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Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Orf virus (ORFV), the type member of the genus Parapoxvirus of the family Poxviridae, is the etiologic agent of orf or contagious ecthyma, a contagious and ubiquitous disease of sheep and goats. ORFV genome consists of a double stranded DNA molecule with approximately 138 Kb, and contains 131 putative genes. Among those, 15 are novel genes, unique to parapoxviruses, which lack homology to other known viral or cellular genes. In the present study we describe the functional characterization of three of these genes, ORFV024, ORFV002, and ORFV121. Results presented here demonstrate that the proteins encoded by these genes inhibit the activation of the nuclear factor-kappa B (NF-κB) signaling pathway. ORFV-encoded ORFV024 inhibits activation of the NF-κB signaling pathway in the cell cytoplasm by inhibiting phosphorylation of the IκB kinases, IKKα and IKKβ, consequently inhibiting the activation of the IKK complex. Deletion of ORFV024 from the ORFV genome had no significant effect on disease severity, progression or time to resolution in sheep, indicating that ORFV024 does not contribute to ORFV virulence. ORFV-encoded ORFV002 functions in the cell nucleus, where it interacts with the NF-κB subunit NF-κB-p65, inhibiting its acetylation, a p300-mediated modification of NF-κB-p65 which modulates its transcriptional activity. Similarly to ORFV024, deletion of ORFV002 from the ORFV genome had no significant effect on ORFV virulence and disease pathogenesis in sheep. ORFV-encoded ORFV121 functions in the cell cytoplasm, where it binds to and inhibits phosphorylation and nuclear translocation of NF-κB-p65. Deletion of ORFV121 from the ORFV genome resulted in a marked attenuated disease phenotype in sheep, indicating that ORFV121 is a determinant of virulence of ORFV in the natural host. These results indicate that ORFV, like other poxviruses, has evolved multiple strategies to modulate NF-κB, targeting different steps of the signaling pathway. Results obtained in the pathogenesis studies performed here suggest that multiple NF-κB inhibitors encoded by ORFV may exert complementary and/or redundant functions to effectively block host cell responses regulated by the NF-κB signaling pathway. Additionally, it is possible that ORFV-encoded NF-κB inhibitors modulate distinct cellular processes regulated by NF-κB in vivo. A better understanding of ORFV-host interactions may provide valuable insights for the development of improved vaccines against orf, or yet for the development of novel ORFV-based therapeutic agents and vaccine vectors with enhanced safety and efficacy, and a broader applicability. O vírus da orf (ORFV), protótipo do gênero Parapoxvirus da família Poxviridae, é o agente etiológico da orf ou ectima contagioso, uma enfermidade contagiosa de distribuição mundial que afeta primariamente ovinos e caprinos. O genoma do ORFV consiste de uma molécula de DNA de fita dupla com aproximadamente 138 Kb, que contém presumidamente 131 genes. Dentre estes, 15 são genes novos, identificados apenas nos parapoxvírus e que não possuem homologia com outros genes de origem viral ou celular. O presente estudo descreve a caracterização funcional de três destes genes, ORFV024, ORFV002 e ORFV121. Os resultados apresentados no presente estudo demonstram que as proteínas codificadas pelos genes ORFV024, ORFV002 e ORFV121 inibem a ativação da via de sinalização do fator de transcrição nuclear-kappa B (NF-κB). O produto da ORFV024 bloqueia a ativação da via do NF-κB no citoplasma celular, inibindo a fosforilação das quinases IκB (IKK), IKKα e IKKβ e, consequentemente inibindo a ativação do complexo IKK. A deleção do gene ORFV024 do genoma do ORFV não alterou a severidade, a progressão, ou o tempo de resolução das lesões produzidas pelo ORFV em ovinos, indicando que o produto deste gene não contribui para a virulência do vírus. O gene ORFV002 codifica um inibidor do NF-κB que atua no núcleo das células. O produto do ORFV002 interage com a subunidade NF-κB-p65 do NF-κB, inibindo a sua acetilação, uma modificação pós-traducional do NF-κB-p65 mediada pela acetiltransferase p300 que regula a sua atividade transcripcional. Semelhante ao ORFV024, a deleção do gene ORFV002 do genoma do ORFV não afetou a virulência do vírus nem alterou a patogenia da enfermidade em ovinos. O produto do gene ORFV121 atua no citoplasma das células, onde esta proteína viral interage com o NF-κB-p65 inibindo sua fosforilação e translocação nuclear. A deleção do gene ORFV121 do genoma do ORFV reduziu significativamente a severidade, a progressão e o tempo de resolução da doença em ovinos, indicando que este produto viral constitui-se em um fator de virulência para o ORFV em seu hospedeiro natural. Estes resultados demonstram que, assim como outros poxvírus, o ORFV também desenvolveu múltiplas estratégias para modular a via de sinalização do NF-κB, codificando proteínas que atuam em diferentes eventos desta complexa via de sinalização intracelular. Os resultados obtidos nos estudos de patogenia sugerem que os inibidores do NF-κB codificados pelo ORFV desempenham funções complementares e/ou redundantes, provavelmente, para promover um bloqueio efficiente dos processos biológicos regulados pelo NF-κB. Além disso, estes produtos virais podem modular diferentes processos biológicos controlados pelo NF-κB in vivo. Um melhor entendimento das interações do ORFV com o seu hospedeiro pode favorecer o desenvolvimento de vacinas mais eficazes para o ectima contagioso, ou ainda, promover o desenvolvimento de vacinas vetoriais ou imunoterápicos, baseados no ORFV, mais eficazes e com uma maior espectro de aplicações.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico This study describes aspects of the pathogenesis of bovine herpesvirus-5 (BoHV-5) infection in goats and rabbits. The study performed in goats was aimed at investigating the susceptibility of this species to BoHV-5 infection, due its potential role as a virus reservoir. Young goats were inoculated intranasally with three Brazilian BoHV-5 isolates (SV-507, G1; SV-609, G2; and EVI-88, G3) and monitored thereafter regarding to virus shedding, clinical signs and antibody response. The acute infection was characterized by virus shedding in nasal secretions for up to 14 days post-inoculation (pi) in titers reaching up to 105.97 TCID50/mL, mild respiratory signs and seroconversion. At day 60 pi, two animals of each group were euthanized for tissue collection to search viral DNA. The remaining animals were submitted to dexamethasone (Dx) administration to reactivate latent infection. Dx treatment resulted in virus reactivation in 75% (9/12) animals, as ascertained by virus shedding (8/12), and/or seroconversion (3/12). Latent viral DNA was detected in the trigeminal ganglia (TG) and/or in the main olfactory bulb (MOB) of all goats euthanized at days 60 pi and 40 post-dexamethasone. These results demonstrate that goats are susceptible to BoHV-5 acute and latent infection and may shed virus upon reactivation of latency. Thus, this species should be considered a potential reservoir for BoHV-5 in areas where goats and cattle are raised in close contact. The second experiment was aimed at investigating the role of the olfactory pathway in the transport of BoHV-5 to the brain of rabbits. For this, thirty days-old rabbits had the MOB surgically removed and were subsequently inoculated intranasally (IN) or conjunctivally (IC) with the strain SV-507 of the BoHV-5. Intranasal inoculation resulted in neurological disease in 100% of the control animals (with MOB), with clinical signs starting between days 5 and 10 pi; in the group submitted to MOB ablation only one animal (9.1%) developed neurological signs (started at day 17 pi). Following IC inoculation 10/12 (83.3%) control rabbits (with MOB) developed neurological disease with clinical signs starting between days 11 and 20 (mean 15.3 days). Furthermore, 10/12 rabbits lacking the MOB also developed neurological disease starting between days 9 and 15 pi (mean 12.5 days). These results demonstrate that both the olfactory and the trigeminal pathways may be used by BoHV-5 to invade the brain of rabbits after experimental infection. The transport by the olfactory pathway is faster and more efficient, while the trigeminal transport is slower and less efficient. These results add important information to the knowledge about the neuropathogenesis of alphaherpesvirus infection. O presente estudo descreve aspectos da patogenia da infecção pelo herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) em caprinos e coelhos. O estudo em caprinos teve como objetivo investigar a susceptibilidade da espécie ao BoHV-5, devido ao seu possível papel como reservatório do vírus. Para isto, caprinos jovens foram inoculados pela via intranasal (IN) com três isolados brasileiros do BoHV-5 (SV-507, G1; SV-609, G2; e EVI-88, G3) e monitorados nos aspectos virológicos, clínicos e sorológicos. A fase aguda caracterizou-se por excreção viral em secreções nasais por um período de até 14 dias pós-inoculação (pi) em títulos de até 105,97 DICC50/mL, sinais respiratórios brandos e soroconversão. No dia 60 pi, dois animais de cada grupo foram submetidos à eutanásia para a coleta de tecidos e pesquisa de DNA viral. Os animais restantes foram submetidos à administração de dexametasona (Dx), na tentativa de reativar a infecção latente. A administração de Dx resultou em reativação da infecção latente em 75% (9/12) animais, detectada pela excreção viral (8/12) e/ou soroconversão (3/12). O DNA viral latente foi detectado no gânglio trigêmeo (TG) e/ou no bulbo olfatório (BO) de todos os animais eutanasiados nos dias 60 pi e 40 pós-dexametasona. Esses resultados demonstram que caprinos são susceptíveis a infecção aguda e latente pelo BoHV-5 e podem excretar vírus durante a reativação da infecção. Portanto, essa espécie pode ser considerada um potencial reservatório do BoHV-5 em áreas onde caprinos e bovinos são criados conjuntamente. O segundo experimento teve como objetivo investigar a importância da via olfatória na invasão do encéfalo de coelhos pelo BoHV-5. Para isto, coelhos recém desmamados foram previamente submetidos à ablação cirúrgica do BO e inoculados pela via IN ou conjuntival (IC) com a cepa SV-507 do BoHV-5. A inoculação IN resultou no desenvolvimento de doença neurológica em 100% dos animais controle (com BO), com início dos sinais clínicos entre os dias 5 e 10 pi. No grupo submetido à ablação do BO apenas um animal (9,1%) apresentou sinais neurológicos (início dia 17 pi). Após a inoculação IC, 10/12 (83,3%) coelhos controle (com BO) desenvolveram doença neurológica com o início dos sinais entre os dias 11 e 20 (média 15,3 dias); 10/12 coelhos (83,3%) sem o BO também desenvolveram a doença neurológica, com os sinais iniciando entre os dias 9 e 15 pi (média 12,5 dias). Esses resultados demonstram que tanto a via olfatória como a via trigeminal podem ser utilizadas pelo BoHV-5 para invadir o SNC de coelhos após infecção experimental. Porém, o transporte pela via olfatória é mais rápido e mais eficiente enquanto que a via trigeminal atua como via de acesso mais lento e menos eficiente. Esses resultados são importantes para um melhor conhecimento sobre a neuropatogênese das infecções pelos alfaherpesvírus.

O presente estudo teve como objetivo determinar a prevalência de anticorpos contra os vírus da influenza (EIV), da arterite viral (EVAV) e herpesvírus (EHV) em eqüinos no Estado do Rio Grande do Sul (RS), Brasil. Amostras de soro provenientes de eqüinos de 65 municípios do Estado foram submetidas ao teste de inibição da hemaglutinação (HI) para a pesquisa de anticorpos contra o EIV, e à técnica de soroneutralização (SN), para a detecção de anticorpos contra os vírus da EVA e da EHV. Das 1.506 amostras testadas, 986 (65,4%) apresentaram anticorpos para o EIV (títulos entre 10 e 1280), 33 (2,2%) para o EVAV (2-16) e 67 (4,5%) foram positivas para o EHV (2-64). Dentre os 65 municípios amostrados, 55 (84,6%) apresentaram pelo menos um animal positivo para o EIV, 15 (23%) para o EVAV e 12 (18,5%) para o EHV. A prevalência de anticorpos para cada vírus não variou muito entre animais de diferentes propósitos (esporte, exposição e reprodução) e entre machos e fêmeas, indicando que os diferentes sistemas de criação apresentam condições epidemiológicas semelhantes em relação a essas infecções. Os resultados obtidos sugerem a circulação desses agentes na população eqüina do RS e alertam para a necessidade de estudos adicionais sobre a importância e o impacto econômico-sanitário dessas viroses para a eqüideocultura do Estado. This study was aimed at investigating the prevalence of antibodies against infections virus of influenza virus (EIV), viral viral arteritis (EVAV), and herpesvirus (EHV) among horses in Rio Grande do Sul (RS) state, Brazil. Serum samples from horses of Serum samples from horses from 65 counties of northern and northwestern of RS, submitted to serological diagnosis for equine infectious anemia (EIA) at the University of Passo Fundo (UPF), were tested by inhibition hemaglutination test (HI) for EIV and by virus -neutralization test (VN) for EVAV and EHV antibodies. From 1506 samples, 986 (65.4%) presented antibodies against to EIV (titers ranging from 10 to 1280), 33 (2.2%) were positive for to EVAV antibodies (2-16), and 67 (4.5%) for EHV (2-64). Among the 65 sampled counties, 55 (84.6%) presented at least one positive animal to EIV, 15 (23%) to EVAV, and 12 (18.5%) to EHV. The prevalence among horses of different purposes (sports, farmshow and reproduction) and between genders did not differ significantly, indicating that these different herds are epidemiologically similar regarding these infections. These results demonstrate indicatesuggest the presence of these agents among RS horses and indicate the need necessityneed for additional epidemiological studies to determine the sanitary and economical importance of these infections for the RS equine husbandry.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Caprine alphaherpesvirus 1 (CpHV-1) is a pathogen of goats distributed worldwide, associated with systemic infections and respiratory disease in kids and subclinical infection or reproductive disease and abortions in adult animals. The losses associated with CpHV-1 infection could be prevented by vaccination, however, commercial vaccines are not available. Thus, the present study aimed to construct and characterize a recombinant of the CpHV-1 with a deletion in the thymidine kinase (TK) gene for potential use in vaccines. A recombinant with a total deletion in the tk gene was constructed by homologous recombination, by replacing the tk with the enhanced green fluorescent protein (eGFP) gene for the selection of recombinants. In vitro characterization showed that the recombinant CpHV-1TK replicated to similar titers and produced plaques of similar size to the parental virus in cell cultures, demonstrating that the deletion of the tk gene did not affect the replicative ability of the virus in vitro. After intranasal inoculation of five kids per virus (107 TCID50), the parental virus replicated more efficiently and for a longer period of time than the recombinant virus. In addition, the parental virus produced moderate systemic and respiratory signs, whereas the kids inoculated with the recombinant virus remained healthy and seroconverted to lower titers. The administration of dexamethasone on days 35 to 39 post-infection (pi) did not result in viral excretion in nasal secretions, indicating the absence of viral reactivation. However, viral DNA was detected in the trigeminal ganglia of 4 animals from the parental group (4/5) and 3 animals from the recombinant group (3/5), euthanized at day 14 pDx, indicating that both viruses established latent infection. These results demonstrated that the recombinant CpHV-1TK shows an attenuated phenotype in kids compared to the parental virus and, thus, may be a suitable strain for use as a CpHV-1 vaccine. O Alphaherpesvirus caprino 1 (CpHV-1) é um patógeno de cabras distribuído mundialmente, associado com infecções sistêmicas e doença respiratória em caprinos jovens e infecção subclínica ou doença reprodutiva e abortos em animais adultos. As perdas associadas com a infecção pelo CpHV-1 poderiam ser prevenidas por vacinação, no entanto não existem vacinas comerciais disponíveis. Assim, o presente trabalho teve como objetivo construir e caracterizar um recombinante do CpHV-1 com deleção no gene da enzima timidina quinase (TK) para potencial uso em vacinas. Um recombinante contendo deleção total no gene tk foi construído por recombinação homóloga, introduzindo-se em seu lugar o gene da proteína verde fluorescente (eGFP) para seleção dos recombinantes. A caracterização in vitro demonstrou que o recombinante CpHV-1TK replicou em títulos similares e produziu placas de tamanho semelhante ao vírus parental em cultivos celulares. Com isso, demonstrou-se que a deleção do gene tk não afetou a capacidade replicativa in vitro do vírus. Após inoculação intranasal em 5 cabritos por vírus (107 TCID50), o vírus parental replicou de forma mais eficiente e por um período de tempo maior que o vírus recombinante. Além disso, o vírus parental produziu sinais clínicos sistêmicos e respiratórios moderados, enquanto os animais inoculados com o recombinante CpHV-1TK permaneceram saudáveis e soroconverteram em títulos mais baixos. Administração de dexametasona nos dias 35 a 39 pós-infecção (pi) não resultou em excreção viral em secreções nasais dos animais inoculados, indicando ausência de reativação viral. Entretanto, o DNA viral foi detectado no gânglio trigêmeo de 4 animais do grupo parental (4/5) e em 3 animais do grupo recombinante (3/5), eutanasiados no dia 14 pDx, indicando que ambos os vírus estabeleceram infecção latente. Esses resultados demonstram que o recombinante CpHV-1TK apresenta um fenótipo atenuado em caprinos jovens em comparação com o vírus parental e, portanto, pode ser uma cepa apropriada para uso em vacina.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Parapoxvirus ovis (PPVO) or orf virus (ORFV) is the causative agent of contagious ecthyma (or orf), a mucocutaneous disease that affects mainly sheep and goats. The ORFV belongs to the family Poxviridae, subfamily Chordopoxvirinae and genus Parapoxvirus. The virions are enveloped and their genome consist of a linear, double stranded DNA molecule of approximately 138 kb and contains at least 131 genes. ORFV has several biological and genomic properties that make it an attractive candidate for a vaccine vector. Therefore, it has been proposed as a vaccine platform to carry heterologous genes of veterinary interest. The first study reports the construction and characterization of two ORFV recombinants out of the parental strain ORFV IA82, expressing the rabies virus glycoprotein G (RABVG) at the loci of ORFV024 or ORFV121 genes, respectively, and an evaluation of their immunogenicity in swine and cattle. The in vitro characterization showed that the recombinants ORFVΔ024RABV-G and ORFVΔ121RABV-G retained their replicative capacity in cell culture, compared to the parental virus. The recombinant viruses expressed RABV-G efficiently even after 10 passages in cell culture, demonstrating the stability of the inserts. Immunization of swine and cattle with ORFVΔ024RABV-G and ORFVΔ121RABV-G resulted in a robust neutralizing antibody response against the rabies virus (RABV). The neutralizing antibodies titers induced by ORFVΔ121RABV-G in swine and cattle were higher than those induced ORFVΔ024RABV-G, indicating a higher efficiency of ORFVΔ121 as a vector in these species. In a second study, ORFV mutants with individual deletions of genes ORFV112, ORFV117 or ORFV127 were constructed, characterized in vitro and inoculated experimentally in lambs. When characterized in vitro, the deletion mutants replicated in ovine fetal turbinate (OFTu) cells with the same efficiency of the parental virus, with no changes in replication kinetics, plaque size and morphology. Experimental inoculation of lambs at the mucocutaneous junction of the oral commissure demonstrated that individual deletions of ORFV112, ORFV117 or ORFV127 genes did not result in obvious changes in virulence, since the mutants produced lesions as severe as those induced by the parental virus. However, resolution of the lesions apparently occurred more rapidly in the animals inoculated with the mutant virus than in those inoculated with the parental virus. In addition, the mutant viruses were excreted from the lesions in lower titers than those of the parental virus. These results demonstrated that genes ORFV112, ORFV117 and ORFV127 are not essential for viability of ORFV in vitro and interfere only partially in ORFV virulence in lambs. A third study was conducted to compare the magnitude and duration of the serological response induced in cattle by four commercial vaccines against RABV. After two vaccinations 30-days apart, the animals received a booster vaccination one year later, and were subjected to serological tests for virus neutralizing (VN) antibodies at different intervals after vaccination and booster. The four vaccines were found to be suitably immunogenic, e.g., induced high titers of VN antibodies in the animals after primary vaccination. However, a marked decrease in antibody levels was observed prior to the annual booster. Therefore, it is recommended that annual revaccination protocols be reviewed, since part of the vaccinated animals no longer have adequate antibodies levels one year after vaccination. In summary, the experiments presented in this thesis demonstrate that ORFV represents a promising platform for vectoring vaccine antigens in swine and cattle and that, in addition to the ORFV024 and ORFV121 genes, loci ORFV112, ORF117 and ORFV127 can also be used for heterologous gene insertion. O Parapoxvirus ovis (PPVO) ou vírus da orf (ORFV) é o agente do ectima contagioso (ou orf), uma enfermidade mucocutânea que afeta principalmente ovinos e caprinos. O ORFV pertence à família Poxviridae, subfamília Chordopoxvirinae e gênero Parapoxvirus. Os vírions possuem envelope e o genoma consiste de uma molécula de DNA linear e de fita dupla, com aproximadamente 138 quilobases (kb) e contém pelo menos 131 genes. O ORFV possui várias propriedades biológicas e genômicas que o tornam um atraente candidato a vetor vacinal. Por isso, tem sido proposto como plataforma vacinal para vetorar genes heterólogos de interesse veterinário. Em um primeiro estudo, descreve-se a construção e caracterização de dois recombinantes do ORFV, a partir da cepa parental ORFV IA82, que expressam a glicoproteína G do vírus da raiva (RABV-G) nos loci dos genes ORFV024 ou ORFV121, respectivamente, e a avaliação da sua imunogenicidade em suínos e bovinos. A caracterização in vitro demonstrou que os recombinantes ORFVΔ024RABV-G e ORFVΔ121RABV-G não apresentaram alterações na capacidade replicativa em cultivo celular, comparando-se ao vírus parental. Foi demonstrado que os recombinantes expressam a RABV-G com eficiência, mesmo após 10 passagens em cultivo celular, demonstrando a estabilidade dessas inserções. A imunização de suínos e bovinos com o ORFVΔ024RABV-G e ORFVΔ121RABV-G resultou em resposta robusta de anticorpos neutralizantes contra o vírus da raiva (RABV). Os títulos de anticorpos induzidos pelo recombinante ORFVΔ121RABV-G em suínos e bovinos foram superiores aos induzidos pelo ORFVΔ024RABV-G, indicando uma maior eficiência do recombinante ORFVΔ121 como vetor nessas espécies. Em um segundo estudo, mutantes do ORFV com deleções individuais nos genes ORFV112, ORFV117 ou ORFV127 foram construídos, caracterizados in vitro e inoculados experimentalmente em cordeiros. Quando caracterizados in vitro, os mutantes de deleção replicaram em células de corneto etmoidal ovino (OFTu) com a mesma eficiência do vírus parental, sem alterações na cinética de replicação, tamanho e morfologia de placas virais. A inoculação experimental de cordeiros na junção mucocutânea da comissura oral demonstrou que as deleções individuais dos genes ORFV112, ORFV117 ou ORFV127 não resultaram em alterações evidentes de virulência, pois os mutantes produziram lesões tão severas quanto as induzidas pelo vírus parental. No entanto, a resolução das lesões aparentemente ocorreu de forma mais rápida nos animais inoculados com os vírus mutantes do que naqueles inoculados com o vírus parental. Além disso, os vírus mutantes foram excretados das lesões em títulos inferiores aos do vírus parental. Estes resultados demonstraram que os genes ORFV112, ORFV117 e ORFV127 não são essenciais para a viabilidade do ORFV in vitro ou in vivo e interferem apenas parcialmente na virulência em ovinos. Um terceiro estudo foi conduzido para comparar a magnitude e duração da resposta sorológica induzida em bovinos por quatro vacinas comerciais contra o RABV. Após duas vacinações com intervalo de 30 dias, os animais receberam reforço vacinal um ano após, sendo submetidos a pesquisa e quantificação de anticorpos neutralizantes a diferentes intervalos após a vacinação e reforço. Verificou-se que as quatro vacinas são adequadamente imunogênicas, ou seja, induziram altos títulos de anticorpos neutralizantes nos animais após a primovacinação. Porém, verificou-se um decréscimo acentuado nos níveis de anticorpos antes do reforço, de forma que vários animais já não apresentavam níveis adequados de anticorpos por ocasião do reforço. Assim, recomenda-se que os protocolos de revacinação anual sejam revistos, antecipando-se a data prevista para reforçar a vacinação. Em resumo, os experimentos apresentados na presente tese demonstram que o ORFV representa uma plataforma promissora para vetorar antígenos vacinais em suínos e bovinos e que, além dos genes ORFV024 e ORFV121, os loci ORFV112, ORFV117 e ORFV127 também podem ser utilizados para a inserção de genes heterólogos de interesse.