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Lorch, M. S. (2020). Producción de antígenos recombinantes y su empleo en métodos serológicos para la detección de infecciones flavivirales de importancia regional. (Tesis de doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina Los arbovirus son un grupo diverso de virus que se mantienen en la naturaleza a través de la transmisión entre hospedadores susceptibles, mediante ciertas especies de artrópodos hematófagos. Se han convertido en un importante problema de salud mundial en las últimas cuatro décadas, debido a que tienen la capacidad de infectar múltiples hospedadores y colonizar nuevos vectores y hospedadores vertebrados a través de mutaciones adaptativas, pudiendo además aumentar su virulencia y potencial epidémico. Dentro de los arbovirus más relevantes encontramos a los virus pertenecientes al género Flavivirus, un género de virus que forma parte de la familia Flaviviridae. Son virus envueltos que poseen una nucleocápside con simetría icosaedrica, y cuyo material genético reside en una única cadena de ARN de polaridad positiva de aproximadamente 11 kb de longitud. Estos virus son los causantes de numerosas enfermedades en animales y humanos generando graves problemas de salud pública alrededor del mundo, siendo los más conocidos los virus de la fiebre amarilla, dengue, Zika, West Nile y el virus encefalitis de Saint Louis que ha tenido relevancia en América. En base a este panorama, donde las enfermedades transmitidas por vectores constituyen una causa importante de muerte, enfermedad e inequidad en la salud, el progreso continuo en herramientas de vigilancia epidemiológica y en sistemas de diagnóstico son una contribución importante para la salud pública. De esta manera, el objetivo de este trabajo fue desarrollar herramientas moleculares que den lugar al desarrollo de ensayos de diagnóstico para flavivirus, basadas en la detección de la respuesta inmune en pacientes. En esta tesis de doctorado se realizó la producción en bacterias y caracterización inmunológica de distintos antígenos basados en las secuencias completas de la proteína NS1 de los flavivirus Dengue, Fiebre Amarilla, Zika, West Nile y encefalitis de Saint Luis. Adicionalmente se llevó a cabo el desarrollo de antígenos recombinantes con diseño racional, mediante una estrategia de predicción bioinformática de regiones de NS1 que presentan alta probabilidad teórica de formar epítopes lineales para células B. A fin de establecer la utilidad de los antígenos generados, se llevó a cabo la evaluación del desempeño diagnóstico en el formato de test de ELISA indirecto. Para ello se emplearon muestras de sueros humanos negativos y positivos para distintos flavivirus, obteniéndose resultados satisfactorios. Los valores de sensibilidad y especificidad determinados son comparables con los valores obtenidos en otros trabajos con ensayos de ELISA basados en proteínas o partículas virales enteras. Los resultados alcanzados en el presente trabajo de investigación son promisorios y sientan las bases para el diseño de nuevos ensayos de diagnóstico basados en los antígenos producidos.

Laurent, V. E. (2022). Detección prospectiva y sistemática de la enfermedad mínimamente diseminada en pacientes con retinoblastoma de alto riesgo mediante marcadores moleculares y la determinación de su valor pronóstico. (Tesis de doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina. El retinoblastoma es la neoplasia intraocular más común en la infancia. Si bien la sobrevida en la Argentina es mayor del 90%, la diseminación extraocular continúa siendo la causante fatal principal en el país y en los países en desarrollo. Una herramienta pronóstica que permitiría determinar la posibilidad de recidivar en forma potencialmente más sensible y específica que la histología del globo ocular enucleado (el método usado en la actualidad), sería la evaluación de la enfermedad mínimamente diseminada (EMD) en los pacientes enucleados de alto riesgo. El objetivo final fue poder evaluar la posibilidad de identificar tempranamente a los pacientes en alto riesgo para poder administrarles una terapia más intensiva y dirigida al Sitema Nervioso Central (SNC) donde las recaídas son fatales. Para esto, la parte inicial del trabajo se basó en la búsqueda de biomarcadores para la EMD. Así, se estudió la detección del ARN mensajero (ARNm) de la GD2 sintasa como marcador de la EMD por retrotranscripción seguida de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y Nested-PCR (o anidada), a partir de muestras citológicamente negativas de líquido cefalorraquídeo (LCR) de 26 pacientes con retinoblastoma de alto riesgo. En este trabajo la médula ósea (MO) no fue evaluada, ya que este tejido presenta expresión del gangliósido GD2 y por lo tanto de su sintasa, por lo que se decidió buscar otro biomarcador más específico. De este modo, en la siguiente parte de este trabajo, se diseñó una metodología más específica que permitiera evaluar un biomarcador más sensible y específico. El biomarcador molecular seleccionado es específico de linaje y se corresponde con el factor de transcripción de conos y bastones con caja homeótica (CRX: por su nombre en inglés Cone-Rod Homeobox-containing gene) cuya expresión por las células de retinoblastoma primario y también por células diseminadas fue reportado por otros grupos por inmunohistoquímica y por el nuestro, por técnicas moleculares. Una vez seleccionado este biomarcador como el más sensible y específico, se realizó un estudio en pacientes con retinoblastoma metastático, estudiando la MO de los pacientes (n=17) con enfermedad metastásica al diagnóstico (n=9) o a la recaída (n=8) probada mediante biopsia, basada en RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR). El objetivo fue evaluar su utilización como herramienta para la optimización del pronóstico y evaluación de la respuesta al tratamiento mediante la detección de la EMD. En una etapa ulterior, se analizó el uso de CRX para detectar la EMD en muestras de MO y LCR de 96 pacientes prospectivamente estudiados (14 LCR se estudiaron con la GD2 sintasa) con retinoblastoma intraocular (no-metastásico) y factores de riesgo en la histopatología. El objetivo fue evaluar si la EMD era detectable en la enfermedad intraocular, detectar características clínicas o patológicas que predigan la EMD, y evaluar su impacto pronóstico en la sobrevida libre de enfermedad (SLE). Con los resultados obtenidos en la primera parte del trabajo se demostró que la presencia del ARNm de la GD2 sintasa y, por lo tanto de la EMD, está vinculada directamente al riesgo de recaída extraocular. Se sentaron las bases sobre el concepto de que la EMD está presente en el LCR de pacientes con retinoblastoma sin compromiso del SNC al diagnóstico y, especialmente, en aquellos quienes presentan compromiso masivo del nervio óptico y glaucoma; algunos de los cuales pueden salvarse con terapia intensiva, lo que justificaría un protocolo de toma de muestras más intensivo. En la segunda parte, se comprobó que el ARNm del gen CRX es un marcador novedoso en el retinoblastoma diseminado, que sirvió como herramienta no sólo para mejorar la identificación de células tumorales en sitios extraoculares sino que permitió dilucidar mecanismos de diseminación de este tumor ya que, la recaída en el LCR no estaría relacionada con la diseminación sistémica del retinoblastoma en vista de la rápida, completa y sostenida respuesta en MO metastásica luego de la quimioterapia de inducción. En todos los pacientes con metástasis secundaria, la recaída en el LCR ocurrió independientemente de los hallazgos en la MO, sugiriendo que el LCR sería como un sitio santuario. En la última sección, se logró identificar una población de pacientes con “muy alto riesgo” y factores de riesgo en la histopatología quienes presentaban la EMD y en quienes la SLE es significativamente menor a pesar de la terapia adyuvante intensiva. En este subgrupo, se encontró que cerca de un 10% de los pacientes que se presentan con enfermedad clínicamente localizada, tienen diseminación molecular, en especial aquellos que tienen invasión del nervio óptico incompletamente resecado y en los que se presentaron con glaucoma. Por último, se halló que los pacientes con retinoblastoma grupo E y glaucoma tienen un riesgo mayor de tener la EMD al diagnóstico y no deberían ser considerados para candidatos a la terapia conservativa. Retinoblastoma is the most common intraocular malignancy in childhood. While survival in Argentina is above 90%, extraocular dissemination still remains as the fatal leading cause both in this country and in developing ones. A prognostic tool that would determine in a potentially more sensitive and specific manner than the enucleated-eyeball histology (the method used at present) that a relapse may occur, would be the evaluation of the minimal disseminated disease (MDD) in enucleated patients at high risk. The final objective consisted of being able to evaluate the possibility of the early identification of those patients at high risk who might receive a more intensive and Central Nevous System (CNS)-directed chemotherapy, where relapses are typically more fatal. In this regard, the initial part of this work was addressed to the searching of biomarkers for the MDD. The detection of GD2 synthase mRNA as a marker of MDD by reverse transcription followed by polymerase chain reaction (RT-PCR) and Nested-PCR on cytologically negative samples of cerebrospinal fluid (CSF) of 26 patients with high-risk retinoblastoma, was studied. In this work the bone marrow (BM) was not evaluated, since ganglioside GD2 is expressed in this tissue as well as its synthase, reason that resulted in the search of a more specific marker. In the next part of this work, a more specific methodology intended to evaluate a more sensible and specific biomarker was designed. The selected molecular biomarker is a lineage-specific marker which corresponds with the transcription factor of the Cone-Rod homeobox-containing gene whose expression both in cells of primary retinoblastoma and also in disseminated cells was reported by other groups by immunohistochemistry, and ours by molecular techniques. Once this biomarker was selected as the most sensible and specific one, the next step was to study the detection of the CRX mRNA in the BM from those patients with metastatic retinoblastoma (n=17) who had metastatic disease at diagnosis (n=9) or at relapse (n=8), proven by biopsy, by means of a RT real time PCR (RT-qPCR) with the objective to use it as a tool for optimizing diagnosis and assessing treatment response by detecting the MDD. Subsequently, at a later stage of the study, t was analysed the use of CRX for MDD detection in MO and CSF samples of 96 patients (14 CSF were studied with GD2 synthase) with intraocular retinoblastoma (non-metastatic) and pathology risk factors. The aim was to assess whether the MDD was detectable in intraocular disease, to detect clinical or pathological characteristics that predict the MDD, and to evaluate their prognostic impact on disease-free survival (DFS). With the results obtained in the first part of the work it was demonstrated that the presence of GD2 synthase mRNA, and therefore of the MDD, is directly related to the risk of extraocular relapse. The foundations upon the concept of the MDD being present in the CSF of patients with retinoblastoma without CNS involvement at diagnosis were laid, especially in those who have massive involvement of the optic nerve and glaucoma; some of which can be saved with intensive therapy, supporting the need of more intensive protocols of sample collection. In the second part of this work, it was found that the mRNA of the CRX gene is a novel marker for disseminated retinoblastoma, which served as a tool not only to improve the identification of tumor cells at extraocular sites but also to elucidate the dissemination mechanisms of this tumor since CSF relapse would not be related with systemic dissemination of retinoblastoma in the light of the rapid, complete and sustained response of metastatic MO after induction chemotherapy. In all patients with secondary metastasis, relapse in CSF occurred regardless of what had happened in the MO, suggesting that the CSF would be a sanctuary site. In the last section, a sub-population of patients with "very high risk" and pathology risk factors who presented MDD and in whom the DFS is significantly lower despite intensive adjuvant therapy was identified. It was found that 10% of this sub-group of patients, who presents with clinically localized disease, actually already has molecular dissemination, especially those who had invasion of the optic nerve that was incompletely resected, and in those who presented with glaucoma. Finally, it was found that patients with retinoblastoma group E and glaucoma are at higher risk of having the MDD at diagnosis and should not be considered as candidates for conservative therapy.

Fil: Gonzalez, Mariana Selena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Medicina Experimental; Argentina. Fil: Gonzalez, Mariana Selena. Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires. Instituto de Medicina Experimental; Argentina. González, M. S. (2013). Diseño y desarrollo de estrategias de análisis molecular de importancia diagnóstica y pronóstica en neoplasias mieloproliferativas crónicas. (Tesis de doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina. Las neoplasias mieloproliferativas crónicas (NMPs) son un grupo heterogéneo de patologías hematológicas que se caracterizan por la proliferación de alguno de los linajes mieloides: eritroide, megacariocítico o granulocítico. Entre las neoplasias mieloproliferativas se encuentra la Leucemia Mieloide Crónica [LMC BCR- ABL1 (+)] y las neoplasias mieloproliferativas BCR-ABL1 negativas clásicas [NMPs BCR-ABL1 (-)] incluyendo: Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Esencial (TE) y Mielofibrosis Primaria (MP). En este trabajo de Tesis se analizó el perfil de expresión de los genes BCR-ABL1, BAX, BCL-XL, CAMKIIγ, KI-67, HSP70 y HSP90 en LMC con el objetivo de caracterizar el nivel de transcripción de los mismos y su asociación con resistencia al tratamiento con inhibidores de tirosina quinasa. La expresión de los genes mencionados se realizó a partir de muestras de leucocitos de sangre periférica de 101 pacientes con LMC en diferentes etapas de la enfermedad: Debut, Fase Crónica en Remisión (FC Rem), Fase Crónica No respondedora (FC No Resp), Fase Avanzada (FA) y en 20 individuos sanos. Los niveles de transcriptos BCR-ABL1/ABL1 correlacionan positivamente con las fases de la enfermedad. Se observó que los pacientes con LMC al diagnóstico, en FC No Resp y en FA presentaban un perfil de expresión génica característico. Observándose que la relación BAX/BCL-XL era menor mientras que la expresión de los genes CAMKIIγ, KI67, HSP70 y HSP90 era significativamente mayor al diagnóstico, en FC No Resp y en FA respecto de la FC Rem, indicando que el perfil de expresión de los genes mencionados se asociaría a respuesta al tratamiento y/o factores pronósticos. Cuando los pacientes en FC No Resp y en FA fueron reagrupados en función de la presencia de mutaciones en el dominio quinasa del gen ABL1, el estudio del perfil transcripcional demostró un aumento de la expresión de los genes CAMKIIγ y HSP70 y una disminución en el nivel de HSP90 en el grupo de pacientes mutados (MT) respecto del grupo no mutado (WT), mientras que BCR-ABL1, KI67 y la relación BAX/BCL-XL no presentaron diferencias. La expresión diferencial de los genes: CAMKIIγ, HSP70 y HSP90 permitió diseñar un score según la fórmula [CAMKIIγ+HSP70-HSP90]. Se determinó un punto óptimo de corte (cut-off: 1,1) empleando curvas ROC (receiver operating characteristic). Valores mayores a 1,1 tienen 6 veces más probabilidades (OR (IC95%)) de presentar mutaciones que valores menores (p

To inform case definition for neck/shoulder pain in epidemiological research, we compared levels of disability, patterns of association, and prognosis for pain that was limited to the neck or shoulders (LNSP) and more generalised musculoskeletal pain that involved the neck or shoulder(s) (GPNS). Baseline data on musculoskeletal pain, disability, and potential correlates were collected by questionnaire from 12,195 workers in 47 occupational groups (mostly office workers, nurses, and manual workers) in 18 countries (response rate 5 70%). Continuing pain after a mean interval of 14 months was ascertained through a follow-up questionnaire in 9150 workers from 45 occupational groups. Associations with personal and occupational factors were assessed by Poisson regression and summarised by prevalence rate ratios (PRRs). The 1-month prevalence of GPNS at baseline was much greater than that of LNSP (35.1% vs 5.6%), and it tended to be more troublesome and disabling. Unlike LNSP, the prevalence of GPNS increased with age. Moreover, it showed significantly stronger associations with somatising tendency (PRR 1.6 vs 1.3) and poor mental health (PRR 1.3 vs 1.1); greater variation between the occupational groups studied (prevalence ranging from 0% to 67.6%) that correlated poorly with the variation in LNSP; and was more persistent at follow-up (72.1% vs 61.7%). Our findings highlight important epidemiological distinctions between subcategories of neck/shoulder pain. In future epidemiological research that bases case definitions on symptoms, it would be useful to distinguish pain that is localised to the neck or shoulder from more generalised pain that happens to involve the neck/ shoulder region. Para informar sobre la definición de caso para el dolor de cuello/hombro en la investigación epidemiológica, se compararon los niveles de discapacidad, los patrones de asociación y el pronóstico para el dolor que se limitaba al cuello o los hombros (LNSP) y el dolor musculoesquelético más generalizado que afectaba al cuello o los hombros (GPNS). Se recopilaron datos de referencia sobre el dolor musculoesquelético, la discapacidad y los posibles correlatos mediante un cuestionario de 12.195 trabajadores de 47 grupos profesionales (en su mayoría oficinistas, enfermeros y trabajadores manuales) de 18 países (tasa de respuesta del 5%). Se determinó la persistencia del dolor después de un intervalo medio de 14 meses mediante un cuestionario de seguimiento en 9.150 trabajadores de 45 grupos profesionales. Las asociaciones con los factores personales y profesionales se evaluaron mediante una regresión de Poisson y se resumieron en ratios de prevalencia (PRR). La prevalencia a un mes del GPNS en la línea de base fue mucho mayor que la del LNSP (35,1% frente a 5,6%), y tendía a ser más molesta e incapacitante. A diferencia del PSNL, la prevalencia del GPNS aumentó con la edad. Además, mostró asociaciones significativamente más fuertes con la tendencia somatizante (PRR 1,6 frente a 1,3) y la mala salud mental (PRR 1,3 frente a 1,1); una mayor variación entre los grupos ocupacionales estudiados (la prevalencia oscilaba entre el 0% y el 67,6%) que se correlacionaba mal con la variación del LNSP; y era más persistente en el seguimiento (72,1% frente al 61,7%). Nuestros hallazgos ponen de manifiesto importantes distinciones epidemiológicas entre las subcategorías de dolor de cuello/hombro. En futuras investigaciones epidemiológicas que basen las definiciones de los casos en los síntomas, sería útil distinguir el dolor localizado en el cuello o el hombro del dolor más generalizado que afecta a la región del cuello/hombro. Universidad Nacional, Costa Rica Instituto Regional de Estudios en Sustancias Tóxicas