Cd caused reduction in testis, epididymis and seminal vesicle weights, seminiferous tubule (ST) proportion, total length of ST and ST diameter. Degenerated germ cells and multinucleated aggregates were observed in ST and progressive damage resulted in tubules lined only with Sertoli cells. There was a decreased in tubular proportion and increased epithelial height in epididymis after 56 days. Cd caused an increase in plasma GOT and GPT levels after 56 days, but A. lappa extract improved these levels. No relevant alteration was observed in liver transaminase levels. After 7 days, the Cd group showed decrease in hepatocyte proportion and increase sinusoid capillary proportion, also the nuclear density decrease. However, after 56 days, only the hepatocyte nuclear density decreased. In Al and CdAl groups, after 7 days, the hepatocyte nuclear proportion increased and the cytoplasmic decreased, with no alteration in capillary sinusoid proportion. In Al and CdAl groups, after 56 days, hepatocyte nuclear proportion increased and the sinusoid capillary proportion decreased. Also, an increase of hepatocyte nuclear density was observed in Al and CdAl groups. This study revealed that low doses of Cd cause progressive morphological and morphometrical alterations on rat testis and that Cd has a subtle toxic threshold. The dichloromethanic extracts showed antiproliferative activity against K562, MCF-7 and 786-0 human cancer cell lines. The hydroethanolic extract showed higher free radical scavenger activity and higher phenolic content, and was chosen as the best extract for the "in vivo" studies. A. lappa hydroethanolic extract was ineffective in protecting the testis and epididymis against Cd-induced damage, however effectively protected liver tissue. Doutorado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O guaraná (Paullinia cupana Mart. var. Sorbilis) é uma planta originária do Brasil encontrada na região da Bacia Amazônica. Estudos prévios vêm demonstrando a propriedade antioxidante do extrato de guaraná e sua capacidade neutralizar radicais livres. Essa planta é tradicionalmente usada com fins terapêuticos diversos e recentemente tem-se investigado sua capacidade de atuar no tratamento de patologias relacionadas ao desequilíbrio da atividade oxidante da célula. O cádmio é um metal pesado com propriedades tóxicas aos organismos e a contaminação por este elemento torna-se preocupante devido ao seu grande efeito cumulativo e meia vida biológica longa. Esse metal tem sido considerado um importante poluente ambiental, sendo as suas principais fontes de exposição o despejo industrial, a poluição atmosférica e o tabaco. Sabe-se que a natureza tóxica do cádmio é, em parte, devida à sua ação oxidante no organismo, estimulando a produção de radicais livres que causam danos celulares. Os testículos são particularmente vulneráveis aos efeitos tóxicos desse metal, sendo que neste órgão a propriedade cumulativa do cádmio parece ser acentuada. Portanto, os testículos atuam como um importante modelo experimental para estudos referentes aos efeitos tóxicos do cádmio e à possíveis alternativas terapêuticas para os efeitos adversos deste metal. Baseando-se nestas informações, o presente estudo avaliou o potencial do guaraná em atenuar os danos causados pelo cádmio no testículo de ratos Wistar adultos. Foram desenvolvidos dois modelos experimentais diferentes: 1o- administração preventiva do guaraná durante 56 dias antes da exposição ao cádmio; 2o- administração do guaraná durante 56 dias após a exposição ao cádmio. Para análises comparativas, também foram montados um grupo tratado somente com cádmio e um grupo tratado somente com guaraná. As amostras de testículo foram coletadas e submetidas a análises histológicas, morfométricas e ultra-estruturais, e os resultados obtidos estão expostos em dois artigos científicos Abstract: Guaraná (Paullinia cupana Mart. var. Sorbilis) is a Brazilian plant, found in the Amazon basin. Previous studies have demonstrated the antioxidant properties of guaraná and its potential to neutralize free radicals. This plant is traditionally used for several therapeutic purposes and, recently, has been investigated to ascertain the potential of guaraná to counterbalance cellular oxidative disorders. Cadmium is a toxic heavy metal, and the contamination by this element is more harmful due to its long biological half-life, and therefore its accumulation in the organism. This metal is considered important for environmental pollution, in which exposition occurs through industrial wastes, atmospheric pollution and tobacco smoking. Cadmium is known to be toxic partly due to its oxidative effect in the organism, stimulating the production of free radicals that cause cellular damage. The testicles are particularly vulnerable to the toxic effects of this metal and this organ has higher cumulative properties. Therefore the testicles are an important experimental model for studies of the toxic effects of cadmium and the possible therapeutic alternatives for the adverse effects of this metal. Based on this information, the present study evaluated the potential of guaraná to attenuate the harm caused by cadmium in adult rat testicles. Two experimental models were developed: 1) Preventive administration of guaraná during 56 days before exposition to cadmium; 2) Administration of guaraná during 56 days after exposition to cadmium. For comparative analysis, a group was also treated only with cadmium or only with guaraná. Testicle samples were collected and submitted to histological, morphometrical and ultrastructural analysis and the results are presented in the form of two scientific articles. The results show that guaraná is beneficial in both experimental models, contributing to the maintenance of testicular morphology Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Mary Anne Heidi Dolder, Sebastiâo Roberto Taboga Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A Ciclosporina A (CsA) é um imunossupressor amplamente utilizado no tratamento pós-transplante de órgãos e contra doenças auto-imunes. Entretanto, diversos efeitos colaterais estão relacionados ao tratamento com esta droga, dentre eles nefrotoxicidade, hepatoxicidade, tremor, hipertensão, hiperlipidemia, hipercalcemia, hipertricose e hiperplasia gengival. Além destes, danos à reprodução masculina como redução na produção de testosterona e disfunção testicular são extensivamente documentados. Heteropterys aphrodisiaca é uma planta arbustiva típica do Cerrado brasileiro. É conhecida como nó-de-cachorro, sendo utilizada popularmente como tônica e afrodisíaca. Estudos anteriores confirmam a eficiência da infusão de H. aphrodisiaca contra os efeitos colaterais a CsA nos testículos. Visto isso, o objetivo do presente trabalho foi determinar os possíveis efeitos colaterais da CsA na próstata ventral de ratos Wistar e verificar se a infusão de H. aphrodisiaca seria eficiente em minimizá-los. Trinta ratos Wistar adultos (90 dias) foram divididos em cinco grupos (n=6 em cada): Grupo I (controle): tratado com água; grupo II: tratado com CsA; grupo III: tratado com infusão de H. aphrodisiaca; grupo IV: tratamento simultâneo de CsA e H. aphrodisiaca; e grupo V: tratamento com CsA e H. aphrodisiaca em dias alternados. A CsA foi administrada na dose de 15 mg/kg/dia e a infusão de nó-de-cachorro no volume de 0,5 ml por animal (infusão preparada com 25 g de raiz seca e moída em 100 ml de água fervida). Todos os tratamentos foram realizados diariamente, durante 56 dias. Após este período os animais foram pesados e eutanasiados. Testículo, epidídimo, glândula vesicular, glândula de coagulação e próstata ventral foram coletados e pesados. A próstata ventral foi dividida em três porções. Uma foi fixada em Karnovsky e processada para inclusão em metacrilato; este material foi utilizado para análises morfológicas, morfométricas e estereológicas do tecido. A segunda porção, também fixada com Karnovsky, foi processada para inclusão em Epon; este material foi utilizado para realização de análises em microscopia eletrônica de transmissão. Por fim, a terceira porção foi fixada em Metacarn e incluída em parafina para realização de imunohistoquímica para detecção de receptor de andrógeno e técnica para detecção de apoptose (TUNEL). As análises morfológicas, morfométricas, estereológicas e ultraestruturais mostraram que o tratamento com a infusão de H. aphrodisiaca não causou nenhuma alteração na próstata ventral. Por outro lado, o tratamento com CsA causou severos danos a este tecido como redução nos volumes de lumen, epitélio, estroma muscular e não muscular, além de atrofia do epitélio. A análise ultraestrutural mostrou que nas células do epitélio atrofiado havia redução das organelas relacionadas à secreção de proteínas (retículo endoplasmático rugoso e complexo de Golgi), o que provavelmente leva à diminuição de sua atividade secretora. O tratamento conjunto de CsA e H. aphrodisiaca aparentemente reduziu os danos causados na próstata, o que foi evidenciado pela normalização nos parâmetros analisados que haviam sido prejudicados pela administração somente da CsA. Nenhuma alteração entre os grupos experimentais foi observada no padrão de marcação imunohistoquímica para receptores de andrógeno e no índice apoptótico. Os resultados obtidos mostram que o tratamento com CsA causa danos na estrutura prostática que provavelmente refletem em danos funcionais ao tecido. Além disso, foi confirmada a ação protetora da infusão de H. aphrodisiaca contra os efeitos colaterais da CsA na próstata ventral de ratos Wistar Abstract: Cyclosporin A (CsA) is an immunosuppressive drug widely used in the post-operative treatment after organ transplants and against auto-immune diseases. However, various side effects have been associated with the use of this drug, including nephrotoxicity, hepatotoxicity, tremors, hypertension, hyperlipidemy, hypercalcicity, hypertrichosia and hyperplasticity of the gums. Besides these, damage to the male reproductive system, such as diminished testosterone production and testicular dysfunction, have been extensively documented. Heteropterys aphrodisiaca is a bush, typical of the Brazilian "Cerrado" region. It is known as "nó-de-cachorro" and used in traditional medicine as a tonic and an aphrodisiac drink. Previous studies confirm the efficiency of H. aphrodisiaca against the side effects of CsA in rat testicles. As a consequence, this research was undertaken with the aim of determining the possible collateral effects of CsA in the ventral prostate of Wistar rats and to verify whether the infusion of H. aphrodisiaca would be efficient to diminish the possible collateral effects of CsA in this organ. Thirty adult Wistar rats (90 days old) were divided into five groups (n=6 in each). Group I (control) was treated with water, Group II with CsA, group III received the H. aphrodisiaca infusion, group IV was treated simultaneously with CsA and H. aphrodisiaca infusion and group V received CsA or H. aphrodisiaca infusion on alternate days. CsA was administered in the dose of 15 mg/kg/day and the infusion in a volume of 0.5 ml per animal (infusion prepared with 25 g of dry ground roots in 100 ml of boiling water). All treatments were given daily for 56 days. After this period the rats were weighed and euthanized. Testis, epididymis, vesicular gland, coagulating gland and the ventral prostate were collected and weighed. The ventral prostate was divided into three portions. One was fixed in Karnovsky fixative and processed for inclusion in methacrylate. This portion was used for morphological, morphometrical and stereological analysis of the tissue. A second portion, fixed in the same manner, was processed for inclusion in Epon and analyzed with the transmission electron microscope. The last portion was fixed in Metacarn and included in paraffin to be used for immunohistochemistry of the androgen receptor and the TUNEL technique for apoptosis. The morphological, morphometrical, stereological and ultrastructural analyses showed that the H. aphrodisiaca infusion did not cause any alteration of the prostatic tissue. On the other hand, CsA treatment resulted in severe damage to the tissue, reducing the lumen, epithelium, muscular and non-muscular stroma. Atrophied epithelium was observed after CsA administration. Ultrastructural analysis showed that the atrophied epithelium had reduced organelles involved in protein secretion (rough endoplasmic reticulum and Golgi complex) which probably causes decreased secretory activity of the cells. The simultaneous treatment of CsA and H. aphrodisiaca apparently reduced the prostatic damage, since these were less damaged when compared to the prostate of animals that received only CsA. No alteration was found in the pattern of immunohistochemical labeling for androgen receptors and the apoptotic index, for all experimental groups. The results showed that CsA treatment caused structural damage to the prostate which probably reflected functional damage to the organ. The protective action of the H. aphrodisiaca infusion against the collateral effects of CsA was also confirmed for this organ. Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Submitted by Alison Souza (alisonsouza@ufgd.edu.br) on 2020-03-05T12:17:07Z No. of bitstreams: 1 RamaoSouzadeDeusJunior.pdf: 3137075 bytes, checksum: 621240794c2d4c902ffa314007215590 (MD5) Made available in DSpace on 2020-03-05T12:17:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RamaoSouzadeDeusJunior.pdf: 3137075 bytes, checksum: 621240794c2d4c902ffa314007215590 (MD5) Previous issue date: 2019-09-27 Os esteroides anabólicos androgênicos (EAAs) são drogas sintéticas derivadas da testosterona com efeitos anabólicos relacionados ao aumento da massa muscular. Estudos sobre os efeitos de anabolizantes sobre a reprodução masculina são escassos, porém, já é de conhecimento que o uso dos EAAs pode estar relacionado a diminuição do volume, função e quantidade das células de Leydig, células responsáveis pela produção de testosterona, associado a diminuição de LH. Assim, este estudo teve como finalidade avaliar a toxicidade dos EAAs decanoato de nandrolona (DN), estanozolol e oximetolona sobre parâmetros reprodutivos de ratos Wistar machos adultos (avaliação imediata) e depois reavaliar as possíveis alterações após repouso, sem tratamento por 70 dias (avaliação tardia). Foram utilizados 236 ratos, sendo 136 machos e 100 fêmeas (75 dias). Na avaliação imediata, os animais foram divididos em três tratamentos diferentes de acordo com as medicações estudadas. E dentro de cada grupo de EAA eles foram divididos em três grupos novamente (n=7), o grupo controle, o tratado com menor dose (5 mg/Kg) e o tratado com menor dose (10 mg/Kg). Os animais tratados com estanozolol e decanoato de nandrolona receberam injeções intramusculares semanais diluídas em salina e extrato vegetal respectivamente por 70 dias e os tratados com oximetolona receberam gavagem diluída em salina, por 40 dias. Após a eutanásia, nesses animais foram realizadas pesagem corporal final e de órgãos, técnicas de qualidade espermática, avaliação histopatológica do testículo, morfometria testicular, dinâmica do ciclo da espermatogênese e dosagens hormonais. Ainda, 10 ratos e 100 fêmeas foram utilizados para inseminação artificial intrauterina. Na avaliação tardia, foram utilizados 63 ratos divididos em 9 grupos (n=7), da mesma forma que no primeiro experimento, para reavaliar se alguns parâmetros analisados tiveram recuperação. Na avaliação imediata tanto o peso de órgãos quanto todos os parâmetros de qualidade espermática (morfologia, motilidade, contagem, produção diária espermática e tempo de trânsito espermático) apresentaram alterações nos EAAs estudados. Na avaliação tardia, a oximetolona apresentou lenta recuperação, o estanozolol teve uma recuperação parcial dos efeitos deletérios e o DN apresentou aumento de alterações. Na primeira avaliação da dosagem hormonal, a oximetolona e o estanozolol apresentaram diminuição das concentrações de FSH, LH e testosterona intratesticular, enquanto o DN não apresentou alterações nesta avaliação. Porém, na avaliação tardia, na oximetolona as concentrações dos hormônios se normalizaram, porém houve redução da concentração de progesterona; o estanozolol reestabeleceu seus hormônios a normalidade e o DN apresentou reduções nas concentrações de LH, testosterona e testosterona intratesticular. Na inseminação artificial intrauterina, os valores mostram que houve uma redução em ambos os grupos tratados com DN e estanozolol no potencial fértil e aumento das perdas pré-implantação e no grupo tratado com DN com a maior dose foi, ainda, demonstrado aumento nas perdas pósimplantação. Sendo assim, este trabalho demonstrou que os EAAs podem causar problemas ligados a qualidade espermática e desregulagem hormonal o que pode levar a redução da fertilidade masculina, e ainda, que a duração dos efeitos pode variar de acordo com o tipo de anabolizante utilizado, sendo o DN considerado neste estudo o mais perigoso, por seus efeitos piorarem após o repouso de 70 dias de tratamento. Anabolic-Androgenic Steroids (AAS) are synthetic medicines derived from testosterone that produce anabolic-related increase in muscle mass. Studies that evaluate the effects of anabolic steroids on male reproduction are scarce; never the less it was observed that the use of AAS diminished Leydig cell function, which are the cells responsible for testosterone production, number and volume of these cells, and are associated with low LH levels. Thus, this study investigated the impact of using the AAS: nandrolone decanoate (ND), stanozolol and oxymetholone on reproductive parameters of adult male Wistar rats. For this experiment, 173 Wistar rats, 73 males and 100 females, of reproductive age were used (75 days old). The rats (n = 7) were divided into 9 groups, divided into 2 groups according to the dose of the AAS administered (5 mg/Kg and 10 mg/Kg). The groups nandrolone decanoate and stanozolol received the treatment during 10 weeks by a weekly injection with dilution in vegetable oil or saline solution, respectively, while those with oxymetholone diluted in saline solution were treated by gavage for 40 days. These animals were assessed in relation to final body and reproductive organs weights, sperm quality and hormonal dosages. Also, 10 rats and 100 females were used for artificial intrauterine insemination. In the second experiment, 63 rats were divided into 9 groups (n = 7), in the same way as the first experiment, to assess whether recovery had occurred in any of the parameters analyzed. The parameters analyzed included both organ weight and all sperm quality parameters (morphology, motility, count sperm, daily sperm production and sperm transit time though epididymis) and showed alterations in the AAS studied. In the late evaluation, oxymetholone showed a slower recovery, stanozolol had a partial recovery from deleterious effects and ND showed an increase in alterations. In the first evaluation of hormonal dosage, oxymetholone and stanozolol showed decreased FSH, LH and intratesticular testosterone levels while ND did not alter the hormone levels. However, in the late evaluation, in oxymetholone the hormone levels normalized but there was a reduction in the progesterone level, while stanozolol restored hormones to normality and ND showed reductions in LH, testosterone and intratesticular testosterone levels. In intrauterine artificial insemination the values show that there was a reduction of the fertility potential of both groups treated with ND and stanozolol, as well as increased pre-implantation losses. In the group treated with the higher dose of ND, an increase in post-implantation losses was also demonstrated. Thus, this study demonstrated that the use of AAS caused decreased sperm quality and may cause problems related to male infertility. Recuperation time varies according to the type of anabolic steroid used, where ND was considered the most dangerous, according to this study because the deleterious effects worsened 70 days after the end of the treatment.

Orientadores: Mary Anne Heidi Dolder, Grasiela Dias de Campos Severi Aguiar Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Baccharis dracunculifolia D. C. (Asteraceae) é uma planta originária do sudeste da América Latina, conhecida por alecrim do campo e utilizada pela população na medicina tradicional cujos seus metabólitos secundários são coletados pela abelha Appis mellifera para a produção de própolis verde brasileira, que é de grande importância para as indústrias alimentícia e farmacêutica, uma vez que exibe propriedades anticâncer, antibacteriana, anti-inflamatória e antiulcerosa, entre outros. Alguns compostos fenólicos estão presentes em sua composição e têm sido descritos, por exemplo, os efeitos adversos dos fitoestrógenos sobre a saúde humana reprodutiva. A falta de uma supervisão de um profissional sobre a dose e o período de ingestão pode expor os consumidores de produtos naturais a riscos. Por outro lado, a infertilidade masculina é um problema comum e complexo e neste sentido, muitas pesquisas nessa área são realizadas para e em muitos casos, as causas são desconhecidas. Há descrição na literatura de muitos produtos naturais que são usados na medicina popular para o tratamento de disfunções sexuais masculinas. Sendo um desses produtos a própolis que parece induzir aumento do nível de testosterona, é capaz de aumentar a produção de espermatozoides e interferir na morfologia do segmento inicial da cabeça do epidídimo. Por outro lado, a dispersão de agrotóxicos no ambiente tem sido associada ao aumento na frequência de distúrbios na saúde, inclusive na fertilidade. A ametrina é um exemplo desses agrotóxicos, que seu efeito na reprodução demonstrou modificações intersticiais testiculares evidentes, com decréscimo no número de células de Leydig e no número de espermatozoides. Como o herbicida afeta negativamente parâmetros reprodutivos, seria interessante avaliar ação da própolis na possível reversão dessas alterações. Portanto, o objetivo dessa tese foi avaliar os testículos de ratos Wistar sobre o efeito protetor da própolis sobre os danos caudados pela ametrina em animais adultos; o efeito da própolis em animais expostos, desde o desmame até a fase adulta de reprodução; o efeito da própolis da geração F1 machos, de fêmeas prenhas expostas durante a gestação. Em todos os resultados, foi observado alterações nos resultados. E como conclusão, nos animais adultos, pode-se inferir que tanto a ametrina quanto a própolis alteraram a fisiologia testicular reduzindo a PDE e os níveis de testosterona séricos. Quando usadas juntas, o efeito foi mais grave pois houve redução do nível de testosterona e indução de peroxidação lipídica, evidenciando que a própolis não teve um efeito protetor ao dano causado ao tecido testicular pelo agroquímico. Nos animais expostos após o desmame, a própolis afetou o desenvolvimento dos órgãos reprodutivos masculinos, prejudicando a fertilidade masculina durante a vida adulta. Portanto, o presente estudo indica que a ingestão de própolis (6mg/kg/dia) pode representar um risco para a reprodução masculina, afetando a esteroidogênese e a PDE de ratos. E na exposição intrauterina, mostramos pela primeira vez uma ligação entre os macrófagos estimulados e a deterioração celular de Leydig causada pelo estresse oxidativo e destaca a possível implicação da Art-C nesse processo Abstract: Baccharis dracunculifolia D. C. (Asteraceae) is native of Southeast Latin America, known as "alecrin do campo" and used in traditional medicine by people whose secondary metabolites are collected by Appis mellifera bees for the production of Brazilian green propolis, which is of great importance for food and pharmaceutical industries, as it displays among others anticancer, antibacterial, anti-inflammatory and anti-ulcer properties. Some phenolic compounds are present in their composition and have been described, for example, adverse effects of estrogens on the reproductive human health. The lack of professional supervision on the dose and time of ingestion may expose consumers to risks of natural products and the aim of this trial was to investigate the effect of Brazilian green propolis on the production of sperm and number of spermatozoa in the epididymis and morphology the epididymis. Male infertility is a common and complex problem and in this regard, much research has been is conducted since, in many cases, the causes are unknown. There are descriptions in the literature of many natural products that are used in folk medicine for the treatment of male sexual dysfunction. One such product is propolis, which appears to induce increased testosterone levels, is capable of increasing sperm production and interfering with the morphology of the initial epididymis head segment. On the other hand, the spread of pesticides in the environment has been associated with increased frequency of health disturbances, including fertility. Amethrin is an example of such a pesticide that has caused evident testicular interstitial modifications, with a decrease in Leydig cell number and lower sperm count. As the herbicide negatively affects reproductive parameters, it would be interesting to evaluate whether propolis could influence a possible reversal of these changes. Therefore, the objective of this thesis was to evaluate the testicles of Wistar rats as to the protective effect of propolis in relation to damage caused by amethrin in adult animals; the effect of propolis on exposed animals, from weaning to a reproductive adult; the effect on male F1 offspring of pregnant females exposed to propolis during pregnancy. In all experiments, changes of the germinative tissues were observed. And as a conclusion, in adult animals, both amethrin and propolis altered testicular physiology resulting in reduced PDE and serum testosterone levels. When used together, the effect was more severe, as there was a reduction in testosterone level and induction of lipid peroxidation, demonstrating that propolis did not have a protective effect on the damage caused to the testicular tissue by the agrochemical. In animals exposed after weaning, propolis affected the development of male reproductive organs, impairing male fertility during adulthood. Therefore, the present study indicates that propolis intake (6mg / kg / day) may pose a risk to male reproduction, affecting rat steroidogenesis and PDE. In relation to intrauterine exposure, we show for the first time a link between stimulated macrophages and Leydig cell deterioration that is caused by oxidative stress and highlights the possible implication in this process of Artepellin C, a component of propolis Doutorado Biologia Tecidual Doutora em Biologia Celular e Estrutural CNPQ 141438/2018-5 FAPESP 2016/18202-0

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os esteroides anabólicos androgênicos (EAAs) são drogas sintéticas derivadas da testosterona com efeitos anabólicos relacionados ao aumento da massa muscular. Estudos sobre os efeitos de anabolizantes sobre a reprodução masculina são escassos, porém, já é de conhecimento que o uso dos EAAs pode estar relacionado a diminuição do volume, função e quantidade das células de Leydig, células responsáveis pela produção de testosterona, associado a diminuição de LH. Assim, este estudo teve como finalidade avaliar a toxicidade dos EAAs decanoato de nandrolona (DN), estanozolol e oximetolona sobre parâmetros reprodutivos de ratos Wistar machos adultos (avaliação imediata) e depois reavaliar as possíveis alterações após repouso, sem tratamento por 70 dias (avaliação tardia). Foram utilizados 236 ratos, sendo 136 machos e 100 fêmeas (75 dias). Na avaliação imediata, os animais foram divididos em três tratamentos diferentes de acordo com as medicações estudadas. E dentro de cada grupo de EAA eles foram divididos em três grupos novamente (n=7), o grupo controle, o tratado com menor dose (5 mg/Kg) e o tratado com menor dose (10 mg/Kg). Os animais tratados com estanozolol e decanoato de nandrolona receberam injeções intramusculares semanais diluídas em salina e extrato vegetal respectivamente por 70 dias e os tratados com oximetolona receberam gavagem diluída em salina, por 40 dias. Após a eutanásia, nesses animais foram realizadas pesagem corporal final e de órgãos, técnicas de qualidade espermática, avaliação histopatológica do testículo, morfometria testicular, dinâmica do ciclo da espermatogênese e dosagens hormonais. Ainda, 10 ratos e 100 fêmeas foram utilizados para inseminação artificial intrauterina. Na avaliação tardia, foram utilizados 63 ratos divididos em 9 grupos (n=7), da mesma forma que no primeiro experimento, para reavaliar se alguns parâmetros analisados tiveram recuperação. Na avaliação imediata tanto o peso de órgãos quanto todos os parâmetros de qualidade espermática (morfologia, motilidade, contagem, produção diária espermática e tempo de trânsito espermático) apresentaram alterações nos EAAs estudados. Na avaliação tardia, a oximetolona apresentou lenta recuperação, o estanozolol teve uma recuperação parcial dos efeitos deletérios e o DN apresentou aumento de alterações. Na primeira avaliação da dosagem hormonal, a oximetolona e o estanozolol apresentaram diminuição das concentrações de FSH, LH e testosterona intratesticular, enquanto o DN não apresentou alterações nesta avaliação. Porém, na avaliação tardia, na oximetolona as concentrações dos hormônios se normalizaram, porém houve redução da concentração de progesterona; o estanozolol reestabeleceu seus hormônios a normalidade e o DN apresentou reduções nas concentrações de LH, testosterona e testosterona intratesticular. Na inseminação artificial intrauterina, os valores mostram que houve uma redução em ambos os grupos tratados com DN e estanozolol no potencial fértil e aumento das perdas pré-implantação e no grupo tratado com DN com a maior dose foi, ainda, demonstrado aumento nas perdas pós-implantação. Sendo assim, este trabalho demonstrou que os EAAs podem causar problemas ligados a qualidade espermática e desregulagem hormonal o que pode levar a redução da fertilidade masculina, e ainda, que a duração dos efeitos pode variar de acordo com o tipo de anabolizante utilizado, sendo o DN considerado neste estudo o mais perigoso, por seus efeitos piorarem após o repouso de 70 dias de tratamento Abstract: Anabolic-Androgenic Steroids (AAS) are synthetic medicines derived from testosterone that produce anabolic-related increase in muscle mass. Studies that evaluate the effects of anabolic steroids on male reproduction are scarce; never the less it was observed that the use of AAS diminished Leydig cell function, which are the cells responsible for testosterone production, number and volume of these cells, and are associated with low LH levels. Thus, this study investigated the impact of using the AAS: nandrolone decanoate (ND), stanozolol and oxymetholone on reproductive parameters of adult male Wistar rats. For this experiment, 173 Wistar rats, 73 males and 100 females, of reproductive age were used (75 days old). The rats (n = 7) were divided into 9 groups, divided into 2 groups according to the dose of the AAS administered (5 mg/Kg and 10 mg/Kg). The groups nandrolone decanoate and stanozolol received the treatment during 10 weeks by a weekly injection with dilution in vegetable oil or saline solution, respectively, while those with oxymetholone diluted in saline solution were treated by gavage for 40 days. These animals were assessed in relation to final body and reproductive organs weights, sperm quality and hormonal dosages. Also, 10 rats and 100 females were used for artificial intrauterine insemination. In the second experiment, 63 rats were divided into 9 groups (n = 7), in the same way as the first experiment, to assess whether recovery had occurred in any of the parameters analyzed. The parameters analyzed included both organ weight and all sperm quality parameters (morphology, motility, count sperm, daily sperm production and sperm transit time though epididymis) and showed alterations in the AAS studied. In the late evaluation, oxymetholone showed a slower recovery, stanozolol had a partial recovery from deleterious effects and ND showed an increase in alterations. In the first evaluation of hormonal dosage, oxymetholone and stanozolol showed decreased FSH, LH and intratesticular testosterone levels while ND did not alter the hormone levels. However, in the late evaluation, in oxymetholone the hormone levels normalized but there was a reduction in the progesterone level, while stanozolol restored hormones to normality and ND showed reductions in LH, testosterone and intratesticular testosterone levels. In intrauterine artificial insemination the values show that there was a reduction of the fertility potential of both groups treated with ND and stanozolol, as well as increased pre-implantation losses. In the group treated with the higher dose of ND, an increase in post-implantation losses was also demonstrated. Thus, this study demonstrated that the use of AAS caused decreased sperm quality and may cause problems related to male infertility. Recuperation time varies according to the type of anabolic steroid used, where ND was considered the most dangerous, according to this study because the deleterious effects worsened 70 days after the end of the treatment Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural CAPES

Orientador: Rejane Maira Góes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Dietas hiperlipídicas e exposição a desreguladores endócrinos (EDC) são dois fatores ambientais aos quais a população está exposta e que afetam negativamente o desenvolvimento e a manutenção da próstata. O consumo de elevado teor lipídico afeta a homeostase dos hormônios esteroides sexuais, alterando a histofisiologia da próstata e aumentando o risco de adenocarcinoma prostático. Sabe-se que a ação dos lipídios na próstata é variável, depende da quantidade e também do tipo de lipídio ingerido, e está longe de estar bem compreendida. O di-n-butil ftalato é um EDC envolvido na desregulação do desenvolvimento do aparelho genital masculino quando administrado durante o período fetal, comprometendo a formação dos órgãos andrógeno-dependentes. Porém, seu impacto sobre o desenvolvimento e as consequências para a histofisiologia prostática ainda são poucos conhecidos. Nesse contexto, esse estudo investigou se os componentes lipídicos (óleo de milho) da dieta materna podem (1) levar à programação do desenvolvimento da próstata do gerbilo da Mongólia e (2) interferir nos efeitos causados nessa glândula pela exposição gestacional ao di-n-butil ftalato, e também analisou (3) os efeitos do consumo de elevado teor de lipídios saturados (dieta enriquecida com banha), do desmame até a idade adulta, sobre a histofisiologia prostática. Para tanto, foram utilizados lobos ventrais prostáticos de gerbilos adultos (16 semanas de idade) nascidos de mães controle (C) ou expostas, do 8º ao 23º dia gestacional, ao óleo de milho (CO) ou ao di-n-butil ftalato (DBP), bem como de animais alimentados com dieta contendo elevado teor de lipídios saturados, do desmame até a idade adulta (D). Os dados obtidos indicam que a ingestão materna de óleo de milho durante a gestação não alterou o peso corporal e os depósitos de gorduras da prole, porém aumentou os níveis séricos de colesterol não-HDL e 17beta-estradiol. A análise histopatológica revelou a presença de hiperplasia reativa e PIN na próstata dos animais CO, associada ao aumento da atividade proliferativa e expressão de AR e ER? e à ativação da via de sinalização da AKT. A exposição gestacional a altas doses de di-n-butil ftalato não alterou os parâmetros metabólicos, a histofisiologia e as vias de sinalização celular na próstata dos animais DBP. Contudo, essa exposição promoveu tumorigênese. O consumo de dieta rica em lipídios saturados, do desmame até a idade adulta, induziu obesidade, causou hipercolesterolemia, alterou a sinalização de AR, AKT e TNF-alfa e induziu a proliferação das células estromais na próstata, favorecendo o surgimento de desordens inflamatórias, pré-malignas e malignas. A partir desses resultados, conclui-se que o consumo materno de óleo de milho leva à programação do desenvolvimento da próstata do gerbilo, induzindo aumento do 17beta-estradiol circulante e lesões inflamatórias e proliferativas na idade adulta. Seu uso como veículo diluidor em estudos de toxicologia reprodutiva, portanto, deve ser evitado. Esse óleo também mascara os efeitos da exposição gestacional ao di-n-butil ftalato, à exceção da promoção do adenocarcinoma prostático. O consumo de dieta rica em lipídios saturados a partir do desmame também prejudica a saúde prostática, favorecendo o desenvolvimento de lesões proliferativas e câncer no início da idade adulta Abstract: A high-fat diet and exposure to endocrine-disrupting chemicals (EDC) are two environmental factors to which the world population is exposed and which negatively affect prostate development and maintenance. The consumption of a high-lipid content diet affects the homeostasis of sex steroid hormones, altering prostate histophysiology and increasing the risk of prostate adenocarcinoma. It is known that lipid action on the prostate is variable, depending on the quantity and also the type of lipid ingested, and is far from being well understood. Dibutyl phthalate is an EDC involved in the deregulation of the development of the male reproductive tract when administered during the fetal period, impairing the formation of androgen-dependent organs. Nevertheless, its impact on development and consequences for prostate histophysiology are still little known. In this context, the present study investigated whether the lipid components (corn oil) of the maternal diet may (1) lead to developmental programming of the Mongolian gerbil prostate and (2) interfere with the effects caused in this gland by gestational exposure to dibutyl phthalate, and also analyzed (3) the effects of high-saturated lipid intake (diet enriched with lard), from weaning to adulthood, on prostate histophysiology. For this investigation, we used ventral prostatic lobes from adult gerbils (16 weeks old) born from mothers control (C) or those exposed, from gestational day 8 to 23, to corn oil (CO) or dibutyl phthalate (DBP), as well as from gerbils fed a diet with a high-saturated fat content, from weaning to adulthood (D). Data obtained indicate that the maternal intake of corn oil during gestation did not alter the body weight and fat deposits of offspring in adulthood. However, it did increase the serum levels of non-HDL cholesterol and 17beta-estradiol. Histopathological analysis revealed the presence of reactive hyperplasia and PIN in the prostate of the CO animals, associated with enhanced proliferative activity, and AR and ER? expression, and with an activation of the AKT signaling pathway. Exposure to high doses of dibutyl phthalate did not change the metabolic parameters, histophysiology and cell signaling pathways in the prostate of the DBP animals. Nevertheless, such exposure promoted tumorigenesis. The intake of a diet rich in saturated lipids, from weaning to adulthood, induced obesity, caused hypercholesterolemia, altered AR, AKT and TNF-alpha signaling and induced proliferation of stromal cells in the prostate of D animals, favoring the development of inflammatory, premalignant and malignant disorders. In conclusion, maternal intake of corn oil leads to developmental programming of the gerbil prostate, inducing an enhancement of circulating 17beta-estradiol and inflammatory and proliferative lesions in adult life. Its use as a dilutor vehicle in reproductive toxicology research should therefore be avoided. This vegetable oil also masks the effects of gestational exposure to dibutyl phthalate, except in relation to the promotion of prostate adenocarcinoma. High-saturated lipid intake from weaning is harmful to prostate health, favoring the onset of proliferative lesions and carcinoma at the beginning of adult life Doutorado Biologia Celular Doutora em Biologia Celular e Estrutural CNPQ 147426/2014-6 FAPESP 2014/03300-8 CAPES

Orientador: Wilma De Grava Kempinas Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A obesidade está afetando crianças e adolescentes em diversos países. Tem sido relatado que as disfunções no perfil lipídico estão associadas com a obesidade, o estilo de vida inapropriado e o sedentarismo. A rosuvastatina é um medicamento de última geração que diminui os níveis séricos colesterol e triglicérides. O ácido ascórbico é um importante composto antioxidante que é essencial para a fertilidade. Os objetivos do estudo foram investigar os parâmetros reprodutivos e a fertilidade das gerações F0 e F1 de ratos expostos à rosuvastatina e avaliar o papel do ácido ascórbico na prevenção desses efeitos adversos. Ratos machos pré-puberes foram distribuídos em seis grupos experimentais que receberam solução salina 0,9% (veículo), 3 ou 10 mg/Kg/dia de rosuvastatina, 150 mg/dia de ácido ascórbico, ou 3 ou 10 mg/Kg/dia de rosuvastatina co-administrada com 150 mg/dia de ácido ascórbico por gavagem do dia pós-natal (DPN) 23 até o DPN 53. Os ratos (n=10/grupo) foram eutanasiados no DPN 53 para avaliação dos efeitos reprodutivos imediatos. Os demais ratos (n=10/grupo) foram mantidos até a maturidade sexual (DPN 100) quando o comportamento sexual e a fertilidade dos machos foram avaliadas. Os ratos foram acasalados com mais de uma fêmea para obtenção da sua prole masculina e feminina. No DPN 110, os animais controle e tratados (n=10/grupo) foram eutanasiados e os parâmetros reprodutivos foram avaliados. A prole feminina foi avaliada na puberdade e na maturidade sexual, e a prole masculina foi estudada na vida adulta em relação aos parâmetros reprodutivos. Os grupos expostos à rosuvastatina mostraram atraso na instalação da puberdade, depleção androgênica e danos na morfologia testicular e epididimária na puberdade. Além disso, esses grupos apresentaram menor qualidade espermática, menores concentrações de testosterona, menor marcação para os receptores androgênicos nucleares nas células de Sertoli nos estágios IX-XIII, aumento na frequência da morte de células germinativas e maior estresse oxidativo na maturidade sexual. A prole masculina dos grupos tratados com a rosuvastatina exibiram aumento da fragmentação do DNA, depleção androgênica, aumento na taxa de morte de células germinativas e prejuízo para a histoarquitetura epididimária. A prole feminina dos pais que foram expostos ou co-expostos à maior dose da estatina apresentou menor número de corpos lúteos na puberdade. Na maturidade sexual, as fêmeas do grupo cujos pais foram expostos à dose de 3 mg de rosuvastatina demonstraram menor área do epitélio luminal uterino. A co-administração de ácido ascórbico para ratos machos pré-púberes diminuiu o dano reprodutivo nas gerações F0 e F1 promovidos pelo tratamento com a rosuvastatina. Em resumo, a exposição pré-puberal à rosuvastatina afetou a reprodução nas gerações F0 e F1, provavelmente devido a depleção androgênica, aumento no estresse oxidativo, presença de maiores danos no DNA espermático e as possíveis alterações epigenéticas no espermatozoide dos pais. Entretanto, o ácido ascórbico foi capaz de estimular a esteroidogênese, reduzir o estresse oxidativo e melhorar a capacidade antioxidante, além de proteger, pelo menos parcialmente, o espermatozoide dos pais de possíveis alterações epigenéticas, diminuindo dessa forma, os danos reprodutivos promovidos nas gerações F0 e F1 pelo tratamento com a rosuvastatina Abstract: Obesity is affecting children and adolescents in several countries. It is known that dysfunctions on lipid profile are related to obesity, inappropriate lifestyle and sedentary habits. Rosuvastatin is a first-line therapy medication that decreases serum cholesterol and triglycerides levels. Ascorbic acid is an important antioxidant compound that is essential for fertility and sperm integrity. The study aimed to investigate the reproductive parameters and fertility of generations F0 e F1 of male rats exposed to rosuvastatin and evaluate the role of ascorbic acid preventing these adverse effects. Pre-pubertal male rats were distributed into six experimental groups that received saline solution 0.9% (vehicle) , 3 or 10 mg/Kg/day of rosuvastatin, 150 mg/day of ascorbic acid, or 3 or 10 mg/Kg/day of rosuvastatin co-administered with 150 mg/day of ascorbic acid by gavage from post-natal day (PND) 23 until PND 53. Male rats (n=10/group) were euthanized on PND 53 to assess the short-term reproductive effects of rosuvastatin exposure and the possible preventive role of ascorbic acid in reproduction. The remaining rats (n=10/group) were maintained until sexual maturity (PND 100) when sexual behavior test and fertility were evaluated. Males were mated with an additional non-treated female rat to obtain their male and female offspring. On PND 110, the control and treated males (n=10/group) were euthanized and the reproductive parameters were assessed. Female offspring were evaluated at puberty and adulthood, and male offspring were evaluated on sexual maturity in relation to their reproductive parameters. Rosuvastatin-treated groups showed delayed puberty installation, androgen depletion and impairment on testicular and epididymal morphology at puberty. Additionally, they showed lower sperm quality, decreased testosterone concentrations, weaker androgen receptors nuclear staining in Sertoli cells at stages IX-XIII, increased germ cell death and augmented oxidative stress at adulthood. Male offspring from rosuvastatin-exposed groups showed increased sperm DNA fragmentation, androgen depletion, an augmented rate of germ cell death and impairment on the epididymal structure. Female offspring whose fathers were exposed or co-exposed to the higher dose of statin showed a lower number of corpora lutea during puberty. On sexual maturity, females from the group whose fathers were exposed to 3 mg showed lower uterine luminal epithelium area. Ascorbic acid co-administered to pre-pubertal male rats ameliorated the reproductive damage in the F0 and F1 generation promoted by rosuvastatin exposure. In summary, pre-pubertal exposure to rosuvastatin impaired the reproduction in the F0 and F1 generation, probably due to the androgen depletion, increased oxidative stress, augmented sperm DNA damage and the possible epigenetic changes in paternal sperm. On the other hand, ascorbic acid was able to stimulate steroidogenesis, reduce oxidative stress, and improve antioxidant status, besides to protect, at least partially, paternal sperm from the possible epigenetic changes, thus alleviating the reproductive damage in the F0 and F1 generation promoted by rosuvastatin exposure Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural FAPESP 2013/22495-1 CAPES

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Compostos naturais são amplamente utilizados pela população devidos suas ricas propriedades terapêuticas. A própolis verde brasileira é um composto natural de consistência viscosa produzida pela abelha Apis mellifera a partir de uma mistura de resinas, gomas e bálsamos exsudados por diversos órgãos vegetais. O composto é amplamente utilizado pela população e demonstra inúmeras propriedades farmacológicas. Recentemente, as investigações sobre a associação entre várias doenças e exposições ambientais e/ou ocupacionais a agrotóxicos aumentaram substancialmente. A Ametrina é um dos herbicidas mais utilizados no mundo, provavelmente devido ao excelente desempenho dos efeitos seletivos sobre as plantas daninhas. Porém pouco se sabe sobre seu efeito em parâmetros reprodutivos. Dessa forma, o presente estudo propôs avaliar, através de análises morfométricas, estereológicas, ultraestruturais, hormonais, cromatográficas e bioquímicas, o efeito do herbicida ametrina e da própolis verde na próstata de ratos Wistar com idade de 90 ou 146 dias. As análises de UHPLC-MS (cromatografia ¿ espectrometria) possibilitaram a identificação do Ácido Cumárico, Pinobanksina, Dihidrocanferida, Ácido 3-prenil-4-(2-metilpropioniloxi) Cinâmico, Canferida e Artepelin como componentes químicos da própolis utilizada no experimento. Apesar do tratamento com própolis ter mostrado efeito antioxidante em apenas algumas das análises bioquímicas, o tratamento usando própolis verde e/ou Ametrina ocasionou claros danos morfológicos e ultraestruturais ao tecido prostático, ressaltando que não houve proteção da própolis em relação à exposição à Ametrina. Mais estudos devem ser realizados para se elucidar as vias moleculares pelas quais acontecem tais danos Abstract: Natural compounds are widely employed due to their rich therapeutic properties. Brazilian green propolis is a naturally occurring compound with a viscous consistency produced by the Apis mellifera honeybee, using a blend of resins, gums and balms exuded by plant organs. The compound is widely used and demonstrates numerous pharmacological properties. Recently, investigations into the association between various diseases and environmental and/or occupational exposures to pesticides have increased substantially. Ametryn is one of the most widely used herbicides in the world, probably due to the excellent performance of its selective effect on weeds. However, little is known about its effect on reproductive parameters. Thus, the present study proposed to evaluate, through morphometric, stereological, ultrastructural, hormonal, chromatographic and biochemical analyzes, the effect of the herbicide Ametryn and green propolis on the prostate Wistar rats with ages 90 or 120 days old. The analysis of UHPLC-MS (chromatography ¿ spectrometry) identified the presence of Coumaric Acid, Pinobanksin, Dihydrokaempferol, 3-Prenyl-4- (2-methylpropionyloxy) Cinnamic Acid, Kaempferol and Artepelin as chemical components of the propolis used in the experiment. Although the propolis treatment has shown an antioxidant effect, the treatment with green propolis and / or ametrine clearly caused morphological and ultrastructural damages to the prostatic tissue, emphasizing that propolis did not protect the tissue in relation to Ametryn exposure. Further studies are necessary to elucidate the molecular pathways through which such damage occurs Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural FAPESP 2017/18201-0 ; 2016/18201-0 CAPES

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O cádmio é conhecido pelos seus efeitos genotóxicos e espermiotóxicos, sendo um dos poluentes ambientais e industriais mais tóxicos. Considerando essas informações, o desenvolvimento de terapias naturais para diminuir os danos que esse metal pode causar é considerado altamente pertinente. Ilex paraguariensis, (St. Hil) conhecida como erva mate, tem sido utilizada na medicina tradicional e sua infusão apresenta propriedades hepatoprotetoras, hipoglicêmica, antiinflamatórias, dentre outras. Estes efeitos foram atribuídos aos compostos fenólicos presentes nesta planta. Nós hipotetizamos que a infusão da erva mate poderia minimizar o estresse oxidativo, modulando a defesa antioxidante enzimática. Para testar esta hipótese, foram realizados dois experimentos, um de curta duração (15 dias) e outro de longa duração (56 dias). O experimento de curta duração consistiu em: C-15. controle (água), M-15. erva mate, Cd-15. cádmio, CdM-15. cadmio seguido de erva mate e MCd-15. erva mate durante 15 dias seguido de cádmio no último dia. O experimento a longo prazo empregou grupos muito semelhantes, mantidos durante 56 dias, incluindo: C-56. controle (água), M-56. erva-mate, Cd-56 cádmio, MCd-56 cádmio seguido de erva-mate. Uma dose única de cloreto de cádmio (1,2 mg / kg de peso corporal) foi injetada i.p. em ratos adultos (grupos Cd-15, MCd-15, CdM-15, Cd-56, MCd-56). A erva-mate usada nesta pesquisa foi a erva comercial (110mg de erva-mate / 1000mL de água). Cada animal recebeu diariamente 0,5 mL de água (grupos C-15, Cd-15, C-56, Cd-56) ou infusão (grupos M-15, MCd-15, CdM-15, M-56, MCd -56). Após o tratamento, os animais foram anestesiados com xilazina e cetamina (5: 80mg / kg). Os testículos foram removidos, pesados, fixados e rotineiramente processados para microscopia de luz e eletrônica. O testículo esquerdo e o epidídimo foram congelados (-20 ° C) para o cálculo da produção espermática diária (DSP) e o número de espermatozóides no epidídimo e o trânsito espermático, respectivamente. Analisamos danos oxidativos lipídicos atráves da dosagem de MDA e as defesas antioxidantes nos testículos (SOD e CAT), bem como a dosagem de cádmio nos testículos. A análise histopatológica mostrou claramente danos induzidos pelo cádmio, tais como danos nas células germinativas. Diferenciação celular e desenvolvimento de espermatozóides não foram observados na maioria dos testículos deste grupo. O cádmio afetou a taxa de produção espermática e DSP durante os tratamentos. O cádmio diminuiu a espermatogênese e estimulou as atividades antioxidantes através do aumento de enzimas SOD e CAT, provavelmente devido à indução de uma resposta adaptativa, no modo de manutenção e / ou aumento das atividades fisiológicas. Concluimos que a ingestão de infusão de Ilex paraguariensis durante 15 dias é apenas parcialmente eficiente na proteção dos testículos contra os danos induzidos por cádmio. E a integridade do testículo foi parcialmente preservada no grupo tratado com infusão de cádmio e Ilex paraguariensis durante 56 dias, sugerindo um efeito protetor da planta sobre o parênquima testicular. Em contrapartida, os grupos que receberam apenas infusão da erva-mate, em ambos tratamentos (15 e 56 dias), não apresentaram alterações negativas em relação a dinâmica e integridade testicular, e em alguns parâmetros analisados, foi observado aumento da espermatogêneses e maior produção de enzimas antioxidantes, sugerindo melhora substancial. Mostrando não haver correlação entre o consumo da erva e danos testisculares Abstract: Cadmium is known for its genotoxic and spermiotoxic effects and is one of the most toxic environmental and industrial pollutants. Considering these characteristics, the development of natural therapies to diminish the damage it can cause is highly pertinent. Ilex paraguariensis (St. Hil), known as yerba mate, has been used in traditional medicine and its infusion exhibits hepatoprotective, antirheumatic, and anti-inflammatory properties. These effects have been attributed to the phenolic compounds present in this plant. We hypothesized that yerba mate infusion could minimize oxidative stress, modulating enzymatic antioxidant defense. To test this hypotesis, two experiments were performed. The short-term experiment (15 days) consisted in the groups (n=5): C-15. control (water), M-15. yerba mate, Cd-15. cadmium, CdM-15. cadmium followed by yerba mate and MCd-15. mate during 15 days followed by cadmium on the last experimental day. The long term experiment employed similar groups maintained for 56 days, including: C-56. control (water), M-56. yerba mate, Cd-56 cadmium, MCd-56. cadmium followed by yerba mate. A single dose of cadmium chloride (1.2 mg/kg BW) was injected i.p. in adult rats (groups Cd-15, MCd-15, CdM-15, Cd-56, MCd-56). The yerba mate used in this research was commercial tea (110mg yerba mate/1000mL water). Each animal received, daily, 0.5mL of either water (groups C-15, Cd-15, C-56, Cd-56) or infusion (groups M-15, MCd-15, CdM-15, M-56, MCd-56). After the treatment, animals were anesthetized with Xylazine and Ketamine (5:80mg/kg). Testicles were removed, weighed, fixed and routinely processed for light and electron microscopy. The left testis and epididymis were frozen (-20°C) for the calculation of daily sperm production (DSP), the number of sperm within the epididymis and sperm transit, respectively. We analyzed lipid oxidative damage and antioxidant defense in testes tissue and cadmium acumulation in this tissue. Histopatological analysis clearly showed damage induced by cadmium, such as defective germ cells. Cell differentiation and spermatozoa development were not observed in some more strongly affected testicles. Cadmium affects DSP and sperm production rate over a period of time. Cadmium affected spermatogenesis and stimulated the antioxidant activities probably due to an adaptive response, in an effort to maintain and/or increase physiological activities. Ilex paraguariensis infusion ingestion during 15-days is only partially efficient in protecting the testicles from cadmium induced damage. Testis integrity was partially preserved in the group treated with both cadmium and Ilex paraguariensis infusion during 56 days, suggesting a protective effect of the plant on the testicular parenchyma. On the other hand, groups that received only mate, in both experiments, testicular dynamics and integrity were not altered, and substantial improvement was observed in some parameters analyzed, such as spermatogenesis and antioxidant enzime production. Therefore, no harmful correlations could be drawn associated between the use of plant infusion and testicle structure Mestrado Biologia Celular FAPESP 2016/18201-0; 67657788/2015 CAPES

Orientadores: Mary Anne Heidi Dolder, Adelina Aparecida Francisca Ferreira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O gênero Tropidurus compreende atualmente 30 espécies de lagartos ovíparos que ocorrem na América do Sul cis-Andina, apresentando variações no ciclo reprodutivo categorizados como contínuo, sazonal e descontínuo. Considerando essas variações reprodutivas, o objetivo foi avaliar a aptidão reprodutiva de quatro espécies de Tropidurus do grupo torquatus com ampla distribuição geográfica e elevada representatividade nas coleções zoológicas do Brasil. Um total de 276 indivíduos machos divididos em 65 populações e 201 fêmeas com 43 populações das espécies Tropidurus torquatus, T. hispidus, T. itambere e T. oreadicus foram analisadas. Amostras de testículo, ducto epididimal e ovário foram incluídas em resina plástica e preparadas para análise em microscopia de luz. Os parâmetros da aptidão reprodutiva incluíram o comprimento na maturidade sexual, tamanho de ninhada, presença ou ausência de espermatozoides, ovos e folículos. Nos machos, as células germinativas foram morfologicamente semelhantes, porém a produção de espermatozoides variou ao longo do tempo com maior continuidade para as espécies T. torquatus e T. hispidus, e sazonal para T. itambere e T. oreadicus. O ducto epididimal apresentou hipertrofia do epitélio e atividade secretora relacionadas com a espermiação e regressão nos túbulos seminíferos. O comprimento na maturidade sexual variou no seu tamanho mínimo entre as populações e biomas. Nas fêmeas, o ovário apresentou apenas uma cama germinativa com oogônias e oócitos primários associados ao estroma. O desenvolvimento folicular foi bastante conservado no aspecto morfoestrutural, com duas fases: uma pré-vitelogênica e outra vitelogênica. Durante a maturação folicular foi observado maior duração da conecção entre a ponte intercelular e o oocito na vitelogênese, além de uma organização distinta do alvéolo cortical nas quatros espécies de Tropidurus. A atresia, folículos pós-ovulatórios e corpo lúteo, foram detalhadas também pela primeira vez para as espécies Tropidurus torquatus, T. itambere e T. oreadicus. A aptidão reprodutiva foi sazonal para T. hispidus e T. itambere, porém mais extensa para T. torquatus e T. oreadicus, com a duração de oito meses. O número de cama germinativa, ocorrência de corpo lúteo e atresia sugerem controle intríseco de cada uma dessas espécies no tamanho de ninhada e folículos viáveis para reprodução Abstract: The Tropidurus genus currently comprises 30 oviparous lizards that occupy South American cis-Andina continent, presenting variations in the reproductive cycle characterized as continuous, seasonal and non-continuos. Considering the reproductive variations, the aim was to evaluate the reproductive aptitude of four Tropidurus species of torquatus group, with wide distribution and high representative specimens in the zoological collections in Brazil. A total of 276 male individuals in 65 populations and 201 females in 43 populations of the species: Tropidurus torquatus, T. hispidus, T. itambere and T. oreadicus were evaluated. Samples of testicular, epididymal duct and ovary were included in plastic resin and prepared for analysis under light microscopy. Reproductive aptitude parameters included the minimum size at sexual maturity, clutch size, presence or absence of free spermatozoa, eggs and mature follicles. Males presented conserved germinative cells in morphology, however the spermatozoa production varied in time with continuity for T. torquatus and T. hispidus and seasonal for T. itambere and T. oreadicus. The epididymal duct showed epithelial hypertrophy and secretory activity related to the spermiation and regression in the seminiferous tubules. Sexual maturity varied in the minumum size among populations and biomes. Females presented the ovary with one germinative bed with oogonia and primary oocytes associated with stroma. Follicular development was conserved in morphostructural aspects, with two phases: previtellogenic and vitellogenic phases. During follicular maturation was observed longer duration of the connection between the intercellular bridge and the oocytes in vitellogenesis, besides a distinct organization of the cortical alveoli in four Tropidurus species. The atresia, post-ovulatory follicles and corpus luteum, were also detailed for the first time for Tropidurus torquatus, T. itambere and T. oreadicus. The reproductive aptitude was seasonal for T. hispidus and T. itambere, but extended for T. torquatus and T. oreadicus, with a duration of eighteen months. Germinal bed number, occurrence of corpus luteum and atresia suggest intrisic control of each of these species in clutch size and viable follicles for reproduction Doutorado Biologia Celular Doutora em Biologia Celular e Estrutural CNPQ 140818/2015-4 CAPES

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A isotretinoína é a substância mais usada no tratamento de acne persistente, representando esperança de cura da doença. O tratamento sistêmico é indicado para casos severos e resistentes a outros tratamentos ou com recidivas frequentes. Uma vez que o intestino é o sítio de absorção de medicamentos e o fígado o local de seu metabolismo, torna-se interessante observar o resultado de um tratamento com isotretinoína nestes órgãos. O objetivo deste trabalho foi investigar o uso de três doses diferentes de isotretinoína no fígado, intestino delgado e no perfil bioquímico de enzimas ligadas à função hepática e de estresse oxidativo. 36 ratos machos foram separados em 6 grupos: água; óleo de soja; 1 mg/kg de isotretinoína; 2 grupos recebendo 5mg/kg de isotretinoína, sendo que um deles permaneceu outros 30 dias sem tratamento; 10mg/kg de isotretinoína. O veículo foi o óleo de soja e a solução foi ofertada por gavagem diária. Após 60 dias de experimentação, os ratos foram submetidos à eutanásia e as porções desejadas coletadas e processadas com rotina usual para análise na microscopia de luz e eletrônica. Após outros 30 dias o grupo com tratamento interrompido foi submetido ao mesmo procedimento. No fígado não encontramos alterações estruturais associadas a 1mg/kg da droga, mas elevação nos índices lipídicos, bem semelhantes às já descritas na literatura, apenas no grupo com 10mg/kg. A ultraestrutura mostrou resposta ao tratamento com indícios de maior atividade celular de forma dose dependente com aumento da frequência de mitocôndria e maior área de retículo endoplasmático rugoso. No perfil sérico e enzimático tecidual, notamos que 10mg/kg causou mais alterações com elevação dos níveis de HDL e VLDL. Jejuno e íleo mostraram-se como os mais sensíveis ao tratamento. As células caliciformes sofreram alterações em frequência nas três porções e independente da dose. Notamos que 5 mg/kg trouxe uma tendência a aumento da célula AB+PAS no íleo e redução no jejuno e duodeno, enquanto com a célula PAS+ o inverso foi notado. Essa alteração pode modificar a modulação da microbiota e pH na região, sendo necessários outros testes que viessem a elucidar o resultado para o organismo. Com relação a espessura da parede do órgão, o que poderia indicar uma tendência a desenvolvimento tecidual, vimos que duodeno não sofre alteração, jejuno tem uma tendência a aumento e íleo também. Considerando o grupo mantido após interrupção da droga, houve uma redução da parede do jejuno e um aumento constante no íleo. Interessante foi observar que 1mg/kg, a dose mais recomendada em tratamentos com o princípio ativo, não foi suficiente para alterações pronunciadas. Com o grupo 10mg/kg, notamos redução da área de mucosa ocupada por vilos e criptas no duodeno, que é a área mais sensível nessa dose. Observamos que o organismo mostrou um novo padrão em resposta ao tratamento proposto, o que traz uma nova perspectiva com relação ao princípio ativo. Os resultados desta tese indicam ser interessante o uso de técnicas que viessem a elucidar o possivel efeito que as alterações das células caliciformes podem trazer principalmente ao órgão Abstract: Isotretinoin is the substance most commonly used to treat persistent acne and it represents a hope to cure the disease. Systemic treatment is indicated for severe cases and those resistant to other treatments or having frequent recurrences. Since the drug absorbed in the intestine and metabolized in the liver, it is interesting to note the result in these organs of an isotretinoin treatment. The objective of this study was to investigate the use of three different doses of isotretinoin in the liver, small intestine and biochemical profile of enzymes linked to liver function and oxidative stress. 36 male rats were separated into 6 groups: water; soybean oil; 1mg/kg of isotretinoin; Two groups received 5mg/kg of isotretinoin, one of which remained another 30 days without treatment; 10mg/kg of isotretinoin. The vehicle was soybean oil and the solution was offered daily by gavage. After 60 days of trial, the mice were euthanized and the desired portions were collected and processed with the usual routine for analysis in light microscopy and electronic transmission one. The group that was maintained another 30 days after the treatment was subjected to the same procedure. Regarding the liver we did not find structural changes associated with 1mg/kg of the drug, but an increase in lipid levels similar to those described in the literature was observed in the group receiving 10mg/kg. The ultrastructural analysis showed increasing, dose dependent activity of the cells, with more frequent mitochondria and greater granular endoplasmic reticulum area. Regarding the serum and tissue enzyme profile, we noted that 10mg/kg group had increased elevation of HDL and VLDL levels. Jejunum and ileum structural features showed a greater sensibility to the treatment. Goblet cells changed their frequency in the three intestinal portions, independently of the isotrentinoin dose. The 5mg/kg group had a tendency to increase the AB+PAS+ cell in the ileum but they are reduced in the duodenum and jejunum, while the contrary was found for PAS+ cells. This change can modify the microflora and pH of the region, requiring further tests to elucidate this condition. Body wall thickness, which could indicate a tendency for tissue development, remained unchanged in the duodenum, while the jejunum and ileum had a tendency to increase their thickness. The group that was maintained for a month after drug discontinuation, reduced the wall thickness of the jejunum but a continued increase of the ileum wall was found. It was interesting to note that 1mg/kg, the recommended dose for treatments with the active ingredient was not sufficient to produce pronounced changes. With 10mg/kg the mucosal area occupied by villi and crypts in the duodenum was reduced, this being the most sensitive area at the highest dose. Our study showed a new standard of response to the treatments proposed, which brings a new perspective regarding the active ingredient of this medicine. The results of this thesis suggest the use of new techniques that could elucidate the effect of the changed pattern of goblet cells regarding organ function Doutorado Biologia Tecidual Doutora em Biologia Celular e Estrutural CAPES CNPQ 140073/2015-9 FAPESP

Orientador: Adelina Aparecida Francisca Ferreira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A contagem de células germinativas, para machos e fêmeas, é uma forma de análise bastante eficiente para determinar períodos favoráveis à reprodução. No intuito de descobrir sobre as possíveis variações na produção de gametas de uma população de Rhinella schneideri (Anura, Bufonidae) em uma área urbana do município de Cuiabá, MT, Brasil, fizemos a caracterização das células germinativas e as contamos mensalmente em dois períodos (2007/2008 e 2012/2013). Machos exibem seis categorias de células germinativas, sendo elas espermatogônias primárias e secundárias, espermatócitos primários e secundários, espermátides e espermatozóides. Fêmeas exibem cinco, sendo ovogônias, ovócitos pré-vitelogênicos, vitelogênicos, maduros e complexos pós-ovulatórios. A quantificação celular mostrou diferença no período de maior produtividade gamética entre ambos períodos analisados para ambos os sexos. Para machos todas as categorias de células germinativas foram vistas em todos os períodos, em 2007/2008, o período de maior produtividade gamética corresponde ao período chuvoso, já em 2012/2013 a produção de gametas em agosto foi alta, mas com a chegada do período chuvoso diminuiu, se contrapondo ao encontrado em 2007/2008. Visualizamos, apenas no segundo período, presença de ovócitos pré-vitelogênicos no interior dos túbulos seminíferos de poucos indivíduos da população. Em 2007/2008, as fêmeas apresentaram gônadas em três diferentes estágios de maturação: ovário em período de aptidão reprodutiva, o qual vai de outubro a dezembro de 2007, período de recuperação e crescimento do ovário, o qual vai de janeiro a maio de 2008 e período de repouso, o qual vai de junho a agosto de 2008. Em 2012/2013 elas apresentaram gônadas em dois diferentes estágios de maturação: fase ovário em desenvolvimento a qual ocorre de fevereiro a junho de 2013 e fase de aptidão á reprodução, na qual o ovário tem abundância de ovócitos maduros e complexos pós-ovulatório observada de agosto de 2012 a janeiro de 2013. A dinâmica gametogênica para ambos sexos difere na mesma população em momentos distintos e pode estar relacionada às ações antrópicas. Isso é um fato comum a outras espécies de anuros e pode estar relacionado à localização geográfica da população Abstract: The germ cell count, in both males and females, apparently, is a very efficient form of analysis to determine favorable reproductive periods. In order to discern possible variations in gamete production of a population of Rhinella schneideri (Anura, Bufonidae) in an urban area of Cuiabá, MT, Brazil, we characterized the germ cells and counted their production for two nonconsecutive years (2007 / 2008 and 2012/2013). Males exhibit six categories of germ cells, including primary and secondary spermatogonia, primary and secondary spermatocytes, spermatids and spermatozoa. Females exhibit five, which are oogonia, pre-vitellogenic oocytes, vitellogenic, mature and atresic oocytes. Furthermore, we described the morphology of the seminiferous tubules demonstrating the presence or absence of cell types for the two periods. Cell quantification showed the difference in the period of greatest gametic productivity between the two periods analyzed for both sexes. For males all categories of germ cells were found in all periods, in 2007/2008, the period of greatest gametic productivity corresponds to the rainy season, a fact shown by the greater amount of spermatid differentiation, in 2012/2013, the production of gametes was high in August, subsided arrival of the rainy season, in contrast to the data found in 2007/2008. Furthermore, we visualized, during the second period, the presence of pre-vitellogenic oocytes inside the seminiferous tubules of a few individuals of the population. Females in 2007/2008 showed gonads in three different maturation stages: ovary in reproductive aptitude, which occurs from October to December 2007, recovery period and ovarian growth, which occurs from January to May 2008 and finally a resting period, which occurs from June to August 2008. In 2012/2013 they had gonads in two different stages of maturation: ovarian resting which occurred from February to June 2013, and the reproductive aptitude phase, in which the ovary has plenty of mature oocytes and atresia, and recovery occurring simultaneously, was observed from August 2012 to January 2013. The dynamics of spermatogenesis in R. schneideri, for both sexes, differs in the same population when viewed at different times and may be related to human activities. This fact may be common to other frog species and may also be related to the geographical location of this population Mestrado Biologia Tecidual Mestre em Biologia Celular e Estrutural CNPQ 131272/2014-4

Orientadores: Rejane Maira Góes, Maria Etelvina Pinto Fochi Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A obesidade está associada a vários prejuízos para a saúde, mas os efeitos sobre o sistema genital e reprodução masculina ainda são pouco compreendidos. Um estudo concluído recentemente em nosso laboratório comparou os efeitos do ambiente obesogênico (AO) em diferentes fases do desenvolvimento de ratos sobre a produção espermática na idade adulta. Todos os grupos expostos ao AO apresentaram prejuízos espermáticos. Para esclarecer esses achados, no presente trabalho, nós investigamos se os diferentes períodos de exposição ao AO resultaram em alterações funcionais nas células de Sertoli e modificaram permanentemente o ambiente parácrino intratesticular. Foram utilizados ratos Wistar adultos expostos à obesidade materna na gestação (O1), na gestação/ lactação (O2), ou sujeitos ao AO após desmame (O3), da lactação até a idade adulta (O4) ou da gestação até a idade adulta (O5) e grupo controle (C). A obesidade materna ou o AO foram induzidos por dieta com 20% de lipídeos (ração controle: 4% de lipídeos), por 15 semanas. As análises em microscopia de luz não mostraram alterações morfológicas nas células de Sertoli e no número dessas células expressando o receptor de andrógeno nos estágios VII e VIII do ciclo do epitélio seminífero. Entretanto, a percentagem de túbulos com descolamento prematuro de células germinativas foi acentuada em O5, moderada nos grupos O1, O2 e O3 e menor em O4. A testosterona sérica diminuiu 60% em O3 e O5, 27 % em O2, ~45% em O4 e não variou no O1. A dosagem de citocinas e de fator de crescimento, com o uso de ensaios multiplex, indicou aumento do TNF-'alfa' e a diminuição do FGF-2 no testículo dos grupos O1, O3 e O4, diminuição da IL-1'alfa' e IL-1'beta' no grupo O2, e diminuição da IL-1'alfa' no grupo O5. Nenhum grupo apresentou alteração para a IL-6. Adicionalmente, as análises por imunocitoquímica e por Western blotting mostraram que a expressão de conexina 43 diminuiu para o grupo exposto ao AO por toda a vida. As alterações no TNF-'alfa' e na IL-1'alfa1 pode ter aumentado a permeabilidade da barreira hematotesticular e juntamente com a queda na testosterona, podem explicar o descolamento de células germinativas e o prejuízo na eficiência e produção espermática. Esses dados indicam que o AO modula os fatores parácrinos testiculares de maneira diferencial, dependendo do período de exposição Abstract: Obesity is associated with several health damage, but the effects on the reproductive system and male reproduction are still poorly understood. A study recently in our laboratory compared the effects of the obesogenic environment (OE) at different stages of development of rats on sperm production in adulthood. All the groups exposed to OE showed sperm damage. To clarify these findings in the present study, we investigated whether the different periods of exposure to OE resulted in functional changes in Sertoli cells and permanently changed the intratesticular paracrine environment. Wistar adult rats exposed to maternal obesity during pregnancy (O1), during pregnancy / lactation (O2), or subject to OE after weaning (O3), lactation to adulthood (O4) or from pregnancy to adulthood ( O5) and control group (C) were used. The maternal obesity or OE were induced by diet with 20% lipids (control diet: 4% lipid) for 15 weeks. The analysis by light microscopy showed no morphological changes in Sertoli cells and in the number of these cells expressing the androgen receptor in the seventh and eighth stages of the cycle of seminiferous epithelium. However, the percentage of tubules with premature separation of germ cells was accentuated in O5, moderate in groups O1, O2 and O3 and lower in O4. Serum testosterone decreased by 60% in O3 and O5, 27% in O2, ~ 45% in O4 and did not change in O1. The dosage of cytokines and growth factor with the use multiplex assays, showed an increase of TNF-'alpha' and the reduction of FGF-2 in the testis of groups O1, O3 and O4, reduced IL-1'alpha' and IL-1'beta' in O2 group, and decreased IL-1'alpha' in the O5 group. Neither group showed a change for IL-6. Additionally, analysis by immunocytochemistry and Western blotting showed that the expression of connexin 43 decreased to the group exposed to OE for all life. Changes in TNF-'alpha' and IL-1'alpha' may have increased the permeability of Blood-Testis barrier and along with the drop in testosterone may explain the detachment of germ cells and the loss in efficiency and sperm production. These data indicate that the OE modulates testicular paracrine factors differentially, depending on the exposure period Mestrado Biologia Celular Mestra em Biologia Celular e Estrutural CAPES FAPESP 2013/18011-9

Orientadores: Mary Anne Heidi Dolder, Fernanda Ramos Gadelha, Mary Anne Heidi Dolder Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Heteropterys tomentosa A. Juss. é uma planta endêmica do cerrado brasileiro cuja raiz é popularmente utilizada como planta medicinal. O extrato vegetal é consumido de maneira rudimentar e sem qualquer forma de extração padronizada. No entanto, determinadas propriedades com potencial clínico são descritas na literatura para o extrato de H. tomentosa. Entre estas, expressiva atividade antioxidante in vivo, a qual poderia ser contribuir para os efeitos benéficos à saúde do composto. Portanto, propôs-se investigar neste trabalho os mecanismos antioxidantes do extrato de H. tomentosa em testículo de ratos Wistar submetidos a estresse oxidativo por cloreto de cádmio. Dois possíveis mecanismos bioquímicos foram considerados: capacidade de quelar íons de cádmio e de metais de transição, como ferro e cobre; capacidade de neutralizar espécies reativas de oxigênio. Os animais foram organizados em quatro grupos (n=5) e tradados durante 30 dias: Controle - ingestão ad libitum de água; Cd - ingestão ad libitum de solução aquosa de cloreto de cádmio [75mg/L]; Ht - uma injeção intraperitoneal diária do extrato vegetal NSE50 [50 mg/Kg Pc]; CdHt - ingestão ad libitum de solução aquosa de cloreto de cádmio [75mg/L] concomitantemente à injeção intraperitoneal diária do extrato vegetal NSE50 [50 mg/Kg Pc]. Ao término do tratamento, as amostras de testículo foram coletadas e submetidas a análises bioquímicas, estereológicas e histopatológicas. Os resultados demonstram que o extrato de H. tomentosa reduziu significativamente as taxas de peroxidação lipídica nos animais submetidos ao cádmio. As evidências sugerem que ambos os mecanismos antioxidantes inicialmente propostos estão envolvidos neste processo. Isto é, o extrato possui propriedades quelantes associadas à capacidade de neutralizar as EROs normalmente formadas após a exposição ao metal. Adicionalmente, os resultados acusam a presença de cádmio no testículo dos animais não expostos experimentalmente, provavelmente obtido através da ração comercial. Este cenário expõe um grave problema ambiental envolvendo a presença do metal na agricultura voltada para o consumo humano e, dessa forma, reforça os estudos populacionais que correlacionam exposição não ocupacional ao cádmio com diversas patologias idiopáticas Abstract: Heteropterys tomentosa A. Juss. is an endemic Brazilian bush whose root is widely used as a medicinal plant. The plant extract is traditionally taken imbibed in alcohol and, therefore neither go through any standard extraction procedure nor has its active compounds identified. Nonetheless, the literature have reported some pharmacological properties with clinical potential for H. tomentosa root extract, such as a relevant in vivo antioxidant activity. Therefore, its health benefits could partially be attributed to the capacity of reducing the oxidative stress in the organism. For this reason, the aim of the present study is to shed light on the antioxidant mechanisms of H. tomentosa in Wistar rat testis undergoing cadmium induced lipid peroxidation. Two possible mechanisms have been investigated: the capacity of chelating cadmium and transitional metal ions, such as iron and copper; the capacity of ROS scavenging. Animal were set into four different groups (n=5) and submitted to different treatments for 30 days: Control - water ad libitum; Cd - water plus cadmium solution [75mg/L] ad libitum; Ht - daily intraperitoneal injection of NSE50 extract [50 mg/Kg Pc]; CdHt - water plus cadmium solution [75mg/L] ad libitum accompanied by a daily intraperitoneal injection of NSE50 extract [50 mg/Kg Pc]. At the end of the treatment, testis samples were collected and submitted to stereological, histopathological and biochemical analyses. The results showed a significant reduction in lipid peroxidation rates for the animals submitted to cadmium diet and simultaneously treated with the NSE50 extract. Our data indicates that two antioxidants mechanisms are employed by the plant extract: a cadmium chelating property and a ROS scavenging activity. In addition, results show the presence of cadmium in testis of control and Ht group, although they were not experimentally exposed to the metal. These animals are likely to have been contaminated through rat ration, mainly made from corn. This scenario exposes a current environmental issue involving agriculture for human consumption and, thus reinforces some epidemilogical studies correlating cadmium and several idiopathic pathologies Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural CAPES CNPQ FAPESP

Orientadores: Karina Carvalho Mancini, Mary Anne Heidi Dolder Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Apesar de Formicidae constituir um dos grupos animais mais significativos em riqueza de espécies no Brasil, suas relações filogenéticas permanecem controversas. Uma notável fonte de caracteres para análises taxonômicas e filogenéticas é a caracterização espermática e do aparelho reprodutor. Tal caracterização tem se mostrado uma ferramenta na clarificação de questões da biologia reprodutiva e sistemática de diversos grupos de insetos. Desta forma, o presente estudo analisou, através de microscopia de luz e eletrônica de transmissão, a morfologia espermática de quatro espécies do gênero Pachycondyla (Formicidae: Ponerinae), bem como o aparelho reprodutor masculino: P. marginata, P. termitofane comutata, P. harpax e P. striata. A ultraestrutura dos espermatozoides de tais espécies é semelhante à descrita para outros Hymenoptera por apresentar: (1) acrossomo cônico do tipo bicamada; (2) adjunto do centríolo situado entre o núcleo e ambos os derivados mitocondriais e (3) flagelo constituído por dois derivados mitocondriais alongados, dois corpos acessórios triangulares e um axonema de padrão 9+9+2. Entretanto, as mesmas compartilham inúmeras características cujas evidências indicam evoluir como homoplasia via paralelismo, não conferindo, pois, suporte para uma resolução filogenética entre tais espécies e demais clados próximos. Dentre estes caracteres se destacam a organização espacial dos componentes acrossomais, o caráter cromatínico nuclear, a configuração da extremidade da transição núcleo-flagelo, além da condição simétrica do adjunto do centríolo. Além dessas, várias outras características corroboram a definição do estado parafilético do respectivo gênero, tais como o aspecto cromatínico, a condição simétrica do adjunto do centríolo e a organização terminal flagelar, por serem compartilhadas entre determinadas espécies de Pachycondyla e grupos filogeneticamente distantes, evidenciando, pois, as divergências dentro da mesma espécie. Por fim, a análise morfológica do aparelho reprodutor de P. marginata e P. striata evidenciou a existência de um padrão morfológico reprodutivo para Formicidae, uma vez que tais espécies exibiram íntima similaridade às descrições realizadas à respectiva família Abstract: Although Formicidae be one of the most important animal groups in species richness in Brazil, their phylogenetic relationships remain controversial. One notable source of characters for taxonomic and phylogenetic analysis is the characterization of the spermatozoa and male reproductive tract. This characterization has shown to be a tool in clarifying issues of reproductive biology and systematics of many insect groups. Thus, this study analyzed by light and transmission electron microscopies, the sperm morphology of four species of the genus Pachycondyla (Formicidae: Ponerinae), and their male reproductive system: P. marginata, P. termitofane comutata, P. harpax and P. striata. The ultrastructure of spermatozoa of these four species is similar to that described to other Hymenoptera: (1) bilayer tapered acrosome; (2) centriolar adjunct located between nucleus and both mitochondrial derivatives and (3) flagellum comprises two elongate mitochondrial derivatives, two triangular bodies and an axoneme of 9 + 9 + 2 pattern. However, they share a number of features whose evidence indicates evolve as homoplasy via parallelism, not giving, support for a phylogenetic resolution among species and other nearby clades. Among these characters stand out, the spatial organization of acrosomal components, the nuclear chromatin character, setting the end of the transition nucleus-flagellum, in addition to symmetrical condition centriolar adjunct. Besides these, various other features confirm the setting of the paraphyletic status of its genus, such as chromatin aspect, symmetrical condition centriolar adjunct and flagellar terminal organization, by being shared among certain species phylogenetically distant and Pachycondyla groups, highlighting, therefore, the differences within the same species. Finally, the morphological analysis of the reproductor system of P. striata and P. marginata highlighted the existence of a reproductive morphology pattern to Formicidae, since such species showed close similarity to the descriptions made to its family Mestrado Biologia Celular Mestra em Biologia Celular e Estrutural CNPQ 131276/2014-0

Orientadores: Shirlei Maria Recco Pimentel , Gisele Orlandi Introíni Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os anuros da família Leptodactylidae estão alocados em três subfamílias: Leiuperinae, Leptodactylinae e Paratelmatobiinae. Com o auxílio da microscopia eletrônica, foram observados os espermatozoides de 23 espécies de leptodactilídeos buscando-se contribuir com elementos para o entendimento de incertezas filogenéticas. Em Pseudopaludicola, gênero alocado em Leiuperinae, é comparado o espermatozoide de representantes do grupo P. pusilla e de espécies dos quatro clados recuperados na filogenia molecular, os quais correspondem aos grupos cromossômicos 2n=22, 20, 18 e 16. A análise das espécies de Pseudopaludicola mostrou que as cabeças dos espermatozoides são semelhantes e contém a vesícula acrossomal cobrindo o cone subacrossomal. Já as caudas dos espermatozoides de Pseudopaludicola apresentam diferenças marcantes. Nas espécies com número cromossômico 2n=22, Pseudopaludicola sp. 1 (grupo P. pusilla), P. saltica, P. falcipes e P. mineira, as caudas exibem fibras acessórias (justa-axonemal, membrana ondulante e a fibra axial). Essas fibras também são observadas em P. ternetzi e P. ameghini, ambas do clado com 2n=20, mas nas suas caudas a fibra axial é mais desenvolvida. Nos indivíduos do clado com número cromossômico 2n=18, P. canga, P. facureae, P. giarettai, P. atragula e Pseudopaludicola sp. 2 e com 2n=16, P. mystacalis, a cauda apresenta a membrana ondulante espessa, caracterizando um bastão para-axonemal, o qual é mais curto do que a membrana ondulante da cauda dos Pseudopaludicola com número cromossômico 2n=22 e 20. As diferenças morfológicas ultraestruturais observadas nas caudas dos espermatozoides indicam que esses caracteres podem ser filogeneticamente informativos, quando mapeados na filogenia molecular, pois os perfis ultraestruturais da cauda coincidem parcialmente com a formação dos quatro clados filogenéticos e possibilitam levantar a hipótese de uma progressiva simplificação do espermatozoide durante a evolução do gênero Pseudopaludicola. A análise comparativa de espécies entre os gêneros de leiuperíneos mostra que as caudas dos espermatozoides de Physalaemus (P. albifrons, P. centralis, P. cicada e P. cuvieri), também exibem fibras acessórias, como a fibra justa-axonemal e a membrana ondulante, contudo, a membrana ondulante nesse gênero é mais longa que aquela encontrada em Pseudopaludicola. Além disso, as caudas dos espermatozoides de Physalaemus não mostram fibra axial. Do gênero Engystomops, grupo irmão de Physalaemus, foram analisadas E. petersi, E. freibergi e E. puyango, cujas caudas apresentam fibra justa-axonemal, membrana ondulante e fibra axial. Esses gêneros diferem ainda pela membrana ondulante mais curta em Engystomops, corroborando a revalidação do gênero Engystomops. A cauda de Engystomops puyango difere de E. petersi e E. freibergi, clado Duovox, e é igual a E. pustulosus, do clado Edentulus, indicando a necessidade de ampliar os estudos desse gênero. A espécie Pleurodema diplolister, do gênero próximo a Physalaemus e Engystomops, apresenta na cauda do espermatozoide a fibra justa-axonemal e a membrana ondulante, as quais são semelhantes àquelas observadas nas espécies de Physalaemus, entretanto, a membrana ondulante de P. diplolister é menor que a observada em Physalaemus. A comparação dos espermatozoides de representantes das outras subfamílias de Leptodactylidae mostrou que Paratelmatobiinae, representada por P. poecilogaster, apresenta estruturas iguais àquelas observadas nos Pseudopaludicola do clado com número cromossômico 2n=22. Por outro lado, a espécie analisada, Leptodactylus natalensis, Leptodactylinae, apresenta fibra axial bem desenvolvida, diferente daquela exibida nos espermatozoides de Engystomops, Pseudopaludicola e P. poecilogaster. A outra espécie de Leptoctylinae, Adenomera marmorata, a qual era alocada em Leptodactylus, apresenta apenas o axonema na cauda do espermatozoide. Essa diferença ultraestrutural das caudas de A. marmorata e L. natalensis, corrobora com a re-alocação de A. marmorata como espécie válida e diferente de Leptodactylus. A descrição ultraestrutural dos gametas masculinos leptodactilídeos mostra caracteres filogenéticos informativos, principalmente aqueles das caudas dessas células, que podem ser usados para o entendimento dos relacionamentos intragenérico e intergenérico. Abstract: The anurans of the family Leptodactylidae are distributed in three subfamilies ¿Leiuperinae, Leptodactylinae and Paratelmatobiinae. The spermatozoa of 23 leptodactylid species were analyzed under an electron microscope in order to provide evidence for the better understanding of a number of phylogenetic uncertainties. In the case of the leiuperine genus Pseudopaludicola, the sperm of the representative of the P. pusilla group and those of four clades identified in the molecular phylogeny, which correspond to well-defined chromosomal groups with 2n=22, 20, 18, and 16, were compared. The analysis of the different Pseudopaludicola species found spermatozoa with heads of similar shape, which contain an acrosomal vesicle covering the subacrosomal cone. However, the tails present marked differences. In the species with 2n=22, that is, Pseudopaludicola sp. 1 (P. pusilla group), P. saltica, P. falcipes and P. mineira the tails present accessory fibers (juxtaxonemal fiber, undulating membrane and axial fiber). Fibers of this type are also observed in P. ternetzi and P. ameghini (representatives of the 2n=20 clade), although the axial fiber is more developed. In the specimens of the 2n = 18 clade (P. canga, P. facureae, P. giarettai, P. atragula and Pseudopaludicola sp. 2) and the 2n=16 clade (P. mystacalis), the tail has a thick undulating membrane, characterized by a paraxonemal rod, which is shorter than the undulating membrane of the tail of Pseudopaludicola (2n=22 and 20). The ultrastructural morphological differences observed in the tails of the spermatozoa indicates that these traits are phylogenetically informative, given their partial correspondence to the four clades identified in the molecular studies, and provide evidence of a progressive simplification of the spermatozoa during the evolution of the genus Pseudopaludicola. The comparative analysis of the leiuperine genera indicates that in Physalaemus (P. albifrons, P. centralis, P. cicada and P. cuvieri), the tail of the spermatozoon also shows accessory fibers, such as the juxtaxonemal and the undulating membrane, although in this genus, the membrane is longer than that observed in Pseudopaludicola. In addition, there is no axial fiber on the tail of the spermatozoon in Physalaemus. In the case of Engystomops, sister group of Physalaemus, the species E. petersi, E. freibergi, and E. puyango the sperm tail presents all three types of fiber (juxtaxonemal, undulating membrane and axial fiber). The tail of these two genera also differ each other for the shorter undulating membrane in Engystomops, corroborating the revalidation of the genus Engystomops. Additionaly, the tail of E.puyango differs from E. petersi and E. freibergi, Duovox clade, and it is similar to E. pustulosus, Edentulus clade, indicating the need of more studies in this genus. In Pleurodema diplolister, representing the genus closest to Physalaemus and Engystomops, the sperm tail has a juxtaxonemal fiber and undulating membrane, which are similar to those found in Physalaemus, although the membrane observed in Pleurodema diplolister is shorter than that observed in Physalaemus. Comparisons with other leptodactylid subfamilies indicated that the Paratelmatobiinae, represented by P. poecilogaster, has the same structures as those observed in the 2n = 22 clade of Pseudopaludicola. On the other hand, the leptodactyline species analyzed, Leptodactylus natalensis, has a well-developed axial fiber, distinct from that found in the sperm of Engystomops, Pseudopaludicola and P. poecilogaster. However, in the other leptodactyline species analyzed, Adenomera marmorata, previously allocated to Leptodactylus, the sperm tail has only an axoneme. This ultrastructural difference in the tails of A. marmorata and L. natalensis supports the status of A. marmorata as a valid taxon distinct from Leptodactylus. Overall, then, the ultrastructural description of the male gametes of a selection of leptodactylid species provided informative phylogenetic characters, especially with regard to the morphology of the sperm tails, which can be used for understanding of the intrageneric and intergeneric relationships Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural FAPESP CNPQ CAPES