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Hypomorphic mutations are a valuable tool for both genetic analysis of gene function and for synthetic biology applications. However, current methods to generate hypomorphic mutations are limited to a specific organism, change gene expression unpredictably, or depend on changes in spatial-temporal expression of the targeted gene. Here we present a simple and predictable method to generate hypomorphic mutations in model organisms by targeting translation elongation. Adding consecutive adenosine nucleotides, so-called polyA tracks, to the gene coding sequence of interest will decrease translation elongation efficiency, and in all tested cell cultures and model organisms, this decreases mRNA stability and protein expression. We show that protein expression is adjustable independent of promoter strength and can be further modulated by changing sequence features of the polyA tracks. These characteristics make this method highly predictable and tractable for generation of programmable allelic series with a range of expression levels.

AAA Proteine gehören zur großen Überfamilie der AAA+ Proteine. Diese sind ringförmige P-loop NTPasen, deren gemeinsame Funktion das engerieabhängige Entfalten von Makromolekülen ist. AAA Proteine bestehen im Allgemeinen aus einer N-terminalen Domäne und einer oder zwei ATPase Domänen, die mit D1 und D2 bezeichnet werden. Die ATPase Domänen innerhalb der Familie der AAA Proteine sind verhältnismäßig konserviert. Sie bewirken wahrscheinlich eine Hexamerisierung. Die N-terminalen Domänen sind wichtig für die Erkennung und Bindung des Substrats und unterscheiden sich im Gegensatz zu den ATPase Domänen strukturell. Auf der Grundlage veröffentlichter Daten und zusätzlicher bioinformatischer Analyse der AAA Proteine wurden mehrere verschiedene N-terminale Domänen von AAA Proteinen aus Archaebakterien für eine funktionelle und strukturelle Charakterisierung ausgewählt. Es wurden weiterhin Proteine charakterisiert, die ähnliche oder verwandte Domänen wie die AAA Proteine haben. Dabei wurde darauf Wert gelegt, Zusammenhänge und Gemeinsamkeiten herauszustellen. Es wurden Hitze- und chemische Aggregations Tests mit verschiedenen Substratproteinen durchgeführt, um die N-terminalen Domänen oder die gesamten AAA Proteine auf intrinsische Chaperon-Aktivität zu untersuchen. Die Proteinstrukturen wurden mit Röntgenstrukturanalyse oder mit NMR Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die barrel-fömigen N-terminalen Domänen der AAA Proteine aus bauart-ähnlichen, Nukleinsäure bindenden Domänen hervorgingen. Die Substrataffinität hat sich wahrscheinlich durch verschiedene evolutionäre Mechanismen von Nukleinsäuren zu Proteinen gewandelt. Im Fall der doppelten Psi-Barrels ist dies vermutlich durch die Evolution eines einfachen beta-alpha-beta-Motifs geschehen, das man auch in den RIFT und in den swapped hairpin-Barrels findet. Letztere sind Transkriptionsfaktoren, d.h. sie binden DNA. Die Struktur von Mj0056 und SpoVT legt nahe, dass RIFT und swapped hairpin-Barrels entweder durch eine Insertion verschiedener Strukturelemente (Mj0056) oder durch die Rekrutierung einer Domäne (SpoVT) weiter evolviert sind. Ähnlichkeiten zwischen den N-terminalen Domänen von PAN und ARC wurden sowohl in Struktur und Funktion gefunden. Beide Domänen beinhalten eine coiled-coil Faltung, auf die eine oder zwei OB Faltungen folgen. OB steht für Oligosaccharid-Bindung und weist darauf hin, dass diese Domäne ebenfalls aus einer DNA-bindenden Struktur entstand. Die Struktur der ARC-Nc Subdomäne und eine umfassende Analyse von Chimären aus coiled-coil und OB Faltungen zeigen auf, dass sich die N-terminalen Domänen von ARC und PAN evolutionär durch die Rekrutierung von Domänen entwickelt haben. Die strikte strukturelle Zusammensetzung der Subdomänen ist wichtig für die Chaperon-Funktion und wird durch die konservierten PP-Linker, die die beiden Subdomänen verbinden, erhalten. Die strukturelle und funktionale Charakterisierung von AfAMA, das zu der neuen Gruppe der AMA AAA Proteine gehört, zeigte, dass die Substratbindefunktion und die Chaperon-Aktivität dieser Proteine in ihrer beta-clam ähnlichen N-terminalen Domäne liegen. Diese Domäne kann die genannten Funktionen unabhängig voneinander erfüllen, was sie von anderen homologen Domänen unterscheidet. Es war uns möglich, die Bedeutung der Oligomerisierung für die Aktivität dieser Domänen zu zeigen. Des Weiteren haben wir gezeigt, dass die Oligomerisierung durch ein kleines GYPL-Motif vermittelt wird, das auf einem Loop liegt, der vermutlich in das Zentrum des Hexamers zeigt. Die N-terminale Domäne von AMA bewirkt die Hexamerisierung des ganzen Proteins unabhängig von dem AAA Teil des Proteins und unabhängig von ATP Verbrauch. Darin weicht sie stark von anderen Familien der AAA Proteinen ab. Funktionelle Daten von anderen beta-clam Domänen (z.B. VAT-Nc, Ph1500N und Hm-clam) würden darauf hinweisen, dass diese Domänen universelle Protein-Protein Wechselwirkungsmodule darstellen. AAA proteins are part of the large superfamily of AAA+ proteins, which are ringshaped P loop NTPases, whose common function is unfolding macromolecules in an energy-dependant manner. AAA proteins usually consist of an N-terminal domain, and one or two ATPase domains named D1 and D2. ATPase domains are relatively conserved within the family of AAA proteins and they are also thought to mediate hexamerization. N-terminal domains are important for substrate recognition and binding and, in contrast to the ATPase domains, they vary in their folds. Based on published data and additional bioinformatic analysis of AAA proteins, we selected several different N-terminal domains from archaeal AAA proteins for functional and structural characterization. We also characterized proteins which share similar or related domains to the ones found in AAA proteins, making an important link between them. Heat and chemical aggregation assays of different substrate proteins were used to assay N-terminal domains, or full AAA proteins, for intrinsic chaperone activity. Protein structures were determined by crystallography or NMR spectroscopy. Results of this study indicate that the barrel-like N-terminal domains of AAA proteins originated from the similar nucleic acid binding domains. A change in the affinity for substrate, from nucleic acid to protein, may have occurred through different mechanisms in the evolution. In the case of double-psi barrels this has probably happened through the evolution of a simple beta-alpha-beta-motif found also in the RIFT and swapped hairpin barrels which are transcription factors, i.e. DNA binders. Structures of Mj0056 and SpoVT indicate that RIFT and swapped hairpin barrels have evolved further either by insertion of different structure elements (Mj0056) or by domain recruitment (SpoVT). Similarity between the PAN and ARC N-domains was found to be both in structure and function. Both domains comprise a coiled-coil followed by one or two OB folds. OB stands for oligosaccharide binding and indicates that also this domain originated from a DNA-binding fold. Structure of the ARC-Nc subdomain and a comprehensive analysis of chimeric constructs of the coiled coils and OB folds indicate that ARC and PAN N-domains have arisen through evolution by domain recruitment. Strict structural composition of the subdomains important in the chaperone function is maintained through the conserved PP-linker connecting the two subdomains. Structural and functional characterization of the AfAMA, a member of the novel group of AMA AAA proteins, showed that substrate binding function and chaperone activity of these proteins resides in its beta-clam like N-terminal domain. This domain can fulfill these functions independently, in contrast to the other homologous domains. We were able to show the importance of oligomerization for activity of these domains and that oligomerization is mediated by a small GYPL-motif found in a loop that presumably projects to the center of the hexamer. The N-terminal domain of AMA mediates hexamerization of the full protein independently from the AAA part of the protein and ATP utilization, which differs largely from other families of AAA proteins. Functional data on other beta-clam domains: VAT-Nc, Ph1500N and Hm-clam would indicate that these domains represent universal protein-protein interaction modules.