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Accuracy and transparency of scientific data are becoming more and more relevant with the increasing concern regarding the evaluation of data reproducibility in many research areas. This concern is also true for quantifying coding and noncoding RNAs, with the remarkable increase in publications reporting RNA profiling and sequencing studies. To address the problem, we propose the following recommendations: (a) accurate documentation of experimental procedures in Materials and methods (and not only in the supplementary information, as many journals have a strict mandate for making Materials and methods as visible as possible in the main text); (b) submission of RT-qPCR raw data for all experiments reported; and (c) adoption of a unified, simple format for submitted RT-qPCR raw data. The Real-time PCR Data Essential Spreadsheet Format (RDES) was created for this purpose.

Orientador: Rejane Maira Góes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A reprogramação metabólica ao longo do processo carcinogênico confere suporte à alta demanda anabólica e energética. Este ajuste também é observado no câncer de próstata (CaP), em especial a desregulação mitocondrial e da lipogênese, vulnerabilidades exploradas como estratégias terapêuticas. O ácido docosahexaenóico (DHA) é um ácido graxo poli-insaturado ômega-3 com propriedade antiproliferativa em diferentes tipos tumorais, inclusive na próstata, cujos mecanismos ainda não estão esclarecidos, mas parecem envolver o metabolismo celular. Este trabalho avaliou a propriedade antitumoral do DHA em diferentes contextos androgênicos do CaP e os mecanismos subjacentes, associados à modulação do metabolismo tumoral. Primeiramente, avaliamos o potencial do DHA em reduzir o crescimento celular associado à regulação da via androgênica, de sensores metabólicos que co-regulam morte e proliferação celular, como também a mitocondrial. Para isso, foram utilizadas células epiteliais prostáticas humanas pré-maligna (PNT1A, AR-positiva) e tumorais resistentes à castração (CRPC) 22rv1 (AR-positiva) e PC3 (AR-negativa). O DHA (100µM, 48h) modulou o crescimento celular diferentemente, reduzindo a fase S e induzindo morte celular nas AR-positivas, enquanto provocou parada do ciclo em G2/M na AR-negativa. Nestas linhagens, este ômega-3 induziu estresse oxidativo, acúmulo lipídico e disfunção mitocondrial. A PNT1A mostrou-se mais responsiva quanto à regulação de genes envolvidos com o metabolismo, resposta a hormônios, estresse, como também na fisiologia mitocondrial. Apesar de menor quantidade, o DHA desregulou genes nas células malignas que estão frequentemente alterados de forma oposta no CaP. Na PNT1A, o ômega-3 ainda prejudicou a biogênese mitocondrial e provocou a fragmentação da sua rede. Em seguida, nas mesmas condições experimentais, foi avaliado o metabolismo lipídico em células tumorais malignas AR-positivas LNCaP, andrógeno-responsiva, C4-2 e 22rv1, ambas CRPC. O DHA induziu parada do ciclo celular em todas as linhagens, sendo incorporado em triacilgliceróis e ésteres de colesterol, como também em fosfolipídios com consequente aumento da insaturação na membrana celular, o que sensibiliza células a danos oxidativos. Tal incorporação foi acompanhada de menor regulação da via lipogênica, lipogênese a partir de glicose e redução proteica de FASN. Além disso, o DHA estimulou a oxidação de ácidos graxos, sendo que a linhagem 22rv1 apresentou preferência pelo ômega-3. A redução da lipogênese não ocorreu devido à regulação da via androgênica, mesmo com redução da expressão proteica de AR-FL e AR-V7. Tendo em vista os desafios terapêuticos do CRPC, avaliamos o efeito do DHA sobre o crescimento de organoides MSK-PCa3 e em modelo xenográfico com a linhagem 22rv1 (DHA 10mg/kg/dia/28 dias), o qual teve seu diâmetro reduzido e o crescimento tumoral inibido, respectivamente. Por fim, testamos o efeito simultâneo do DHA e inibidores da lipogênese (FASNi/ACCi-100nM/28 dias) e observamos potencialização na redução do diâmetro dos organoides. A administração de FASNi (100mg/mL/28 dias) e DHA reduziu o crescimento do tumor em mais de 80%. Em conclusão, o DHA é um agente antitumoral multialvo em diferentes contextos androgênicos por vias que culminam na parada do ciclo ou indução de morte celular, associadas ao metabolismo, sendo a mitocondrial prevalente em estágio inicial e o metabolismo lipídico em estágios avançados do CaP Abstract: Metabolic reprogramming during carcinogenesis supports the increased anabolic and energetic demand in proliferating cells. Such adjustment is also observed in the prostate cancer (PCa), mainly the dysregulation of mitochondria and lipogenesis, both vulnerabilities often explored as therapeutic strategies. Docosahexaenoic acid (DHA) is an omega-3 polyunsaturated fatty acid with antiproliferative property in different cancers, including prostate, but the mechanisms are not elucidated yet and seem to be related with cell metabolism regulation. This study evaluated the DHA antitumoral property on distinct androgenic contexts of PCa and the underlying mechanisms, associated with tumor metabolism. Firstly, we tested the DHA potential in decrease cell growth due to regulation of the androgenic pathway, metabolic sensors that also co-regulate death and proliferative pathways, in addition to induce mitochondria dysfunction. For this purpose, we incubated with DHA at 100µM for 48h human epithelial prostate cells from pre-malignant, (PNT1A, AR-positive) and castrated-resistant stage (CRPC) 22rv1 (AR-positive) and PC3 (AR-negative). DHA differently modulated the cell growth by reducing S-phase and inducing cell death in AR-positive while led AR-negative to cell cycle arrest in G2/M. In these cell lines, the omega-3 raised oxidative stress, lipid accumulation and mitochondrial dysfunction. PNT1A was more responsive regarding to regulation of genes related with metabolism, response to hormones and stress as well as mitochondrial physiology. In 22rv1 and PC3, DHA regulated less genes compared to PNT1A, but they are often altered in PCa samples. In PNT1A, the omega-3 also impaired mitochondrial biogenesis and led to its network fragmentation. Secondly, under same experimental conditions, we evaluated the lipid metabolism in AR-positive malignant cells LNCaP (androgen-responsive), C4-2 and 22rv1, both CRPC. DHA induced cell cycle arrest on these cell lines, being incorporated into triacylglycerol and cholesterol esters as well as phospholipids, which showed increase in unsaturation status hence in the cell membrane, turning cells prone to oxidative damage. Such incorporation was followed by downregulation of the lipogenic pathway, lipogenesis from glucose and reduction of FASN protein levels. Moreover, DHA stimulated fatty acids oxidation, being 22rv1 the cell line with preference for the omega-3 itself. Lipogenesis impairment was not due to androgenic pathway regulation, even though DHA decreased AR-FL and AR-V7 protein levels. Considering the therapeutic challenges of the CRPC stage, we evaluated the DHA effect on MSK-PCa3 organoids growth and 22rv1 xenografts (DHA 10mg/kg/day/28 days). It decreased the organoids diameter and suppressed tumor growth, respectively. Lastly, we tested the concomitant administration of DHA with lipogenesis inhibitors (FASNi/ACCi-100nM/28 days) and observed an enhancement in the reduction of organoids diameters. The FASNi (100mg/mL/28 days) and DHA administration reduced tumor growth in at least 80%. In conclusion, DHA is an antitumor agent at different androgenic contexts and has several targets that culminate in cell cycle arrest and cell death induction. The involved pathways are associated with the metabolism, being mitochondria the major one at early stages and the lipid metabolism in the advanced PCa Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural CAPES 001 FAPESP 2018/21891-4

Orientador: Sandra Martha Gomes Dias Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Células tumorais apresentam uma autonomia metabólica aumentada em comparação a células não-transformadas, incorporando nutrientes e metabolizando-os através de vias que suportam o seu crescimento e proliferação. O foco deste trabalho foi a enzima glutaminase, a qual processa glutamina em glutamato para posterior produção de alfa-cetoglutarato pela enzima glutamato desidrogenase, reabastecendo o ciclo do TCA e suportando seu funcionamento e geração de metabólitos essenciais para a síntese de macromoléculas. O gene GLS1 codifica para as isoformas glutaminase kidney-type (KGA) e glutaminase C (GAC). Estas proteínas apresentam outros domínios além do catalítico, e, no caso da KGA, repetições do tipo ankirin, sabidamente envolvidas em contatos proteínas-proteínas. Os objetivos deste projeto foram de encontrar parceiros de interação para a glutaminase kidney-type (KGA) e avaliar o impacto desta interação para o metabolismo tumoral. Um candidato inicialmente avaliado, a Aldolase A, não foi confirmado como parceiro de interação. Outro candidato, a BNIP-H, apesar de ter sido mostrado interagir com a KGA em células nervosas, não mostrou indícios de interação com a KGA em linhagem de células de câncer de mama. Por fim, estudos de duplo-híbrido em levedura revelaram o receptor nuclear PPAR? (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) como forte candidato a parceiro de interação. Realizou-se um mapeamento dos domínios responsáveis pela interação entre estas duas proteínas, também por duplo híbrido, tendo sido identificado o domínio LBD da proteína PPAR? como envolvido na interação. Mesmo estudos realizados com fragmento da KGA, apesar de incompletos, mostraram que a interação não ocorre pelo domínio carboxi-terminal da enzima. Ensaios de anisotropia de fluorescência com as proteínas KGA e PPAR? purificadas indicaram que a interação é favorecida pela presença do produto da reação glutaminolítica, glutamato, e apresenta um Kd de 4,6 ± 0,5 ?M. Microscopia confocal de imunofluorescência mostrou que ambas as proteínas se co-localizam no citoplasma, mas não no núcleo. Mais se verificou que em células HEK 293T a presença de KGA diminui a capacidade de transativação de PPAR? induzida pelo ativador roziglitazona, enquanto que celular PC3 com superexpressão de KGA apresentam níveis diminuídos de expressão da proteína ACADL, alvo do PPAR?. Da mesma maneira, ensaios in vitro de atividade da KGA mostraram que a presença de PPAR? inibe a atividade da glutaminase. Nossos resultados mostram a interação in vitro entre as proteínas KGA-PPAR? e a potencial influência funcional que uma proteína exerce sobre a outra. Dado a participação de ambas as proteínas no processo tumoral, especula-se que esta interação possa ter impacto no desenvolvimento do câncer Abstract: Tumor cells have an increased metabolic autonomy compared to non-transformed cells, metabolizing nutrients and incorporating them through pathways that support cell growth and proliferation. The focus of this study was the glutaminase enzyme, which processes glutamine to glutamate for subsequent production of alpha-ketoglutarate, by the glutamate dehydrogenase enzyme, replenishing TCA cycle and bearing its function and the generation of metabolites essential for the synthesis of macromolecules. The gene GLS1 codes for the isoforms kidney-type glutaminase (KGA) and glutaminase C (GAC). These proteins exhibit other domains besides the catalytic, and in the case of KGA, ankirin repeats, known to be involved in protein-protein contacts. The goal of this project was to investigate potential interacting partners of KGA and contextualize the interaction within the metabolic demands of tumor cells. A candidate initially evaluated, the Aldolase A, was not confirmed as a partner of interaction. Another candidate, the BNIP-H, despite having been shown to interact with the KGA in nervous cells, showed no evidence of interaction with KGA in one tested breast cancer cell lines. Finally, yeast two-hybrid studies revealed the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR?) as a strong interaction partner candidate. We mapped the domains responsible for the interaction between these two proteins, also by two-hybrid and identified the LBD domain of PPAR? as involved in the interaction. The same studies with KGA fragments, although incomplete, showed that the interaction did not involve the carboxy-terminal domain of the enzyme. KGA and PPAR? proteins were expressed in E. coli, purified and their interaction was analyzed by pull-down, fluorescence anisotropy, electrophoresis under native conditions, gel filtration chromatography and crosslinking. The assays indicated that the interaction is favored by the presence of the reaction product glutamate and has a Kd of 4,6 ± 0,5 ?M and disfavored by phosphate. Immunogold labeling followed by transmission electron microscopy of SKBR3 cells revealed a curious nuclear staining pattern probably heterochromatic of KGA. Immunofluorescence confocal microscopy showed that both proteins co-localize in the cytoplasm but not in the nucleus. Moreover, it was found that in HEK 293T cells, the presence of KGA decreases PPAR? ability of inducing transactivation of a reporter gene, while PC3 cell overexpressing KGA have low levels of protein expression ACADL target this receptor. Likewise, activity in vitro assays in the presence of KGA showed that PPAR? receptor inhibits the glutaminase activity. Our results demonstrate the in vitro interaction between proteins KGA-PPAR? and the potential functional influence that these proteins exerts on each other. Given the involvement of both proteins in the tumor growth, it is speculated that this interaction may have impact on the development of cancer Mestrado Clínica Médica Mestre em Ciências

Orientadores: Sandra Martha Gomes Dias, Ana Carolina de Mattos Zeri Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Grandes avanços foram feitos ao longo dos anos em nossa compreensão sobre o câncer, mas muitos detalhes relativos aos mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento tumoral ainda não são completamente entendidos. Recentemente, a capacidade de reprogramar o metabolismo energético foi reconhecida como um dos hallmarks da transformaçao tumoral. Seu estudo e compreensão tem aberto novas e promissoras portas para a busca de alvos terapêuticos. Cerca de 10-20% dos casos de câncer de mama diagnosticados correspondem ao subtipo triplo-negativo (TN), o qual não expressa os receptores dos hormônios estrogênio e progesterona e não apresenta amplificação de HER2. Os tumores TN apresentam um perfil molecular único, comportamento agressivo e pior prognóstico em relação a outros subtipos de câncer de mama. Além, os tumores TN não respondem aos tratamentos convencionais desenvolvidos para a doença, o que ressalta a necessidade de se procurar novas estratégias terapêuticas. Tumores TN tem captação aumentada de 2-deoxi-2- (18F) fluoro-D-glicose (FDG) e dependência de glutamina, o que se correlaciona com seu alto índice proliferativo e evidencia a intensificação da glicólise aeróbica ou efeito Warburg. Neste trabalho, objetivamos analisar a expressão gênica diferencial e de metabólitos de linhagens celulares e tecidos tumorais de mama TN e não-TN de maneira a se caracterizar a assinatura metabólica do subtipo TN. Por fim, objetivamos identificar potenciais novo alvos terapêuticos para o tratamento deste subtipo tumoral. Como resultados, verificamos que tumores TN apresentam características que potencialmente lhes garantem uma alta eficiência no uso de nutrientes, com alta captação e processamento de glicose, alto processamento de glutamina, re-aproveitamento de lactato e utilização de acetaldeídos como fonte energética e biossintética. No último caso, lhe grantindo, uma potencial via de quimioresistência. Há ainda a indicação de ativação de vias de síntese/modificação de lipídeos que podem ter uma função sinalizadora nas células. Por fim, foi gerada uma lista de 73 genes com expressão aumentada em tumores de mama TN (em relação a não-TN). Desta lista, GBP1, uma guanylate-binding protein, mostrou diminuir seletivamente a proliferação celular de linhagens TN quando silenciado. Sua função para o estabelecimento/progressão/sobrevivência do subtipo TN precisa ser avaliada de maneira a confirmá-la como alvo para o tratamento desta doença Abstract: Great advances have been made over the years in our understanding of cancer, but many details of the mechanisms involved for tumor development are not yet fully understood. Recently, the ability to reprogram the energy metabolism was recognized as one of the hallmarks of tumoral transformation. His study and understanding has opened promising new doors in the search for therapeutic targets. About 10-20% of cases of breast cancer diagnosed corresponds to triple negative (TN) subtype, which does not express the hormones receptors of estrogen and progesterone and does not have HER2 amplification. TN tumors have a unique molecular profile, an aggressive behavior and a poor prognosis compared to others breast cancer subtypes. In addition, TN tumors do not respond to conventional treatments developed for the disease, which highlights the need to look for new therapeutic strategies. TN tumors increase the uptake of 2-deoxy-2- (18F) fluoro-D-glucose (FDG) and has a glutamine dependence, which correlates with their high proliferative index and demonstrates the enhancement of aerobic glycolysis or Warburg effect. In this study, we aimed to analyze differential gene expression and metabolomics from cell lines and tumor breast tissues TN and not TN (N-TN) subtypes in order to characterize the metabolic signature. Finally, we aimed to identify potential therapeutic targets for treatment of this tumor subtype (TN). As a result, we found that TN tumors potentially have characteristics that guarantee them a high efficiency in the use of nutrients, with high uptake and processing of glucose, high glutamine processing, re-use lactate and use of acetaldehyde as energy and biosynthetic source. This last resource could be an important way of chemoresistance. There is also activation of synthesis and modification pathways of lipids that can have important signaling function in cells. Finally, we generated a list of 73 genes with increased expression in TN breast tumors (relative to non-TN) and from this list, GBP1 a guanylate-binding protein, shown to reduce selectively the cell proliferation in TN cell lines when muted. Its function for the establishment / progression / survival TN subtype must be evaluated to confirm it or not as a potential target to treat this disease Doutorado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Doutora em Ciências FAPESP 2012/09452-9

Orientadores: Carmen Veríssima Ferreira Halder, Ronaldo Aloise Pilli Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital quando liberada Abstract: The abstract is available with the full electronic document when available Doutorado Bioquímica Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Clarice Weis Arns, Fernando Rosado Spilki Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os membros da família Paramyxoviridae são vírus que causam infecções em humanos e animais de importância econômica global. Entre os membros desta família incluem patógenos de importância mundial para os humanos, como o vírus respiratório sincicial humano (hRSV), o metapneumovírus humano (hMPV) e vírus de importância em Medicina Veterinária, como o vírus respiratório sincicial bovino (bRSV) e o metapnemovírus aviário (aMPV). Os membros da família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae são vírus envelopados, não-segmentados dotados de genoma de RNA de fita simples com sentido negativo. Na primeira parte do estudo, desenvolvemos um adenovírus recombinante expressando a proteína F do aMPV. A expressão da proteína F foi determinada por Western Blot. Os níveis de transcrição do gene F foram avaliados por RT-PCR em tempo real, em células HEK-293 e células HEP-2. Foi realizada a imunização experimental de Ad-aMPV-F e foi analisada a indução de resposta de anticorpos em camundongos BALB/c. Os títulos de anticorpos neutralizantes foram detectados após a imunização com Ad-aMPV-F. Na segunda parte do trabalho o objetivo foi à construção de adenovírus recombinantes expressando a proteína F do bRSV. A proteína F parece ser um antígeno ideal para fins de diagnóstico. Utilizando anticorpo anti-V-5, uma banda de ~90 kDa foi detectada no sobrenadante de cultura de células HEK-293 infectadas com Ad-bRSV-F. Na terceira parte do estudo, o objetivo foi à construção de dois vetores adenovirais expressando as proteínas G do aMPV e bRSV, a expressão destas proteínas em células HEK-293 infectadas foi analisada pela expressão do gene repórter, da proteína verde fluorescente (GFP) Abstract: The members of the family Paramyxoviridae are viruses that cause infectious in human and animals of importance to global economics. Among the member of this family include pathogens of importance global for humans such as human respiratory syncytial virus (hRSV), the human and metapneumovirus (hMPV) and of viruses importance in veterinary medicine, such as bovine respiratory syncytial virus (bRSV) and avian metapnemovírus (aMPV). The members of the Paramyxoviridae are enveloped, non-segmented viruses, with negative-sense single stranded genomes. In the first part of the study, we developed a recombinant adenovirus expressing the F protein of AMPV. The expression of F gene was determined by Western Blot. The levels of transcription were evaluated by RT-PCR in real time in HEK-293 cells and HEP-2 cells. Immunization experiment was carried out Ad-AMPV-F was analyzed and the induction of antibody response in BALB/c mice. The neutralizing antibody titers detected after immunization with Ad-AMPV-F. In the second part, the objective was to construct recombinant adenoviruses expressing the F protein of bRSV. Protein F appears to be an ideal antigen for diagnostic purposes. Using the anti-antibody AdV-5, a single band of ~ 90 kDa was detected in the culture supernatant in 293 cells infected with Ad-bRSV-F. In the third part of the study, the objective was to build two adenoviral vectors expressing the G protein of aMPV and bRSV and the expression of these proteins in infected HEK-293 cells were analyzed for expression of the reporter gene, green fluorescent protein (GFP) Doutorado Microbiologia Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Jörg Kobarg Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A proteína Ki-1/57 foi descoberta através da reação cruzada do anticorpo monoclonal Ki-1 em células do linfoma de Hodgkin. Estudos anteriores demonstraram que Ki-1/57 interage com a proteína RACK-1, sofre fosforilação por PKCs e metilação por PRMT1, uma arginino metiltransferase que modula diversas proteínas ligantes ao RNA. Estudos mostraram que Ki- 1/57 é capaz de controlar o splicing do pré-mRNA do gene viral E1A. Análises por SAXS, gel filtração analítica e ultracentrifugação analítica indicaram uma estrutura bastante alongada e flexível para a construção C-terminal 6xhis-(122-413)Ki-1/57. Ensaios de proteólise limitada também mostraram uma baixa composição de núcleos hidrofóbicos estáveis e compactos, sugerindo que a proteína é intrinsecamente desordenada, o que pode explicar o elevado número de diferentes proteínas parceiras que ela é capaz de interagir. Neste trabalho foi identificada a interação de Ki-1/57 com proteínas da Família do X frágil, e sua localização no Perfil Ribossomal, além de ser capaz de ativar a tradução quando conectada ao gene repórter da Luciferase. Outra observação importante é que Ki-1/57 é sumoilada in vitro e in vivo, sendo as lisinas alvos desta sumoilação identificadas, e a proteína não sumoilada é incapaz de atuar no splicing do pré-mRNA do gene viral E1A. Mais experimentos foram feitos no sentido de caracterizar a interação RACK-Ki-1/57. A interação entre as duas proteínas é forte, possuindo uma constante de dissociação de 0,7 ?M, seguindo uma estequiometria de 1:1 observada em experimentos de sedimentação em equilíbrio. Experimentos de ultracentrifugação analítica mostraram que a proteína RACK1 tem propriedades hidrodinâmicas similares ao seu modelo predito por homologia, e que em solução ela é encontrada em sua forma monomérica, possuindo uma leve tendência a agregação. A superexpressão de Ki-1/57 e CGI-55 provocou a alteração de 413 e 217 genes respectivamente, que em sua grande maioria foram regulados negativamente. A maioria dos genes, que foram inibidos pela superexpressão de Ki-1/57, estão envolvidos na proliferação celular, muitos sendo expressos em diferentes tumores. Os dados obtidos no teste do MTS confirmam que houve uma diminuição na proliferação celular em células superexpressando as proteínas Ki-1/57 e CGI-55. Com base nos resultados obtidos neste trabalho, novas funções da proteína Ki-1/57 foram descritas, tais como: a influência de Ki-1/57 na proliferação celular, na tradução proteica e o papel importante que a modificação pós traducional, como a sumoilação, representa para que a proteína Ki-1/57 desempenhe sua função Abstract: The protein Ki-1/57 was discovered through cross reactivity of the monoclonal antibody Ki-1 in cells of Hodgkin lymphoma. Previously studies demonstrated that Ki-1/57 interacts with RACK-1 protein, undergoes phosphorylation by PKCs and methylation by PRMT1, an arginine methyltransferase that modulates several RNA binding proteins. Studies have shown that Ki- 1/57 is able to control the pre-mRNA splicing of the viral E1A gene. SAXS analysis, analytical gel filtration and analytical ultracentrifugation indicate a rather elongated and flexible structure to build C-terminal 6xhis-(122-413) Ki-1/57. Limited proteolysis assays also showed a low composition of stable and compact hydrophobic cores, suggesting that the protein is intrinsically unstructured, it could explain the wide array of protein partners with which it is able to interact. In this work we identified the interaction of Ki-1/57 proteins with Family fragile X, and its location on Ribosomal profile, besides being able to increase the translation when tethered to the reporter gene Luciferase. Another important observation is that Ki-1/57 is sumoylated in vitro and in vivo, the targets of this lysine sumoylated were identified, and the not somoylated protein is unable to act in the pre-mRNA splicing of E1A. More experiments were made to characterize the interaction of RACK1 with Ki-1/57. The interaction between the two proteins is strong, possessing a dissociation constant of 0.7 ?M and follows the stoichiometry of 1:1 as observed by sedimentation equilibrium experiments. Analytical ultracentrifugation experiments showed that human RACK1 has similar hydrodynamic properties to that predicted to homology model, and that in solution it is found in its monomeric form, with a slight tendency to aggregation. Overexpression of Ki-1/57 and CGI-55 caused changes in 413 and 217 genes respectively, which were mostly negative regulated. Most genes that were inhibited by overexpression of Ki-1/57 are involved in cell proliferation, and expressed in different types tumors. The MTS data obtained confirm a decrease in cell proliferation through overexpressing of Ki-1/57 and CGI-55 protein. Based on the results of this study new functions for Ki-1/57 protein have been described such as: the influence of Ki- 1/57 in cell proliferation, in protein translation and the important role that the post translational modification, such as sumoylation, represents so that the protein Ki-1/57 performs its function Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: José Andrés Yunes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A Leucemia Linfóide Aguda (LLA) é o tipo de câncer mais comum que acomete crianças. Sabe-se que a interação do tumor com o contexto celular do hospedeiro (microambiente tumoral) é recíproca, ou seja, na medida em que o tumor estimula o seu microambiente, este potencializa a sobrevivência, proliferação e invasividade tumoral. A interação da LLA com as células estromais da medula óssea tem um impacto positivo na resistência das células leucêmicas à quimioterapia. No presente estudo foi investigado a modulação de uma série genes de sensibilidade e resistência à asparaginase em células de LLA-B precursoras após co-cultura com as células estromais. Mostramos o aumento da expressão e secreção da IGFBP7 pelas células leucêmicas após co-cultivo com células do estroma da medula óssea. Em ensaios com o silenciamento do IGFBP7 em células leucêmicas e células estromais, mostramos que a IGFBP7 atua regulando positivamente o crescimento celular e aumenta a resistência a asparaginase. A IGFBP7 'leucêmica' junto com IGF/insulina atua sobre as células estromais, induzindo nestas células o aumento da produção de asparagina, e diminuindo a ação da asparaginase. Além deste mecanismo de resistência dependente das células estromais, mostramos que a IGFBP7 em conjunto com IGF/insulina promove a resistência das células leucêmicas à ação de outros compostos quimioterápicos (dexametasona e metotrexato) de forma independente da interação leucemia-estroma. Ainda pode ser observado que o plasma de crianças com LLA ao diagnóstico, apresenta maiores níveis de IGFBP7 do que em amostras controles. É importante ressaltar que níveis mais altos de mRNA IGFBP7 foram associados com menor sobrevida livre de leucemia (Modelo de regressão de Cox, P = 0,003), em células de LLAB Ph(-) presursoras Abstract: Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) is the most common type of cancer that affects children. It is known that the interaction between tumor and the cellular context of the host (tumor microenvironment) is reciprocal, ie, to the extent that the tumor stimulates their microenvironment, this enhances the survival, proliferation and tumor invasiveness. The interaction of ALL with bone marrow stromal cells has a positive impact on leukemia resistance to chemotherapy. In the present study, we investigated the modulation of a series of putative asparaginase-resistance/sensitivity genes in B-precursor ALL upon co-culture with stromal cells. We showed an increase expression and secretion of IGFBP7 in leukemic cells after co-culture with BMSCs. Assays with IGFBP7 knockdown in leukemic cells and stromal cells, showed that IGFBP7 acts as a positive regulator of cell growth and increases resistance to asparaginase. 'Leukemic' IGFBP7 together with IGF/insulin acts on stromal cells, increasing asparagine production, thus reducing the asparaginase effect. Besides this mechanism of resistance dependent of stromal cells, we showed that IGFBP7 in conjunction with IGF/insulin promotes the resistance of leukemia cells to the action of other chemotherapeutic compounds (dexamethasone and methotrexate) independently of the interaction leukemia-stroma. We still observed that diagnostic BM plasma from children with ALL at diagnosis, have higher levels of IGFBP7 than control samples. Importantly, higher levels of IGFBP7 mRNA were associated with lower leukemia-free survival (Cox regression model, P = 0.003) in precursor B-ALL Ph (-) patients Doutorado Genética Animal e Evolução Doutor em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Wilson Nadruz Júnior Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O aumento do estresse circunferencial ou mecânico é um dos principais estímulos responsáveis pela aterogênese induzida por hipertensão arterial, além de ser um determinante para a localização das placas ateroscleróticas na árvore arterial. Neste contexto, moléculas mecano-sensíveis ou responsivas ao estresse mecânico podem exercer um papel fundamental no desenvolvimento do fenótipo pró-aterogênico em células vasculares. A quinase de adesão focal (FAK) tem sido considerada uma proteína central na mecanotransdução em diversos tipos celulares, por seu papel potencial na ativação de vias de sinalização envolvidas no crescimento celular, anti-apoptose e inflamação. Neste trabalho, nós inicialmente caracterizamos a ativação da FAK em linhagem de célula endotelial de aorta de coelho (RAEC) submetida a estiramento mecânico pulsátil e, em seguida, investigamos a influência da inibição desta proteína, por meio de oligodeoxinucletídeo-antisense e pelo inibidor farmacológico PP2, sobre a expressão de moléculas pró-aterogênicas e a adesividade leucocitária neste modelo experimental. Nossos resultados mostraram que a FAK é ativada precocemente por estiramento mecânico e é fundamental para a expressão de TLR2, TLR4, VCAM-1 e E-selectina induzida por sobrecarga mecânica em células endoteliais. A inibição da FAK endotelial com PP2 e oligodeoxinucletídeo-antisense bloqueou a adesão de células monocitóides THP1 às células endoteliais induzida por estiramento in vitro. O próximo passo foi avaliar o impacto da FAK sobre expressão de moléculas pró-aterogênicas induzida por sobrecarga hemodinâmica in vivo, utilizando o modelo de coarctação da aorta em ratos Wistar. Os resultados dos estudos in vivo demonstraram que a FAK é ativada nas primeiras horas após instituição da sobrecarga pressora em segmentos de aorta. Após 7 dias de coarctação, os segmentos aórticos proximais à estenose apresentaram aumento na expressão de TLR2, TLR4, VCAM-1, E-selectina, metaloproteinases de matriz 2 e 9, além de maior adesividade às células THP1. Estes fenômenos foram inibidos por meio de tratamento prévio dos animais com small interference RNA direcionado especificamente contra a FAK. Em conjunto, estes dados indicam que a FAK exerce um papel fundamental na resposta pró-aterogênica de células vasculares ao estresse mecânico in vitro e in vivo Abstract: The increase in circumferential or mechanical stress is a major stimulus by which hypertension stimulates atherogenesis and a main determinant for the location of atherosclerotic plaques in the arterial tree. Mechano-sensitive molecules can play a key role in the development of pro-atherogenic vascular cell phenotype. Focal Adhesion Kinase (FAK) has been considered a central protein in mechanotransduction, because of its potential role in the activation of cell signaling pathways involved in cell growth, anti-apoptosis, and inflammation. In this work, we initially evaluated the activation of FAK in rabbit aortic endothelial cell (RAEC) lineage subjected to cyclic mechanical stretch and then investigated the impact of FAK inhibition, by transfection with specific oligodeoxynucleotide antisense and pre-treatment with the pharmacological inhibitor PP2, on the expression of pro-atherogenic molecules and leukocyte adhesion in this experimental model. Our results showed that FAK was rapidly activated by mechanical stretch and was critical to stretch-induced expression of TLR2, TLR4, VCAM and E-selectin in endothelial cells. FAK endothelial inhibition also blocked the adhesion of THP1 monocytoid cells to endothelial cells induced by stretch in vitro. The next step was to investigate the role of FAK in load-induced expression of pro-atherogenic molecules in vivo, by subjecting Wistar rats to aortic constriction. The results of in vivo assays revealed an early activation of FAK in aortic segments subjected to pressure overload. After 7 days of aortic constriction, vascular segments subjected to high pressure exhibited increased expression of TLR2, TLR4, VCAM-1, E-selectin, matrix metalloproteinases 2 e 9, and higher adhesion to THP-1 monocytoid cells. These events were inhibited by pre-treatment of rats with small interference RNA designed to silence FAK expression. In general these findings indicate that FAK is critical do stretch-induced expression of pro-atherogenic molecules in vascular cells in vitro and in vivo Doutorado Ciências Básicas Doutor em Clínica Médica

Orientadores: Sandra Martha Gomes Dias, Marília Meira Dias Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A proliferação celular comanda os processos de embriogênese e de crescimento do organismo, sendo essencial para a correta função de vários tecidos adultos. Apesar de ser importante para a homeostase do organismo, a sua desregulação compõe a força motriz do desenvolvimento tumoral. Somente nos últimos vinte anos começou a ser evidenciada a relação entre as vias de tradução de sinais estimuladas por fatores de crescimento e a reorganização da atividade metabólica, a qual precisa priorizar a biossíntese e o aumento da biomassa, processos essenciais para a divisão celular. Em células tumorais, o consumo de glutamina é aumentando concomitante ao aumento da atividade de glutaminase. Três isoenzimas de glutaminase são expressas na maioria dos tecidos (liver-type glutaminase, kidney-type glutaminase e glutaminase C), todavia pouco se sabe sobre a necessidade específica de cada uma delas para o metabolismo tumoral. Vários artigos recentes têm definido o papel da glutaminólise, ou metabolismo da glutamina e seus subprodutos, na ativação da mTOR. Neste sentido é uma hipótese válida imaginar que mTOR possa contra-regular glutaminase. Desta maneira, resolvemos investigar se mTOR atua na regulação da atividade de glutaminase. Para tanto, realizamos knockdown estável de PTEN em células MDA-MB 231 e verificamos que não o mesmo afetou os níveis protéicos de GAC e KGA, assim como não houve mudança na localização subcelular das isoformas. Cinética enzimática da fração mitocondrial desta linhagem revelou que o knockdown de PTEN levou à uma diminuição do KM da enzima sem alteração de Vmax. De acordo, o tratamento com rapamicina, inibidor da mTOR, elevou o KM para os níveis detectados nas células controles. A atividade de glutaminase de lisado total de MDA-MB 231, NIH 3T3, IMR90 e BJ5TA foi afetada pelo tratamento com rapamicina conforme julgado por ensaios de dose e tempo resposta. Mais, ensaios de privação de glicose, glutamina e de fatores de crescimento levaram à inibição de mTOR e concomitante redução da atividade de glutaminase. Somado a isso, o knockdown estável de TSC2 em MDA-MB 231 e BJ5TA, assim como o knockout de TSC2 em MEF, promoveu superestimulação de mTOR e foi capaz de aumentar a atividade de glutaminase. Dosagem de atividade de glutaminase de células MDA-MB 231 com knockdown de GAC, KGA ou GAC/KGA tratadas com rapamicina indicaram que mTOR possa agir em ambas as isoformas. Curioso foi que apenas células shGAC e shGAC/KGA apresentaram redução da fosforilação de S6K em Thr389 indicando que GAC ou o metabolismo de glutamina via esta isoforma, possa contra-regular mTOR. Em adição, na comparação entre PC3 e DU145, verificamos que DU145 apresentou maior expressão de GAC, maior consumo de glutamina, maior dependência de glutamina em seu crescimento, maior sensibilidade ao inibidor de glutaminase, BPTES, e por fim, se mostrou mais responsiva à metformina, ativador indireto de AMPK. A ativação de AMPK por metformina, um conhecido sensor de estresse energético, mostrou diminuir a atividade de glutaminase em célula de tumor de próstata, DU145, indicando uma potencial ação de AMPK na atividade de glutaminase Abstract: Cell proliferation is crucial for embryogenesis and organism growth, being also essential for the proper function of several adult tissues. Although important for the homeostasis of the organism, its deregulation composes the driving force of tumor development. In the past twenty years the relationship between the processes of signal translation stimulated by growth factors and the reorganization of metabolic activity has become more evident. Growing cells need to prioritize the biosynthesis and biomass increase, processes essential for cell division. In tumor cells, the glutamine consumption is increased concurrently with the increasing in the glutaminase activity. Three glutaminase isoenzymes are expressed in most tissues (liver- type glutaminase, kidney -type glutaminase and glutaminase C), but not much is known about the necessity of each isoform for the tumor metabolism. Several recent papers have defined the role of glutaminolysis or glutamine metabolism in mTOR activation. So it is a valid hypothesis to speculate that mTOR can counter-regulate glutaminase. Thus, we decided to investigate whether mTOR can control glutaminase activity. To this end, we have made MDA - MB 231 cells stably knocked down for PTEN and verified no alteration in KGA and GAC protein levels, as well as there was no change on their subcellular location. Enzyme kinetics of the MDA-MB 231 mitochondrial fraction revealed that PTEN knockdown led to a decrease in the KM of the enzyme without changing Vmax. Accordingly, the treatment with rapamycin (mTOR inhibitor), led to an increase in KM back to the level detected in control cells. The glutaminase activity of MDA - MB 231, NIH 3T3, IMR90 and BJ5TA total cellular lysates was also affected by rapamycin treatment in a dose- and time-response fashion. Moreover, glucose, glutamine and growth factors deprivation promoted mTOR inhibition and concomitant reduction on glutaminase activity. Glutaminase activity of MDA-MB 231 cells knocked down for GAC, KGA or GAC/KGA and treated with rapamycin indicated that mTOR can regulate both isoforms. Curiously, it was only on GAC or GAC/KGA knocked down cells that we observed a decrease in S6K Thr 389 phosphorylation, which could indicate that GAC or the GAC dependent-glutamine metabolism is a specific mTOR counter-regulator. Accordling, stable TSC2 knockdown in MDA-MB 231 and BJ5TA, as well as TCS2 knockout in MEF cells, promoted overstimulation of mTOR and increasing on glutaminase activity. Moreover, a comparison between PC3 and DU145 revealed that DU145 has higher GAC expression, greater consumption of glutamine, is more dependent on glutamine for its growth, more sensitive to the inhibitor of glutaminase, BPTES, and more responsive to metformin, an indirect AMPK activator. The activation of AMPK by metformin, a known energy stress sensor, led to a decreased glutaminase activity in the prostate tumor cell line DU145 indicating a potential role of AMPK on glutaminase activity Mestrado Genética Animal e Evolução Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Fernando Moreira Simabuco Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas Resumo: Introdução: A via de sinalização da mTOR vem sendo relacionada a várias doenças e desordens metabólicas em humanos, incluindo obesidade, diabetes, vários tipos de câncer e neurodegeneração. As proteínas S6Ks têm mostrado importante papel na sinalização da mTOR, funcionando como efetoras dessa via. A família das S6Ks é composta por dois genes, RPS6KB1 e RPS6KB2, sendo que o primeiro codifica as isoformas p85- e p70-S6K1, enquanto que o segundo codifica as isoformas denominadas p56- e p54-S6K2. Este estudo investigou as parceiras de interação das isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2 em células HEK293, com objetivo de diferenciar essas proteínas de acordo com seus envolvimentos em processos biológicos. Além disso, foi investigada mais detalhadamente a interação das isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2 com as proteínas eIF2? e PARP1. Justificativa: Acreditava-se que as isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2 apresentavam funções biológicas redundantes, uma vez que possuem um elevado grau de similaridade entre si. Dessa forma, poucos estudos têm como objetivo identificar diferentes funções e envolvimentos dessas isoformas em processos biológicos. Entretanto, descobrir as diferentes funções dessas proteínas pode ter grande importância para estudos que investigam novas estratégias para desenvolver terapias para certos tipos de doenças, como o câncer. De forma geral, esse trabalho contribui para um melhor entendimento da via mTOR/S6Ks. Resultados: Nos primeiros dados obtidos desse estudo, que geraram um artigo científico publicado na revista Proteomics em 2016 (Anexo I), foi observado, por espectrometria de massas, que as isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2 possuem diferentes proteínas de interação e que atuam em diferentes processos biológicos, indicando que tais isoformas possuem funções biológicas distintas. Algumas parceiras de interação, eIF2?, PARP1, PPM1B, FXR1, FMRP, PRMT5 e WDR77, foram escolhidas para que suas relações com as isoformas p70-S6K1 e p54-S6K2 fossem estudadas de forma mais detalhada. Alguns experimentos de imunoprecipitação foram realizados mostrando evidências da interação entre p70-S6K1 e p54-S6K2 com a proteína eIF2?, e somente p54-S6K2 com a proteína PARP1. Em uma situação de estresse celular, eIF2? é fosforilada no seu resíduo serina 52 (S52), acarretando na inibição da síntese protéica global e no estimulo da autofagia e apoptose. Identificamos que eIF2? apresenta um sítio de fosforilação predito das S6Ks (RXRXXT/S) em serina 58 (S58), sendo este conservado em uma variedade de espécies. Ensaios de imunoprecipitação revelaram que eIF2? é fosforilada em um sítio RXXT/S na presença de insulina. Além disso, foi visto que a ativação das S6K1 e S6K2 através de insulina e somente S6K2 através de FGF2 está diretamente relacionada com a redução na fosforilação de eIF2? em serina 52. Por outro lado, inibidores farmacológicos de mTOR e S6Ks, como a rapamicina e o PF4708671, respectivamente, estão associados com o aumento dos níveis de fosforilação de eIF2? (S52). Também foi realizada a superexpressão de p70-S6K1 e p54-S6K2 constitutivamente ativas e foi visto redução da fosforilação de eIF2? (S52). Por fim, foi realizado um ensaio de mutação sítio dirigida em eIF2?, mimetizando uma fosforilação no resíduo 58 de eIF2?. Como resultado, observamos que a fosforilação constante no resíduo 58 está acompanhado de uma redução da fosforilação do resíduo S52. Conclusões: Este estudo mostrou que diferentes isoformas de S6Ks possuem distintas proteínas de interação, indicando que tais isoformas possuem funções biológicas distintas na célula. Os resultados ainda sugerem que as S6Ks podem fosforilar eIF2? em serina 58, e devido a proximidade dos sítios, possa haver uma inibição da fosforilação em serina 52, regulando assim a atividade de eIF2á Abstract: Introduction: The mTOR signaling pathway has been related to several diseases and metabolic disorders in humans, including obesity, diabetes, several types of cancer and neurodegeneration. The S6Ks proteins have shown an important role in mTOR signaling, acting as effectors of this pathway. The S6Ks family is composed of two genes, RPS6KB1 and RPS6KB2. RPS6KB1 encodes two isoforms: p85- and p70-S6K1, while RPS6KB2 encodes two other isoforms, known as p56 and p54-S6K2. This study investigated the interaction partners of p70-S6K1 and p54-S6K2 isoforms in HEK293 cells, in order to differentiate these proteins according to their involvement in biological processes. Furthermore, it was investigated in more detail the interaction of p70-S6K1 and p54-S6K2 isoforms with eIF2? and PARP1 proteins. Justification: It was believed that S6K1 and S6K2 exhibited redundant biological functions, since they have a high degree of similarity. Thus, few studies aim to identify different roles and implications of these isoforms in biological processes. However, discovering different functions of these proteins may have great importance for the investigation of new strategies to develop therapies for certain types of diseases such as cancer. In general, this work contributes to a better understanding of the mTOR / S6Ks pathway. Results: The first data obtained from this study, which generated a scientific article published in the journal Proteomics in 2016 (Annex I), it was observed, by mass spectrometry, that the p70-S6K1 and p54-S6K2 isoforms have different interaction proteins and act in different biological processes, indicating that such isoforms have distinct biological functions. Some partner interaction, as eIF2?, PARP1, PPM1B, FXR1, FMRP, PRMT5 and WDR77, were chosen for its relations with the p70-S6K1 and p54-S6K2 isoforms were studied in more detail. Some immunoprecipitation experiments were performed showing evidence of the interaction between p70-S6K1 and p54-S6K2 with the eIF2? protein, and only p54-S6K2 with the PARP1 protein. In a situation of cellular stress, eIF2? is phosphorylated at its serine residue 52 (S52), leading to the inhibition of global protein synthesis and the stimulation of autophagy and apoptosis. We have identified that eIF2? has a predicted phosphorylation site of S6Ks (RXRXXT/S) at serine 58 (S58), which is conserved in a variety of species. Immunoprecipitation assays revealed that eIF2? is phosphorylated at RXXT/S site in the presence of insulin. In addition, it was shown that the activation of S6K1 and S6K2 through insulin and only S6K2 through FGF2 is directly related to the reduction in eIF2? phosphorylation in serine 52. Conversely, pharmacological inhibitors of mTOR and S6Ks, such as rapamycin and PF4708671, respectively, are associated with increased of eIF2? phosphorylation levels at S52. The overexpression of constitutively active p70-S6K1 and p54-S6K2 was also performed and reduction of the phosphorylation of eIF2? (S52) was seen. Finally, a site-directed mutation assay was performed on eIF2?, mimicking a phosphorylated residue 58 of eIF2?. As a result, we observed that constant phosphorylation at residue 58 is accompanied by a reduction of phosphorylation of residue S52. Conclusions: This study demonstrated that S6Ks isoforms present different interacting proteins, indicating that those isofroms present distinct biological functions in the cell. The results also suggest that S6Ks can phosphorylate eIF2? in serine 58, and due to the proximity of the sites may be an inhibition of the phosphorylation of serine 52, thereby regulating the activity eIF2á Mestrado Metabolismo e Biologia Molecular Mestra em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo FAPESP 2015-00311-1

Orientadores: Anete Pereira de Souza, Ricardo Aparício Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Após o sequenciamento do genoma da Xylella fastidiosa, linhagem 9a5c houve um grande aumento de informações relacionadas a este organismo. Porém grande parte das proteínas desta bactéria ainda não apresentam funções preditas. No presente estudo, objetivou-se a caracterização inicial de três proteínas deste micro-organismo, a saber: XfCysB (orf Xf0683), XfLysRL (orf Xf1448) e XfycjZ (orf Xf1480). Essas proteínas apresentam alta similaridade com membros da família de reguladores transcricionais do tipo LysR (LTTR). Os LTTR constituem a família de reguladores mais comuns em procariotos e apresentam funções diversas tais como regulação de genes envolvidos no metabolismo, divisão celular, quorum sense, virulência, resposta ao estresse oxidativo, entre outras. Dentre as proteínas em estudo, a única proteína que possui predição dentro da família LysR é a XfCysB, cujas proteínas homólogas, já caracterizadas, estão envolvidas na regulação do operon cys, o qual está envolvido na biossíntese de cisteína. Após a clonagem das proteínas, a caracterização estrutural foi feita por Cromatografia de Exclusão por Peso Molecular, em que foi possível observar o estado oligomérico da proteína; Dicroísmo Circular para verificar se a proteína apresenta estrutura secundária estruturada e SAXS (Espalhamento de Raios-X a Baixos Ângulos) ,apenas para a proteína XfLysRL, para a determinação do envelope da proteína em solução. A caracterização funcional foi feita pela análise da expressão das proteínas durante as diferentes fases de formação do biofilme (5, 10, 15, 20 e 30 dias de crescimento) de X. fastidiosa por Western blot utilizando anticorpos específicos para cada proteína em estudo. Com os resultados obtidos pode-se estimar que a massa molecular da proteína XfLysRL é de 50 kDa quando em solução, indicando que a XfLysRL encontra-se na forma dimérica, uma vez que a massa molecular do monômero é de 23,7 kDa. Possui também a estrutura secundária estruturada, sendo estável de 4°C a 44 ° C. Foi possível verificar também que a proteína está monodispersa quando em solução, é estruturalmente globular e pôde-se produzir, com os dados obtidos, um primeiro modelo para a estrutura da proteína. Já a proteína XfCysB teve a sua massa estimada em 45,3 kDa quando em solução e de 195,1 kDa quando na presença do seu co-indutor específico, além de apresentar uma estrutura secundária estruturada. Em relação à proteína XfycjZ pôde-se observar que esta quando em solução possui uma massa molecular estimada em 174,8 kDa demonstrando que sua forma oligomérica é de tetrâmero. Os estudos funcionais indicam que as três proteínas são expressas durante a formação do biofilme de X. fastidiosa, ou seja, estão presentes nos 6 tempos analisados. Deste modo, o estudo detalhado das presentes proteínas torna-se importante devido a sua presença na formação do biofilme de X. fastidiosa, um dos mecanismos de patogenicidade da bactéria. Outro fator importante é a utilização dos resultados da caracterização estrutural na elucidação do papel desempenhado pelas proteínas, visto que a estrutura protéica está diretamente envolvida com sua função Abstract: After sequencing the genome of Xylella fastidiosa, strain 9a5c, there was a large increase in information related to this organism, but most of the proteins produced by these bacteria do not have predicted functions. In this study, the objective was the initial characterization of three proteins of this organism, namely XfCysB (orf Xf0683) XfLysRL (orf Xf1448) and XfycjZ (orf Xf1480). These proteins show high similarity to members of the family of LysR-type transcriptional regulators (LTTR). The LTTR family of regulators is the most common in prokaryotes and has diverse functions such as regulation of genes involved in metabolism, cell division, quorum sense, virulence, oxidative stress response, among others. Among the proteins under study, the only protein that has more specific prediction of classification within the family is the LysR XfCysB, which already characterized homologous proteins are involved in the regulation of cys operon, which is involved in the biosynthesis of cysteine. After cloning the protein, structural characterization was performed using the techniques of Exclusion Chromatography for Molecular Weight that shows the oligomeric state of the protein; circular dichroism to determine if protein has folded and stable secondary structure and SAXS (X-Ray Scattering at Small Angle) for the determination of protein structure in solution. Functional characterization was performed by analyzing the expression of proteins during different stages of biofilm formation (5, 10, 15, 20 and 30 days of growth) of X. fastidiosa by producing antibodies specific for each protein under study and performance of Western blot using total protein extract of the antibody produced against biofilm. With results obtained it was possible to estimate that the molecular weight of protein was 50 kDa XfLysRL in solution, indicating that the XfLysRL is in dimeric form, since the molecular weight of the monomer is 23.7 kDa. It also has a stable secondary structure folded and supporting a rise in temperature to 44° C. It was also verified that the protein is monodisperse in solution, is structurally globular and could be produced, with the data obtained, a first model for the structure of the protein. The protein XfCysB had its mass estimated at 45.3 kDa in solution and 195.1 kDa in the presence of its coinducer specific, besides presents a folded secondary structure. Regarding the protein XfycjZ was observed that when this solution has a molecular mass of 174.8 kDa demonstrating that it's oligomeric form is a tetramer. Functional studies indicate that the three proteins were expressed during the biofilm formation of X. fastidiosa, follows that they are present in 6 times analyzed. Thus, the detailed study of these proteins is important because their presence in biofilm formation of X. fastidiosa, one of the mechanisms of pathogenicity of the bacteria. Another important factor is the use of results in the structural elucidation of the role of proteins because the protein structure is directly involved in its function Mestrado Genética Vegetal e Melhoramento Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Sandra Martha Gomes Dias, Marilia Meira Dias Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Tumores consomem grandes quantidades de glicose e glutamina. O aumento do consumo de glutamina, além de contribuir para a formação de precursores biossintéticos, está relacionado à progressão tumoral. As glutaminases são codificadas por dois genes, GLS e GLS2. Ambas glutaminases são proteínas modulares, com domínios notoriamente envolvidos em interações proteína-proteína. GLS é oncogênico em diversos tipos tumorais, enquanto GLS2 desempenha um papel ambíguo, sendo anti- ou pró-tumoral em diferentes contextos. Em publicação recente do grupo, foi comprovado o papel pró-tumorigênico de GLS2 em um grupo de tumores de mama com expressão aumentada de GLS2, via eixo de interação ZEB/ERK/vimentina. O objetivo deste trabalho foi entender o papel de GLS2 no crosstalk com células do sistema imune infiltradas no microambiente, e o papel desta interação para a progressão tumoral em câncer de mama. Análise in silico utilizando o banco de dados doTCGA (The Cancer Genome Atlas) revelou que tumores com altos níveis de expressão de GLS2 são depletados de linfócitos e enriquecidos em macrófagos M2, um subtipo envolvido na progressão tumoral. Ensaios de co-cultura in vitro com a linhagem de câncer de mama humana MCF7 com expressão ectópica de GLS2 (GLS2+) com monócitos humanos revelaram secreção aumentada de citocinas anti-inflamatórias responsáveis pela polarização de macrófagos M2, comparado as células controle (Mock). Co-cultura com a linhagem tumoral de mama murina EO771 Mock e GLS2+ alterou o fenótipo de polarização de macrófagos primários murinos no sentido de favorecer o fenótipo M2, mas isto não dependeu da expressão de GLS2. Expressão de GLS2 diminuiu (e atrasou) a invasão de EO771; M2 não acelerou este processo tanto em Mock quanto em GLS2+. Implantes ortotópicos de EO771 GLS2+ em camundongos singênicos cresceram mais e ficaram mais pesados do que tumores Mock. Análise histológica dos cortes tumorais GLS2+ revelou extensas regiões de fibrose, necrose e hemorragia nestes tumores, comparados aos tumores Mock. Análise de infiltração de macrófagos nos cortes tumorais revelou maior presença de macrófagos M1 em tumores Mock do que em tumores GLS2+, enquanto que, qualitativamente, presença de M2 aparentou ser igual, sugerindo maior taxa M2/M1 em tumores GLS2+ comparado a Mock. Cortes tumorais GLS2+ também revelaram aumento na marcação de células endoteliais comparado aos tumores controle. Por fim, com o intuito de identificar parceiros de interação de GLS2, realizamos co-imunoprecipitação seguida de espectroscopia de massas na linhagem EO771 Mock/GLS2+ cultivada in vitro. As proteínas identificadas não nos apontaram nenhuma relação clara e necessitam de posterior comprovação. Concluímos que existe uma relação entre a isoenzima GLS2 e o conteúdo de macrófagos infiltrados em tumores com o aumento da resposta inflamatória e progressão tumoral em câncer de mama. Entretanto, esta reposta, no modelo estudado, não está relacionada com algum crosstalk específico entre a expressão de GLS2 nas células de câncer e o perfil de polarização de macrófagos, sendo, provavelmente, o produto de uma relação mais complexa entre o tumor e distintas células imunes (e/ou outros tipos celulares) no microambiente tumoral Abstract: Tumors consume large amounts of glucose and glutamine. The increase in glutamine consumption, in addition to contributing to the formation of biosynthetic precursors, is related to tumor progression. Glutaminases are encoded by two genes, GLS and GLS2. Both glutaminases are modular proteins, with domains notoriously involved in protein-protein interactions. GLS is oncogenic in several tumor types, while GLS2 plays an ambiguous role, being anti- or pro-tumor in different contexts. In a recent publication by the group, the protumorigenic role of GLS2 was proven in a group of breast tumors with increased expression of GLS2, via the ZEB/ERK/vimentin interaction axis. The aim of this work was to understand the role of GLS2 in crosstalk with immune system cells infiltrated in the microenvironment, and the role of this interaction for tumor progression in breast cancer. In silico analysis using the TCGA (The Cancer Genome Atlas) database revealed that tumors with high levels of GLS2 expression are depleted of lymphocytes and enriched in M2 macrophages, a subtype involved in tumor progression. In vitro co-culture assays with the human breast cancer line MCF7 with ectopic expression of GLS2 (GLS2+) with human monocytes revealed increased secretion of anti-inflammatory cytokines responsible for the polarization of M2 macrophages compared to control cells (Mock). Co-culture with murine breast tumor lineage EO771 Mock and GLS2+ altered the polarization phenotype of murine primary macrophages towards favoring the M2 phenotype, but this did not depend on GLS2 expression. GLS2 expression slowed down (and delayed) EO771 invasion; M2 didn't speed up this process in either Mock or GLS2+. EO771 GLS2+ orthotopic implants in syngeneic mice grew larger and heavier than Mock tumors. Histological analysis of the GLS2+ tumor sections revealed extensive regions of fibrosis, necrosis and hemorrhage in these tumors, compared to Mock tumors. Analysis of macrophage infiltration in tumor sections revealed a greater presence of M1 macrophages in Mock tumors than in GLS2+ tumors, while qualitatively, the presence of M2 appeared to be equal, suggesting a higher M2/M1 rate in GLS2+ tumors compared to Mock tumors. GLS2+ tumor sections also revealed increased endothelial cell labeling compared to control tumors. Finally, to identify GLS2 interaction partners, we performed co-immunoprecipitation followed by mass spectroscopy in the EO771 Mock strain /GLS2+ cultured in vitro. The identified proteins did not show any clear relationship and need further proof. We conclude that there is a relationship between the GLS2 isoenzyme and the content of macrophages infiltrating tumors with increased inflammatory response and tumor progression in breast cancer. However, this response, in the model studied, is not related to any specific crosstalk between the expression of GLS2 in cancer cells and the polarization profile of macrophages, being probably the product of a more complex relationship between the tumor and different cells (and/or other cell types) in the tumor microenvironment Doutorado Genética Animal e Evolução Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2016/06625-0 ; 2016/23301-4

Orientador: Sandra Martha Gomes Dias Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O câncer de mama é o tipo de câncer mais diagnosticado em mulheres, sendo estimada uma incidência de aproximadamente 3,2 milhões de casos por ano até 2050. O subtipo triplo-negativo (Triple Negative Breast Cancer, TNBC), caracterizado pela baixa expressão/não detecção dos receptores hormonais de estrógeno (ER), progesterona (PR) e fatores de crescimento (Her2), é o mais comum entre mulheres jovens, tendo como características serem mais agressivos, de maior tamanho, maior chance de metástase e apresentarem pior prognóstico com maiores chances de recidiva. Reprogramações metabólicas em células tumorais podem fornecer alvos para o tratamento do câncer. Dentre elas, destaca-se a ativação da glicólise (mesmo na presença de oxigênio), com aumento da secreção de lactato e cataplerose do ciclo do ácido tricarboxílico (Tricarboxilic acid cycle, TCA) para prover de intermediários importantes vias biosintéticas. No subtipo triplo-negativo em específico, a enzima glutaminase, codificada por GLS, a primeira na via de metabolização do aminoácido glutamina e importante fonte anaplerótica do TCA, foi descrita como alvo para tratamento. GLS codifica, por splicing alternativo, glutaminase C (GAC) e kidney-type glutaminase (KGA). IPN60090 e CB-839 são inibidores de GLS em testes clínicos de fase I e II, respectivamente, em tumores sólidos (como o de mama triplo-negativo) e hematológicos. Há alguns anos, nosso laboratório realizou duas campanhas empregando ensaio bioquímico de High Throughput Screening (HTS), uma com uma biblioteca de 30 mil compostos sintéticos (Chembridge) e outra de 728 fármacos aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA) dos EUA. Um ensaio celular foi também previamente realizado no laboratório usando linhagem celular com expressão de GLS ou knock down do gene para avaliação de extratos e frações de produtos naturais. Alguns dos hits identificados nestas campanhas foram os alvos de estudo desta tese. O screening com produtos naturais não revelou nenhum composto com atividade inibitória de GLS. Idebenona, um análogo da Ubiquinona (coenzima Q10), avaliada no tratamento de Alzheimer e doenças neuromusculares e hoje aprovada para o uso em Leber’s hereditary optic neuropathy, mostrou ser um inibidor de GLS, GLS2 e glutationa desidrogenase com ação antitumoral in vitro. Quarenta e seis hits da campanha de HTS foram adquiridos e 3 deles, chamados de C9, C12, C15 além de moléculas com grupamento funcional triazol, foram estudados nesta tese. Estudos de estrutura-função de C9, C12, C15.1 e os triazóis revelaram análogos de maior potência e seletividade celular. Em destaque, foi identificado um derivado de C9, C9.22, com um arcabouço estrutural inovador e descrito os determinantes moleculares de sua atividade inibitória Abstract: Breast cancer is the most diagnosed type of cancer in women, with an estimated incidence of approximately 3.2 million cases per year until 2050. The triple negative subtype (Triple Negative Breast Cancer, TNBC), characterized by low expression/ non-detection of estrogen hormone receptors (ER), progesterone (PR) and growth factors (Her2), is the most common among young women, having the characteristics of being more aggressive, larger, more likely to metastasize and have a worse prognosis with greater chances of recurrence. Metabolic reprogramming in tumor cells may provide targets for cancer treatment. Among them, the activation of glycolysis (even in the presence of oxygen) stands out, with an increase in lactate secretion and cataplerosis of the tricarboxylic acid cycle (Tricarboxylic acid cycle, TCA) to provide important intermediary biosynthetic pathways. In the triple-negative subtype specifically, the enzyme glutaminase, encoded by GLS, the first in the pathway of metabolization of the amino acid glutamine and an important anaplerotic source of TCA, was described as a target for treatment. GLS encodes, by alternative splicing, glutaminase C (GAC) and kidney-type glutaminase (KGA). IPN60090 and CB-839 are GLS inhibitors in phase I and II clinical trials, respectively, in solid (such as triple-negative breast) and hematologic tumors. A few years ago, our laboratory carried out two campaigns using a High Throughput Screening (HTS) biochemical assay, one with a library of 30,000 synthetic compounds (Chembridge) and the other with 728 drugs approved by the US Food and Drug Administration (FDA). A cell assay was also previously performed in the laboratory using cell lineage with GLS expression or gene knock down to evaluate extracts and fractions of natural products. Some of the hits identified in these campaigns were the study targets of this thesis. Idebenone, an analogue of ubiquinone (coenzyme Q10), evaluated in the treatment of Alzheimer's and neuromuscular diseases and now approved for use in Leber's hereditary optic neuropathy, has been shown to be a tumor-acting inhibitor of GLS, GLS2 and glutathione dehydrogenase. Forty-six hits from the HTS campaign were acquired and 3 of them, called C9, C12, C15, in addition to molecules with a triazole functional group, were explored in this thesis. Screening with natural products did not reveal any compounds with GLS inhibitory activity. Structure-function studies of small hit molecules revealed analogues of greater potency and cell selectivity. In focus, we identify a C9 derivative, C9.22, with an innovative structural scaffold and describe the molecular determinants of its inhibitory activity Doutorado Genética Animal e Evolução Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2016/09077-4

Orientadores: Ana Carolina Migliorini Figueira, Albane le Maire Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O Receptor de Ácido Retinóico (RAR) é uma proteína pertencente à família dos receptores nucleares que atua na transcrição de genes relacionados ao crescimento e proliferação celular, homeostase e no metabolismo. Essa regulação da transcrição é mediada pela interação com seu ligante natural, o ácido retinóico. Na presença desse ligante, o RAR é capaz de recrutar moléculas coativadoras que interagem com outras proteínas da maquinaria de transcrição. Porém, na ausência do ligante, o RAR consegue reprimir a transcrição ao interagir com moléculas correpressoras, que são proteínas multidomínios capazes de recrutar enzimas que impedem a maquinaria de transcrição de atuar em determinado gene. Anomalias neste tipo de regulação podem relacionar o RAR e outros RNs a doenças, como é o caso da Leucemia Promielocítica Aguda (APL), uma condição patológica que resulta em uma alta proliferação de células promielóides anormais. Nesta condição, o RAR é expresso fusionado à Proteína da Leucemia Mielóide (PML) e se mantem inativo, sendo que a hipótese mais aceita é que esta fusão PML-RAR dificulta o desligamento de moléculas correpressoras, e por consequência, impede que haja a ativação de genes que diferenciem essas células promielóides. Esta tese buscou compreender detalhes moleculares do mecanismo de repressão nos quais essas proteínas estão envolvidas. Para isso foram realizados diversos ensaios que consistem primeiramente na (a) expressão das proteínas normais (selvagem) e de condição patológica (mutante PLM-RAR), (b) estudos de interação entre RAR/PML-RAR e correpressores, bem como sua interação nos complexos com RXR e DNA, (c) montagem dos complexos com correpressores, e (d) estudos estruturais dessas proteínas e complexos.Os resultados obtidos nesta pesquisa apontam para uma nova abordagem no entendimento de como a presença da proteína PML-RAR atua na APL. Ensaios de DLS e de estabilidade térmica apontam para a capacidade do PML-RAR de gerar grandes complexos organizados, com características beta-amiloides, como identificado em ensaios de ThT. Através destes resultados levantamos a hipótese de que o PML-RAR, ao formar estes grandes complexos, impede a ação do RAR nas vias de regulação gênica (interação com DNA e correguladores) e do PML nas suas funções nucleares, através do sequestro de proteínas normais/selvagens (RAR e PML) Abstract: The Retinoic Acid Receptor (RAR) is part of the nuclear receptors superfamily , and acts as transcription regulators of genes related to cell growth and proliferation, homeostasis and metabolism. This process is mediated by the interaction of RAR with its natural ligand, the retinoic acid. In the presence of its ligand, RAR is able to recruit coactivators that are capable of interacting with other proteins from the transcription machinery. However, in the absence of ligand, RAR can repress transcription by interacting with corepressors, which are multidomain proteins capable of recruiting enzymes that prevent transcription machinery to function in a particular gene. In this way many diseases are related to RAR and to nuclear receptors in general. This is the case of acute promyelocytic leukemia (APL), a pathological condition which presents a high promieloids abnormal cell proliferation . This occurs because the RAR is expressed fused to Protein Myelogenous Leukemia (PML), and behaves repressed. Until now, the most accepted explanation for this repression is that RAR-PML impairs the corepressors' dissociation and, consequently, prevents the activation of genes that are involved in these promieloid cells differentiation. In this sense, this study aimed to understand the molecular mechanism of repression in which RAR is involved. For this purpose, several tests which consist primarily on (a) expression of normal proteins (wild type) and in pathological conditions (PLM-RAR mutant) were performed together with (b) the study of the nuclear receptors and corepressores interactions , as well as, the interaction of these complexes with DNA, (c) the assembling of the NR-corepressores complexes , and (d) the structural studies of these complexes. The results obtained in this research point to a new approach in understanding how the presence of the PML-RAR protein acts in the APL. DLS and thermal stability assays point to the ability of PML-RAR to generate large organized complexes, with beta-amyloid characteristics, as identified in ThT assay. Through these results we raise the hypothesis that PML-RAR, when forming these large complexes, prevents the action of RAR in the pathways of gene regulation (interaction with DNA and co-regulators) and PML in its nuclear functions, through the sequestration of normal/wild proteins (RAR and PML) Doutorado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Doutora em Ciências FAPESP 2016/02348-2 CAPES 001

Orientadores: Sandra Martha Gomes Dias, Marcelo Falsarella Carazzolle Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Devido à sua importância na adaptação metabólica e na progressão do câncer, obter informações funcionais sobre as HIFs que venham a responder seus mecanismos de ação é de suma importância para o entendimento da doença. De especial interesse é a isoforma menos estudada, HIF-3alfa, e suas diversas variantes por splicing alternativo. Quatro das variantes (-3alfa1, -3alfa2, -3alfa3 e -3alfa9) apresentam domínio bHLH de interação ao DNA e domínio NTAD de regulação da transcrição gênica, de maneira que regulam diretamente a transcrição gênica de genes alvos. De fato, já foi demonstrado que HIF- 3?9 regula um set de genes próprios. Outras 3 isoformas (-3alfa4, -3alfa5 e 3alfa7) não apresentam o domínio bHLH ou o NTAD, podendo promover regulação não como elementos ativos, mas como supressores, tal como já provado para o gene HIF-3?4. Neste trabalho, desenvolvemos uma plataforma de análise de dados de ômicas de tecidos tumorais disponíveis pelo The Cancer Genome Atlas usando a linguagem estatística R. O programa foi chamado de GDCtools e já está disponível no GitHub (https://github.com/Facottons/GDCtools). Ele permite análises baseadas na separação de grupos de tumores de acordo com características contínuas (expressão genica, nível de isoformas, metilação, nível proteico e sobrevida) ou discretas (características clinicas e mutação), seguido de análise de expressão genica diferencial utilizando os pacotes EBSeq, DESeq2 e edgeR, acompanhado das possibilidades de análises de intersecção por diagrama de Venn e enriquecimento de vias. Além disso, é possível utilizar a análise de co-expressão, a qual correlaciona as variações de expressões de diferentes genes em um dado. De posse deste pacote e de análises extras estudamos então as diferentes isoformas do gene HIF3A. Neste estudo procuramos por isoformas diferencialmente expressas entre tecidos normais e tumorais relacionados, seguido da avaliação do impacto da expressão das mesmas no prognóstico de tumores. Nossos estudos apontaram para duas isoformas, HIF- 3alfa2 em adenocarcinoma de cólon e HIF-3alfa3 em adenocarcinoma de próstata, cuja alteração em nível de expressão indicaram piora ou melhora (respectivamente) na sobrevida livre de recidiva dos respectivos tumores e levaram ao enriquecimento de vias que podem explicar tais impactos. Desta maneira, tais isoformas têm o potencial de estarem envolvidas na progressão desses tipos tumorais e merecerem posteriores estudos em laboratório para se provar seu envolvimento nestas doenças Abstract: Because of its importance in metabolic adaptation and cancer progression, obtaining functional information about HIFs that will respond to its mechanisms of action is of paramount importance for understanding the disease. Of special interest is the less studied isoform, HIF-3alpha, and its several variants by alternative splicing. Three of the variants (-3alpha1, -3alpha3 and -3alpha9) present DNA interaction domain bHLH and NTAD domain of gene transcription regulation in a way that potentially directly regulate the gene transcription of target genes. In fact, HIF-3alpha9 has already been shown to regulate a set of genes themselves. Other 3 isoforms (-3alpha4, -3alpha5 and 3alpha7) do not present the bHLH domain or the NTAD, being able to promote regulation not as active elements, but as suppressors, as already proven for the HIF-3alpha4 gene. In this work, we developed a platform for the analysis of tumor tissue data available by The Cancer Genome Atlas using the R programming language. The program was called GDCtools and is already available on GitHub (https://github.com/Facottons/GDCtools). It allows analyses based on the separation of tumor groups according to continuous characteristics (genetic expression, level of isoforms, methylation, protein level and survival) or discrete (clinical characteristics), followed by differential gene expression analysis using the EBSeq, DESeq2 and edgeR, accompanied by the possibilities of Venn diagram intersection and pathway enrichment analysis. In addition, it is possible to use co-expression analysis, which correlates the expression variations of different genes in a given tumor and clusters them in color-labeled modules. With this package and extra analyses, we studied the different isoforms of the HIF3A gene. In this study we searched for differentially expressed isoforms between normal and tumor related tissues, followed by the evaluation of the impact of tumor expression on the tumors‘ prognosis. Our studies pointed to two isoforms, HIF-3alpha2 in colon adenocarcinoma and HIF-3alpha3 in prostatic adenocarcinoma, whose alteration in expression level indicated worsening or improvement (respectively) in relapse-free survival of the respective tumors and led to the enrichment of pathways that may explain such impacts. Thus, these isoforms have the potential to be involved in the progression of these tumor types and deserve further laboratory studies to prove their involvement in these diseases Mestrado Bioinformática Mestre em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2015/26059-7

Orientadores: Camila Caldana, Marina Câmara Mattos Martins Soldi Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O crescimento e o desenvolvimento vegetal são mantidos por uma complexa rede controlada por fatores ambientais incluindo a disponibilidade de nutrientes, água e luz, e por diversas vias de sinalização que interagem entre si. Uma das principais vias que exerce papel fundamental na regulação do crescimento celular em eucariotos é a quinase "Target Of Rapamycin" (TOR). Em plantas, várias linhas de evidência apontam que a TOR desempenha uma função crucial no balanço entre carbono e nitrogênio, atuando como um regulador do metabolismo central controlando o crescimento e a produção de biomassa. Apesar disso, pouco se conhece sobre seu modo de ação em plantas. Para investigar a participação da TOR no controle do metabolismo, plântulas de Arabidopsis thaliana em fase inicial de desenvolvimento receberam tratamento com o inibidor químico da TOR, AZD-8055, e foram analisadas através de perfis metabólicos em larga escala (GC-TOF-MS e LC-MS/MS) combinados com análises enzimáticas ao longo do ciclo diuturno. As respostas metabólicas da inibição dessa via a curto prazo ampliaram as evidências de uma forte regulação do metabolismo primário. A repressão desta via em períodos específicos do ciclo diuturno permitiu elucidar que o fenótipo de acúmulo de amido ocorre graças à redução da degradação em períodos definidos do dia (primeiras e últimas horas de luz). Por outro lado, os baixos teores de sacarose não permitem comprovar que a inibição do complexo TOR apenas leve à diminuição da demanda de carbono para o crescimento. Ao contrário, a repressão desta via desacopla a percepção e sinalização de açúcares, indicando que o complexo TOR não apenas é afetado pelos níveis destes metabólitos, mas também atua em sua regulação. Um exemplo é a quebra da sólida relação entre sacarose e seu açúcar sinalizador trealose-6-fosfato (Tre6P) por mecanismo ainda não elucidado. Os resultados obtidos nessa tese expõem pela primeira vez a interação entre TOR e Tre6P, indicando um papel importante desta via em perceber os níveis de nutrientes para ajustar o crescimento vegetal Abstract: Plant growth and development are maintained by a complex network controlled by environmental factors including the availability of nutrients, water and light, and by several signaling pathways that interact with each other. One of the most important pathways that plays a key role in regulating cell growth in eukaryotes is the kinase "Target of Rapamycin" (TOR). In plants, several lines of evidence point out that TOR has a crucial function in carbon and nitrogen balance, acting as a regulator of central metabolism controlling growth and biomass production. However, knowledge about its mode of action is limited in plants. To investigate the contribution of TOR to the control of metabolism, seedlings of Arabidopsis thaliana in the early-stage of development were treated with the chemical inhibitor of TOR, AZD-8055, and analyzed using large-scale MS-based metabolite profiling (GC-TOF-MS and LC-MS/MS) in combination with enzymatic assays during the diurnal cycle. Short-term metabolic responses to the inhibition of this pathway have provided further evidences for a strong regulation of primary metabolism. TOR repression in specific periods of the diel cycle made it possible to elucidate that the starch excess phenotype occurs due to reduced starch degradation in particular periods of the day (first and last hours of light). On the other hand, the low levels of sucrose could not confirm that inhibition of TOR complex leads simply to a reduction in carbon demand for growth. Conversely, repression of this pathway uncouples sugar sensing and signaling, indicating that TOR complex is not only affected by the levels of these metabolites, but also play a role on their regulation. One example is the breakage of the solid correlation between sucrose and the signal molecule trehalose-6-phosphate (Tre6P) by an unknown mechanism. The results obtained in this thesis expose for the first time the interaction between TOR and Tre6P pointing out an important role of this pathway to sense nutrient levels in order to adjust plant growth Doutorado Genética Vegetal e Melhoramento Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2014/10407-3 CAPES 0

Orientador: Ana Carolina Migliorini Figueira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os Receptores Ativadores da Proliferacao de Peroxissomos (PPAR) sao fatores de transcricao modulados por ligantes e pertencentes a superfamilia dos receptores nucleares. O isotipo PPAR¿À/¿Â esta envolvido em processos metabolicos como metabolismo energetico, adipogenese e metabolismo de lipidios, sendo um alvo interessante para o desenvolvimento de farmacos para doencas metabolicas. Alem disso, esse receptor e o isotipo mais expresso em pele e esta envolvido em diversos processos nesse orgao, como manutencao da barreira epidermal, sintese de lipidios, diferenciacao epidermal e cicatrizacao, o que o torna um alvo para o desenvolvimento de farmacos ou dermocosmeticos que possam atuar em processos de regeneracao de pele. O objetivo geral deste trabalho foi prospectar compostos que possam atuar como ligantes ativadores do PPAR¿À/¿Â e investigar os efeitos da modulacao deste receptor por ligantes em celulas epiteliais. Foi desenvolvido um protocolo de triagem de agonistas para este receptor, composto por um ensaio de transativacao celular seguido por dois ensaios de caracterizacao biofisica da interacao ligante:proteina - ensaio de termoestabilidade e ensaio de supressao da fluorescencia da sonda 8-anilino-1-naftalenosulfonico. O protocolo desenvolvido apresenta melhorias em relacao aos ensaios de transativacao celular comumente utilizados para triagem de ligantes de PPARs: (i) semi-automatizacao; (ii) analise da citotoxicidade aparente; (iii) uso de metodologias biofisicas para confirmacao da interacao direta entre ligante:proteina; (iv) e afericao da afinidade entre os hits e o receptor por meio do calculo da constante de dissociacao. Apos padronizacao, este racional foi utilizado para triar 121 compostos isolados enviados por colaboradores, 560 extratos de plantas brasileiras da biblioteca Phytobios, 719 compostos da biblioteca drug-like NIH-NCC e 80 derivados semi-sinteticos de produtos naturais da biblioteca TimTec NDL-3,000 pre-selecionados por virtual screening. Ao final do pipeline de busca de agonistas, o Extrato 2 da biblioteca Phytobios e sua fracao Extrato 2-18 foram selecionados como hits de PPAR¿À/¿Â, pois apresentaram componentes que ativam e estabilizam a estrutura terciaria do receptor, com constantes de dissociacao de 0,011 } 0,007 mg/mL e 0,016 } 0,007 mg/mL, respectivamente. Alem do protocolo de triagem, foram padronizados metodos de migracao, proliferacao e diferenciacao de queratinocitos humanos (HaCaT) para caracterizacao da modulacao do PPAR¿À/¿Â por ligantes em processos de regeneracao de pele. Nestes ensaios, os agonistas comerciais GW0742, GW501516 e L-165,041 aumentaram a taxa de migracao 2D de queratinocitos humanos (HaCaT), e os agonistas GW501516 e L-165,041 diminuiram a proliferacao deste tipo celular. Em relacao a diferenciacao de HaCaT, os agonistas GW0742 e L-165,041 nao alteraram a expressao genica dos marcadores de diferenciacao celular queratina 14, queratina 1 e involucrina. Avaliando os niveis de expressao de mRNA de componentes da matriz extracelular da pele (colageno, fibronectina e colagenases), nao foram observadas alteracoes no padrao de expressao desses alvos apos a ativacao do PPAR¿À/¿Â em celulas HaCaT, ou apos a supressao da expressao do receptor em camundongos knockouts com estimulo de reparo de feridas cutaneas. Em resumo, neste trabalho foi desenvolvido um pipeline de selecao de agonistas para o PPAR¿À/¿Â que ativem e a estabilizem a estrutura do receptor, alem de possibilitar o calculo da constante de dissociacao entre as amostras testadas e a proteina. Por fim, foram acoplados ensaios a este pipeline para posterior caracterizacao dos agonistas de PPA Abstract: Peroxisome Proliferator Activated Receptors (PPAR) are transcriptional factors regulated by ligands and members of the nuclear receptor superfamily. The PPARâ/ä is involved in metabolic processes such as energetic metabolism, adipogenesis and lipid metabolisms, which made it an interesting target for the development of drugs for metabolic disorders. In addition, this isotype is the most expressed in skin and, in this organ, it is involved in processes such as epidermal barrier maintenance, lipid synthesis, epidermal differentiation and wound healing, which made it a target for the development of dermocosmetics or drugs for skin repair. Aiming to select new activators (agonists) for PPARâ/ä, for future drug development, in this work, we developed a pipeline for screening of agonists for this receptor. The pipeline is composed of a cellular transactivation assay followed by two biophysical assays (Thermal Shift Assay and 8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS) fluorescence quenching assay) for characterization of the direct interaction of ligand:protein. The pipeline brings improvements if compared to traditional methods for PPAR ligand-screening: semi-automatization; parameter of apparent cytotoxicity; biophysical methodologies for confirmation of direct interaction ligand:protein; and calculation of dissociation constant between hits and the receptor. With the pipeline, we screened 121 compounds/extracts given by collaborators, 560 Brazilian plant extracts from Phytobios library, 719 drug-like compounds from NIH-NCC library, and 80 semi-synthetic natural products derivatives from TimTec NDL-3,000 library pre-selected via virtual screening. At the end of the pipeline, Extract 2 and one of its fraction (Extract 2-18) from Phytobios library showed to activate PPARâ/ä, stabilize its tertiary structure and had a dissociantion constant of, respectively, 0.011 ± 0.007 mg/mL e 0.016 ± 0.007 mg/mL, being selected as PPARâ/ä agonists. Besides the screening pipeline, methods of migration, proliferation and differentiation of keratinocytes (HaCaT cells) were also developed to characterize PPARâ/ä modulation by ligands in skin regeneration processes. These methods will be incorporated to the pipeline for agonist screening to futher characterize new PPARâ/ä ligands. The commercial agonists GW0742, GW501516 and L-165,041 increased the migration rate of HaCaT, and GW501516 and L-165,041 decreased proliferation in this cell type. Regarding HaCaT differentiation, gene expression of the analysed markers (keratin 14, keratin 1 and involucrin) were not changed after ligand treatment in the selected protocols. The RNA expression levels of extracellular matrix proteins (collagens, fibronectin and collagenases) were not altered after keratinocyte activation by PPARâ/ä ligand GW501516, nor in PPARâ/ä- knockout compared to wild type after wound healing stimuli. In summary, in this work we developed a pipeline to screening for PPARâ/ä agonists and further characterize them in skin regeneration processes Doutorado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Doutora em Ciências FAPESP 2013/22648-2, 2016/16476-2 CNPQ 403433/2016-9

Orientador: Sandra Martha Gomes Dias Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A anaplerose do ciclo do TCA por glutamina, uma importante fonte energética e biossintética para células em elevada divisão celular, é prejudicada pela inibição da glutaminase. A inibição da glutaminase por CB-839 está em teste clínico como tratamento de múltiplos tumores sólidos e hematológicos. HuR (Human antigen R) é uma proteína codificada pelo gene ELAVL1. HuR apresenta três domínios de ligação à RNA e liga a elementos ricos em AU, afetando a estabilidade e o splicing do RNA. Achados prévios relacionam HuR à estabilização do mRNA da isoforma de glutaminase chamada de glutaminase C (GAC) em acidose renal e seu ortólogo, HuD, ao splicing alternativo de GLS em células neuronais. Com base nisto, nós hipotetizamos que HuR seria um importante regulador de glutaminase em câncer. Inicialmente nós avaliamos dados de transcriptômica pan-câncer do TCGA e observamos que pacientes com alta expressão de ELAVL1 apresentam aumentado risco de recidiva tumoral, sendo que em câncer de mama observamos um Cox hazard ratio (HR) de 1,82. Além disto, utilizando dados públicos de RNA-Seq, RIP-Seq e PAR-CLIP-Seq nós mostramos que HuR liga ao intron 14 de GLS e controla seu splicing, levando à escolha da isoforma kidney-type glutaminase (KGA) frente à GAC. Em adição, empregando células de câncer de mama e próstata e HEK293 (com um knock-in produzido por CRISPR/Cas9 onde foi inserido gene para proteína fluorescente no C-terminal de KGA) nós confirmamos que HuR aumenta os níveis de KGA por afetar o splicing e a estabilidade do mRNA. O silenciamento lentiviral de ELAVL1 prejudicou a proliferação, migração, invasão e aumentou o vício em glutamina de células de câncer de mama in vitro. O tratamento de células de câncer de mama silenciadas para ELAVL1 com CB-839 teve efeito sinérgico no sentido de afetar proliferação e invasão celulares in vitro. Nós propomos HuR como um fator de prognóstico em câncer de mama, com impacto especialmente no metabolismo de glutamina através da regulação de splicing do gene GLS. Nesta tese, nós também apresentamos em anexo sete artigos publicados que participei como co-autor, sendo quatro em co-primeira autoria Abstract: TCA cycle anaplerosis by glutamine, an important energetic and biosynthetic source for rapidly dividing cells, is impaired by glutaminase inhibition. Glutaminase inhibition by CB-839 is currently under clinical trials for treating multiple solid and haematological tumors. HuR (Human antigen R) is a protein encoded by the ELAVL1 gene. HuR contains three RNA-binding domains and binds cis-acting AU-rich elements, affecting mRNA stability and splicing. Previous findings have linked HuR to GLS mRNA stabilization in renal acidosis, and its ortholog, HuD, to GLS splicing in neuronal cells. We then hypothesized that HuR was an important glutaminase regulator in cancer. We first inquired a TCGA pan-cancer cohort and found that patients with higher ELAVL1 expression had increased risk of tumor recidive (Cox HR of 1.82 for breast cancer). Moreover, by using publicly available RNA-Seq, RIP-Seq and PAR-CLIP-Seq data we showed that HuR binds to GLS intron 14 and controls GLS splicing, leading to kidney type glutaminase (KGA) choice over glutaminase C (GAC). Using breast and prostate cancer and HEK293 (with a CRISPR/Cas9 knock in) cell lines we further confirmed that HuR increases KGA by affecting splicing and mRNA stability. Lentiviral ELAVL1 silencing impaired breast cancer cell¿s proliferation, migration, invasion and increased glutamine addiction in vitro. Treating silenced ELAVL1 breast cancer cells with CB839 further impaired proliferation and invasion. We proposed HuR as a prognostic factor in breast cancer, with special impact on glutamine metabolism through splicing regulation. In this thesis, we also present seven published articles on which I participated as a co-author, being four as co-first author Doutorado Genética Animal e Evolução Doutor em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2014/17820-3

Orientador: Sandra Martha Gomes Dias Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Glutaminases (GLS) são enzimas envolvidas no crescimento e progressão tumoral dado seu papel na manutenção da homeostase redox, produção de energia e aumento de biomassa celular. Assim, as GLS têm sido caracterizadas como importantes para os processos de migração e invasão. A via da PI3K/mTOR está intimamente relacionada ao aumento de biomassa e crescimento tumoral, estando com sua função desregulada em tumores. mTOR regula glutaminases em nível de estabilidade de RNA em mecanismo envolvendo aumento traducional de c-MYC que, por sua vez, inibe a expressão de um miRNA, impactando nos níveis proteicos de GLS. Neste trabalho, interferimos na via da mTOR através da sua inibição com rapamicina ou pelo knockdown do regulador negativo TSC2, assim como a estimulamos pela expressão da RagB selvagem ou de um mutante constitutivamente ativo. Em todos os casos, observamos uma relação positiva entre a atividade de mTOR e a atividade de GLS, o que, entretanto, não envolveu alteração no nível proteico da enzima. Intrigados sobre qual poderia ser o mecanismo por trás da regulação, investigamos via espectrometria de massas se a glutaminase C (GAC, uma das isoforma do gene GLS) sofria modificações pós-traducionais ou ligação a parceiros de interação, dependentes da ação de mTOR. Como possíveis candidatos, identificamos a proteína Sec13 (componente de GATOR2), HNRNP H1 (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1), EEFD (Eukaryotic elongation factor delta) e ASS1 (Argininosuccinate synthase). Por outro lado, também identificamos uma fosforilação em serina 95 (S95) e acetilação na lisina 197 (K197), os quais, entretanto, não responderam diferencialmente ao tratamento com rapamicina. Verificamos que a expressão do fosfomimético S95D levou a diminuição na atividade de glutaminase de lisado celular. Em acordo, a expressão de GAC.S95D levou a diminuição nos fenótipos de proliferação e migração celular. Curiosamente, o mutante S95A, com pouco impacto na atividade de glutaminase, levou a um aumento proeminente de proliferação, migração e dos níveis de marcadores de transição epitélio-mesênquima (EMT). Tomados em conjunto nossos resultados apontam que GAC tem o potencial de ser regulada por mTOR via interação proteica. Além disto, mostramos que o N-terminal de GAC sofre fosforilação no resíduo S95 e, através do uso de mutantes, identificamos que esta modificação tem o potencial de afetar a função da enzima glutaminase endógena e parâmetros celulares tais como proliferação e migração Abstract: Glutaminases (GLS) are enzymes involved in tumor growth and progression due to their role in maintaining redox homeostasis, energy production and increased cellular biomass. In this sense, GLS have been characterized as important for migration and invasion processes. The PI3K / mTOR pathway is closely related to increased biomass and tumor growth and is frequently dysregulated in tumors. mTOR regulates glutaminases in RNA stability in a mechanism involving c-MYC translational control, which in its turn, inhibits miRNA expression, impacting on increased GLS protein levels. In this work, the mTOR pathway was disturbed using a chemical inhibitor, rapamycin, through the knockdown of TSC2 and the expression of wild-type RagB and the constitutively active mutant. In all cases, we observed a positive regulation of mTOR on GLS activity without changes in glutaminase protein levels. Intrigued by the mechanism by which mTOR was regulating glutaminases, we investigated, using mass spectrometry, whether glutaminase C (one of the GLS isoforms) underwent post-translational modifications or binding to interaction partners, dependent on the action of mTOR. As a possible candidate, we have identified Sec13 (GATOR2 component), HNRNP H1 (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1), EEFD (Ekaryotic elongation factor delta) and ASS1 (Argininosuccinate synthase) proteins. On the other hand, we also identified a phosphorylation in serine 95 (S95) and acetylation in lysine 197 (K197), which, however, is not under mTOR control. We have found that expression of phosphomimetic S95D led to a decrease in glutamine activity. Accordingly, an expression of GAC.S95D led to a slight decrease in proliferation and cell migration phenotypes. Interestingly, the mutant S95A, which had little impact on glutaminase activity, led to a prominent increase in proliferation, migration, and levels of epithelial-mesenchymal transition markers (EMT). Taken together, our results show that GAC has the potential to be regulated by mTOR through protein interaction. In addition, we show that the N-terminal of GAC undergoes phosphorylation in residue S95 and, through the use of mutants, it was identified that this modification has the potential to affect an endogenous glutaminase enzyme function and cellular parameters such as proliferation and migration Doutorado Genética Animal e Evolução Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2013/23510-4 CNPQ 140545/2014-0

Orientador: Fabiana Fantinatti Garboggini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As lagoas das Salinas do Norte de Peru são geoformas, caracterizadas por depressões ou subsidências da costa do Oceano Pacífico. São considerados ambientes extremófilos e halofílicos devido à presença de sais na água e no solo, sendo os principais os cloretos, seguidos de sulfetos, bicarbonatos, brometos de magnésio, cálcio e potássio. O cloreto de sódio, comercialmente chamado de sal, é explorado pela população que vive nessas áreas. O presente estudo teve por objetivo isolar, caracterizar taxonomicamente bactérias presentes nas lagoas Salinas de Mórrope e Bayovar e avaliar a atividade antiproliferativa dos extratos brutos e suas frações destes micro-organismos frente a diferentes linhagens tumorais. Foram isoladas 211 bactérias, das quais 166 foram reativadas e caracterizadas morfologicamente e 50 foram identificadas por sequenciamento e análise filogenética do gene RNA ribossomal 16S. A identificação molecular agrupou as bactérias nos gêneros Streptomyces (n=39), Pseudonocardia (n=3), Staphylococcus (n=4), Pseudomonas (n=2) e Bacillus (n=2). Foram obtidos 23 extratos brutos a partir do crescimento microbiano e extração líquido-líquido com o solvente acetato de etila (AcOEt) para os testes antiproliferativos com Sulforodamina B (SRB) frente à linhagens tumorais. Os isolados M-92, B-146, B-81 e B-8 pertencem ao gênero Streptomyces e mostraram resultados promissores frente às células tumorais, U251 glioma; MCF7 mama; NCI-H460 pulmão tipo de não pequenas células. Para a amplificação da escala, fracionamento, isolamento e identificação de substâncias bioativas foram selecionados os isolados M-92, B-146, B-81 crescidos em três diferentes meios de cultura, NB, ISP2 e R2A, destes o meio R2A apresentou os melhores resultados em termos de atividade antiproliferativa, entretanto, o maior rendimento em massa foi obtido do meio ISP2. O extrato bruto e as frações do isolado B-81 foram avaliados por sua potencialidade em relação à atividade antiproliferativa frente a um painel de nove linhagens tumorais, U251 glioma; MCF7 mama; NCI-H460 pulmão tipo de células não pequenas, UACC-62 melanoma, NCI-ADR/RES ovário resistente a múltiplos fármacos, 786-O adenocarcinoma rim, OVCAR-03 ovário, HT-29 cólon e K562 leucemia, e uma não tumoral, HaCaT queratinócito, sendo a fração 3 (MeOH 100%) e a fração 4 (MeOH-AcOEt) as mais ativas. O perfil químico do extrato bruto e das frações do isolado B-81 foi investigado por UHPLC-MS e ESI-MS/MS e as moléculas detectadas por razão massa-carga (m/z) foram desreplicadas sendo possível sugerir a presença de substâncias descritas na literatura como Benastatin A, Phoslactomycin C, Actinomycin A, Asparenomycin A, Azinnomycin B, entre outras; biomoléculas já documentadas, além de novas moléculas que podem pertencer a outras classes químicas de compostos presentes nas actinobactérias do gênero Streptomyces. Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que o ambiente halofílico representa uma fonte promissora de microorganismos capazes de produzir novos compostos com potencial antiproliferativo Abstract: The Salinas lagoons of the North of Peru are geoforms, characterized by depressions or subsidence of the coast of the Pacific Ocean. Saline are considered as extremophilic and halophilic environments due to the presence of salts in water and soil, the main ones being chlorides, followed by sulfides, bicarbonates, bromides of magnesium, calcium and potassium. Sodium chloride, commercially called salt, is exploited by the population living in these areas. The present study aimed to isolate and taxonomically characterize bacteria present in the Salinas de Mórrope and Bayovar lagoons and to evaluate the antiproliferative activity of the crude extracts and their fractions of these microorganisms against different tumoral strains. 211 bacteria were isolated, of which 166 were reactivated and characterized morphologically and 52 were identified by sequencing and phylogenetic analysis of the 16S ribosomal RNA gene. The molecular identification grouped the bacteria in the genera Streptomyces (n = 39), Pseudonocardia (n = 3), Staphylococcus (n = 4), Pseudomonas (n = 2) and Bacillus (n = 2). Twenty-three crude extracts were obtained from the microbial growth and liquid-liquid extraction with the ethyl acetate solvent (AcOEt) for antiproliferative tests with Sulforodamine B (SRB) against tumor lines. The isolates M-92, B-146, B-81 and B-8 belong to the genus Streptomyces and showed promising results against tumor cells, U251 glioma; MCF7 breast; NCI-H460 non-small cell lung type. The isolates M-92, B-146, B-81 grown in three different culture media, NB, ISP2 and R2A were selected for the amplification of the scale, fractionation, isolation and identification of bioactive substances. Results in terms of antiproliferative activity, however higher mass yield was obtained from the ISP2 medium. The crude extract and fractions of the B-81 isolate were evaluated for their potential against antiproliferative activity against a panel of nine tumor lines, U251 glioma, MCF7 breast, NCI-H460 non-small cell lung, UACC-62 melanoma, NCI-ADR / RES multidrug resistant ovary, 786-adenocarcinoma kidney, OVCAR-03 ovary, HT-29 colon and K562 leukemia, and a non-tumor, HaCaT keratinocyte, fraction 3 (MeOH 100%) and fraction 4 (MeOH-AcOEt) the most active. The chemical profile of the crude extract and fractions of the B-81 isolate was investigated by UHPLC-MS and ESI-MS / MS and the molecules identified by m/z were de-replicated It is possible to suggest the presence of substances described in the literature such as Benastatin A, Phoslactomycin C, Actinomycin A, Asparenomycin A, Azinnomycin B, among others; biomolecules already documented, as well as new molecules that may belong to other chemical classes of compounds present in the actinobacteria of the genus Streptomyces. The results obtained in this study demonstrated that the halophilic environment represents a promising source of microorganisms capable of producing new compounds with antiproliferative potential Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular CNPQ 190390/2014-0

Orientador: Roger Frigerio Castilho Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Gliomas são tumores bastante agressivos e altamente glicolíticos. No presente estudo avaliamos a função respiratória mitocondrial de células de glioma humano (T98G e U-87MG) e de tecido humano de glioblastoma multiforme (GBM). Para isso foram realizadas medidas da taxa de consumo de oxigênio (TCO) em diferentes condições experimentais. Verificou-se que a TCO de células T98G e U-87MG está acoplada à fosforilação do ADP, uma vez que a quantidade de ATP produzida por oxigênio consumido (razão ADP/O) foi de ~2.5. A respiração basal de GBM também se mostrou parcialmente associada à fosforilação oxidativa do ADP. Além disso, a presença de um inibidor do poro de transição de permeabilidade mitocondrial não afetou a TCO de células de glioma intactas, indicando integridade da membrana mitocondrial. A respiração basal de células intactas (T98G e U-87MG) não se mostrou limitada pela disponibilidade de substratos endógenos, uma vez que a TCO basal foi estimulada pelo protonóforo FCCP. Essas células também apresentaram alta afinidade pelo oxigênio, conforme evidenciado pelos valores da pressão parcial de oxigênio na qual a respiração é metade da máxima (p50). Em células de glioma permeabilizadas, a TCO estimulada por ADP foi aproximadamente 50% daquela obtida com a adição de FCCP, revelando uma limitação significativa da fosforilação oxidativa (OXPHOS) em relação à atividade do sistema de transporte de elétrons (ETS). Essa característica se manteve mesmo quando as células foram cultivadas sob baixa concentração de glicose. Análises de coeficiente de controle de fluxo demonstraram que a limitação da OXPHOS pode estar associada a função da ATP sintase e do translocador de nucleotídeos de adenina, mas não a do transportador de fosfato. A inibição da OXPHOS em células em cultura promoveu um aumento da toxicidade do quimioterápico temozolomida na linhagem mais resistente (T98G) ao tratamento com esta droga. Em conjunto, os dados obtidos indicam que a disponibilidade e metabolismo de substratos respiratórios bem como o sistema de transporte de elétrons em células de glioma T98G e U-87MG encontram-se preservados, apesar dessas células possuírem uma limitação relativa da capacidade da OXPHOS Abstract: Gliomas are aggressive and highly glycolytic tumors. In the present study, we evaluated the mitochondrial respiratory function of glioma cells (T98G and U-87MG) and fresh human glioblastoma (GBM) tissue. To this end, measurements of oxygen consumption rate (OCR) were performed under various experimental conditions. The OCR of T98G and U-87MG cells was well coupled to ADP phosphorylation based on the ratio of ATP produced per oxygen consumed (ADP/O ratio of ~2.5). In agreement, the basal OCR of GBM tissue was also partially associated with ADP phosphorylation. The presence of an inhibitor of the mitochondrial permeability transition pore did not affect OCR of intact glioma cells, indicating mitochondrial membrane integrity. The basal respiration of intact T98G and U-87MG cells was not limited by the supply of endogenous substrates, as indicated by the increased OCR in response to the protonophore FCCP. These cells also displayed a high affinity for oxygen, as evidenced by the values of the partial pressure of oxygen when respiration is half maximal (p50). In permeabilized glioma cells, ADP-stimulated OCR was only approximately 50% of that obtained in the presence of FCCP, revealing a significant limitation in oxidative phosphorylation (OXPHOS) relative to the activity of the electron transport system (ETS). This characteristic was maintained when the cells were grown under low glucose conditions. Flux control coefficient analyses demonstrated that the impaired OXPHOS was associated with the function of both mitochondrial ATP synthase and the adenine nucleotide translocator, but not the phosphate carrier. The OXPHOS inhibition in cultured cells resulted in an increased temozolomide toxicity in the cells more resistant (T98G) to this drug. Altogether, these data indicate that the availability and metabolism of respiratory substrates and mitochondrial ETS are preserved in T98G and U-87MG glioma cells even though these cells possess a relatively restrained OXPHOS capability Mestrado Fisiopatologia Médica Mestra em Ciências CNPQ 132755/2015-7 FAPESP 11/50400-0

Orientador: Sandra Martha Gomes Dias Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O câncer de mama triplo-negativo (TN) corresponde a cerca de 15% dos casos diagnosticados da doença e é caracterizado pela ausência dos receptores de hormônios progesterona e estrógeno e do receptor de membrana HER2 e, por isso, não responde aos tratamentos convencionais para o câncer de mama. Estudos recentes têm mostrado uma relação entre o câncer de mama TN e o metabolismo alterado, sugerindo que a reprogramação metabólica (com dependência do aminoácido glutamina) pode ser chave na progressão da doença e importante no desenvolvimento de novas terapias. Dado que a inibição da enzima glutaminase (GLS), primeira na via de metabolismo de glutamina, já está sendo avaliada na terapêutica de tumores de mama triplo-negativo com o composto CB-839 (Fase Clinica II), nós avaliamos quais mecanismos metabólicos alternativos poderiam ser acionados com o tratamento, causando a resistência deste subtipo tumoral ao composto. Inicialmente, confirmamos dados da literatura que mostram uma dependência variada à glutamina e sensibilidade ao composto CB-839 em linhagens celulares TN e, dessa maneira, identificamos células resistentes (inibição de proliferação menor que 50% em relação ao veículo) e sensíveis ao tratamento (morte ou inibição de proliferação maior que 50%). Em seguida, a partir da análise de dados de transcriptômica de linhagens e tecidos tumorais, observamos que genes relacionados ao metabolismo de lipídios são diferencialmente expressos entre células resistentes e sensíveis ou entre tumores com baixo e alto nível de expressão de GLS. Especificamente, diversos genes relacionados ao processo de beta-oxidação estão com expressão aumentada em tecidos tumorais com baixa expressão de GLS. Além disso, pacientes com tumores com baixa expressão de GLS e maior expressão de Carnitina Palmitoiltranferase (CPT1) apresentaram pior prognóstico. Para validar se beta-oxidação é uma via metabólica importante em linhagens resistentes ao CB-839, verificamos o nível proteico de CPT1 e CPT2, atividade de CPT1 e sensibilidade ao etomoxir (inibidor da beta-oxidação) dessas linhagens. Como resultado, verificamos que células resistentes ao CB-839 têm maior nível proteico de CPT2, maior atividade de CPT1 e apresentam maior sensibilidade ao etomoxir (em relação à proliferação) do que células sensíveis. Observamos também que CB-839 impacta menos na morfologia mitocondrial e nível de ATP em linhagens resistentes em relação às células sensíveis. Além disso, o tratamento conjunto de CB-839 com etomoxir nas células resistentes tem maior impacto na respiração celular de ácidos graxos, nível de ATP intracelular e nos fenótipos de crescimento, invasão e migração celular. Por fim, observamos que os níveis de fosforilação de Tyr172 em Proteína cinase ativada por AMP (AMPK) e Ser72 em Acetil-CoA Carboxilase (ACC) são maiores em tumores com menor expressão de GLS, provendo as bases moleculares para a ativação da beta-oxidação em células resistentes ao CB-839. Em sumário, concluímos que o metabolismo de glutamina e de ácidos graxos dão plasticidade metabólica para os tumores de mama triplo-negativo e que os níveis proteicos de CPT1 e CPT2 devem ser usados como marcadores de resposta ao tratamento com CB-839 Abstract: Triple-negative breast cancer accounts for about 15% of all breast cancer, characterized by a lack of estrogen and progesterone receptor expression (ESR and PGR, respectively) and the absence of human epithelial growth factor receptor (ERBB2) amplification. Therefore, this subtype does not respond to conventional treatments for breast cancer. Recent studies have shown a relationship between triple-negative breast cancer and altered metabolism, suggesting that metabolic reprogramming (with dependence on the amino acid glutamine) may be key to disease progression and promising in the development of new therapies. Inhibition of Glutaminase enzyme (GLS), first in the glutamine metabolism pathway, has been evaluated in the treatment of triple-negative breast tumors with compound CB-839 (Clinical Phase II) and, therefore, we evaluated which alternative metabolic mechanisms could be triggered with the treatment, causing tumor resistance to the compound. Initially, we confirmed literature data showing a varyable dependence on glutamine and sensitivity to CB-839 in TN cell lines and, thus, identified resistant (proliferation inhibition less than 50% compared to vehicle tretatment) and sensitive (death or proliferation inhibition more than 50% of that of the vehicle-treated cells) cells lines. Then, from the analysis of transcriptomic data from cells lines and tumor tissues, we observed that the genes related to lipid metabolism are differentially expressed between resistant and sensitive cells and between tumors with low or high GLS expression. Specifically, several genes related to the beta-oxidation process have increased expression in tumor tissues with low GLS expression. In addition, patients with tumors with lower GLS associated to higher CPT1 expression show worse prognosis. In order to validate whether beta-oxidation is an important metabolic pathway in resistant cells lines, we evaluated CPT1 and CPT2 protein expression, CPT1 activity, and etomoxir sensibility (beta-oxidation inhibitor) levels on those cells. Cells resistant to CB-839 have higher CPT2 protein level, higher CPT1 activity and are more sensitive to etomoxir (in relation to proliferation) than sensitive cells. We also observed that CB-839 treatment impacted less the mitochondrial morphology and ATP levels of resistant compared to sensitive cells. Combined treatment of CB-839 with etomoxir in resistant cells promoted a greater impact on cellular respiration of fatty acids, intracellular ATP level, cell proliferation, invasion and migration phenotypes. The levels of Tyr172 phosphorylation in AMPK and Ser72 in ACC are higher in tumors with lower GLS expression, providing the molecular bases for the activation of beta-oxidation in CB-839-resistant cells. In summary, we conclude that glutamine and fatty acid metabolism provide metabolic plasticity for triple-negative breast tumors and that the protein levels of CPT1 and CPT2 should be used as markers of response to CB-839 treatmen Doutorado Genética Animal e Evolução Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2014/18061-9

Orientador: Sandra Martha Gomes Dias Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A descoberta de fármacos é um processo longo e complexo. Em muitos casos, ele é composto pela identificação e validação inicial de alvo, seguida pelo desenvolvimento de ensaios bioquímicos ou celulares, rastreio de alto rendimento (High Throughput Screening, HTS) de uma biblioteca de compostos, identificação de compostos hits, otimização de moléculas leads e finalmente seleção de um candidato para seu desenvolvimento clínico. Glutaminase é uma enzima que desempenha um papel fundamental nas células tumorais e sua inibição ou atenuação da expressão demonstraram ser citotóxicas para vários tipos de tumor, em especial ao câncer de mama triplo-negativo (TN) (sem expressão dos receptores de estrógeno -ER, progesterona -PR e da proteína de membrana Her2). Mesmo sendo um importante alvo terapêutico, até a presente data, não há inibidores de glutaminase aprovados para o uso na clínica. Nosso grupo desenvolveu e realizou um ensaio bioquímico de HTS utilizando uma biblioteca de 30.000 compostos filtrados para seguirem as cinco regras de Lipinski. Neste trabalho, descrevemos no primeiro capítulo a avaliação de 11 dos compostos hits obtida em ensaios secundários celulares com o objetivo de verificar se os mesmos têm ação seletiva para tumores de mama TN em contraste a tumores não-T, células de tumor benigno (fibrose cística) e epitélio de mama imortalizado não tumorigênico. Dentre os compostos avaliados verificamos que os compostos C1 e C10 exibiram potência e seletividade tumoral medidos pela inibição do crescimento celular. Além disto, estes compostos inibiram em 50% o consumo de glutamina nas células tumorais TN MDA-MB-231 e diminuíram, nestas células, a porcentagem de núcleos marcados com Edu, indicando também ação citoestática. Entretanto, ambos compostos não apresentaram ação antitumoral dependente de GLS. Dando continuidade a busca por inibidores de glutaminase, no segundo capítulo desta dissertação, abordamos o estabelecimento de uma nova metodologia de triagem alvo-direcionada baseada em células, ensaio o qual foi empregado para o screening de duas coleções de bibliotecas de produtos naturais. Após validação e realização das triagens foi possível obter um total de 6 extratos/frações com potencial de serem inibidores seletivos de GLS Abstract: The drug discovery process is a long and complex process composed of an initial target identification and validation, followed by the development of a biochemical or cellular assays, high throughput screening (HTS) of a compound library, hit identification, lead optimization and ?nally the selection of a candidate molecule for clinical development. Glutaminase is an enzyme that plays a key role on Myc-driven tumor cells and its expression inhibition or attenuation has been shown to be cytotoxic for various tumor types, especially triple-negative (TN) breast cancer (without expression of estrogen receptors-ER, Progesterone-PR and HER-2 membrane protein). Although it is an important therapeutic target, until nowadays, there are no glutamine inhibitors approved for use in the clinic. Our group developed and performed a biochemical HTS assay using a 30,000 compounds library filtered to follow the five Lipinsky rule. In this work, we describe in the first chapter the evaluation of 11 hits compounds obtained in secondary cell assays in order to verify if they have selective action against TN breast tumors in contrast to non-TN tumors, benign tumor cells (cystic fibrosis) and non-tumorigenic immortalized breast epithelium. Among the evaluated compounds, we verified that the compounds C1 and C10 exhibited potency and tumor selectivity measured by cell growth inhibition. In addition, these compounds inhibited the consumption of glutamine in TN tumor cells MDA-MB-231 by 50% and decreased the percentage of nuclei labeled with Edu, indicating also its cytostatic action. However, both compounds did not present GLS-dependent antitumor action. Continuing the search for glutaminase inhibitors in the second chapter of this work, we approached the establishment of a new target cell-based screening methodology, which was used to screen two collections of natural compounds libraries. After screening validation and execution, it was possible obtain a total of 6 extracts/fractions with potential to be selective GLS inhibitors Mestrado Genética Animal e Evolução Mestra em Genética e Biologia Molecular CAPES