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Les WNTs sont une famille de glycoprotéines qui, secrétées dans le milieu extracellulaire, jouent un rôle important dans l’embryogenèse. Chez l’adulte, leur dérégulation va entrainer diverses affections incluant des troubles du développement accompagnés ou non de malformations mais aussi des cancers. Au niveau de l’ovaire, le rôle des WNTs demeure peu défini même si des études chez l’humain et la souris prouvent l’implication de certains membres de cette famille dans le développement ovarien ainsi que dans les processus de maturation folliculaire et d’ovulation. Dans ce contexte, nous avons voulu évaluer l’expression de quelques membres de la famille des WNTs (-2, -2b, -4, -5a et -5b) durant l’expansion des cellules du cumulus et évaluer l’effet de certains d’entre eux sur le COC ainsi que la maturation de l’ovocyte chez la vache. Les COCs bovins étaient placés dans une solution de maturation in vitro pendant 0, 6, 12 et 22h et les niveaux d’ARNm mesurés par PCR en temps réel. L’abondance de l’ARNm pour WNT-2b était significativement plus élevée après 6h de maturation comparée aux COCs immatures (à 0h), alors que l’ARNm codant pour WNT-2, -4, -5a et -5b n’augmentait qu’en fin de culture. L’addition d’EGF provoquait l’expansion du COC et la progression de l’ovocyte vers la métaphase II (MII) comme nous l’espérions mais, à notre grande surprise, l’ajout de WNT-2b au milieu de maturation provoquait également l’expansion du COC (82% et 69% pour EGF et WNT-2b respectivement) et la progression de l’ovocyte vers le stade MII (62% et 56% EGF et WNT-2b respectivement). La combinaison d’EGF et WNT-2b n’a pas produit de meilleurs résultats. Notre étude met en lumière l’implication des WNTs dans la maturation du COC chez la vache. Leurs voies d’activation restent toutefois à déterminer., The Wnts comprise a large family of secreted glycoproteins which, when secreted in the extracellular space, play a key role in embryonic development. In adults, Wnts play a role in homeostasis and their deregulation likely causes several problems including developmental abnormalities with or without deformities, and cancer. The role of Wnts in the ovaries is not clearly defined although studies in humans and mice show the involvement of some Wnts in ovarian development, follicular maturation and in the process of ovulation. In this study, we tested the hypothesis that members of the Wnt family are involved in oocyte maturation in cattle. The specific objectives were to measure the expression of key Wnts (Wnt-2, -2b, -4, -5a and -5b) in cumulus cells during expansion, and to assess the effect of select Wnt proteins on expansion of the cumulus oocyte complex (COC) and oocyte maturation. Bovine COCs were placed into IVM medium for 0, 6, 12 and 22 h and mRNA levels measured by real-time PCR. The abundance of Wnt-2b mRNA in the cumulus cells was significantly higher at 6 h of maturation compared to immature (time 0) COCs, whereas mRNAs encoding Wnt-2, -4, -5a and -5b did not increase until the end of culture. The addition of EGF induced COC expansion and progression of the oocyte to meiosis II (MII) as expected but, unexpectedly, addition of Wnt-2b also induced expansion and (82% and 69%, EGF and Wnt2b, respectively) and progression to MII (62% and 56%, EGF and Wnt2b, respectively); a combination of WNT-2b and EGF did not improve the rates over either alone. Our study provides new evidence for a role for Wnts in the maturation of the COC in cattle. The Wnt signalling pathways are still unknown and more studies are needed.

La cryoconservation d'ovocytes est une méthode qui faciliterait la conservation du potentiel génétique chez la femelle et permettrait plus de flexibilité dans l'application des techniques de reproduction assistée chez les animaux domestiques et les espèces en voie de disparition. Chez le cheval, le taux de réussite de cette technique est faible comparée à celui obtenu chez d’autres espèces animales. Par conséquent, plus d’études seront nécessaires pour élucider les mécanismes spécifiques responsables du faible taux de succès après la cryopréservation. Le but de cette étude était d'évaluer l'effet de la vitrification d'ovocytes équins immatures sur leur taux de maturation, de clivage et le développement de blastocystes en utilisant un protocole de vitrification en trois étapes avec de l’ethylène glycol (EG) et du diméthylsulfoxyde (DMSO), ainsi que comparer l'effet des milieux hors congélation. Le protocole de vitrification utilisé dans la présente étude a été conçu en fonction des résultats obtenus au cours d’études préliminaires. Des ovocytes provenant de follicules immatures de juments ont été conservés pendant une nuit (14-18 heures) à température ambiante (~22⁰C) dans un milieu de maintien. Le lendemain, les ovocytes ont été dénudés et placés dans une solution de base (BS) composée de 20% de sérum de veau foetal (FBS) + M199/Hanks’ salts. Les ovocytes ont ensuite été répartis au hasard dans différents groupes : contrôle, vitrification et exposés aux agents cryoprotecteurs (CPA)-. Les ovocytes du groupe contrôle ont été immédiatement mis en maturation in vitro (IVM). Trois ovocytes ont été exposés à un protocole de vitrification en trois étapes décomposées en (1) solution de pré-vitrification (PVS) 1 (5% EG / 5 DMSO) 40s. (2) PVS 2 (10% EG / 10% DMSO) 40s et enfin, (3) solution de vitrification (VIT) (17,5% EG / 17,5% DMSO / 3 M saccharose) 10s. Le groupe vitrification est plongé dans l'azote liquide alors que les groupes CPA-exposés ont été exposés aux cryoprotecteurs mais n’ont pas été congelés. Les ovocytes ont ensuite été transférés sur un maillage en acier inoxydable stérile puis réchauffés à 42 ° C dans un BS pendant 5 min. Les ovocytes ont ensuite été soumis à l’IVM, fécondés par injection intracytoplasmique d’un spermatozoïde puis mis en culture dans le but de produire des embryons. Les différences en termes de maturation, de clivage et de taux de blastocystes entre les groupes ont été analysées par le test exact de Fisher. Le taux de maturation des deux groupes vitrification et CPA-exposés ne différait pas significativement avec le groupe contrôle. Aucun blastocyste n'a cependant été obtenu des groupes vitrification et CPA-exposés. Ces résultats ont montré que les ovocytes équins immatures peuvent maintenir une viabilité et une compétence méiotique après vitrification similaires à celles du groupe contrôle; de plus, l'exposition aux cryoprotecteurs n'a pas abouti à la formation de blastocystes en comparaison avec le groupe contrôle. Une étude plus approfondie sur la physiologie des ovocytes équins est nécessaire afin de pouvoir optimiser la production d’embryons., Oocyte cryopreservation would facilitate the conservation of female genetic material and allow more flexibility in the application of assisted reproductive techniques in domestic animals and endangered species. The overall success rate of this technique in the horse is low compared with other species. Therefore, further research is required to elucidate the species-specific mechanisms responsible for poor survivability following vitrification. This study aimed to evaluate the effect on maturation rate, cleavage and blastocyst development of vitrified immature equine oocytes, using a three-step vitrification protocol with ethylene glycol (EG) and dimethyl sulfoxide (DMSO); and comparing the effect of media without freezing. The vitrification protocol was designed based on the results of preliminary experiments. Oocytes were recovered from immature follicles of live mares. Oocytes were held overnight at room temperature (14-24 hrs) in a holding medium. Oocytes were then denuded and placed in a base solution (BS) composed of 20% fetal bovine serum (FBS) + M199/Hanks’ salts. Oocytes were randomly allotted to control, vitrification, and cryoprotectant agents (CPAs)-exposed groups. Control oocytes were cultured directly for in-vitro maturation (IVM). Three oocytes were exposed to a three-step vitrification protocol composed of a pre-vitrification solution (PVS) 1 (5% EG/ 5% DMSO); PVS 2 (10% EG/ 10% DMSO) during 40s each; and finally vitrification solution (VS) (17.5% EG/ 17.5% DMSO/ 3 M sucrose), during 10s. All media were diluted in M199/Hanks’ salts + 20% FBS. Oocytes were then transferred to a 75-μm sterile stainless steel mesh. The oocytes were warmed at 42 °C in the BS for 5 minutes. Oocytes from the vitrified group were plunged into liquid nitrogen, while oocytes from CPA-exposed groups were only exposed to cryoprotectants. Oocytes were then subjected to IVM, fertilization and embryo culture. Fisher's Exact Test analyzed differences in maturation, cleavage and blastocyst rates between groups. The maturation rate of vitrified and CPA-exposed groups did not differ significantly from control oocytes. However, no blastocysts were obtained from CPA-exposed and vitrified groups. Vitrification and control groups showed that immature equine oocytes could maintain viability and meiotic competence; moreover, cryoprotectant exposure did not show any blastocyst formation as compared to control. Further investigation is necessary to understand the overall physiology of equine oocytes in order to optimize the developmental capacity of embryos.