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RESUMEN: El concepto de quiralidad la atípica propiedad que muestra un objeto que no es superponible con su imagen especular es de gran importancia en diversos campos, entre ellos las ciencias de la salud, ya que muchas moléculas y biorreceptores exhiben esta naturaleza. En concreto, la distinción de enantiómeros las distintas formas en las que un objeto quiral se puede presentar es vital para el sector farmacéutico, puesto que diferentes enantiómeros pueden tener efectos distintos, a veces contraproducentes, en el cuerpo humano. La óptica ha jugado un importante papel en el reconocimiento de estos compuestos. En concreto, durante la última década, varias técnicas ópticas han sido desarrolladas para la diferenciación de enantiómeros, explotando el hecho de que la propia luz puede ser quiral dependiendo de su polarización. En este trabajo se estudia la respuesta electromagnética de sistemas quirales con el fin de encontrar una estructura que permita un sensado eficiente y selectivo de enantiómeros. En concreto, se ha realizado el diseño y caracterización de una metasuperficies plasmónica capaz de amplificar la respuesta quiro-óptica de muestras en una longitud de onda del infrarrojo cercano (NIR), y llevarla al rango ultravioleta (UV), donde se ubican los picos de absorción de la mayoría de moléculas; mediante la generación de tercer armónico. Partiendo de una celda unidad quiral, basada en una estructura conocida en la literatura, se realiza una optimización, obteniendo una señal de dicroísmo circular en campo lejano de -8◦ y valores del factor de disimetría en campo cercano superiores a ±2 a λ = 900 nm. La estructura ofrece una generación de tercer armónico quiral, con un dicroísmo circular asociado de 7◦ . Por otra parte, se ha realizado un estudio de la respuesta térmica de dicha celda unidad, empleando métodos de elementos finitos, demostrando que, a una intensidad de I = 10 mW/µm2 se produce un calentamiento moderado de la estructura y su entorno. El estudio se ha completado con el planteamiento en metasuperficie de la celda unidad propuesta, obteniendo una señal de dicroísmo circular en campo lejano de -14◦ y valores del factor de dissimetría en campo cercano en torno a ±2 a λ = 900 nm, además de un dicroísmo circular de tercer armónico de cerca de -20◦. ABSTRACT: The concept of chirality — an atypical property an object that cannot be superimposed with its mirror image shows — is of great importance in various fields, including life sciences, as many bioreceptors exhibit this nature. Specifically, the distinction between enantiomers different forms in which a chiral object can present itself – is very important for the pharmaceutical sector, as different enantiomers of the same molecule often have different effects in the human body. During the last decade, several enantiomer differentiation techniques based in optics have been developed, since light can be chiral depending on its polarization. In this work the electromagnetic response of different chiral systems is studied in order to find a structure able to enhance the chiroptical response of possible targets (enantiomers being sensed). In particular, the design and characterization of a plasmonic metasurface capable of enhancing the chiroptical response of samples put onto it, at a near infrarred wavelength; has been performed. This chiroptical amplification consisted also on the differential generation of a Third Harmonic chiral wave at a ultraviolet wavelength, where molecules often have their absorption peaks. Using a chiral unit cell based on a well-known structure from the literature, an optimization process has been carried out, obtaining a Circular Dichroism signal of -8◦ in the far field regime and dissymmetry factor values over ±2 in the near field, at a wavelength λ = 900 nm. The unit cell structure also offered a chiral Third Harmonic Generation, with an associated Circular Dichroism signal of 7◦. A thermal response study has also been performed on the unit cell structure using Finite Element Methods. It has been demonstrated that with a standard illumination intensity of I = 10 mW/µm2, mild temperature increments are observed in the structure and its surroundings. The study has been completed with a metasurface treatment of the unit cell, obtaining a Circular Dichroism signal of -14◦ in the far field and dissymmetry factor values near ±2in the near field, at a wavelength λ = 900 nm . The Circular Dichroism signal associated with the metasurface Third Harmonic Generation was of about -20◦. Máster en Ciencia e Ingeniería de la Luz

Dissertação de Mestrado em Química Medicinal apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia O estudo de pequenos peptídeos tem vindo a mostrar-se bastante relevante para uma melhor compreensão do processo de folding (enrolamento) proteico, pois estes pequenos fragmentos podem ser fulcrais na condução deste processo de enrolamento. Assim, estas sequências de aminoácidos podem ser retiradas de proteínas e realizar o seu folding numa solução aquosa e consequentemente adquirir a sua estrutura nativa típica. Além disso, são também bastante importantes para o estudo de colapsos hidrofóbicos, da formação de pontes de hidrogénio intramoleculares e para o estudo do empacotamento de cadeias laterais. Motivos como hélices-α e ganchos-β são muitas vezes utilizados nesta área da ciência, sendo que estes últimos são os mais simples de caracterizar.O peptídeo Chignolin é a estrutura mais pequena em gancho-β conhecida que é solúvel em água. É constituído por 10 resíduos de aminoácidos (GYDPETGTWG) e embora ainda não se conheça bem a sua cinética de folding julga-se que esta ocorra numa escala de nano ou microssegundos. No entanto a ordem em que estes acontecimentos ocorrem gera bastante controvérsia dentro da comunidade científica.Com o objetivo de estudar o papel de aminoácidos ionizáveis nas alterações conformacionais do peptídeo, pretende-se utilizar as técnicas de dicroísmo circular (CD), calorimetria fotoacústica resolvida no tempo (TR-PAC) e mecânica molecular. A combinação destas técnicas contribuirá para o aprofundamento do conhecimento do mecanismo de refolding da chignolin, nomeadamente no que concerne à sua cinética. The study of small peptides has revealed itself highly relevant for a better understanding of the protein folding process, since these small fragments can be crucial in driving this folding process. Thus, these amino acid sequences can be removed from proteins and perform their folding in aqueous solution and consequently acquire their typical native structure. Moreover, they are also quite important for the study of hydrophobic collapses, the formation of intramolecular hydrogen bridges and for the study of side-chain packing. Motifs such as α-helices and β-hairpins are often used in this area of science, the latter being the simplest motif to characterise.The Chignolin peptide is the smallest known hairpin-β structure that is soluble in water. It consists of 10 amino acid residues (GYDPETGTWG) and although its folding kinetics are not yet well known it is thought to occur on a nano or microsecond timescale. However, the order in which these events occur is quite controversial within the scientific community.In order to study the role of ionizable amino acids have in the conformational changes of the peptide, we intend to use the techniques like circular dichroism (CD), time-resolved photoacoustic calorimetry (TR-PAC) and molecular mechanics. The combination of these methods will contribute to a better understanding of chignolin’s refolding mechanism, particularly with respect to its kinetics. The combination of these methods will contribute to a better understanding of chignolin’s refolding mechanism, particularly with respect to its kinetics.

Made available in DSpace on 2022-01-11T17:20:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 8654_18359.pdf: 3357119 bytes, checksum: 9700e875a0ebf921697bf494ec80d154 (MD5) Previous issue date: 2021-11-17

Orientador: Jorg Kobarg Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A infecção crônica pelo vírus da hepatite B (HBV) é uma das causas do desenvolvimento do câncer de fígado. O genoma do HBV codifica a onco-proteína HBx, uma proteína multi-funcional de 17 kDa que possui 10 resíduos de cisteína, e que está relacionada com a indução do câncer de fígado em camundongos transgênicos para HBx. Apesar de não ter uma função definida, sabe-se que a proteína HBx é um potente trans-ativador transcricional, ativando a transcrição de muitos promotores virais e celulares através de interações proteína-proteína, uma vez que HBx não interage diretamente com o DNA de fita dupla. Desta forma, HBx pode afetar a replicação e proliferação virais, e interferir nos processos celulares de apoptose e carcinogênese. Neste trabalho, a proteína HBx foi expressa em E. coli, em fusão com a proteína GST ou com a cauda de poli-histidina, e utilizada em ensaios funcionais e estruturais. Através de ensaios de retardamento da mobilidade eletroforética e UV cross-linking, observou-se que a proteína HBx possui uma afinidade maior pelos oligonucleotídeos de RNA ricos em bases "A", "V" e "AV", com tamanho superior a 21-mer, e que os resíduos de cisteína não interferiram na ligação da HBx com o oligonucleotídeo de RNA AV-38. A ausência dos resíduos de eisteína da proteína HBx também não interferiu na ativação do promotor alvo para a proteína p53, em sistema de mono-híbrido em levedura, nem tampouco na interação in vitro da HBx com a proteína humana p53, o que foi confirmado através de um ensaio de co-precipitação. Em cultura de células HeLa, a proteína HBx causou um aumento do crescimento celular e uma leve uma estabilização dos mRNAs dos proto-oncogenes c-fos e c-myc, como mostraram os ensaios de cinética de degradação de mRNAs, e esta estabilização poderia contribuir para o fenótipo transformador da onco-proteína HBx. Os experimentos de dicroísmo circular e de fluorescência mostraram que a proteína HBx encontrava-se parcialmente estruturada em solução aquosa, mas apresentou uma tendência à estruturação sob determinadas condições experimentais, o que poderia ser uma conseqüência de uma provável flexibilidade conformacional inerente à proteína HBx. Vma estrutura flexível poderia explicar as interações observadas entre a HBx e uma variedade de proteínas celulares e ácidos nucléicos de fita simples, de modo que a proteína HBx poderia interferir nos processos de sinalização, transcrição, apoptose e nos mecanismos de reparo de DNA, que levariam ao desenvolvimento do câncer de fígado Abstract: Chronic infection of the hepatitis B virus (HBV) is one of the causes leading to liver cancer. The HBV genome encodes the 17 kDa onco-protein HBx, a multi-functional protein that contains 10 cysteine residues and is related to induce liver cancer in transgenic mice. The exact function of HBx is still unknown. However, it has been shown that HBx is a potent trans-activator, which activates transcription of many cellular and viral promoters indirecdy through protein-protein interactions, although it does not bind to double-stranded DNA direcdy. Besides, the HBx protein can affect viral replication and proliferation, and it interferes with cellular apoptosis and carcinogenesis. In this work, the recombinant HBx protein was expressed in E. coli as a GST or 6xHis fusion protein, and used in functional and structural assays. By Electrophoretic Mobility Shift Assay and UV cross-linking assays, it was observed that the HBx protein was able to bind to the "A", "V" and "AV" rich RNA oligonucleotides, and that the cysteine residues of the HBx protein were not required for its binding to the AV-rich RNA oligonucleotide (AV-38). The lack of cysteine residues in the HBx protein did not interfere with the pS3 promoter activation in the yeast one-hybrid system, or neither in the in vitro interaction through a co-precipitation assay of the HBx and human p53 protein. In HeLa cells, the HBx protein increased the cellular growth and caused a slight c-fos and c-myc mRNA stabilization. This mRNA stabilization could contribute for the transforming character of the onco-protein HBx. Both the circular dichroism and fluorescence spectroscopic assays had shown that the HBx protein was partially structured in aqueous solution, but the protein presented a propensity to gain secondary structure under specific experimental conditions. The HBx inherent conformational flexibility might explain its interaction with a wide array of cellular proteins and single-stranded nucleic acids, in a way that the HBx protein interferes with signaling cellular processes, modulates transcription, apoptosis and DNA repair, and contributes to the development of the liver cancer Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

The concept of chirality — an atypical property an object that cannot be superimposed with its mirror image shows — is of great importance in life sciences, as many bioreceptors exhibit this nature. Specifically, the distinction between enantiomers — different forms in which a chiral object can present itself – is very important for the pharmaceutical sector, as different enantiomers of the same molecule often have different effects in the human body. During the last decade, several enantiomer differentiation techniques based in optics have been developed, since light can be chiral depending on its polarization. In this work the electromagnetic response of different chiral systems is studied in order to find a structure able to enhance the chiroptical response of possible targets (enantiomers being sensed). In particular, design and characterization of metasurfaces capable of generating Surface Plasmon Polaritons (SPP) – interaction between light and the conduction electrons of a metal – has been performed. A novel metasurface that combines chiroptical enhancement and excitation of directional plasmons has been proposed to improve the current chiral biosensing techniques. REUMEN : El concepto de quiralidad — la atípica propiedad que muestra un objeto que no es superponible con su imagen especular — es de gran importancia para las ciencias de la salud, ya que muchas moléculas y biorreceptores exhiben esta naturaleza. En concreto, la distinción de enantiómeros — las distintas formas en las que un objeto quiral se puede presentar – es vital para el sector farmacéutico, puesto que diferentes enantiómeros pueden tener efectos distintos, a veces contraproducentes, en el cuerpo humano. La óptica ha jugado un importante papel en el reconocimiento de estos compuestos. En concreto, durante la última década, varias técnicas ópticas de diferenciación de enantiómeros han sido desarrolladas, utilizando el hecho de que la propia luz puede ser quiral dependiendo de su polarización. En este trabajo se estudia la respuesta electromagnética de sistemas quirales con el fin de encontrar una estructura que permita un sensado eficiente y selectivo de enantiómeros. En particular, se ha realizado el diseño y caracterización de metasuperficies capaces de generar resonancias plasmónicas superficiales (SPP) – interacciones entre la luz y los electrones de conducción de un metal. Se ha propuesto una novedosa metasuperficie capaz de combinar una amplificación de la respuesta quiral de muestras y la excitación unidireccional de plasmones superficiales, algo que permite una mejora significativa en las técnicas de biosensado quiral actuales. Grado en Física

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O gene que codifica a proteína INT6 corresponde a um dos sítios de inserção do vírus de tumor de glândula mamária em camundongo (MMTV). Esta inserção pode levar à formação de proteínas truncadas sem a porção C-terminal e sem o domínio PCI, descrito como domínio de interação entre proteínas. Neste trabalho, realizamos 3 triagens para a identificação dos ligantes protéicos da proteína humana INT6 (hINT6) pelo método do duplo-híbrido de levedura. Embora interações específicas tenham sido identificadas, não foi possível a confirmação in vitro das novas interações isoladas. Para análises estruturais, usamos a proteína INT6 de Arabidopsis thaliana (AtINT6), visto que a proteína humana expressou em níveis muito baixos na fração solúvel do extrato de Escherichia coli. Análises de dicroísmo circular revelaram que a proteína AtINT6 é rica em estrutura do tipo a-hélice. A região que compreende os aminoácidos 172 a 415, incluindo o domínio PCI, foi identificada por proteólise parcial e espectrometria de massas como um domínio estrutural que após sua clonagem apresentou alto nível de expressão, solubilidade e estabilidade. Este trabalho envolveu também a caracterização da NY-REN-21, que foi isolada pelo duplo-híbrido para a identificação dos ligantes protéicos da proteína hINT6 e representa uma possível ortóloga para o fator de transcrição ZFP38 de camundongo. Ambas as proteínas apresentam um domínio de dimerização (SCAN), 7 domínios dedos de zinco tipo C2H2 na porção C-terminal e uma região central predita como desestruturada. A proteína NY-REN-21 se mostrou parcialmente desenovelada e sua estrutura secundária é afetada pela incubação com EDTA. Ensaios de proteólise limitada, dicroísmo circular e fluorescência confirmaram que sua região central é intrinsicamente desordenada, além de apresentar mobilidade anômala em gel de SDS-PAGE e representa uma fração flexível da proteína. Não foi possível a caracterização da região dos dedos de zinco, pois esta região se mostrou altamente instável. O domínio SCAN da NY-REN-21 é capaz de formar homodímeros e heterodímeros com a proteína SCAND1. Esta interação pode representar uma forma de regulação da atividade da proteína NY-REN-21 Abstract: The INT6 gene was reported as a frequent genome integration site of Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV). This integration may result in truncated forms of INT6 protein lacking its C-terminal region and the PCI domain. It has been reported that this domain is involved in protein-protein interaction. We performed 3 yeast two-hybrid screens in order to identify the human INT6 (hINT6) interaction partners. Although two previously described specific interactions were identified in these screens, it was not possible to confirm the new interactions by in vitro binding assays. The Arabidopis thalina INT6 ortholog (AtINT6) was used for structural analyses, since the hINT6 was insoluble following expression in Escherichia coli. AtINT6 showed CD spectra with high helical content. The region comprising amino acids 172 to 415 forms a compact protease resistant domain as determined by limited proteolysis and mass spectrometry analyses. This domain, comprising the PCI domain sequence, was cloned and expressed in E. coli and showed high solubility and stability. This recombinant protein has the potential to serve as a model protein for three-dimensional structure determination of the PCI domain. We also studied the NY-REN-21 protein, which was isolated as a potential hINT6 interaction partner and represents a putative ortholog of the mouse ZFP38 transcriptional factor. Both proteins are C2H2 type multifinger proteins, containing a conserved oligomerization domain (SCAN) in the N-terminal region and a predicted disordered central region. Our analyses showed that full-length NY-REN-21 is partially unfolded and its secondary structure content is affected by incubation with EDTA. The central region of NY-REN-21 shows an aberrant mobility on SDS-PAGE and is intrinsically unstructured as reveled by circular dichroism, fluorescence and limited proteolysis. The zinc finger region was not characterized because of its unstable nature. The recombinant SCAN domain of NY-REN-21 can form homodimers and heterodimers with the SCAND1 protein. This interaction may represent a novel regulatory mechanism of NY-REN-21 activity Doutorado Genética Animal e Evolução Doutor em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Iscia Teresinha Lopes Cendes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A análise molecular de proteínas é um componente crítico para o entendimento da molécula como um todo e de suas interações com outras moléculas nos mecanismos celulares. O papel de uma proteína no contexto celular fornece informações fundamentais para o entendimento de mecanismos biológicos causadores de muitas doenças hereditárias, cujas formas de tratamento ou cura são desconhecidas. Para que estas causas sejam elucidadas é necessário o entendimento dos processos de funcionamento das células, que em ultima análise depende essencialmente da descoberta das interações proteína-proteína no ambiente celular. Dentro deste contexto, é grande o interesse nas proteínas envolvidas nos mecanismos causadores de uma classe de doenças neurodegenerativas hereditárias por repetições de poliglutaminas (poliQ), as ataxias espinocerebelares (SCAs). Dentre elas nosso interesse recaiu sobre a proteína relacionada à doença ataxia espinocerebelar do tipo1 (SCA1). A mutação responsável pela SCA1 foi atribuída a expansões instáveis de poliQ localizadas na região codificadora do gene ATX1 que codifica uma proteína, a ataxina 1. A ataxina 1 apresenta entre 782-869 aminoácidos dependendo do número de glutaminas, tem massa molecular de aproximadamente 100 kDa, e é normalmente uma proteína predominantemente citoplasmática. No entanto, nos estados patológicos ela parece agregarse no núcleo dos neurônios de pacientes com a SCA1 (Paulson et al., 1997). O papel exato da proteína ataxina 1 normal ainda é desconhecido, embora evidências sugiram que sua função possa estar ligada a fatores de transcrição (Tsai et al., 2004). O mesmo acontece com o único domínio identificado e caracterizado na ataxina denominado AXH (De Chiara et al., 2005), que exibe uma similaridade significativa com a proteína HBP1 que age como ativador da transcrição para diversos genes (Levender et al., 1997; Tevosian et al., 1997). Neste estudo, o objetivo principal foi expressar e purificar o domínio AXH da proteína ataxina 1 e fragmento com poliQ nas formas normal e mutada, a fim de caracterizar essas regiões quanto às suas propriedades moleculares através da aplicação de técnicas de dicroísmo circular e raios-X de baixo ângulo Abstract: Molecular analysis of proteins is a critical component to understanding the molecule as a whole and its interactions with other molecules in cellular mechanisms. The role of a protein in the cellular context provides information essential to understanding the biological mechanisms that cause many inherited diseases whose treatment or cure are unknown. For these causes are elucidated it is necessary to understanding the processes of cell function, which ultimately depends essentially on the discovery of protein-protein interactions in cellular environment. Within this context, it is great interest in the proteins involved in the mechanisms causing a class of hereditary neurodegenerative diseases by repeats of polyglutamine (poliQ), the spinocerebellar ataxias (SCAs). Among them our interest fell on the protein related to the disease spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1). The mutation responsible for SCA1 was attributed to unstable expansions of poliQ located in the coding region of ATX1 gene that encodes a protein ataxin 1. Ataxin- 1 shows between 782-869 amino acids depending on the number of glutamine, has a molecular mass of approximately 100 kDa, and is usually a predominantly cytoplasmic protein. However, in pathological states it seems to aggregate in the nucleus of neurons of patients with SCA1 (Paulson et al., 1997). The exact role of the protein ataxin-1 standard is still unknown, although evidence suggests that its function may be linked to transcription factors (Tsai et al., 2004). The same applies to the only area identified and characterized in ataxin named AXH (De Chiara et al., 2005), which displays a significant similarity to HBP1 protein that acts as an activator of transcription for several genes (Levender et al., 1997; Tevosian et al., 1997). In this study, the main objective is to express and purify the AXH domain of ataxin-1 protein in normal and mutated forms in order to characterize this region in terms of some of its molecular properties with the application of the techniques of circular dichroism and X-rays of low angle Doutorado Ciências Biomédicas Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Marco Aurelio Zezzi Arruda Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica Resumo: Nesta dissertação foi estudado o comportamento de partição da albumina, proteína presente em elevada concentração no plasma sangüíneo e que interfere na determinação em diversas técnicas analíticas. No estudo efetuado foram avaliados diferentes sistemas aquosos de duas fases, explorando um fenômeno denominado ponto nuvem. Tais sistemas empregam surfactantes, sob condições experimentais específicas, obtendo-se a formação de duas fases imiscíveis: uma rica e outra pobre em tensoativo. Observou-se que devido às características hidrofílicas da albumina, bem como à dimensão dos agregados formados, sua extração para fase rica em tensoativo apresenta valores de coeficiente de partição que não ultrapassam 0,66 o que representa uma eficiência de extração de ca.40%. A extração da proteína apresentou-se viável mediante a utilização de uma mistura composta por um tensoativo não-iônico (Triton® X-114), que possibilita a separação de fases em temperatura biocompatível, na presença de outro tensoativo iônico (dodecil sulfato de sódio - SDS), que atua favorecendo as interações eletrostáticas entre os agregados e as moléculas protéicas, desde que se trabalhe em meio com pH abaixo de 5,0. Análises de dicroísmo circular complementaram o estudo e fornecerem evidências de que a aplicação do sistema baseado na mistura composta por Triton® X-114 e SDS causava desnaturação parcial da proteína, o que não inviabilizou sua aplicação para extração da mesma em uma amostra real. A eficiência deste sistema foi, então, avaliada para a remoção de albumina em plasma sangüíneo. Um coeficiente de partição de 1,1 foi obtido, indicando que ca.51% das proteínas encontravam-se na fase rica em tensoativo. As amostras submetidas ao procedimento de extração também foram avaliadas frente à técnica de eletroforese em gel, sendo que a fase pobre em sufactante apresentou um perfil eletroforético mais detalhado quando comparada a uma amostra que não foi submetida ao procedimento proposto. Já na fase rica em surfactante, foi observada a presença majoritária de albumina e, em menor concentração, outras proteínas de grande abundância no plasma tais como imunoglobulina G e transferrina. Por fim, o método apresentou desempenho semelhante ao de sistemas disponíveis comercialmente para remoção de albumina, tal como o sistema da Millipore®, apresentado neste trabalho Abstract: In this work the partition behavior of albumin was studied, which is found at high concentrations in blood plasma, which interferes in many analytical techniques determinations. The present study evaluated different aqueous two-phase systems, exploiting a phenomenon called of cloud point. These systems employ surfactants under specific experimental conditions, enabling formation of two immiscible phases: one rich and another poor in surfactant. Due to the hydrophilic characteristcs of albumin, as well as its aggregate dimensions, its extration to the surfactant rich phase presented partition coefficients lower than 0.66, representing and extraction efficiency of ca. 40%. Protein extraction was feasible by applying a mixture comprised of a nonionic surfactant (Triton® X-114), which allowed the phase separation at biocompatible temperatures, and an ionic one (sodium dodecylsufate - SDS), wich promotes eletrostatic interactions between aggregates and protein molecules, since the extraction procedure is carried out at pH 5.0. Circular dichroism analysis complemented the study and it showed that a system based on a Triton® X-114 and SDS mixture causes partial protein denaturation, but its application for a real sample is feasible. The efficiency of this was evaluated for albumin removal from blood plasma. A partition coefficient of 1.1 was obtained, indicating that ca. 51% of proteins were contained in the surfactant rich phase. Albumin depleted samples were submitted to gel eletrophoresis and the surfactant poor phase presented a more detailed gel electrophoresis profile, when compared with a crude sample. The surfactant rich phase reveled that albumin is the predominant protein present, but it is possible to find other highly concentrated plasmatic proteins including immunoglobulin G and transferrin. Finally, the method presented similar performance when compared with commercially available systems for albumin removal, such as the Millipore® system, wich was also evaluated in this work Mestrado Química Analítica Mestre em Química

Made available in DSpace on 2021-12-23T14:16:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 8102_17462.pdf: 3503773 bytes, checksum: 06850532bb7cb23aa4f10de30433ecbd (MD5) Previous issue date: 2021-03-12

The concept of chirality — an atypical property an object that cannot be superimposed with its mirror image shows — is of great importance in life sciences, as many bioreceptors exhibit this nature. Specifically, the distinction between enantiomers — different forms in which a chiral object can present itself – is very important for the pharmaceutical sector, as different enantiomers of the same molecule often have different effects in the human body. During the last decade, several enantiomer differentiation techniques based in optics have been developed, since light can be chiral depending on its polarization. In this work the electromagnetic response of different chiral systems is studied in order to find a structure able to enhance the chiroptical response of possible targets (enantiomers being sensed). In particular, design and characterization of metasurfaces capable of generating Surface Plasmon Polaritons (SPP) – interaction between light and the conduction electrons of a metal – has been performed. A novel metasurface that combines chiroptical enhancement and excitation of directional plasmons has been proposed to improve the current chiral biosensing techniques. REUMEN : El concepto de quiralidad — la atípica propiedad que muestra un objeto que no es superponible con su imagen especular — es de gran importancia para las ciencias de la salud, ya que muchas moléculas y biorreceptores exhiben esta naturaleza. En concreto, la distinción de enantiómeros — las distintas formas en las que un objeto quiral se puede presentar – es vital para el sector farmacéutico, puesto que diferentes enantiómeros pueden tener efectos distintos, a veces contraproducentes, en el cuerpo humano. La óptica ha jugado un importante papel en el reconocimiento de estos compuestos. En concreto, durante la última década, varias técnicas ópticas de diferenciación de enantiómeros han sido desarrolladas, utilizando el hecho de que la propia luz puede ser quiral dependiendo de su polarización. En este trabajo se estudia la respuesta electromagnética de sistemas quirales con el fin de encontrar una estructura que permita un sensado eficiente y selectivo de enantiómeros. En particular, se ha realizado el diseño y caracterización de metasuperficies capaces de generar resonancias plasmónicas superficiales (SPP) – interacciones entre la luz y los electrones de conducción de un metal. Se ha propuesto una novedosa metasuperficie capaz de combinar una amplificación de la respuesta quiral de muestras y la excitación unidireccional de plasmones superficiales, algo que permite una mejora significativa en las técnicas de biosensado quiral actuales. Grado en Física

[Resumen]: El presente Trabajo de Fin de Máster se centra en la síntesis, purificación y caracterización de dos ciclofanos (Nf4+ y Bi4+), análogos al macrociclo RedBox (Rb4+), previamente sintetizado por el grupo de investigación QUIMOLMAT. Además, se estudió la interacción entre la Rb4+/Bi4+ con distintas estructuras de ADN G-cuádruplex (h-TELO, c-MYC y Hairpin): mediante valoraciones UV-Vis y DC y, a través de estudios in silico mediante docking molecular. Dichos estudios tienen como objetivo principal demostrar la interacción entre ambas especies y tratar de racionalizarla, dentro de la búsqueda de nuevos fármacos antitumorales. [Abstract]: This Final Master’s Thesis focuses on the synthesis, purification and characterization of two cyclophanes (Nf4+ and Bi4+), analogues of the macrocycle RedBox (Rb4+), previously synthesized by the QUIMOLMAT research group. In addition, the interaction between the Rb4+/Bi4+ with different G-quadruplex DNA structures (h-TELO, c-MYC and Hairpin) was studied: by UV-Vis and CD titrations and, through in silico studies by molecular docking. The main objective of these studies is to demonstrate the interaction between both species and its rationalization, within the context of the discovery of new antitumor drugs. Traballo fin de mestrado (UDC.CIE). Investigación química y química industrial. Curso 2020/2021

RESUMEN: En este trabajo se han estudiado metamateriales quirales 3D al incidir sobre ellos con ondas electromagnéticas a frecuencias de microondas. Para ello, se han propuesto las estructuras \Diente de Sierra" y \Zig Zag" y se ha observado su respuesta electromagnética a partir de la actividad óptica y el dicroísmo circular, efectos principales producidos por el comportamiento quiral. El análisis se ha efectuado mediante el software de simulación EMPro Keysight que ha facilitado la extracción y la presentación de los resultados. En particular, la investigación se ha centrado en mejorar la respuesta quiral a través de la propiedad de la quiralidad extrínseca, que se pone de manifiesto rotando la estructura según el eje y. De esta forma, la incidencia se considera oblicua con un determinado ángulo respecto a la normal del material. Se ha observado que para ciertas situaciones se producen resonancias en anchos de banda donde antes no había respuesta alguna, y que estos casos muestran resultados significativos de actividad óptica y dicroísmo circular. ABSTRACT: In this proyect, it has been studied 3D chiral metamaterials falling upon them with electromagnetic waves at microwave frequencies. In order to do that, it has been put the structures \Diente de Sierra" and \Zig Zag" forward. It has been observed its electromagnetic response from optical activity and circular dichroism which are the main effects produced by the chiral behavior. The analysis has been carried out by the simulation software EMPro which has made easier the extraction and presentation of the results. In particular, the investigation has been focused on improving the chiral response through the property of extrinsic chirality, which is brought to light by spinning the structure by the y axes. In this way, the incidence is considered as oblique with a given angle in relation to the normal of the material. It has been observed that, for certain situations, resonances are produced in bandwidths where there was not any response before. Additionally, it has been seen that this cases show significant results of optical activity and circular dichroism. Grado en Física

RESUMEN: En este trabajo se estudia la posibilidad de amplificar el dicroísmo circular que presentan los compuestos quirales, que es un fenómeno usado para realizar mediciones de espectroscopía que permiten la distinción entre las dos “formas” en las que se puede presentar una molécula quiral (enantiómeros R y S). El problema se ha abordado desde el campo de la nanofotónica, que estudia la interacción de la radiación con la materia en la nanoescala, en concreto, en nanofotónica se estudian las novedosas técnicas de control de luz que ofrecen los materiales nanoestructurados. Así, se ha estudiado la posibilidad de usar nanoestructuras que modifiquen adecuadamente la luz en torno a ellas para que las moléculas depositadas aumenten su dicroísmo circular. Mediante técnicas de nanofotónica se han reproducido resultados de trabajos en este área y se ha propuesto y estudiado una nueva y prometedora estructura. En concreto, esta estructura consiste en una esfera de silicio con una hendidura. Esta geometría produce efecto nanoantena para determinadas polarizaciones y longitudes de onda de la onda incidente. Además, como todas las estructuras estudiadas, es sintonizable espectralmente. Sin embargo, aunque bajo determinadas condiciones se dan situaciones en las que se favorecerían las medidas de dicroísmo circular de moléculas en la cavidad, estas no coinciden con aquellas en las que se consigue efecto nanoantena y por tanto la estructura no es óptima. ABSTRACT: In this work we study the possibility of amplifying the circular dichroism that chiral compounds present, which is a phenomenon used to perform spectroscopy measurements that allow the distinction between the two “ways” in which a chiral molecule can be presented (enantiomers R and S). The problem has been addressed from the field of nanophotonics, which studies the interaction of radiation with matter at the nanoscale, specifically, in nanophotonics, the novel light control techniques offered by nanostructured materials are studied. Thus, the possibility of using nanostructures that adequately modify the light around them has been studied so that the deposited molecules increase their circular dichroism. Using nanophotonics techniques, the results of works in this area have been reproduced and a promising new structure has been proposed and studied. Specifically, this structure consists of a silicon sphere with a slit. This geometry produces a nanoantenna effect for certain polarizations and wavelengths of the incident wave. Furthermore, like all the structures studied, it is spectrally tunable. However, although under certain conditions there are situations in which circular dichroism measurements of molecules in the cavity would be favored, these do not coincide with those in which the nanoantenna effect is achieved and therefore the structure is not optimal. Grado en Física

RESUMEN: En este trabajo se estudia la posibilidad de amplificar el dicroísmo circular que presentan los compuestos quirales, que es un fenómeno usado para realizar mediciones de espectroscopía que permiten la distinción entre las dos “formas” en las que se puede presentar una molécula quiral (enantiómeros R y S). El problema se ha abordado desde el campo de la nanofotónica, que estudia la interacción de la radiación con la materia en la nanoescala, en concreto, en nanofotónica se estudian las novedosas técnicas de control de luz que ofrecen los materiales nanoestructurados. Así, se ha estudiado la posibilidad de usar nanoestructuras que modifiquen adecuadamente la luz en torno a ellas para que las moléculas depositadas aumenten su dicroísmo circular. Mediante técnicas de nanofotónica se han reproducido resultados de trabajos en este área y se ha propuesto y estudiado una nueva y prometedora estructura. En concreto, esta estructura consiste en una esfera de silicio con una hendidura. Esta geometría produce efecto nanoantena para determinadas polarizaciones y longitudes de onda de la onda incidente. Además, como todas las estructuras estudiadas, es sintonizable espectralmente. Sin embargo, aunque bajo determinadas condiciones se dan situaciones en las que se favorecerían las medidas de dicroísmo circular de moléculas en la cavidad, estas no coinciden con aquellas en las que se consigue efecto nanoantena y por tanto la estructura no es óptima. ABSTRACT: In this work we study the possibility of amplifying the circular dichroism that chiral compounds present, which is a phenomenon used to perform spectroscopy measurements that allow the distinction between the two “ways” in which a chiral molecule can be presented (enantiomers R and S). The problem has been addressed from the field of nanophotonics, which studies the interaction of radiation with matter at the nanoscale, specifically, in nanophotonics, the novel light control techniques offered by nanostructured materials are studied. Thus, the possibility of using nanostructures that adequately modify the light around them has been studied so that the deposited molecules increase their circular dichroism. Using nanophotonics techniques, the results of works in this area have been reproduced and a promising new structure has been proposed and studied. Specifically, this structure consists of a silicon sphere with a slit. This geometry produces a nanoantenna effect for certain polarizations and wavelengths of the incident wave. Furthermore, like all the structures studied, it is spectrally tunable. However, although under certain conditions there are situations in which circular dichroism measurements of molecules in the cavity would be favored, these do not coincide with those in which the nanoantenna effect is achieved and therefore the structure is not optimal. Grado en Física

Neste presente trabalho foi descrito o isolamento de dois diastereoisômeros a partir de uma reação de adição de Michael enantiosseletiva entre a furan-2(5H)-ona com o (E)- (2-nitrovinil)benzeno, catalisada por um complexo de zinco dinuclear. As configurações relativas dos dois diastereoisômeros foram atribuídas por comparação entre os dados do deslocamento químico experimental de RMN dos produtos com aqueles calculados por meio do método da DFT. Erro médio absoluto (MAE) e análise CP3 foram usados para comparar o conjunto de dados. A configuração absoluta de cada diastereoisômero foi inicialmente atribuída por análise de dicroísmo circular eletrônico (ECD), o qual foi consistente com a estrutura cristalográfica de Raio-X já conhecida para uma reação relacionada cujo produto foi nomeado (R)-5-((R)-1-(4- clorofenil)-2-nitroetil)furan-2(5H)-ona. In the present work we describe the isolation of two diastereoisomers from the enantioselective Michael addition of furan-2(5H)-one to (E)-(2-nitrovinyl)benzene catalyzed by dinuclear Zn-complex. The relative configurations of the diastereoisomers were assigned by comparing NMR experimental chemical shift data with those computed by DFT methods. Mean Absolute Error (MAE) and CP3 analyses were used to compare the data sets. The absolute configuration of each diastereoisomer was initially assigned by Electronic Circular Dichroism (ECD) analysis, which was consistent with that of the known X-ray crystallographic structure of the product of a related reaction, namely (R)-5-((R)-1-(4-chlorophenyl)-2-nitroethyl)furan-2(5H)-one.

Agradecimentos: ESRF is acknowledged for concession of beamtime. This work was supported by FAPESP Grants No. 2017/10581-1 and No. 2018/20142-8, and CNPq Grants No. 409504/2018-1 and No. 308607/2018-0, Brazil Abstract: The Fe electronic structure and magnetism in (i) monoclinic Ca2FeReO6 with a metal-insulator transition at T-MI similar to 140 K and (ii) quasicubic half-metallic Ba2FeReO6 ceramic double perovskites are probed by soft x-ray absorption spectroscopy (XAS) and magnetic circular dichroism (XMCD). These materials show distinct Fe L-2,L-3 XAS and XMCD spectra, which are primarily associated with their different average Fe oxidation states (close to Fe3+ for Ca2FeReO6 and intermediate between Fe2+ and Fe3+ for Ba2FeReO6) despite being related by an isoelectronic (Ca2+/Ba2+) substitution. For Ca2FeReO6, the powder-averaged Fe spin moment along the field direction (B = 5 T), as probed by the XMCD experiment, is strongly reduced in comparison with the spontaneous Fe moment previously obtained by neutron diffraction, consistent with a scenario where the magnetic moments are constrained to remain within an easy plane. For B = 1 T, the unsaturated XMCD signal is reduced below T-MI consistent with a magnetic transition to an easy-axis state that further reduces the powder-averaged magnetization in the field direction. For Ba2FeReO6, the field-aligned Fe spins are larger than for Ca2FeReO6 (B = 5 T) and the temperature dependence of the Fe magnetic moment is consistent with the magnetic ordering transition at T-C(Ba) = 305 K. Our results illustrate the dramatic influence of the specific spin-orbital configuration of Re 5d electrons on the Fe 3d local magnetism of these Fe/Re double perovskites CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Fechado

Agradecimentos: The authors would like to dedicate this work to Prof. Dra. Maria Lúcia Belém-Pinheiro from UFAM, Brazil, for her contributions for more than 30 years to the study of the chemistry of natural product from the Amazon region. We are also grateful to Prof. Dr. A. C. Webber of UFAM for botanical identification, M. Sc. Renan Galaverna from UNICAMP, Brazil, for the ECD measurements, and Central Analítica (UFAM) for the NMR and MS analysis. We acknowledge the funding foundations FAPEAM, CAPES, CNPq, FINEP, and FAPESB In addition to seven known alkaloids (2, 6-11) and 1,2,4-trimethoxybenzene (1), three isoquinoline-derived alkaloids (3-5), namely, duguetinine (3), a compound based on an unprecedented oxahomoaporphine scaffold, and two new 8-oxohomoaporphine alkaloids, duguesuramine (4) and 11-methoxyduguesuramine (5), and a new asarone-derived phenylpropanoid (10) were isolated from the bark of Duguetia surinamensis. The isolation workflow was guided by HPLC-HRESIMS/MS and molecular networking-based analyses. Twenty-four known alkaloids were dereplicated from the D. surinamensis alkaloid-rich fraction network and were assigned by manual MS/MS interpretation. Their cytotoxic potential was evaluated FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DA BAHIA - FAPESB COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DO AMAZONAS - FAPEAM Fechado

Análisis conformacional de un fragmento peptídico del primer bucle extracelular del receptor tipo 1 de angiotensina humano Conformational analysis of a peptide fragment from first extracelular loop of the receptor human type 1 of angiotensin Nélida Marín Huachaca1, Clóvis R. Nakaie2 y Shirley Schreier1 1 Departamento de Bioquímica de la Universidade de São Paulo, Av. Prof. Lineu Prestes 748, CEP: 05513-970 São Paulo, Brasil 2 Departamento de Biofísica de la Universidade Federal de São Paulo, Rua 3 de Maio 100, CEP: 04044-020, São Paulo, Brasil. Recibido el 15 de noviembre del 2017, aceptado el 20 de diciembre del 2017 DOI: https://doi.org/10.33017/RevECIPeru2017.0009/ Resumen El receptor tipo 1 de angiotensina (AT1) es mediador importante de las funciones vasoconstrictoras de la angiotensina II. Durante el proceso de activación del receptor, éste sufre alteración estructural que conlleva al proceso de transducción de señal. En el presente estudio se investigaron las propiedades conformacionales del fragmento peptídico Ac-YRWPFGNYL-CONH2 (fEC1) correspondiente al primer bucle extracelular del receptor AT1 humano tanto en medio acuoso como en la presencia de sistemas que mimetizan la membrana biológica. De esta manera, se utilizaron micelas y vesículas unilamelares grandes (LUV) -tanto de naturaleza aniónica como zwitteriónica- como sistemas biomiméticos. Las micelas fueron preparadas a partir de los lisofosfolípidos: 1-palmitoil-2-hidroxi-fosfatidilcolina (LPC) y 1-palmitoil-2-hidroxi-fosfatidilglicerol (LPG), mientras que, las LUV fueron preparadas a partir de 1-palmitoil-1-oleoil-fosfatidilcolina (POPC) y 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilglicerol (POPG). El péptido fue sintetizado por el método de síntesis en fase sólida y los análisis conformacionales fueron realizados mediante dicroísmo circular. Los experimentos fueron realizados en pH 7.0. En este pH la carga teórica de fEC1 es +1. El espectro de dicroísmo circular de fEC1 en solución presentó una banda positiva en aproximadamente 226 nm, mientras que, en la presencia de micelas zwitteriónicas y aniónicas y, en la presencia de LUV aniónicas fueron observadas alteraciones espectrales, esto es, la adquisición de estructura secundaria del péptido como consecuencia de la interacción péptido-sistema biomimético. Descriptores: Receptor AT1 humano, dicroísmo circular, micelas, vesículas unilamelares grandes Abstract The type 1 receptor for angiotensin (AT1) is an important mediator of the vasoconstrictor functions of angiotensin II. During the activation process of the receiver, it undergoes structural alteration that leads to the process of signal transduction. In the present study, the conformational properties of the peptide fragment Ac-YRWPFGNYL-CONH2 (fEC1) corresponding to the first extracellular loop of the human AT1 receptor both in aqueous medium and in the presence of systems that mimics the biological membrane were investigated. In this way, micelles and large unilamellar vesicles (LUV) -both anionic and zwitterionic in nature- were used as biomimetic systems. The micelles were prepared from the lysophospholipids: 1-palmitoyl-2-hydroxy-phosphatidylcholine (LPC) and 1-palmitoyl-2-hydroxy-phosphatidylglycerol (LPG), whereas, the LUV were prepared from 1-palmitoyl- 1-oleoyl-phosphatidylcholine (POPC) and 1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylglycerol (POPG). The peptide was synthesized by the solid phase synthesis method and the conformational analyzes were performed by circular dichroism. The experiments were performed at pH 7.0. At this pH the theoretical charge of fEC1 is +1. The circular dichroism spectrum of fEC1 in solution showed a positive band at approximately 226 nm, whereas in the presence of zwitterionic and anionic micelles and, in the presence of anionic LUV, spectral alterations were observed, that is, the acquisition of secondary structure of the peptide as a consequence of the peptide-biomimetic system interaction. Keywords: Human AT1 receptor, circular dichroism, micelles, large unilamellar vesicles

The type 1 angiotensin (AT1) receptor belongs to G protein coupled receptors (GPCR) superfamily. Conformational studies of GPCR peptide fragments require the use of systems that mimic the receptor environment. The current study aims to investigate the interaction of the peptide fragment Ac-YRWPFGNYL-CONH2 (fEC1), corresponding to amino acid residues 92 -100 of the first extracellular loop of the human AT1 receptor, with model membranes –micelles and large unilamellar vesicles (LUV). The micelles were prepared from lysophospholipids: 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (LPC) and 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (LPG) and, LUVs were prepared from 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) and 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG). The peptide fEC1 was synthesized by solid-phase synthesis. Fluorescence measurements were performed using the tryptophan residue (W94), present in the amino acid sequence of fEC1, as an intrinsec fluorescent probe. The excitation wavelength (lexc) was 195 nm. The fluorescence spectra of fEC1 (10 µM) were obtained at increasing concentrations of lysophospholipids or phospholipids. The fluorescence intensity of peptide in the presence of zwitterionic (LPC) and anionic (LPC: LPG, mol:mol) micelles and in the presence of anionic LUV (POPC:POPG, mol:mol) increased. Besides, upon addition of these model systems, a blue-shift of the maximum emission peak of the peptide was observed. The spectral changes observed are due to the sensitivity of tryptophan to the polarity of the medium. From the binding isotherms, binding constants (Kb) were determined. According to these values, the binding of the peptide with the anionic systems was higher than with the zwitterionic ones, this is due to the contribution of electrostatic forces. For fluorescence quenching studies, acrylamide was used as a collisional quencher, thus, Stern-Volmer constants were determined. According to these data, the fluorophore is more exposed to acrylamide when fEC1 is in solution than in the presence of the biomimetic membrane. Moreover, the values ​​of fluorescence anisotropy (r) which are related to the rotational diffusion of a fluorophore were calculated. According to these data, the peptide showed higher rotational diffusion in aqueous medium than in presence of model systems. The results obtained by steady-state fluorescence show the binding of the peptide fragment fEC1 with lysophospholipid micelles, POPC: POPG LUV and, in lesser extent, with POPC LUV. El receptor tipo 1 de angiotensina (AT1) humano pertenece a la superfamilia de receptores acoplados a Proteínas G (GPCR). Estudios conformacionales de fragmentos peptídicos de GPCR requiere el uso de sistemas que mimeticen el ambiente del receptor. El presente estudio propone investigar la interacción del fragmento peptídico Ac-YRWPFGNYL-CONH2 (fEC1), que corresponde a los residuos de aminoácidos 92 -100 del primer bucle extracelular del receptor AT1 humano, con sistemas miméticos de membrana biológica -micelas y vesículas unilamelares grandes (LUV). Las micelas fueron preparadas a partir de los lisofosfolípidos: 1-palmitoil-2-hidroxi-fosfatidilcolina (LPC) y 1-palmitoil-2-hidroxi-fosfatidilglicerol (LPG), mientras que, las LUV fueron preparadas a partir de 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina (POPC) y 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilglicerol (POPG). El péptido fEC1 fue sintetizado por el método de síntesis en fase sólida. Se realizaron medidas de fluorescencia utilizando, como sonda fluorescente intrínseca, el residuo de triptófano (W94), presente en la secuencia de aminoácidos de fEC1. La longitud de onda de excitación (lexc) fue de 195 nm. Los espectros de fluorescencia de fEC1 (10 mM) fueron obtenidos en concentraciones crecientes de lisofosfolípidos o de fosfolípidos. La intensidad de fluorescencia del péptido aumentó en la presencia de micelas tanto zwitteriónica (LPC) como aniónica (LPC: LPG, mol:mol) y, en la presencia de LUV aniónica (POPC:POPG, mol:mol). Asimismo, se observaron desplazamientos de las longitudes de onda de emisión máxima (lmax) hacia el azul. Las alteraciones espectrales observadas son debido a la sensibilidad del triptófano a la polaridad del medio en que se encuentra. A partir de las isotermas de interacción fueron determinadas las constantes de asociación (Ka). De acuerdo a estos valores, la interacción del péptido con los sistemas aniónicos fue mayor que con los zwitteriónicos debido a la contribución de fuerzas electrostáticas. Para los estudios de supresión de fluorescencia se utilizó acrilamida como supresor colisional y se determinaron las constantes de Stern-Volmer. Conforme a estos valores, el fluoróforo está más expuesto a la acrilamida cuando fEC1 está en solución que cuando está en la presencia de sistemas biomiméticos, lo cual es debido a la interacción del péptido con estos sistemas. Asimismo, se calcularon los valores de anisotropía de fluorescencia (r) los cuales están relacionados al movimiento de difusión rotacional de un fluoróforo. De acuerdo a estos datos, el péptido presenta mayor movimiento de difusión rotacional en medio acuoso que cuando interactúa con los sistemas modelo. Los resultados obtenidos, a través de la fluorescencia de estado estacionario, muestran la interacción del fragmento peptídico fEC1 con micelas de lisofosfolípido, LUV de POPC: POPG y, en menor extensión, con LUV de POPC.

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Ele apresenta alta atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas, principalmente Enterococcus resistente à vancomicina (VRE-S13) in vitro. Entretanto, este peptídeo também possui atividade hemolítica. Neste contexto, foram desenhados e sintetizados cinco análogos de P3 a partir de substituições pontuais de resíduos específicos por um resíduo de lisina, os quais foram denominados L2K, I5K, N7K, I9K e L13K. O objetivo da criação destes análogos foi estudar a relação de estrutura e atividade do peptídeo P3, a fim de investigar o efeito da modificação de suas características biofísicas em sua atividade biológica. Para isso, os peptídeos foram sintetizados por meio da técnica de síntese em fase sólida (SPFS), purificados por cromatografia líquida de alta eficiência em coluna de fase reversa (CLAE-FR) e identificados por espectrometria de massas (SM). Os peptídeos purificados foram testados quanto à sua atividade biológica e foi verificado que o análogo L2K apresentou atividade somente para a bactéria Gram-negativa testada, o análogo N7K mostrou ser mais ativo que P3 tanto para Gram-positivas quanto para Gram-negativas e os outros análogos não apresentaram atividade antimicrobiana. Foi avaliada também a atividade hemolítica dos peptídeos, e foi verificado que o único análogo que apresentou atividade contra eritrócitos foi N7K. A hidrofobicidade dos peptídeos foi analisada por meio do tempo de retenção obtido por CLAE-FR e foi verificado que o peptídeo P3 se mostrou mais hidrofóbico que todos os análogos criados. Dentre os análogos, N7K foi o que apresentou maior tempo de retenção seguido de L2K que mostrou ter hidrofobicidade intermediária. Foram estudados quanto a capacidade de adotar estrutura secundária regular utilizando a técnica da espectroscopia de dicroísmo circular (DC) frente a miméticos de membrana e foi verificado que P3 e N7K foram os que mais adotaram estrutura em α-hélice na presença de miméticos de membrana tanto de bactérias quanto de eucariotos. Com o objetivo de verificar a capacidade dos peptídeos em atuarem nas membranas, foram realizados estudos utilizando a técnica da espectroscopia de fluorescência em experimentos conduzidos na ausência e na presença de miméticos de membranas e foi verificado que P3 e N7K demonstraram maior interação e capacidade de permeabilização de miméticos de membrana tanto de bactérias quanto de eucariotos. Todos os outros análogos mostraram maior interação e permeabilização de miméticos de membrana de bactérias, porém em níveis diferentes, sendo que L2K foi o mais ativo. Concluiu-se então que, por meio de substituições pontuais, foi possível alterar algumas propriedades do peptídeo P3, bem como sua atividade biológica. The antimicrobial peptide Pantinin-3 (P3) has 13 residues and is derived from the venom of the African scorpion Pandinus imperator. It has high antimicrobial activity against Gram-positive bacteria, mainly vancomycin-resistant Enterococcus (VRE-S13) in vitro. However, this peptide also has hemolytic activity. In this context, five P3 analogs were designed and synthesized from point substitutions of specific residues by a lysine residue, which were named L2K, I5K, N7K, I9K and L13K. The objective of the creation of these analogues was to study the structure and activity relationship of the P3 peptide in order to investigate the effect of the modification of its biophysical characteristics on its biological activity. For this, the peptides were synthesized using the solid-phase peptide synthesis technique (SPPS), purified by high performance liquid chromatography on a reverse phase column (HPLC-RF) and identified by mass spectrometry (MS). The purified peptides were tested for their biological activity and it was found that the L2K analog showed activity only for the Gram-negative bacteria tested, the N7K analog showed to be more active than P3 for both Gram-positive and Gram-negative and the others did not present antimicrobial activity. The hemolytic activity of the peptides was also evaluated, and it was verified that the only analog that showed activity against erythrocytes was N7K. The hydrophobicity of the peptides was analyzed by the retention time obtained by HPLC-RF and it was verified that the peptide P3 proved to be more hydrophobic than all analogues created. Among the analogues, N7K showed the highest retention time followed by L2K which showed intermediate hydrophobicity. It was studied the ability to adopt regular secondary structure using the circular dichroism (CD) spectroscopy technique against membrane mimetics and it was verified that P3 and N7K were the ones that most adopted α-helix structure in the presence of membrane mimetics both bacteria and eukaryotes. In order to verify the ability of the peptides to act on the membranes, studies were carried out using the fluorescence spectroscopy technique in experiments conducted in the absence and presence of membrane mimetics, and it was verified that P3 and N7K demonstrated greater interaction and permeabilization capacity membrane mimetics of both bacteria and eukaryotes. All other analogues showed higher interaction and permeabilization of bacterial membrane mimetics, however at different levels, with L2K being the most active of these. It was then concluded that, by means of point substitutions, it was possible to alter some properties of the P3 peptide, as well as its biological activity.

Tityus stigmurus corresponde à espécie de escorpião predominante na região Nordeste do Brasil, sendo considerado um dos principais causadores de acidentes escorpiônicos. Na peçonha do T. stigmurus, que é composta de uma mistura complexa de moléculas de alta e baixa massa molecular, foi identificado e caracterizado um peptídeo antimicrobiano denominado Stigmurina (FFSLIPSLVGGLISAFK-NH2). Peptídeos antimicrobianos são pequenas moléculas consideradas a primeira linha de defesa contra micro-organismos, apresentando amplo espectro de ação antimicrobiana. A literatura reporta também a atividade desses peptídeos contra células cancerígenas. Sequências nativas de peptídeos bioativos como protótipo para a obtenção de novas moléculas têm sido utilizadas com o intuito de potencializar a sua atividade e reduzir a toxicidade. Nesse contexto, realizou-se a caracterização estrutural in silico e por dicroísmo circular, bem como a avaliação da atividade antimicrobiana, antiparasitária, antiproliferativa e hemolítica de dois peptídeos análogos obtidos à partir da Stigmurina, denominados StigA3 e StigA4. A análise da conformação tridimensional in silico do StigA3 e StigA4 demonstrou uma estrutura helicoidal, sendo este resultado confirmado por dicroísmo circular. O aumento da carga superficial e do momento hidrofóbico de ambos os peptídeos análogos quando comparado com a Stigmurina resultaram na potencialização da atividade antimicrobiana e antiparasitária. Os peptídeos StigA3 e StigA4 apresentaram ação antiproliferativa semelhante ao peptídeo nativo, com exceção para a célula normal, para qual os peptídeos análogos se mostraram menos tóxicos. Portanto, estes resultados indicam uma potencial aplicação terapêutica destes peptídeos análogos, demonstrando a eficiência do desenho racional de fármacos para a obtenção de novos agentes antiproliferativos e anti-infecciosos. Tityus stigmurus it’s the predominant scorpion specie in Northeast region from Brazil, it’s considered one of the main cause of scorpion accidents in this region. In T. stigmurus venom, which is a complex mixture of high and low molecular mass molecules, was identified an antimicrobial peptide denominated Stigmurin. Antimicrobial peptides are small molecules considered the first line of defense against microorganisms, they show broad spectrum action. Many authors have proved that these peptides can also be effective on cancerous cells. Mutation in these molecules sequence has been held aiming the increase in the activity maintaining its low toxicity. Therefore, it is proposed the characterization of the structure in silico and by circular dichroism, as well the antimicrobial, antiparasitic, anti-proliferative and hemolytic activities of two analog peptides from Stigmurin, denominated StigA3 and StigA4. We performed an in silico analysis for these peptides, where we were able to observe α-helix structure, which was confirmed by circular dichroism. We were also able to find that the analog peptides net charge and hydrophobic moment were higher than Sitgmurin’s, which can explain the increase in antimicrobial and antiparasitic activity. The peptides StigA3 e StigA4 showed activity on cancerous cells similiar to the native peptide, except when tested on a normal cell we were able to find that they’re less toxic. Therefore, these results indicate a potential biotechnological application for the analogs peptides, even as prototype to new therapeutic agents.

Submitted by Milena Novais da Costa null (miuli_nc@hotmail.com) on 2017-12-01T20:56:50Z No. of bitstreams: 1 dissertacao com carta de aprovacao.pdf: 1961789 bytes, checksum: 1c01b1ab10c4730f3b81e006c1ef5d88 (MD5) Approved for entry into archive by Ana Carolina Gonçalves Bet null (abet@iq.unesp.br) on 2017-12-04T11:44:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 costa_mn_me_araiq_par.pdf.pdf: 772561 bytes, checksum: b22698e65315d11eef43806a1ca9c92b (MD5) Made available in DSpace on 2017-12-04T11:44:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 costa_mn_me_araiq_par.pdf.pdf: 772561 bytes, checksum: b22698e65315d11eef43806a1ca9c92b (MD5) Previous issue date: 2017-09-13 Devido ao avanço científico e tecnológico, notável sucesso tem sido alcançado na identificação de novos compostos antitumorais. Entretanto, problemas associados à baixa estabilidade e seletividade tem limitado o sucesso da grande maioria destes compostos. Dentre as estratégias para aumentar a estabilidade de moléculas bioativas, a bioconjugação em domínios de ligação a albumina (DLA) tem se mostrado promissor para ampliar o tempo de vida médio de moléculas susceptíveis à degradação proteolítica. Neste trabalho, a estrutura e a atividade de um composto contendo um peptídeo citotóxico, um DLA e um sítio de clivagem específico foram avaliadas. Motivado pela perspectiva do peptídeo melitina apresentar atividade antitumoral, o nosso grupo de pesquisa avaliou a síntese e atividade biológica deste composto com o peptídeo RQKRSLGG-WQRPSSW. O peptídeo obtido foi testado contra tipos de celulas tumorais e não tumorais (linhagem MCF-7 e HaCaT, respectivamente), mostrando-se potente, porém tóxico. Nos estudos de dicroísmo circular, os peptídeos não apresentaram estrutura secundária em solução aquosa. Em presença de miméticos de membrana, os peptídeos adquiriram uma estrutura em α-hélice exceto o peptídeo sítio de clivagem-DLA. Estudos de vazamento de carboxifluoresceína em LUVs (POPC:POPS), através da técnica de espectroscopia de fluorescência, mostraram que o peptídeo completo tem capacidade de permeabilização similar ao da melitina e que é dependente da concentração. Os resultados de fluorescência confirmaram a interação do peptídeo com a proteína HSA. A intensidade da fluorescência do Trp presente nos peptídeos aumenta após a ligação com a HSA e o comprimento de onda de emissão é deslocado para o azul (blue-shift), indicando a mudança de ambiente do Trp para um meio mais hidrofóbico. A ligação dos peptídeos com a HSA não foi suficiente para proteger os compostos antitumorais das enzimas proteolíticas presente no plasma sanguíneo, mostrando baixa estabilidade do peptídeo. Os dados obtidos mostraram que, a estratégia utilizada para o aumento da seletividade e estabilidade da melitina não é adequada. Due to the scientific and technological advanced permitted remarkable successful in the field of identification of new antitumour compounds. However, problems associated with low stability and selectivity have been a restriction in the successf ul of majority of this compounds. Inside the strategic for increase the stability of bioactive molecules, bioconjugation with albumin - binding domain (ABD) have been promising for increasing t he lifetime of molecules susceptible for the proteolytic degradat ion. Herein, structure and activity of a compound containing a cytotoxic peptide, ABD, and cleavage site were evaluated. The ABD (WQRPSSW) can give more stability for molecules, while the cle avage site RQKRSLGG can give more selectivity to the peptide. Thi s sequence is degraded for the protease Kallikrein 4 (KLK4), which occurs in elevated quantity in the tumours cells, releasing the cytotoxic compound, especially in the microenvironments of t hese cells, promoting the higher selectivity. Inspired for the pe rspective of Melittin peptide holds a promising antitumour activity, our research group evaluated the synthesis and biological activity with this peptide containing the sequence RQKRSLGG - WQRP SSW. The peptide was evaluated against diversity of tumours and n o tumours cells (MCF - 7 and HaCaT respectively), presenting effective activity but toxic. In circular dichroism studies the peptides did not show second structure in aqueous solution. In the p resence of membrane mimetic, the peptides acquired an α - helix structure, excluding the peptide cleavage site - ABD. Studies of carboxyfluorescein release in LUVS (POPC:POPS), by fluorescence spectroscopy, showed that the complete peptide has a similar capac ity of Melittin for permeability, also, the Melittin and the complete peptide activities were concentration - dependent. Nevertheless, for the complete peptide this effect was less manifested, which means that the electrostatic interaction between the positi ve charges of peptides and the negative charges of membranes play a key role in the process. The fluorescence assays confirmed the peptide interaction with HSA protein. The Trp fluorescence quantum yield of the peptides increased after the HSA attachement , while, Trp emission wavelength resulted in blue - shift. Indicating that the Trp activity change between a polar solvent for a hidrophobic environment. Probably, conformational changes occurred in the molecule, which not enough were for protect the antitu mour compounds from proteolytic enzymes current in blood serum, endorsing the fewer stability of the antitumour peptides.

Introduction: Due to the interest in the treatment of hepatitis, the industrial production process of INF-α has been developed and perfected over the last few years. Objective: The present work aimed to develop a protocol to characterize the molecular structure of INF-α2b in pharmaceutical formulations by MALDI-TOF mass spectrometry. Method: Initially, a reversed-phase liquid chromatography method was developed to promote the separation of active and minor constituent INF-α2b and human serum albumin, also present in the pharmaceutical formulations, to obtain samples with protein homogeneity revealed by electrophoresis. Samples were hydrolyzed with trypsin and submitted to MALDI-TOF. In order to analyze the molecular structure, a procedure based on immunoaffinity and gel filtration chromatography was developed. Results: Prepared samples by these methods showed protein homogeneity by SDS-PAGE, and were analyzed by circular dichroism and fluorescence, which showed three – dimensional structure degradation. Conclusions: This work provides important data that support the establishment of a protocol for the analysis of INF-α2b in final product, which could replace the traditional peptide mapping by liquid chromatography, with the advantage of resulting in a larger amount of information about the structure of the biopharmaceutical. Introdução: Em virtude do interesse para o tratamento da hepatite, o processo de produção industrial do INF-α foi desenvolvido e aperfeiçoado ao longo dos últimos anos. Objetivo: O presente trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo para caracterizar a estrutura molecular do INF-α2b em formulações farmacêuticas por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF. Método: Inicialmente foi desenvolvido um método de cromatografia líquida baseado em fase reversa para promover a separação entre o INF-α2b constituinte ativo e minoritário e a soro albumina humana, também componente presente nas formulações farmacêuticas, obtendo-se amostras com homogeneidade proteica, revelada por eletroforese. As amostras em solução foram submetidas à digestão com tripsina, levadas ao espectrômetro de massa MALDI-TOF. Para que fosse analisada a estrutura molecular, foi desenvolvido um procedimento baseado em imunoafinidade e cromatografia de gel filtração. Resultados: As amostras preparadas por estes métodos apresentaram homogeneidade proteica por eletroforese, sendo analisadas por dicroísmo circular e fluorescência, o que demonstrou ter degradação da estrutura tridimensional. Conclusões: Esse trabalho fornece dados importantes que subsidiam o estabelecimento de um protocolo para a análise de INF-α2b em produto final, que poderia substituir o mapa de peptídeos tradicional por cromatografia líquida, com a vantagem de resultar em um maior número de informações sobre a estrutura molecular do biofármaco.

O trabalho de investigação levado a cabo para a realização desta dissertação de Mestrado teve como primeiro objetivo sintetizar piridinochalconas fotocrómicas que no estado fotoestacionário apresentem piridinocromenos quirais (hemicetais) como espécie maioritária. O objectivo final é partir de compostos pro-quirais (piridinochalconas) e usar a luz para obtenção de piridinocromenos em excesso enatiomérico recorrendo ao uso de matrizes quirais (interação com recetores quirais ou com solventes quirais). Isto poderá dar origem a novos materiais, com aplicações potenciais em sistemas fotocrómicos oticamente ativos. Foram sintetizados três novos compostos: (E)-3-(2-hidroxifenil)-1-(piridin-2-il)prop-2-en-1-ona (2-piridinochalcona, Py2), (E)-3-(2-hidroxifenil)-1-(piridin-3-il)prop-2-en-1-ona (3-piridinochalcona, Py3) e (E)-3-(4-(N,N-dietilamino)-2-hidroxifenil)-1-(piridin-4-il)prop-2-en-1-ona (7-dietilamino-4- piridinochalcona, 7NPy4)). A elucidação estrutural dos compostos sintetizados foi feita por 1H- e 13CRMN, análise elementar, ESI-MS e por cristalografia de raios-X. A caraterização dos compostos em solução por espectroscopia de absorção no UV/Visível permitiu descrever a rede de reações químicas dos compostos Py2, Py3 e 7NPy4 por variações bruscas de pH. Para alcançar o objectivo final do trabalho, foram selecionados os compostos Py2, Py3 e Py4 (composto previamente descrito) por serem fotocrómicos e no estado fotoestacionário apresentarem o hemicetal quiral como espécie maioritária. Selecionou-se como matriz quiral a β-ciclodextrina (β-CD) que é adequada para encapsular compostos com anéis aromáticos através de interações hidrofóbicas e ligações de hidrogénio. A constante de associação relativa dos compostos com a β-CD tem a seguinte ordem Py4 > Py2 > Py3 e o composto 7NPy4 não complexou com a β-CD. Por dicroísmo circular observou-se maior atividade ótica no complexo com Py2 que no complexo com Py3 e o complexo com Py4 não tem atividade ótica.

Neste trabalho são investigadas e comparadas, de forma detalhada, modificações estruturais do derivado glicosilado da PS-2, a [pOAcGlc-trz-A14]PS-2, sendo empregadas, para tal objetivo, as espectroscopias de dicroísmo circular (CD) e de ressonância magnética nuclear (RMN). Primeiramente foi realizada a síntese do glicopiranosil-triazol-peptídeo [pOAcGlc-trz-A14]PS-2 empregando a estratégia Fmoc de síntese em fase sólida aliada a reação de cicloadição entre alcinos e azidas catalisada por cobre (I) (CuAAC). Em seguida, o produto foi purificado e caracterizado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e espectrometria de massas (MS). Foram realizados estudos de preferências conformacionais da [pOAcGlc-trz-A14]PS-2 por CD em diferentes meios e condições, como na presença de vesículas fosfolipídicas, micelas e em misturas de diferentes proporções de TFE:H2O. Os resultados obtidos a partir dessas análises indicaram um alto grau de estruturação helicoidal para condições comumente utilizadas em estudos de RMN em solução. Sendo assim, foram adquiridos espectros de RMN desse composto em TFE-d2:H2O (60:40) e na presença de micelas de DPC-d38 (400 mmol.L-1). Respectivas correlações foram assinaladas e as informações obtidas a partir dessas análises convertidas em restrições para cálculos estruturais. Foram realizadas análises comparativas entre as estruturas tridimensionais obtidas as estruturas da PS-2 em TFE-d2:H2O (60:40) já relatadas na literatura, bem como entre as estruturas calculadas da [pOAcGlc-trz-A14]PS-2 nos diferentes meios analisados. Assim, os resultados apontam para diferenças mais pronunciadas para a porção C-terminal, sendo elas constituídas principalmente por diferentes orientações da porção glicosídica nos diferentes meios analisados e interações de stacking aromáticos entre os resíduos H-18 e F-19. In this work, structural modifications of the glycosylated derivative of PS-2, [pOAcGlc-trz-A14]PS-2, are investigated and compared in detailed by using circular dichroism (CD) and nuclear magnetic resonance (NMR). Firstly, glucopyranosyl-triazole-peptide [pOAcGlc-trz-A14]PS-2 was performed employing a Fmoc strategy of solid phase synthesis associated with copper (I)-catalyzed azide alkyne cycloaddition reaction. The product was then purified and characterized by high performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS). The conformational preferences of [pOAcGlc-trz-A14]PS-2 were investigated by CD in different environment and conditions, such as in the presence of phospholipid vesicles, micelles and in mixtures with different TFE:H2O ratios. The obtained results indicated high degrees of helical structure in the membrane media commonly used for NMR experiments. Thus, NMR spectra were obtained for the compound in TFE-d2: H2O (60:40) and in the presence of DPC-d38 micelles (400 mmol.L-1). The respective correlations were assigned and the information obtained from these analyses were converted into geometric restrictions for structural calculations. Comparative analyses between the obtained three-dimensional structures and the ones of PS-2 in TFE-d2: H2O (60:40), already report in the literature, between the calculated structures of [pOAcGlc-trz-A14]PS-2 in the different environment were performed. The obtained results point to more pronounced differences in the C-terminal portion, in which different orientations of the glycosidic group of the glucopyranosyl-triazole-peptide in the different environment analyzed and aromatic stacking interactions between the H-18 and F-19 residues are observed.

Submitted by Rosangela Silva (rosangela.silva3@unioeste.br) on 2017-08-30T18:51:47Z No. of bitstreams: 2 Carla Lieko Della Torre.pdf: 1852525 bytes, checksum: db416b0a6fe4435a764893198350dbcc (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Made available in DSpace on 2017-08-30T18:51:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Carla Lieko Della Torre.pdf: 1852525 bytes, checksum: db416b0a6fe4435a764893198350dbcc (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-07 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Enzymes of the xylanolytic complex, from microorganisms, have been an increasingly important biotechnological tool mainly in industrial processes that require high temperatures, such as in the baking industry, animal feed, textile, pulp and cellulose. Among the fungi producing thermostable enzymes, Thermomyces lanuginosus has been evidenced as a good producer of xylanases. In this context, xylanase from the recently isolated thermophilic fungus of the Paraná Atlantic Forest, T. lanuginosus, was purified, biochemically characterized, as well as a structureactivity correlation study of the enzyme was investigated through circular dichroism and fluorescence spectroscopy. Extracellular xylanase was purified after four steps of ion exchange chromatographic columns and molecular filtration. The purity and molecular mass (21.3 kDa) of the enzyme were determined by SDS-PAGE and MALDI-TOF/MS. The xylanase is highly specific to the beechwood xylan substrate and generated mainly xylobiose (X2) and xylotriose (X3), products characteristic of the action of endoxylanase. The enzyme was able to cleave the xylooligosaccharides xylotetraose and xylopentaose, except xylobiose and xylotriose. It exhibit higher activity at pH 6.5 and temperature of 75°C, with stability between pH 5.0-8.0 for 100 hours and thermostability between 40 and 75°C for 5 hours. The deconvolution of the circular dichroism spectrum (CD) enzyme revealed a secondary conformation rich in β-structures with transition midpoint temperature (Tm) of 73.0  0.2°C. In this structural study, xylanase reveals that to perform high enzymatic activity, it was necessary a conformational change. Its secondary structure is conserved even at pH extremes at temperatures up to 70°C and in the presence of MnCl2 (1 mM), DTT (5 mM) and high concentration of guanidine (6 M). Intrinsic fluorescence reveals that the tertiary structure is influenced by pH, guanidine (1 M) associated with temperature and in the presence of MnCl2 and DTT, whereas extrinsic fluorescence, using the ANS probe, shows changes in pH extremes and in the presence of MnCl2 and DTT. Fluorescence results suggest that both the increased enzymatic activity in the presence of cofactors and the loss of activity at extreme pH values are related to changes in the tertiary structure of the enzyme. Thus, T. lanuginosus xylanase has interesting biochemical characteristics for application in several industrial sectors that mainly use high temperature conditions. As enzimas do complexo xilanolítico, provenientes de microrganismos, têm se tornado uma ferramenta biotecnológica cada vez mais importante, principalmente em processos industriais que requerem temperaturas elevadas, como na indústria de panificação, de rações animais, têxtil, polpa e celulose. Dentre os fungos produtores de enzimas termoestáveis, Thermomyces lanuginosus tem se destacado como bom produtor de xilanases. Nesse contexto, a xilanase do fungo termofílico recentemente isolado da Mata Atlântica do Paraná, T. lanuginosus, foi purificada, caracterizada bioquimicamente, bem como um estudo de correlação estruturaatividade da enzima foi investigado através das espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência. A xilanase extracelular foi purificada após quatro etapas cromatográficas envolvendo colunas de troca iônica e filtração molecular. A pureza e massa molecular (21,3 kDa) da enzima foram determinadas por SDS-PAGE e MALDI-TOF/MS. A xilanase é altamente específica para o substrato xilano de beechwood e gerou principalmente xilobiose (X2) e xilotriose (X3), produtos característicos da ação de endoxilanase. A enzima foi capaz de clivar os xilooligossacarídeos xitotetraose e xilopentaose, exceto a xilobiose e xilotriose. Exibe maior atividade em pH 6,5 e temperatura de 75°C, com estabilidade entre os pH 5,0-8,0 durante 100 horas e termoestabilidade entre 40 e 75°C durante 5 horas. A deconvolução do espectro de dicroísmo circular (CD) da enzima revela uma conformação secundária rica em estruturas-β, com temperatura do ponto médio da transição (Tm) de 73,0  0,2°C. Neste estudo estrutural, a xilanase revelou que, para desempenhar elevada atividade enzimática, foi necessário ocorrer mudança conformacional. Sua estrutura secundária é conservada mesmo em extremos de pH, em temperaturas até 70°C e na presença de MnCl2 (1 mM), DTT (5 mM) e elevada concentração de guanidina (6 M). A fluorescência intrínseca revela que a estrutura terciária sofre influência do pH, guanidina (1 M) associado à temperatura e na presença de MnCl2 e DTT, enquanto a fluorescência extrínseca, utilizando a sonda ANS, revela mudanças em extremos de pH e na presença de MnCl2 e DTT. Os resultados da fluorescência sugerem que tanto o aumento da atividade enzimática na presença dos cofatores quanto a perda da atividade em valores extremos de pH relacionam-se às alterações da estrutura terciária da enzima. Dessa forma, a xilanase de T. lanuginosus possui características bioquímicas interessantes para aplicação em diversos setores industriais que utilizam principalmente condições de temperatura elevada.

Orientadora: Profa. Dra. Giselle Cerchiaro Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2017. Entender os mecanismos pelos quais os radicais livres e espécies oxidantes atuam em processos fisiológicos torna-se cada vez mais complexo, especialmente aqueles envolvendo metais de transição com elevada atividade redox como o cobre, ou com funções celulares como o zinco, ambos presentes na metaloenzima Cu,Zn-Superóxido Dismutase (SOD1). Muitos processos envolvendo a sua agregação e função peroxidásica deletéria ainda estão em plena discussão na literatura , mesmo após mais de 40 anos de sua descoberta e caracterização. Nesta área de pesquisa, o papel de mutações na enzima relacionado a casos familiares da doença Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) começou a ser elucidado recentemente, quando soube-se que o tipo de agregação proteica observado e a gravidade da doença apresenta relação com o tipo de mutação na SOD1. Mutações que afetam o modo de coordenação do zinco são as mais intrigantes, pois revelam uma alta patogenicidade da ELA. Sabe-se muito pouco sobre como a SOD1 estaria envolvida com casos de ELA esporádicos, mais comumente encontrados, e nossa proposta esta relacionada a alterações no sítio de ligação ao zinco na enzima, levando a agregações proteicas e formas agressivas da doença. Portanto, neste trabalho de Doutorado, foi estudada a mutação sítio dirigida T135SK136E da SOD1 em relação ao comportamento estrutural e catalítico da proteína. Estudos de Dicroísmo Circular e Ressonância Paramagnética Eletrônica mostraram que a mutação causa alterações estruturais, sem alterar, no entanto, o sítio catalítico da enzima. A proteína mutada apresentou dificuldade em alocar os metais Cobre e Zinco em seus sítios metálicos, porem, mostrou maior atividade catalítica quando comparada à SOD1 nativa. Mechanisms involving Free-radical and oxidant species are too complexes to understand, especially those which involves high redox activity transition metals ions as copper, or those that are part of cell function, as zinc, both present at metaloenzyme Cu,Zn-Superoxide Dismutase (SOD1). It is known that many process involving SOD1 aggregation and peroxidase activity remain in literature discussion even more than 45 years from its discovery and characterization. In this research area the role of mutation on the enzyme related to cases of familial Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) begins to be elucidated and mutations related to zinc coordination are more intriguing because they seem to cause a more pathogenic ALS. In this way, in this PhD work we studied the site-direct mutation T135SK136E on SOD1, taking special attention to zinc site, to verify how the enzyme acts catalytic and structurally. Circular Dichroism and Electronic Paramagnetic Resonance assays have shown that the mutation causes structural alterations, without altering, however, the catalytic site of the enzyme. The mutated protein presented difficulty in allocating the copper and zinc metals in their metallic sites, but showed greater catalytic activity when compared to wild type SOD1.

Orientador: Prof. Dr. Flávio Augusto Vicente Seixas Coorientador: Prof.ª Dr.ª Maria Aparecida Fernandez Coorientador: Prof. Dr. Quirino Alves de Lima Neto Dissertação (mestrado em Ciências Biológicas)--Universidade Estadual de Maringá, 2017 Resumo: A proteína KIN foi identificada em 1989 em células de rato a partir da reação cruzada de anticorpos policlonais monoespecíficos, dirigidos contra a proteína RecA de Escherichia coli. O gene KIN codifica uma proteína nuclear de 45 kDa que possui a capacidade de se ligar a ácidos nucleicos. Entre os eucariotos, o gene KIN é conservado filogeneticamente, o que indica atividade funcional em processos biológicos indispensáveis. Em murinos, a proteína KIN está associada à cromatina formando focos de replicação por todo o nucleoplasma, similar àqueles observados com outras proteínas envolvidas no reparo do DNA, na replicação e no splicing de RNA. KIN é ubiquamente expressa em mamíferos e mostra alta expressão em células humanas de músculo esquelético, coração, testículo e células com altas taxas de proliferação, como tumores. Estes dados apontando que KIN tenha um papel na replicação. Adicionalmente, vem sendo associada as funções de fator de transcrição em bactérias e leveduras; reprogramação da expressão gênica global na adaptação de plantas à disponibilidade limitada de cobre, pela interação com SPL7; e em murinos mostrou-se que KIN é importante para um eficiente reparo e resolução das quebras de fita dupla, ocasionadas por radiação ionizante e pela troca de isotipo de imunoglobulinas pelos linfócitos B. Em neurônios existe a evidência de um papel alternativo para a KIN ao invés da replicação, já que esses não se dividem mais depois de maduros. A proteína KIN é composta estruturalmente por motivos particulares: um dedo de zinco, um domínio de hélice alada (Winged Helix Domain), um domínio homólogo a proteína recA de E. coli e um motivo KOW. No entanto, a completa estrutura tridimensional da proteína KIN humana ainda não foi resolvida por métodos experimentais e nem por modelagem in silico, devido à falta de moldes estruturais para a maioria da sequência, indicando uma estrutura ímpar para essa proteína. Diante destas características, nosso grupo se propôs a realizar a análise filogenética e a caracterização biofísica da proteína KIN, utilizando técnicas de bioinformática e espectroscopia de Dicroísmo Circular (CD). A determinação dos parâmetros biofísicos da HSAKIN como Entalpia de desnaturação (?Hm) e Temperatura de melting (Tm) ainda não foi efetuada, assim, o objetivo deste trabalho foi o de realizar ensaios de expressão, análise filogenética e análise biofísica desta proteína de modo a determinar parâmetros termodinâmicos que possam contribuir para a elucidação de suas funções celulares. A análise computacional de parâmetros biofísicos e estruturais foi realizada a partir da sequência traduzida da proteína HSAKIN(His)6x, utilizando programas e servidores on-line, os quais, também foram utilizados para os alinhamentos de múltiplas sequências. Foi prevista uma massa de 48.032,65 Da, ponto isoelétrico teórico de 9,07 e um NLS Bipartido (NLS+) para a proteína HSAKIN(His)6x. Com base nos alinhamentos pôde-se verificar que HSAKIN é bastante conservada entre os animais utilizados, passando de 90% de identidade. Quando se analisou a identidade entre os domínios das proteínas homólogas à HSAKIN separadamente, notou-se um maior grau de identidade para os domínios dedo de zinco e hélice alada, sugerindo que podem ser responsáveis pelo processo mais fundamental à função desta proteína, a ligação à cromatina, ao qual já foi visto que esses dois domínios podem se associar, bem como a interação proteína-proteína. O motivo NLS+ encontrado apresentou maior identidade para a maioria dos eucariotos superiores em relação ao anteriormente descrito na literatura. Bactérias Escherichia coli BL21 (DE3) transformadas com o plasmídeo pET23a-d(+)HSAKIN(His)6x, contendo a sequência codificante da proteína HSAKIN(His)6x, foram induzidas com IPTG para promover a superprodução da proteína de interesse. Posteriormente, as proteínas foram purificadas com cromatografia de afinidade e tiveram seus tampões trocados em coluna de exclusão molecular. Depois de purificadas e concentradas, as amostras foram submetidas a análise por dicroísmo circular. A determinação da porcentagem dos elementos de estrutura secundária da proteína purificada foi realizada para três pHs (6,4; 7,4 e 8,4), por meio da deconvolução do espectro de CD a 20 °C. Em pH fisiológico a proteína HSAKIN(His)6x possui mais da metade de sua composição de elementos não estruturados, voltas-ß e random coils, seguido de folhas-ß (30%) e em menor porcentagem de a-hélices (17%). Esses resultados sugerem, com base que regiões não enoveladas podem se inter-relacionar com uma coleção de parceiros na organização de complexas redes de interação proteína-proteína, assim, essas regiões não estruturadas de KIN poderiam auxiliar na formação de complexas redes de interação proteína-proteína, promovendo a formação de complexos proteicos de alto peso molecular que agem nos processos aos quais HSAKIN foi relacionada. Esses dados podem ser extrapolados para as homólogas analisadas que apresentam altos valores de identidade de sequência. Os resultados de desnaturação térmica para os pHs 6,4 e 7,4 no comprimento de onda 222 nm, mostraram os parâmetros biofísicos ?Hm e Tm relativamente baixos em comparação aos encontrados na literatura. Esses valores substancialmente baixos, provavelmente se devem a esta proteína não possuir nenhuma ponte dissulfeto intra-cadeia, mesmo contando com 7 cisteínas em sua sequência. Possivelmente, a não ocorrência de ligações pode ser devido a diversos impedimentos estéricos impostos pela estrutura enovelada da proteína Abstract: KIN protein was identified in 1989 in mouse cells by means cross-reaction of monospecific polyclonal antibodies directed against the RecA protein from Escherichia coli. The KIN gene encodes a 45 kDa nuclear protein which has nucleic acid binding capacity. Among eukaryotes, KIN gene is conserved phylogenetically, which indicates functional activity in indispensable biological processes. In murine, KIN protein is associated with chromatin forming replication foci throughout the nucleoplasm, similar to those observed with other proteins involved in replication, in DNA repair and RNA splicing. KIN is ubiquitously expressed in mammals and shows high expression in human cells of skeletal muscle, heart, testis and cells with high proliferation rates, such as tumors. These data point out that KIN has a role in replication. In addition, it has been associated to other functions like transcription factor in bacteria and yeasts; reprogramming of global gene expression in plant adaptation to limited copper availability by interaction with SPL7; and in murines it has been shown that KIN is important for efficient repair and resolution of double-stranded breaks caused by ionizing radiation and for the immunoglobulins isotype exchange by B-lymphocytes. In neurons, there is evidence of an alternative role for KIN rather than replication, since they do not divide more after mature. KIN protein is structurally composed for particular motifs: a zinc finger, a winged helix domain, a domain homologous to the recA protein from E. coli and a KOW motif. However, the complete three-dimensional structure of human KIN protein has not yet been resolved by experimental methods or by in silico modeling, due to the lack of structural templates for most of the sequence, indicating a unique structure for this protein. In view of these characteristics, our group proposed to carry out the phylogenetic analysis and biophysical characterization of human KIN protein, using bioinformatics techniques and Circular Dichroism spectroscopy (CD). The determination of the biophysical parameters of HSAKIN as denaturation enthalpy (?Hm) and melting temperature (Tm) has not been performed, so the aim of this work was to perform expression, phylogenetic and biophysical analysis of this protein in order to determine thermodynamic parameters that may contribute to the elucidation of their cellular functions. The computational analysis of biophysical and structural parameters was performed from the HSAKIN(His)6x protein sequence, using on-line programs and servers, which were also used for multiple sequence alignments. It was predicted a molecular weight of 48,032.65 Da, theoretical isoelectric point of 9.07 and a bipartite NLS (NLS+) for the HSAKIN(His)6x protein. Based on the alignments it could be verified that HSAKIN is highly conserved among the tested animals, passing from 90% of identity. When the identity among HSAKIN homologous protein domains was analyzed separately, a higher degree of identity was noted for the zinc finger and winged helix domain, suggesting that they may be responsible for the most fundamental process to the function of this protein, the binding to chromatin, to which it has already been seen that these two domains can be associated, as well as the interaction protein-protein. The NLS+ motif found showed higher identity for most eukaryotes compared to that previously described in the literature. Bacteria Escherichia coli BL21 (DE3) transformed with the plasmid pET23a-d (+) HSAKIN(His)6x, containing the HSAKIN(His)6x protein coding sequence, were induced with IPTG to promote overproduction of the protein of interest. Subsequently, the proteins were purified with affinity chromatography and had their buffers exchanged into a molecular exclusion column. After being purified and concentrated, the samples were analyzed by circular dichroism. The percentage determination of the secondary structure elements of the purified protein was performed for three pHs (6,4; 7,4 e 8,4), by deconvolution of the CD spectrum at 20 °C. In physiologic pH HSAKIN(His)6x has more than half of its composition of non-structured elements, ß-turns and random coils, followed by ß- sheets (30%) and a lower percentage of a-helices (17%). These results suggest, based on that non-envelope regions can interrelate with a collection of partners in the organization of complex protein-protein interaction networks, thus, these nonstructured KIN regions could aid in the formation of complex protein-protein, promoting the formation of high molecular weight protein complexes that act on the processes to which HSAKIN has been related. These data can be extrapolated to the analyzed counterparts having high sequence identity values. The thermal denaturation results for pHs 6.4 and 7.4 at the wavelength 222 nm showed relatively low biophysical parameters ?Hm and Tm compared to the literature. These substantially low values are possibly due to this protein having no intra-chain disulfide bridge, even with 7 cysteines in its sequence. Possibly, the nonoccurrence of bonds may be due to several steric hindrances imposed by the fold structure [7] 50 f. : il. (algumas color.).

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Venenos de escorpiões constituem uma rica fonte de peptídeos, que podem ser classificados como peptídeos com ligações dissulfeto e peptídeos sem ligações dissulfeto. Peptídeos aniônicos correspondem aos componentes sem ligações dissulfeto mais abundante na peçonha do escorpião Tityus stigmurus (espécie prevalente no nordeste brasileiro), sendo ricos em resíduos de ácidos aspártico e glutâmico. Esta abordagem apresenta, pela primeira vez, a caracterização estrutural e a avaliação da atividade biológica de um peptídeo aniônico presente na peçonha do escorpião Tityus stigmurus, denominado TanP. A estrutura tridimensional do TanP foi predita por modelagem computacional e refinada por simulações de dinâmica molecular, sendo a estrutura secundária obtida por dicroísmo circular, e estabilidade estrutural avaliada em diferentes meios, pH, temperatura e presença de íons cobre. Além disso, utilizou-se a espectroscopia UV-visível para avaliar a atividade quelante de TanP na presença de cobre. As atividades antimicrobiana, citotóxica, imunomoduladora e antioxidante também foram avaliadas. As análises de CD indicaram uma predominância de conformação randômica em meio aquoso, bem como mudanças estruturais dependentes de pH e temperatura. Os íons cobre, ao se ligarem ao peptídeo, modificaram a estrutura do mesmo. Tais dados corroboraram com o que foi demonstrado na dinâmica molecular. A razão molar de ligação (TanP:cobre) na dinâmica molecular foi 1:5, enquanto no ensaio de reatividade observou-se razões de 1:7 e 1:3, a depender da concentração de TanP na solução. TanP não induziu citotoxicidade para as células normais e cancerígenas testadas, e apresentou capacidade de inibir, in vitro, a liberação de óxido nítrico por macrófagos estimulados por LPS. Desta forma, os resultados sugerem que TanP é um peptídeo promissor para aplicação terapêutica como um agente quelante, bem como agente imunomodulador e antioxidante. Scorpion venoms are a rich source of peptides, which may be classified as disulfide-bridged or non-disulfide-bridged peptides. Among them, there are anionic peptides, rich in aspartic and glutamic acid residues. Despite being the most abundant component in the venom gland of Tityus stigmurus (the prevalent scorpion species in Northeast Brazil), they are poorly characterized in the literature. This work presents, for the first time, structural characterization and biological activity assays of an anionic peptide from the venom of the scorpion T. stigmurus, named TanP. The three-dimensional structure of TanP was obtained by computational modeling and refined by molecular dynamic (MD) simulations. Furthermore, we have performed circular dichroism (CD) analysis to predict TanP secondary structure, and UV-visible spectroscopy to evaluate its chelating activity. CD indicated predominance of random coil conformation in aqueous medium, as well as changes in structure depending on pH and temperature. TanP has chelating activity on copper ions, which modified the peptide’s secondary structure. These results were corroborated by MD data. The molar ratio of binding (TanP:copper) depends on the concentration of peptide. TanP was not cytotoxic to normal or cancer cell lines, and showed an ability to inhibit the in vitro release of nitric oxide by LPS-stimulated macrophages. In this way, the results suggest TanP is a promising peptide for therapeutic application as a chelating, immunomodulatory and antioxidant agent.

Orientador: Marisa Masumi Beppu Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química Resumo: No presente trabalho objetivou-se estudar a influência da idade de casulos produzidos pelo bicho-da-seda nas suas propriedades, durante todas as etapas do processamento até a elaboração do filme de fibroína de seda. O estudo teve início a partir da hipótese de que a idade do casulo poderia causar modificações nas propriedades da fibroína durante seu processamento e, consequentemente, uma possível interferência na qualidade do produto final, conforme observações realizadas no laboratório na manipulação da fibroína ao longo dos anos. Até o momento nenhum estudo relatou a importância da idade dos casulos nos materiais preparados a partir da fibroína de seda. Neste sentido, foram feitas caracterizações utilizando como matéria-prima casulos de diferentes lotes e idades, produzidos em 2009, 2013 e 2015, baseando-se na exploração de três formas nas quais a fibroína se apresenta ao longo das etapas do processamento: i) casulos e fios de fibroína de seda, (ii) dispersões dialisadas de fibroína de seda e (iii) filmes gerados a partir das dispersões dialisadas. Todas as etapas do processamento e análises foram realizadas simultaneamente, portanto as influências observadas somam, de fato, os fatores de envelhecimento e lote de produção. Entretanto, infere-se que a maior parte destas diferenças seja devido ao envelhecimento do casulo, conforme observações realizadas no laboratório com o lote de 2009. As primeiras diferenças em relação à idade dos casulos foram observadas nas dispersões dialisadas, nas quais as amostras dos diferentes anos produziram resultados distintos na análise de eletroforese em gel (determinação da massa molecular). Além disso, a análise do tamanho de partícula indicou a presença de agregados coloidais. Quanto à sua estrutura secundária, a análise de dicroísmo circular mostrou a formação prematura de estruturas folha-? para as dispersões elaboradas a partir de casulos de maior idade e estrutura randômica da dispersão dialisada produzida a partir de casulos novos. O UV-VIS indicou uma maior presença de cromóforos nas dispersões dialisadas elaboradas a partir de casulos de maior idade. Os filmes elaborados a partir de casulos de maior idade apresentaram uma estrutura mais cristalina em relação aos filmes elaborados a partir de casulos novos. Análises termogravimétricas indicam que os filmes elaborados a partir de casulos de maior idade apresentam maior resistência térmica que os demais. Considerando o exposto acima, pode dizer-se que houve influência da idade dos casulos de bicho-da-seda durante o processamento do filme de fibroína de seda a partir da dispersão dos fios e posteriores etapas do seu processamento. Dessa forma, a idade do casulo é um fator que deve ser considerado na elaboração de filmes de fibroína de seda, bem como de outros materiais resultantes da manipulação e processamento da fibroína Abstract: This study aimed to investigate the influence of silkworm cocoon age on their properties, during all stages of processing to obtain the silk fibroin film. The study started with the hypothsis that the cocoon age could cause modifications on fibroin properties during processing and, consequently, a possible interference of the quality of the final product, as observed in the laboratory on handling fibroin along years. However, to date, no study reports the relevance of cocoon age on fibroin-based materials. In this sense, characterizations were performed using as raw material cocoons of different ages and batch, produced in 2009, 2013 and 2015, based on the exploration of three forms in which fibroin appears throughout the stages of processing: (i) cocoons and yarns of silk fibroin, (ii) dialyzed dispersions of silk fibroin and (iii) films produced from dialyzed dispersions. All processing stages and analysis were performed simultaneously. Thus, the observed influences are related to aging factors and batch production. However, it is inferred that most of these differences are due to the aging of the cocoon, due to observations in the laboratory with the batch of 2009. The first differences regarding the age of cocoons were observed on dialyzed dispersion, where samples of different years produced distinct results in electrophoresis gel analysis. Furthermore, particle size analysis indicated the presence of colloidal aggregates. Regarding its secondary structure, the circular dichroism analysis showed premature formation of ?-sheet structures for dispersions from older coocons and random structure for the dispersion from new coocons. The UV-VIS indicated a higher presence of chromophores in dialyzed dispersions from older coocons. The films made with older cocoons showed a more crystalline structure compared to films made from new cocoons. The thermogravimetric analysis indicated that the films prepared from older cocoons presented higher thermal resistance. Considering the above, it can be concluded that there was influence of silkworm cocoon age during the elaboration of silk fibroin film from fibers dispersion and subsequent stages of processeing. Therefore, the cocoon age is a factor that should be considered in the preparation of silk fibroin films, as well as in the preparation of other silk-based materials Mestrado Ciência e Tecnologia de Materiais Mestra em Engenharia Química CAPES 33003017034P8

Orientador: Prof. Dr. Vani Xavier de Oliveira Junior Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2016. Apos a descoberta da penicilina por Alexander Fleming - em 1940, muitos outros compostos antimicrobianos foram relatados, oriundos de uma ampla variedade de invertebrados, plantas e especies de animais - os antimicrobianos, como: tirocidina, gramidicina, bombinina, melitina, surgindo assim a gera antibioticah. Em seguida, no intuito de obter candidatos para a geracao de novas drogas, particularmente no combate aos virus, fungos e bacterias, o foco na obtencao de peptideos antimicrobianos tambem passou a serem bacterias, fungos, insetos, aracnideos, crustaceos, anfibios, peixes e plantas. Nesse contexto, um peptideo antimicrobiano, denominado IsCT foi isolado em 2001, em Isalo-Madagascar, durante a analise do veneno do escorpiao Opisthacanthus madagascariensis, o qual apresentou atividade hemolitica e antimicrobiana. No intuito de obter-se melhores resultados biologicos contra os agentes patogenicos e uma baixa toxicidade, esse trabalho propoe o desenho de novos analogos do IsCT, com a substituicao de alguns residuos de aminoacidos da sua sequencia, levando-se em consideracao o balanco hidrofobico, carga e sua anfipaticidade. Todos os peptideos foram sintetizados em fase solida, pela estrategia Fmoc, purificados em Cromatografia Liquida de Alta Eficiencia (HPLC) e caracterizados por Espectrometria de Massas (LC/ESI-MS); alem disso, foram realizados estudos conformacionais por Dicroismo Circular (CD).Os ensaios biologicos foram realizados em bacteria gram-negativa Escherichia coli (SBS 363), bacteria gram-positiva, Micrococcus luteus (A270) e a levedura Candida albicans (MDM8). Alem disso, foram realizados ensaios hemoliticos e de degradacao enzimatica. Os resultados demonstraram que o analogo 6foi duas vezes mais ativo que o IsCT nativo, nos tres micro-organismos testados, enquanto que os analogos 1, 5 e 8 mostraram-se menos ativos. Em contrapartida, os analogos 2, 3, 6, 7 e 9 apresentaram um aumento na atividade hemolitica. Todos os analogos apresentaram uma rapida cinetica de degradacao, contudo verifica-se que as substituicoes na posicao 8 (analogo 3 e 4) propiciaram analogos um pouco mais resistentes as proteases. Nos Estudos de CD observa-se que a maioria dos analogos apresenta uma propensao a ¿¿-helice em meios com 50% de TFE e 10 ¿ÊM de SDS, como relatado para o IsCT nativo. De forma geral, com os resultados obtidos dos dez peptideos sintetizados neste trabalho foi possivel obter dois peptideos - [Lys]3-IsCT e [Ala]1[Phe]5[Lys]8-IsCT - os quais mostraram uma reducao do 50% na inibicao dos micro-organismos testados, uma menor atividade hemolitica, em comparacao com o IsCT (peptideo nativo), alem de serem mais resistentes a degradacao proteolitica, indicando que as alteracoes pontuais no IsCT afetam significativamente a sua atividade biologica, hemolitica e a sua estruturacao, tornando-os possiveis candidatos a novas drogas. After the discovery of penicillin by Alexander Fleming in 1940, many other antimicrobial compounds (as tyrocidine, gramicidin, bombin and melittin) were described from a wide variety of plants, invertebrates and other animal species, providing the Antibiotic Era. Then, in order to obtain candidates for the generation of new drugs, particularly in the fight against viruses, fungi and bacteria, focus on obtaining antimicrobial peptides also came to be bacteria, fungi, insects, arachnids, crustaceans, amphibians, fishes and plants. In this sense, an antimicrobial peptide called IsCT was isolated in 2001 in Isalo Madagascar, while analyzing the venom of the scorpion Opisthacanthus madagascariensis that showed hemolytic and antimicrobial activity. In the attempt to obtain better biological outcomes against pathogens and a low toxicity, this study proposes the design of new IsCT analogues, with the replacement of some amino acids of its original sequence, considering its hydrophobic balance, charge and amphipathicity. All peptides were synthesized on solid phase, by Fmoc strategy, purified by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterized by mass spectrometry (LC / ESI-MS); furthermore, were performed conformational studies by circular dichroism (CD). The biological tests were carried out on gram-negative bacteria Escherichia coli (SBS 363), gram-positive bacteria Micrococcus luteus (A270) and Candida albicans (MDM8). In addition, enzymatic degradation and hemolytic assays were performed. The results showed that the analog 6 was twice more active than native IsCT in three micro-organisms tested, whereas the analogs 1, 5 and 8 were less active. In contrast, the analogous 2, 3, 6, 7 and 9 exhibited an increase in hemolytic activity. All analogs exhibited rapid degradation kinetics, however, it is seen that substitutions at positions 8 (analogous 3 and 4) analogs provided a little more resistant to proteases. In the CD studies, was observed that most analogs presents a propensity for á-helix in solutions with 50% TFE and 10 ìM of SDS, as has been reported for the native IsCT. In general, the results obtained from the ten peptides synthesized in this work it was possible to obtain two peptides to [Lys]3-IsCT and [Ala]1[Phe]5[Lys]8-IsCT which showed a reduction of 50% in inhibition of tested microorganisms, a lower hemolytic activity compared with the IsCT (native peptide) plus were more resistant to protease degradation, indicating that specific changes in IsCT significantly affect its biological activity, hemolytic and their structure, making the possible candidates for new drugs.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-05-19T12:14:27Z No. of bitstreams: 1 Amanda Emmanuelle Sales.pdf: 4982712 bytes, checksum: 90011cbdafe7a0363213b2fff5735b44 (MD5) Made available in DSpace on 2016-05-19T12:14:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amanda Emmanuelle Sales.pdf: 4982712 bytes, checksum: 90011cbdafe7a0363213b2fff5735b44 (MD5) Previous issue date: 2015-12-21 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Fibrinolytic proteases are enzymes that degrade fibrin, the main component of blood clots. The accumulation of this protein leads to thrombosis responsible for cardiovascular disease including myocardial infarction. A promising alternative to thrombolytic therapy has been the production of these enzymes by microorganisms which promotes low cost, high efficiency and capacity for large scale production. This study aimed to select species of filamentous fungi isolated from Caatinga soil samples - Pernambuco - Brazil and assess their potential for production of proteases with fibrinolytic activity. Among the 36 isolates studied, 58% showed fibrinolytic activity above 100 U/mL. The microorganism with the higher activity in terms of enzyme production was Mucor subtilissimus UCP 1262 with 415 U/mL. Further optimization of the fermentation process resulted in the production of 1075 U/mL of enzymatic activity. The fibrinolytic enzyme had a capacity of enzymatic degradation of the blood clot of 16.7 % in vitro. Extraction of fibrinolytic protease produced at submerged fermentation was carried out using a PEG/ammonium sulphate aqueous two-phase system (ATPS). PEG 8000 15% and 25% ammonium sulphate were selected as the most appropriate components for extraction with Fibrinolytic Activity in salt phase: 345 U/mL; K: 0.65; Y: 253.1 % and FP: 8.8. The fibrinolytic enzyme from Mucor subitilissimus UCP 1262 was pre-purified using extractive fermentation in PEG and ammonium sulphate ATPS, in which the fungal strain was able to grown even in high salt concentration, produced and extracted simultaneously to the PEG phase. A novel protease with fibrinolytic activity was purified also by chromatographic methods using a two-step purification protocol. Compared to the crude enzyme extract, the specific activity of the enzyme increased 5.30 fold with a recovery of 36.31%. The initial crude extract with the enzyme was pre-purified using acetone precipitation and adsorbed by ion exchange chromatography on DEAE-sephadex G50. The two-dimensional electrophoresis system (2DE) coupled with SDS-PAGE showed a single protein band of approximately 15.3 kDa and isoelectric focusing point of 3.9, exhibiting a nature as an acidic enzyme. Additionally, the activity was slightly inhibited by EDTA, but significantly inhibited by PMSF and also had a higher affinity for the N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide (SAApNA) and azocasein substrates, suggesting to be a chymotrypsin-like protease. Protein unfolding induced by pH and temperature were applied to study the protein conformational changes and showed from the thermal denaturation curve, change in ellipticity at 222 nm, indicated Tm (Melting temperature) of the protein to be 58.14°C. The far UV circular dichroism (CD) of the fibrinolytic protease showed the secondary structure with most content percentage of α-helix. These results demonstrate an economical, viable enzyme purification protocol. And studying the purified fibrinolytic enzyme have established basis for elucidating mechanisms responsible for the changes in conformation of the new fibrinolytic enzyme under varying conditions of temperature and pH. This novel fibrinolytic enzyme may represent a new source of therapeutic agents to treat thrombosis diseases. Proteases fibrinolíticas são enzimas que degradam a fibrina, o principal componente dos coágulos sanguíneos. O acúmulo da fibrina nos vasos sanguíneos leva a trombose, fenômeno responsável por doenças cardiovasculares. Uma alternativa promissora para a terapia trombolítica tem sido a produção dessas enzimas por micro-organismos que promovem baixo custo, alta eficiência e capacidade de produção em larga escala. Produzir proteases fibrinolíticas por linhagens de fungos filamentosos por fermentação submersa e desenvolver o processo de purificação utilizando Sistemas de Duas Fases Aquosas (SDFA) e cromatografia líquida, além de caracterizar bioquímico e estruturalmente a enzima. Dentre as 36 espécies estudadas, 58% apresentaram atividade fibrinolítica acima de 100 U/mL A espécie com maior atividade foi Mucor subtilissimus UCP 1262 com 415 U/mL. Foram realizados processos fermentativos que resultaram na produção de 1075 U/mL de atividade fibrinolítica, com capacidade de degradação do coágulo sanguíneo de 16,7% in vitro. A extração da protease fibrinolítica produzida por fermentação submersa foi realizada utilizando o sistema de duas fases aquosas (SDFA) com Polietileno glicol (PEG) e sulfato de amônio. O PEG 8000 (g/mol) a 15% e sulfato de amônio a 25% foi selecionado como a condição mais eficiente para a extração da enzima na fase do sal, apresentando 345 U/mL de atividade, coeficiente de partição K=0,65; Recuperação Y=253,1% e Fator de purificação FP=8,8. A protease fibrinolítica produzida por Mucor subitilissimus UCP 1262 foi também pré-purificada utilizando fermentação extrativa com SDFA (PEG e sulfato de amônio), onde a espécie fúngica foi capaz de crescer mesmo em altas concentrações de sal, produzir e extrair simultaneamente para a fase do PEG do sistema. A protease fibrinolítica foi purificada também através de métodos cromatográficos utilizando um protocolo de purificação com dois passos. O extrato bruto inicial com a enzima foi pré-clarificado utilizando precipitação com acetona e adsorção em cromatografia de troca-iônica em DEAE-sephadex G50, o qual foi capaz de aumentar a pureza em 5,30 vezes com a recuperação de 36, 31%. O sistema de eletroforese bidimensional 2DE acoplado ao SDS-PAGE mostrou uma banda única de aproximadamente 15,3 kDa e a focalização isoelétrica apresentou o ponto isoelétrico no pH 3,9, exibindo uma natureza de enzima ácida. Adicionalmente a enzima foi significativamente inibida por PMSF e alta afinidade catalítica para o substrato sintético amidolítico N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide (SAApNA) e azocaseína. Sugerindo ser uma serino-protease semelhante à quimotripsina. Desdobramento proteico induzido por pH e temperatura foram aplicados para estudar as mudanças conformacionais da enzima e mostraram através da curva de desnaturação térmica, mudança da elipticidade a 222 nm, indicando um Tm (Temperatura de desnaturação) da proteína de 58,14°C. O dicroísmo circular no UV distante (far UV CD) da protease fibrinolítica mostrou a estrutura secundária da proteína com maior teor de α-hélix. Estes resultados demonstram um protocolo de purificação de enzimas eficiente. E o estudo da enzima purificada estabeleceu bases para elucidar mecanismos responsáveis pelas mudanças de conformação de uma nova enzima fibrinolítica sob a variação de condições variadas de temperatura e pH. Esta enzima fibrinolítica pode representar uma nova fonte de agente terapêutico no tratamento de doenças trombolíticas.

This paper presents results from a study of albumin from pacu (Piaractus mesopotamicus, Holmberg 1887) and the catfish pintado (Pseudoplatystoma corruscans, Spix & Agassiz, 1829), two neotropical fish species inhabitants of Brazilian rivers, comparing their molecular mass and discussing their secondary structures based on spectropolarimetric (circular dychroism) measurements. Genetic controlled specimens were obtained from two fish hatcheries, located in Mococa (pacu) and in São João da Boa Vista (pintado), both in São Paulo State, Brazil. After a period of adaptation in holding tanks, fish blood samples were taken by punctioning their abdominal aorta. Purified albumin was obtained by gel filtration. SDS-PAGE electrophoresis was performed for the molecular mass estimation. Circular Dichroism spectra were registered for albumins of the two fish species over the range of 190-250 nm (far-UV), which shown two negative bands at 217 and 208 nm, a positive peak at 196 nm and a crossover at 200 nm. This profile is compatible with proteins that content predominantly alpha-helix structure. Este artigo apresenta os resultados de um estudo sobre as albuminas de pacu (Piaractus mesopotamicus, Holmberg 1887) e pintado (Pseudoplatystoma corruscans, Spix & Agassiz, 1829), duas espécies neotropicais de peixes nativas do Brasil, determinando as suas massas moleculares e discutindo suas estruturas secundárias, com base em medidas de espectropolarimetria (dicroísmo circular). Espécimes controlados geneticamente foram obtidos de duas diferentes pisciculturas, uma localizada na cidade de Mococa (pacu) e a outra, na cidade de São João da Boa Vista (pintado), ambas no Estado de São Paulo, Brasil. Após um período de adaptação em tanques apropriados, amostras de sangue foram coletadas por punção da aorta abdominal dos peixes. Albumina pura foi obtida por gel filtração dessas amostras e as massas moleculares foram determinadas a partir dos dados da eletroforese SDS-PAGE. Espectros de dicroísmo circular das albuminas dos peixes foram registrados na região de 190-250 nm (far-UV), os quais mostraram duas bandas negativas, a 217 e 208 nm, um pico positivo a 196 nm e um crossover a 200 nm; perfil este compatível com proteínas que contem predominantemente estrutura alfa-hélice.

Made available in DSpace on 2018-08-28T15:46:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4582_8694.pdf: 2190304 bytes, checksum: 560cef2fbd1b97a23fd9684dc8f3c24b (MD5) Previous issue date: 2015-11-12

Made available in DSpace on 2018-08-31T15:53:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4443_8618.pdf: 2263559 bytes, checksum: 023f2bf84cc52d8e8b1bba03d40496f3 (MD5) Previous issue date: 2015-11-13

Made available in DSpace on 2018-11-22T16:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4173_8021.pdf: 6023836 bytes, checksum: 8b71dea159044dcd8c8b78faf9c11235 (MD5) Previous issue date: 2015-07-13

La proteína quinasa dependiente de cAMP (PKA) es una quinasa de serina y treonina deamplio espectro que fosforila a sus proteínas blanco en respuesta a estímulosespecíficos. Se encuentra involucrada en la regulación de una gran diversidad deprocesos fisiológicos en una amplia variedad de organismos, motivo por el cual es unmiembro modelo de estudio de la superfamilia de las Proteínas Quinasa. En la mayoría de los organismos, en condiciones de baja concentración de cAMP existecomo una holoenzima inactiva heterotetramérica conformada por dos subunidadescatalíticas (C) y un dímero de subunidades regulatorias (R). En respuesta a estímulosextracelulares específicos, las concentraciones intracelulares del segundo mensajeroaumentan; como consecuencia, dos moléculas de cAMP se unen a cada subunidad R,generando un cambio conformacional que disocia la holoenzima en un dímero desubunidades R y dos subunidades C activas. En mamíferos existen cuatro isoformas de la subunidad R, que presentan una estructurade dominios bien conservada entre los distintos organismos. Ésta consiste de dosdominios de unión a cAMP hacia el extremo C-terminal, y una región responsable de ladimerización hacia el extremo N-terminal. Esta pequeña región de apenas 50aminoácidos se denomina dominio de dimerización y anclaje (D/D), ya que constituyeademás una superficie de interacción para una familia de proteínas denominadas AKAPs (A-Kinase Anchoring Proteins). Estas proteínas tienen como función proporcionar a laholoenzima de la PKA la localización subcelular necesaria para garantizar lapropagación adecuada de las señales disparadas por cAMP. Todas ellas presentan unahélice anfipática de unos 20 aminoácidos cuya cara no polar interactúa con alta afinidadcon una superficie hidrofóbica proporcionada por los dominios D/D. Se conocen las estructuras de alta resolución de los dominios D/D de mamíferos, tantoen su forma apo como en complejo con péptidos derivados de distintas AKAPs. Sinembargo, hasta la fecha no se han llevado a cabo estudios estructurales de estosdominios en otros organismos. El objetivo principal de este trabajo consiste en obtener una caracterización estructuraly funcional del dominio D/D de Bcy1, la subunidad R de la PKA de S. cerevisiae. Lamotivación principal radica en contribuir con el primer estudio de estos dominios enorganismos no mamíferos, a efectos de establecer una comparación con éstos. S.cerevisiae es un organismo modelo por excelencia en bioquímica y biología molecular, yresulta muy pertinente para este trabajo dado que en este organismo la PKA es unaenzima fundamental involucrada en la regulación de los procesos relacionados con larespuesta a la disponibilidad de nutrientes, respuesta a estrés, desarrollo y entrada enfase estacionaria. En primer lugar, se realizó un mapeo del dominio D/D de Bcy1 por análisisbioinformático de secuencias y experimentos de entrecruzamiento químico utilizandomutantes de deleción de Bcy1 en su extremo N-terminal. En segundo lugar, se procedióal clonado, sobreexpresión en bacterias, y desarrollo de un protocolo de purificación delfragmento recombinante Bcy1 1-50. Posteriormente, se procedió a su caracterizaciónestructural, para lo cual se utilizaron dos abordajes generales: estudiar la estructura ensolución y elucidar la estructura cristalina. Para la primera parte, se determinó el estado oligomérico en solución y se obtuvieronparámetros hidrodinámicos característicos utilizando cromatografía de exclusiónmolecular (SEC), dispersión estática de la luz (SLS) y dispersión de rayos X a bajo ángulo (SAXS). Por otro lado, se estudió la estructura secundaria utilizando dicroísmo circular (CD). Finalmente, se construyó un modelo de la estructura en solución consistente conlos datos experimentales, mediante herramientas de modelado molecular. En segundolugar, se logró resolver la estructura cristalina utilizando difracción por rayos X (XRD). Recientemente, en nuestro grupo de investigación se han identificado varias proteínasinteractoras de Bcy1. Estas proteínas son consideradas “candidatas” a ser las primeras AKAPs reportadas en levaduras. Para concluir este trabajo, se estudió la interacciónentre el fragmento Bcy1 1-50 y un péptido sintético derivado de una de estas proteínas, Ira2. Para ello se utilizaron técnicas de dicroísmo circular y espectroscopía defluorescencia. The cAMP dependent protein kinase (PKA) is a broad spectrum serine/threonine kinasewhich phosphorylates its target proteins in response to specific stimuli. It is involved inthe regulation of a great diversity of physiological processes in many organisms. Therefore, it is a model member of study of the Protein Kinase superfamily. In most organisms, when cAMP levels are low, it exists as an inactive heterotetramericholoenzyme which is formed by two catalytic (C) subunits and a regulatory (R) subunitdimer. In response to specific extracellular stimuli, the intracellular concentrations ofthe second messenger rise; as a consequence, two molecules of cAMP bind each Rsubunit, thus triggering a conformational change that dissociates the holoenzyme in an Rsubunit dimer and two active C subunits. In mammals there exist four isoforms of the R subunit, which present a well conserveddomain structure among many organisms. It consists of two cAMP binding sites at the Cterminus,and a region responsible for dimerization at the N-terminus. This small regionof 50 amino acids is called the dimerization and docking (D/D) domain since it presentsa surface for interaction with proteins of the AKAP (A-Kinase Anchoring Proteins)family. These proteins are responsible for the appropriate subcellular localization of theholoenzyme, which is required for the propagation of the signaling events triggered bycAMP. They all present an amphipathic helix of 20 amino acids with a non-polar facethat interacts with high affinity with a hydrophobic surface in the D/D domains. The high resolution structures of mammalian D/D domains are well known, both in theirapo forms and in the AKAP peptide complex. However, to date no structural studies ofthese domains in other organisms have been performed. The main goal of this work consists in performing a structural and functionalcharacterization of the D/D domain of Bcy1, the R subunit of PKA from S. cerevisiae. Themotivation for this work consists in contributing with the first structural study of thesedomains in non-mammalian organisms, in order to compare with mammalian features. S. cerevisiae is a prototypic organism in biochemistry and molecular biology, and it is ofgreat interest for this work because PKA is a key enzyme involved in the regulation onutrient availability, stress response, development and entry into stationary phase. As a first approach, we performed a mapping of the D/D domain of Bcy1 using sequenceanalysis and chemical crosslinking experiments with deletion mutants of the N-terminusof Bcy1. Secondly, we cloned, overexpressed, and purified a recombinant fragment, Bcy1 1-50. Finally, we proceeded with its structural characterization, which consisted of twogeneral approaches: to study the solution structure and the crystal structure. For the solution structure analysis, we determined the oligomeric state and obtainedhydrodynamic parameters using size-exclusion chromatography (SEC), static lightscattering (SLS), and small-angle X-ray scattering (SAXS). On the other hand, we studiedthe secondary structure using circular dichroism (CD). Finally, we generated a model ofthe solution structure which is consistent with the experimental data, using molecularmodelling tools. Finally, we solved the crystal structure using X-ray diffraction (XRD). Recently, in our group, several proteins that interact with Bcy1 have been identified. These proteins are considered “candidates” to be the first AKAPs reported in yeast. Toconclude this work, we studied the interaction between the fragment Bcy1 1-50 and asynthetic peptide derived from one of these proteins, Ira2. To accomplish this goal, weused CD and fluorescence spectroscopy techniques. Fil: González Bardeci, Nicolás Diego. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Orientador: Nelson Henrique Morgon Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: O ibuprofeno (ácido (R,S)-2-(4-(2-metilpropil)fenil)propanóico), um não esteróide derivado do ácido 2-arilpropiônico, é um dos anti-inflamatórios mais conhecidos e utilizados, sendo aplicado na sua forma racêmica, no tratamento da febre, dor e inflamação. Inicialmente sua síntese, patenteada pela Boots Pure Drug Company (rota BOOTS), envolvia várias etapas, formação substancial de sais inorgânicos e baixa eficiência atômica. Posteriormente, uma rota alternativa foi desenvolvida pela parceria entre a Boots e a Hoechst Celanese (rota BHC). Esta rota caracteriza-se por três etapas apenas, possuindo uma maior eficiência atômica e uma redução substancial nos resíduos produzidos. O objetivo desse estudo foi avaliar as rotas BOOTS e BHC do ponto de vista energético, além de explorar a quiralidade do ibuprofeno por meio de métodos quirópticos. A etapa inicial deste estudo foi a avaliação de metodologias teóricas, utilizando-se um conjunto selecionado de 74 sistemas moleculares com características eletrônicas e estruturais similares àquelas encontradas em ambas as rotas citadas. No processo de validação calculou-se as propriedades termoquímicas: entalpia padrão de formação, energia de ionização, afinidades eletrônica e por próton das moléculas do conjunto mencionado anteriormente. Foram avaliadas as seguintes metodologias: G3, G3MP2, G3B3, G3MP2B3, G4 e G4MP2, além de oito funcionais de troca-correlação: SOGGA11, RevTPSS, B3LYP, PBE0, B98, M06-2X, BMK e HSE06. Nesse último conjunto empregou-se as funções de base G3LargeXP. O método G4MP2 mostrou ser o mais adequado no processo de validação, fornecendo resultados das propriedades citadas com a melhor relação exatidão/custo computacional. Utilizando-se então desta metodologia, obtiveram-se os perfis energéticos das rotas sintéticas BOOTS (?G = -114,45 kcal/mol), BHC (?G = -17,36 kcal/mol) e das suas respectivas etapas para os enantiômeros R e S do ibuprofeno. As propriedades quirais dos enantiômeros foram avaliadas por meio de cálculos para a obtenção de espectros teóricos dos métodos de dicroísmo circular eletrônico no nível CAMB3LYP/ GTLargeXP e vibracional no nível B3LYP/GTLargeXP, apresentando uma boa concordância com os dados experimentais nos diferentes solventes estudados Abstract: Ibuprofen ((R,S)-2-(4-(2-methylpropyl)phenyl)propanoic acid) is one of the most known and utilized non-steroidal anti-inflammatory derived from 2-arylpropionic acid and it is applied in the treatment of fever, pain and inflammation in its racemic form. Initially, its synthesis, patented by Boots Pure Drug Company (BOOTS route), involved several steps, substantial formation of inorganic salts and low atomic efficiency. Posteriorly, an alternative route was developed by the partnership between Boots and Hoechst Celanese (BHC route). This last route has only three steps, with higher atomic efficiency and a substantial reduction of by-products. The purpose of this study was to evaluate BOOTS and BHC routes from the energetic point of view, in addition to exploring ibuprofen chirality using chiroptical methods. The initial stage of this study was the evaluation of theoretical methods, using a set of 74 molecular systems with electronic and structural features similar to the ones found in the mentioned routes. In the validation process, thermochemical properties were calculated: standard enthalpy of formation, ionization energy, electronic and proton affinities of the previously mentioned set. The following methodologies were evaluated: G3, G3MP2, G3B3, G3MP2B3, G4 e G4MP2, also eight exchange-correlation functional: SOGGA11, RevTPSS, B3LYP, PBE0, B98, M06-2X, BMK e HSE06. The G3LargeXP basis function was used with the last group. In the validation process, G4MP2 method was proven to be the most appropriate, providing values for the mentioned properties with the best accuracy/computational cost relationship. Using this methodology, the energetic profiles of BOOTS (?G = -114,45 kcal/mol) and BHC (?G = -17,36 kcal/mol) synthetic routes and of their respective steps for the R and S ibuprofen enantiomers were obtained. The chiral properties of the enantiomers were evaluated by calculations to obtain theoretical spectra of electronic circular dichroism at the CAMB3LYP/ GTLargeXP level and vibrational circular dichroism at the B3LYP/GTLargeXP level, being in concordance with experimental data involving the studied solvents Mestrado Físico-Química Mestre em Química CAPES

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-16. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:47:13Z : No. of bitstreams: 1 000846885.pdf: 505151 bytes, checksum: ad11474b84c8cf10e34014ace8c2c242 (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Peptdeos antimicrobianos possuem em geral cadeias curtas, carga líquida positiva devido ao excesso dos res duos b asicos e são ricos em amino acidos hidrof obicos. Possuem um grande potencial farmacológico, com atividade antimicrobiana modulada por interações eletrost aticas e hidrof obicas. Neste trabalho utilizou-se o pept deo sintético L1A (IDGLKAIWKKV ADLLKNT NH2), que devido aos res duos de acido asp artico e lisinas constituintes de sua cadeia, possui carga liquida +3, em pH neutro. Foram analisadas as insuficiências do pH e da carga de ves culas aniônicas na adsorçãao do pept deo. Este estudo utilizou medidas de potencial eletrocin etico de ves culas e experimentos de titulação monitorados por dicro smo circular (CD). A adsorção do L1A a LUVs de POPC e misturas POPC/POPG em diferentes proporções de POPG, foi medida nos pHs 4, 7 e 10. Os espectros de dicro smo circular dos peptídeos, na presença de vesícula, apresentaram caracter sticas de estruturas helicoidais, enquanto apresentaram estruturas desordenadas em tampão. As frações de hélices obtidas são maiores quando o pept deo adsorve em ves culas com maiores quantidades de POPG, indicando forte contribuição eletrost atica. As constantes aparentes de adsorção dos pept deos as membranas modelo foram calculadas atrav es da elipticidade de CD normalizada em 222 nm, obtidas por titulações de pept deo com ves culas. A a - nidade do pept deo a ves culas aniônicas e signi cativamente maior do que a ves culas zwitteriônicas, o que refor ca a import ancia das interçõeoes eletrost aticas no processo de adsorção do pept deo na bicamada. O efeito conjunto de carga das ves culas e de pH resultaram em signi cativa regulação de carga do pept deo resultando em valores de carga efetiva alta em pH 4,0 devido a protonação dos res duos de asp artico. Em pH 10,0 a pequena carga efetiva calculada deve-se as desprotona ações do N-terminal e das lisinas... Antimicrobial peptides have in general short chains, positive net charge due to the excess of basic residues and are rich in hydrophobic amino acids. They have pharmacological potential as antimicrobial agents and their activity is modulated by electrostatic and hydrophobic interactions. In this work, we used the synthetic peptide L1A (IDGLKAIWKKV ADLLKNT NH2) that due to its acid and basic residues have an net charge +3, at neutral pH. The e ects of the pH and of the charges of anionic vesicles on the adsorption of L1A were analized. This study used measurement of electrokinetic potential of vesicles and titration experiments monitored by circular dichroism spectroscopy (CD). Adsorption of L1A to POPC and POPC/POPG LUVs in di erent POPG contents were assessed in the pH 4.0, 7.0 and 10.0. Circular dichroism spectra of the peptides in the presence of vesicles showed to features of helical structures; while random coil structures were observed at bu er for all the used pHs. The helical content was evaluated and showed to increase when the peptide adsorbs into vesicles with increasing amounts of POPG, indicating that there is a strong electrostatic contribution. Partition coe cients were calculated through the normalized CD ellipticities at 222 nm and showed that the a nity of the peptide for anionic model membranes is e ectively higher than those found for zwitterionic ones. It reinforces the importance of the electrostatic contribution to the process of peptide-lipid interaction. The coupled e ect of the vesicle charge and pH lead to signi cant charge regulation of the peptide resulting in high values of e ective charge at pH 4.0 due to the deprotonation of aspartic acid residues. At pH 10.0 the estimated e ective charge is small as a consequence of the deprotonation of both N-terminus and the lysines. The electrostatic and interfatial free energies seems to be additive only at pH 4.0, especially for the bilayers with higher content...

The presence of net circular dichroism in the photoionization of nonchiral homonuclear molecules has been put in evidence recently through the measurement of molecular-frame photoelectron angular distributions in dissociative photoionization of H2 [Dowek, Phys. Rev. Lett. 104, 233003 (2010)]. In this work we present a detailed study of circular dichroism in the photoelectron angular distributions of H2 and D2 molecules, oriented perpendicularly to the propagation vector of the circularly polarized light, at different photon energies (20, 27, and 32.5 eV). Circular dichroism in the angular distributions at 20 and to a large extent 27 eV exhibits the usual pattern in which inversion symmetry is preserved. In contrast, at 32.5 eV, the inversion symmetry breaks down, which eventually leads to total circular dichroism after integration over the polar emission angle. Time-dependent ab initio calculations support and explain the observed results for H2 in terms of quantum interferences between direct photoionization and delayed autoionization from the Q1 and Q2 doubly excited states into ionic states (1sσg and 2pσu) of different inversion symmetry. Nevertheless, for D2 at 32.5 eV, there is a particular case where theory and experiment disagree in the magnitude of the symmetry breaking: when D+ ions are produced with an energy of around 5 eV. This reflects the subleties associated to such simple molecules when exposed to this fine scrutiny, We are very grateful to L. Nahon and G. Garcia for fruitful cooperation, J. F. Gil for technical support, and the SOLEIL general staff for smoothly operating the facility. We gratefully acknowledge the contribution of S. Lupone and S. Damoy (ISMO). N.S. and D.D. acknowledge the support of the Agence Nationale de la Recherche under ATTOWAVE Contract No. ANR-09-BLAN-0031-01. We also thank Mare Nostrum BSC and CCC-UAM for allocation of computer time. The work was supported by the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN) Project No. FIS2010-151127 and ERA-Chemistry Project No. PIM2010EEC-00751, the Spanish Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) Project No. FIS2013-42002-R, the XCHEM Advanced Grant No. GA-290853 of the European Research Council, the European Cooperation in Science and Technology (COST) XLIC Action No. CM1204, and the Vicerrectoría de Investigacion at Universidad de Antioquia (CODI Project No. E01538 and Estrategia de Sostenibilidad 2013-2014)

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-10-24Bitstream added on 2015-03-03T12:07:18Z : No. of bitstreams: 1 000806896_20161029.pdf: 604503 bytes, checksum: 09b8247bf974f840e6a01780c107b6bb (MD5) Bitstreams deleted on 2016-10-31T10:32:33Z: 000806896_20161029.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-10-31T10:33:09Z : No. of bitstreams: 1 000806896.pdf: 21070065 bytes, checksum: 3cf0584410dc2cae4f214389ef036569 (MD5) Levando em consideração a diversidade química das estirilpironas isoladas de Cryptocarya mandioccana, este trabalho teve por objetivo estudar o mecanismo de fragmentação de 6 dessas substâncias por ESI-MS/MS e por GC-EI-MS e também determinar a configuração absoluta dos centros metínicos hidroxilados e do centro C6 do anel pirônico. Foram isoladas seis estirilpironas polihidroxiladas: desacetilcriptocarialactona (1), criptomoscatona D1 (2), criptomoscatona E2 (3), criptomoscatona E1 (4), criptomoscatona E3 (5) e criptomoscatona F1 (6). As análises por ESI-MS/MS e os cálculos teóricos indicaram que em fase gasosa os sítios de protonação e cationização das estirilpironas ocorrem no oxigênio carbonílico, similarmente aos anéis lactônicos descritos na literatura. O mecanismo de fragmentação proposto para as estirilpironas cationizadas com Na+ é comum a todas, apresentando perda neutra de C10H12O [M+Na?148]+ e as substâncias tri-hidroxildas sofreram uma segunda fragmentação com perda neutra de acetaldeído [M+Na?148?44]+. Nos espectros de massas de íons totais não é observado o íon referente às moléculas protonadas [M+H]+, mas sim o íon [M+H?H2O]+ referente à perda de água, portanto uma dissociação na fonte. Assim como para a espécie cationizada, este íon foi submetido à CID e no espectro MS/MS é observado novas eliminações de água referentes as perdas das demais hidroxilas, íons [M+H?nH2O]+, e posteriormente abertura do anel pirônico e eliminação de mais uma molécula de água, seguida de CO [M+H?nH2O?CO]+. A derivação das estirilpironas com MSTFA permitiu analisá-las por CG-MS, porém em quase todos os casos não foi possível detectar o íon molecular. O pico base sempre é referente ao cátion de TMS (m/z 73), comum para substâncias derivadas com este reagente, enquanto que os outros íons fragmentos são resultantes da clivagem homolítica... Taking into account the chemical diversity of styrylpyrones isolated from Cryptocarya mandioccana, this work aimed to study the mechanism of fragmentation of six compounds belonging to this class by means of ESI-MS/MS and GC-EI-MS analysis and also to assign the absolute configuration of hydroxylated methinic centers and that at C6 in the pyrone ring. Six styrylpyrones poli-hydroxilated: desacetilcryptocaryalactone (1), cryptomoscatone D1 (2), cryptomoscatone E2 (3), cryptomoscatone E1 (4), cryptomoscatone E3 (5), e cryptomoscatone F1 (6) were isolated. Analysis by ESI-MS/MS and data from theoretical calculations in gas phase suggest the carbonyl oxygen as protonation and cationization site of the styrylpyrones, which is in accordance to data reported for the lactone rings. The fragmentation mechanism proposed for cationized styrylpyrones with Na+ is common to compounds 1-6, with loss of neutral C10H12O [M+Na?148]+. Tri-hydroxylated substances showed a second fragmentation with loss of an acetaldehyde unit [M+Na??148?44]+. Although it was not possible to observe the protonated molecule ions [M+H]+ in the MS total ion spectrum, the ion [M+H?H2O]+ referring to water loss was observed, which indicates in-source dissociation. As for the cationized species, this ion was subjected to CID process and the MS/MS spectrum showed an additional water loss related to a second hydroxyl group, ions [M+H?nH2O]+. It was then followed by pyrone ring-opening and eliminations of a water molecule and CO [M+H?nH2O?CO]+. Derivatization of the styrylpyrones with MSTFA was conducted to allow the analysis by GC-MS. On the mass spectra, in almost all cases, it was not possible to detect the molecular ion, and the base peak was always related to cation TMS (m/z 73). This ion is common for substances derived with this reagent, while the others ions are fragments resulting from the homolytic ? cleavage with...