Search

During mitosis, phosphorylation and dephosphorylation of lamins triggers the nuclear envelope disassembly/assembly. However, it hasn't been known whether lamin proteins undergo any modification other than phosphorylation during the cell cycle. Glycosylation of lamin proteins is one of the less studied post-translational modification. Glycosylation and phosphorylation compete for the same positions and interplay between two modifications generate a post-translational code in the cell. Based on this, we hypothesized that glycosylation of lamin A/C protein may be important in the regulation of the structural organization of the nuclear lamina during interphase and mitosis. We analysed the glycan units of lamin A/C protein in lung carcinoma cells synchronized at G2/M and S phases via CapLC-ESI-MS/MS. Besides, the outermost glycan units were determined using lectin blotting and gold-conjugated antibody and lectin staining. TEM studies also allowed us to observe the localization of glycosylated lamin A/C protein. With this study, we determined that lamin A/C protein shows O-glycosylation at G2/M and S phases of the cell cycle. In addition to O-GlcNAcylation and O-GalNAcylation, lamin A/C is found to be contain Gal, Fuc, Man, and Sia sugars at G2/M and S phases for the first time. Having found the glycan units of the lamin A/C protein suggests that glycosylation might have a role in the nuclear organization during the cell cycle., Ege University Scientific Research Projects Coordination [17-FEN-031], This work was supported by the Ege University Scientific Research Projects Coordination (grant number 17-FEN-031).

…

Sialic acid is a terminal sugar of carbohydrate chains that participates in numerous biological events. Recent studies have explored the mechanism of carbohydrate-mediated fertilisation to understand the biochemistry of fertilisation, although the type and quantity of sialic acid and the role of sialic acid during fertilisation remain unknown. Echinoderm fertilisation in particular has been studied extensively, yet our understanding of the mechanisms of carbohydrate-mediated fertilisation and the role of sialic acid remains incomplete. In this study, we characterised the sialic acid types in the egg jelly coat of the sea urchin, Paracentrotus lividus, using the sensitive analytical system capillary liquid chromatography electro-spray ionisation tandem mass spectrometry (capLC-ESI-MS/MS). First, we isolated the egg jelly coat and released its sialic acid using acid treatment. These sialic acids were derivatised with 1,2-diamino-4,5-methylenediaoxy-benzene dihydrochloride (DMB) and injected into the capLC-ESI-MS/MS system. When compared with standards, we identified twelve different types of sialic acid according to their retention times and collision-induced dissociation fragments. The mass spectral data revealed that Neu5Gc, Neu5Ac, Neu5GcS, and Neu5Gc9Ac were the predominant types of sialic acid in the sea urchin jelly coat, with Neu5Gc being the most abundant. Other types of sialic acid detected included Neu5AcS, Neu5Gc7,9Ac(2), Neu5,9Ac(2), Neu5Gc8Ac, Neu5Gc7Ac, Neu5,7Ac(2), Neu5Gc8,9Ac(2), and Neu5,8Ac(2). The types and quantities of sialic acid that we detected in the egg jelly coat will aid in the discovery of new sialic acid-specific receptors on the sperm membrane. Mol. Reprod. Dev. 82: 115-122, 2015. (c) 2014 Wiley Periodicals, Inc.

The free circulating coelomocytes in the coelomic cavity of echinoderms are considered to be immune effectors by phagocytosis, encapsulation, cytotoxicity, and by the production of antimicrobial agents. Although echinoderms (especially sea urchin embryo) have been used as a model organisms in biology, no uniform criteria exist for classification of coelomocytes in echinoderms, and few studies have reported about the biological functions of their coelomocytes. Hence, we study the coelomocytes in the echinoid sea urchin, Paracentrotus lividus, and describe their morphological and ultrastructural features using light and transmission electron microscopes. We classify the coelomocytes of P. lividus into red spherule and colorless spherule cells, small cells, vibratile cells, and phagocytic cells; petaloid and filopodial cells. To our knowledge, this is the first report describing ultrastructural details of the coelomocytes of P. lividus. J. Morphol. 276:583-588, 2015. (c) 2015 Wiley Periodicals, Inc.

WOS: 000345431100007, Glycan parts of glycoconjugates on the surfaces of cells regulate many kinds of interactions between the cells and their immediate environments. Alterations in glycosylation on the cancer-associated glycoproteins are responsible for changes in their molecular interactions and biological functions. Glycosylation changes occur in the core and/or at the nonreducing end of the oligosaccharide chains of N-glycans. In this review, we focus on the branching of the common core structure of N-glycans, the responsible enzyme, and the extensions of some of the branches causing size increases on the surface of tumor cells. Abnormal branching, elongation of the branches, and increasing size of the common core of N-glycans are the typical features of these changes and are related with malignant transformations. Seven N-acetylglucosaminyltransferases (GnTs) (GnT-I, GnT-II, GnT-III, GnT-IV, GnT-V, GnT-VI, and GnT-IX) and a1,6-fucosyltransferase (FUT8) initiate the new branches on the core. GnT-IV, GnT-V, and GnT-IX initiate the branches available for poly-LacNAc extensions, which are responsible for tumor progression and metastasis. GnT-III prevents the catalytic activity of GnT-II, GnT-IV, GnT-V, and FUT8 to form branching and elongation of the branches. The contributions of GnT-III and the other enzymes to the cancer progression are in conflict with each other. While GnT-III prevents cancer, the others increase metastasis. The function of FUT8 is related to signal transduction and its activity is higher in tumor tissue than in healthy tissue. The impact of glycosylation changes on some of the cancer-associated proteins (growth factor receptors, adhesion and signal molecules, CD147, TIMP-1, and matriptase) is also summarized.

Fine structure of synaptonemal complexes (SCs) was investigated in primary spermatocytes of Galleria mellonella testes. In longitudinal sections, the SCs were discriminated as linear or curved rods in the prophase nuclei of the first meiotic division. These rods were attached to the inner surface of the nuclear envelope by their one end. Two electron dense axial or lateral elements were clearly distinguished in fine structure of the SCs. A central element was formed by parallel bands with a lesser electron density than the lateral elements. The diameters of the central and the lateral elements were 37 nm and 48.7 nm, respectively. The central element is embedded within the electron lucent central region. Fine transverse filaments crossing the central region between the lateral and central elements were seen. The width of this area was measured 40.4 nm. Taken together, total diameter of the SCs in the testes of G.mellonella reaches to 218 nm.Key words: Synaptonemal complex, Testis, Galleria mellonella, Insect, Electron microscopy.

ÖZET GALLERİA MELLONELLA (LEPIDOPTERA)'NIN GELİŞEN TESTİSLERİNDE TESTIS DUVARI, FOLİKÜLLER, KAN-GERM HÜCRE BARtYERLERİNİN İNCE YAPISI VE GLÎKOKONJUGATLARIN HİSTOKİMYASAL, SİTOKİMYASAL, BİYOKİMYASAL YÖNTEMLERLE BELİRLENMESİ DEVECİ, Remziye Doktora Tezi, Biyoloji Bölümü Tez Yöneticisi: Prof.Dr.Sabire KARAÇALI Temmuz 1997, 133 sayfa Çalışma materyali, Galleria mellonella'mn altı farklı evresindeki (sondan bir önceki ve son evre larva, prepupa, genç ve yaşlı pupa, ergin) teslislerdir. Testislerin gelişimleri ve buna bağlı olarak glikozaminoglikanlarla (GAGlar) sialik asidin (SA) varlıkları, oransal değişimleri ve kan-germ hücre bariyerleri ile ilişkileri araştırılmıştır. Bu amaçla, testislerin genel yapısı, in vivo ve in vitro ortamda stereo mikroskop ile; histolojik yapısı, hematoksilin-eozin ile boyanmış parafin kesitler ve toluidin mavisi ile boyanmış epon kesitlerle; sitolojik yapısı ise uranil asetat-kurşun sitrat ile boyanmış ince epon kesitlerin elektron mikroskobu incelemeleri ile gösterilmiştir. GAGlar, alcian blue + değişik yoğunluklardaki MgCİ2 (pH 5.8) ile histokimyasal, ruthenium red ile sitokimyasal olarak gösterilmiştir. SA nın varlığı ve oranı, nöraminidaz sindirimi ile sitokimyasal, spektrofotometre ile biyokimyasal olarak belirlenmiştir. Kan-germ hücre bariyerleri için horseradish peroksidaz kullanılmıştır. Larval dönemde ayrı olan testisler prepupada birleşirler. İki tabakalı testis duvarının dış ve iç yüzeyleri birer bazal tabaka ile sarılıdır. Larva ve prepupada kalın olan dış bazal tabaka genç pupada yer yer incelir, yaşlı pupada ise büyük bölümü testis duvarından ayrılır. Dış duvarın kalınlığı larvadan ergine doğru kalından-inceye değişir. İç bazal tabakayla yüzleşen hücrelerin granüllü endoplazmik retikulum içermeleri ve bu hücrelerdeki zar katlanmaları arasında, genişlemiş hücreler arası sahalardaki materyalin yapısı iç bazal tabaka materyaline benzer. Prepupada çift iç bazal tabaka görülür.Testis duvarında, GAGlann gösterildiği alcian blue ile, bazal tabakalar en koyu boyanır. Sülfatlanmamış GAGlar (Hyaluronik asit) sülfatlanmış olanlardan özellikle prepupa, genç ve yaşlı pupa iç duvarında daha boldur. Erginde ise azalır. Foliküllerdeki boyanmanın kaynağı da temelde sülfatlanmamış GAGlardır ve en fazla, henüz farklılaşmamış genç germ hücrelerinin bol bulunduğu larvada görülür. Ruthenium red, tüm evrelerde testis duvarının dış yüzeyi ile pozitif reaksiyon verir. Bu reaksiyonun SA ile ilişkisi, nöraminidaz uygulamasından sonra görülen boyanmadaki azalma ile onaya konmuştur. Bu sitokimyasal belirleme ile birlikte total testisteki SAnın spektrofotometrik sonuçlarına göre, SA larvada en fazla (0.762257 mg/g), prepupada ise en azdır (0.201289 mg/g). Yaşlı pupada görülen artış (0.382806 mg/g) larvadaki değerin çok altındadır. Erginde tekrar azalır (0.281435 mg/g). Testis duvarıyla sınırlanan foliküllerdeki folikül sıvısına iç bazal tabaka yoluyla materyal iletimi olur. Yaşlı pupada ayrıca, kist kılıf hücreleri de bu sıvıya katkıda bulunur. Kist sıvısı, kılıf hücrelerinin içerikleri ile oluşturulur veya beslenir. Primer spermatositlerde `sinaptonemal kompleksler`, spermatidlerde `nebenkern mitokondriyumlar` karakteristiktir. Testis duvarında bulunmayan kan-germ hücre bariyerleri, kistlerde yerleşir. Bariyeri oluşturan yapılar, bölmeli (septat) dezmozomlardır. Larva (ayrı ve aynı kistlerin kılıf hücreleri arasında) ve yaşlı pupada (kılıf-germ ve germ-germ hücreleri arasında) en boldur. Sperm kanallarında da bariyer şekillenmesi vardır. Anahtar kelimeler: Testis, kan-testis bariyeri, horseradish peroksidaz, alcian blue, glikozaminoglikan, ruthenium red, sialik asit, nöraminidaz, elektron mikroskobu, spektrofotometre, Galleria mellonella, Lepidoptera. ABSTRACT HNE STRUCTURE OF TESTIS WALL, FOLLICLES AND BLOOD-GERM CELL BARRIERS IN THE DEVELOPING TESTES OF GALLERIA MELLONELLA (LEPIDOPTERA) AND THE DETERMINATION OF GLYCOCONJUGATES BY HISTOCHEMICAL, CYTOCHEMICAL AND BIOCHEMICAL METHODS DEVECLRemziye Ph.D. Thesis, Dept. of Biology Supervisor: Prof.Dr.Sabire KARAÇALI July, 1997, 133 p. Research materials are the testes of six different stages of Galleria mellonella (penultimate and last larval, prepupa, young and old pupae, and adult). Development of the testes and presence of glycosaminoglycans (GAGs) and sialic acid (SA); relative changes and relationship with blood-germ barriers of GAGs and SA were investigated. For this purpose, general structure of the testes in vivo and in vitro conditions, using stereo microscope; histological structure, using paraffin and epon sections stained with heamotoxylen-eosin and toluidin blue respectively and the cytological structure of this material with the electron microscopic observations, thin sections stained with uranyl acetate-lead citrate, were demonstrated. GAGs were determined both histochemically and cytochemically using alcian blue (AB) plus different concentrations of MgCİ2 (pH 5.8) and ruthenium red (RR) respectively. The presence of SA and its ratio were determined cytochemically, by the neuraminidase digestion and biochemically by spectrophotometry. For the blood-germ cell barriers, horseradish peroxidase were applied. The testes which were apart in larval stage combined in the prepupa. Each of the inner and outer surfaces of two layered testis wall were enveloped with basal membranes. Outer basal membrane which is thick in larvae and prepupa partially becomes thin in the young pupa, while in the old pupa, larger part of this membrane is separated from testis wall. Thickness of the outer wall differs from the larvae to adult by thick to thin. The cells, facing the inner basal membrane and having granular endoplasmic reticulum, the structure of expanded extracellular area materials in between membrane folds on these cells are similar to the inner basal membrane materials. In prepupa, double inner basal membranes are observed.vıı Using the alcian blue with which the GAGs were shown at testis wall, basal membranes are stained in darker contrast. In young and old pupa inner walls, nonsulfated GAGs (Hyaluronic acid) are more abundant than sulfated ones, while they decreased in adult. In the follicles, source of the staining is basically non sulfated GAGs, and most frequently seen in the larvae which abundantly contains yet indifferentiated young germ cells. During all of the periods, ruthenium red gives positive reaction with outer surfaces of the testis wall. The relationship of the reaction with SA elucidated by decreased staining observed after the neuraminidase treatment. With this cytochemical determination, SA is the most frequent in larvae (0.762257 mg/g) while most decreased in prepupa (0.201289 mg/g), (according to spectrophotometric results of SA in total testis). The increase in old pupa (0.382806 mg/g) is more below than in larva. In the adult, it decreased again (0.281435 mg/g). The material transfer occurs to follicle fluid which is bordered by testis wall through the inner basal membrane. In addition, in the old pupa, cyst envelope cells also aid to this fluid. Cyst fluid is formed or fed by the contents of envelope cells. In the primer spermatocysts, synaptonemal complexes and `nebenkern mitochondrium` in spermatids, are typical. Blood-germ cell barriers which are not found in the testis wall occupy the cysts. The structures which form the barrier are septate desmosomes. They are most frequent in larvae (between the envelope cells of the some and different cysts) and old pupa (between envelope-germ cells and germ cells-germ cells). There also a barrier formation in the sperm channels. Key words: Testis, blood-testis barriers, horseradish peroxidase, glycosaminoglycans, alcian blue, ruthenium red, sialic acid, neuraminidase, electron microscope, spectrophotometry, Galleria mellonella, Lepidoptera. 450

T Taze, sentetik besinle beslenenler ile sentetik besinlerine ABA (Absisik asit) nın farklı iki dozu (5 ve 50 ppm'lik ABA) karıştırılarak beslenen sol iter ve gregar fazlardaki Locusta migratoria cinerascens (Fab.) dişilerinin pars interserebralis nörosekresyon hücreleri ışık mikroskobuyla incelenmiştir. A,C, ve D-tip hücrelere ait hücre ve nukleus çaplarının analizi sonucunda; A-tip hücreler tüm uygulama larda sol iter fazda daha iri bulunmuştur. ABA 5 daha etkilidir. ABSTRACT The pars intercerebralis neurosecretory cells of Locusta migratoria cinerascens (Fab.) females in solitary and gregarious phases, which were fed with fresh, and synthetic diet with ABA mixture of two different doses (5 and 50 ppm ABA), were investigated on light micros cope. As a result of the analysis of cellular and nuclear diameters of the A,C and D type cells, A type cells were found larger in solitary phase in all treatments. ABA 5 is more effective. ABSTRAKT Taze, sentetik besinle beslenenler ile sentetik besinlerine ABA (Absisik asit) nın farklı iki dozu (5 ve 50 ppm'lik ABA) karıştırılarak beslenen sol iter ve gregar fazlardaki Locusta migratoria cinerascens (Fab.) dişilerinin pars interserebralis nörosekresyon hücreleri ışık mikroskobuyla incelenmiştir. A,C, ve D-tip hücrelere ait hücre ve nukleus çaplarının analizi sonucunda; A-tip hücreler tüm uygulama larda sol iter fazda daha iri bulunmuştur. ABA 5 daha etkilidir. ABSTRACT The pars intercerebralis neurosecretory cells of Locusta migratoria cinerascens (Fab.) females in solitary and gregarious phases, which were fed with fresh, and synthetic diet with ABA mixture of two different doses (5 and 50 ppm ABA), were investigated on light micros cope. As a result of the analysis of cellular and nuclear diameters of the A,C and D type cells, A type cells were found larger in solitary phase in all treatments. ABA 5 is more effective. 104

Berrak hücreli renal hücre karsinomu (ccRCC), proksimal kıvrımlı bir tübülde meydana gelen ve vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü sinyal yolağını (VEGFR) aşırı eksprese eden bir kanserdir. ccRCC'nin başlamasının ana nedenlerinden biri, VHL geninin ekspresyonunu engelleyen mutasyonlardır. VHL mutasyonları hücrelerin, proliferatif gen ekspresyonunu sağlayan ve kanserin sonraki aşamalarında anjiyogenez ve metastazı baŞlatan VEGF'in ekspresyonunu arttırıp VEGFR sinyal yolağının aktivasyonuna neden olur. Ancak; VHL geninin aŞağı regülasyonunu çevreleyen epigenetik ve genetik faktörler, ccRCC'ye neden olmak için yeterli değildir ve kanser başlangıcında diğer faktörlerin de rol oynadığı düşünülmektedir. Önceki çalışmalar, sialiltransferaz ST6Gal1 yoluyla α2-6 sialilasyonunun VEGFR dimerizasyonunu engellemedeki ve VEGFR fosforilasyonunu etkili bir şekilde inhibe etmedeki rolünü tanımlamıştır. Bu araştırmada, ccRCC'de ST6Gal1'in ekspresyon seviyeleri ve ST6Gal1 ile VEGFR sinyal yolağı aktivasyonu arasındaki korelasyon incelenmiştir. ccRCC için dijital gen ekspresyonu verileri, TCGA veri tabanı aracılığıyla elde edilmiştir. Sağlıklı ve primer tümör örnekleri arasında, diferansiyel ifade analizi ve ağırlıklı gen korelasyon ağı analizi gibi hesaplamalı karşılaştırmalar, R programlama dili kullanılarak in silico bir şekilde gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın sonuçları bize ST6Gal1 ekspresyonunun, ccRCC'de normal hücrelere kıyasla daha düşük olduğunu göstermiştir. VHL aşağı regülasyonu ile birlikte ST6Gal1 ekspresyonunun azlığı, ccRCC'de kanser başlamasının arkasındaki neden olabilir. Buna ek olarak, N-glikozilasyon ile ilgili birçok genin ekspresyonlarının azaldığı gözlemlenmiştir. Bu sonuçlar, glikozilasyon ve sialilasyon bağlamında VEGFR modifikasyonlarının ccRCC'nin başlangıcına ve ilerlemesine katkıda bulunabileceğini göstermiştir., Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is a vascular endothelial growth factor receptor signalling pathway (VEGFR) overexpressing cancer that occurs in a proximal convoluted tubule. One of the main causes of ccRCC initiation is the mutations in VHL gene that causes its downregulation. VHL mutations cause cells to express VEGF to activate VEGFR signalling, which provides proliferative signalling and initiates angiogenesis and metastasis in later stages of cancer. However; epigenetic and genetic factors surrounding the downregulation of VHL gene is not enough to cause ccRCC and other factors may be involved in cancer initiation. Previous studies have identified the role of α2-6 sialylation, via sialyltransferase ST6Gal1, in hindering VEGFR dimerization and effectively inhibiting VEGFR phosphorylation. In this research, the expression levels of ST6Gal1, and the correlations between ST6Gal1 and VEGFR signalling pathway activation in ccRCC have been studied. The expression data for ccRCC was acquired via TCGA database and the computational comparisons, such as differential expression analysis and weighted gene correlation network analysis, between healthy and primary tumour samples were performed in silico using primarily R programming language. The results of the study have shown us that, ST6Gal1 is under expressed in ccRCC. Lack of ST6Gal1 expression, combined with VHL downregulation, may be the reason behind cancer initiation in ccRCC. In addition to this, many genes related with N-glycosylation have been found to be downregulated. These results lead us to believe that VEGFR modifications in the context of glycosylation and sialylation may be contributing ccRCC initiation and progression.

Kanser günümüzde en yaygın ve ölümcül hastalıkların başında gelir. Karaciğer kanseri, en sık görülen altıncı kanser türüdür ve diğer kanserlere kıyasla ölüm oranının çok yüksek olması nedeniyle tedavi edilebilmesi ya da başlangıç aşamasında hastalığının önüne geçilmesi adına prognoz hedeflerininin bulunması çok büyük önem taşımaktadır. Sialik asitlerin anormal ifadesi tüm kanserlerde olduğu gibi karaciğer kanserlerinde de görülür. Anormal sialilasyonun nedenleri arasında sialiltransferazların ekspresyonundaki artış bulunmaktadır. Bu nedenle bu tez çalışmasında, karaciğer kanserlerinden hepatoselüler karsinom tercih edilmiş ve sialik asit biyosentez yolağında rol alan, fosforile sialik asit formları oluşturan NANS ve sialik asitlerin, sitidin-monofosfat diestere aktivasyonunu katalize eden CMAS genleri ile glikanlara sialik asit eklenmesinden sorumlu sialiltransferazlar arasındaki korelasyonu araştırmak ve ıslak laboratuvar çalışması için hedef molekülleri in silico yöntemlerle belirlemek amaçlanmıştır. Bunun için, kanser Genom Atlası’ndan (TCGA) sağlanan ekspresyon verileri (50 normal doku, 371 Karaciğer Hepatoselüler Karsinomu primer tümör örneği) ve klinik bilgiler kullanılmıştır. Ekspresyon seviyeleri farklılık gösteren genleri bulmak için Diferansiyel Ekspresyon Analizi ve sonrasında bu genlerin ortak olarak paylaştıkları yolakları tespit etmek adına GSE analizi yapılmıştır. Prognostik genleri belirlemek için sağkalım analizi yapılmış ve son olarak da yüksek korelasyonlu genleri bulmak için ağırlıklı korelasyon ağ analizi (WGCNA)’den yararlanılmıştır. Biyoinformatik analizler sonucunda, sialik asit biyosentez yolağında yer alan NANS geni ile sialiltransferaz gen ailesi üyelerinden ST6Gal1 (R= -0.33, p=7.1e-12), ST8Sia6 (R= -0.32, p=1.4e-11) genleri arasında negatif, ST6GalNAc4 (R=0.51, p, In today’s world, cancer is one of the most prevalent and lethal diseases. In cancer treatment, early prognosis and response are crucial for the successful recovery of the patients. Thus, the recent researches have focused on identifying new prognosis targets for the early diagnosis of cancer. Liver Hepatocellular Carcinoma (LIHC) is the sixth most common type of cancer. Due to its lethality compared to other types of cancers, early diagnosis of LIHC carry more weight for its successful treatment. In liver carcinomas, as well as in other types of cancers, hypersialylation, the addition of sialic acids to cell surface glycans by sialyltransferases, is prevalently observed. It was suspected that the genes involved in sialic acid biosynthesis, with the differential expression of sialyltransferases, may be involved in cancer progression. Therefore in this study; correlations between the expressions of NANS gene, which is responsible for creating phosphorylated sialic acid forms, and CMAS gene, which catalyzes the activation of sialic acids into cytidine-monophosphate diester, and the various sialyltransferases have been analyzed in silico, in order to understand their role in the progression of liver hepatocellular carcinoma. In order to be used in silico analyses, digital gene expression data of 50 normal and 371 Liver Hepatocellular Carcinoma tissue samples, as well as patients’ clinical data were acquired via The Cancer Genome Atlas (TCGA). To identify the differentially expressed genes, differential expression analysis was performed on the digital gene expression data. Identified differentially expressed genes were used in Gene Set Enrichment Analysis to uncover the pathways that were activated or suppressed. Expression data, combined with the clinical data, was also used in survival analyses for the identification of prognostic genes. Finally, Weighted Gene Correlation Network Analysis (WGCNA) was performed to find the highly correlated genes. Results of the in silico analyses show that, NANS gene is negatively correlated with sialyltransferases ST6Gal1 (R= -0.33, p=7.1e-12) and ST8Sia6 (R= -0.32, p=1.4e-11), while being positively correlated with ST6GalNAc4 (R=0.51, p

Reelin, nöral gelişmede çok önem taşıyan iyi korunmuş bir ekstraselüler glikoproteindir. Reelin proteinindeki bozukluklar ve RELN geninde meydana gelen mutasyonlar sonucu oluşan nöral hastalıklara ilişkin birçok çalışma yapılmıştır. Ancak, bu hastalıklarda Reelin'in yapısında bulunan glikanların olası rolü hakkında herhangi bir bilgi bulunmadığı gibi, Reelin'in yapısında yer alan glikanlar hakkındaki bilgiler de çok sınırlıdır. Glikoproteinlerin yapısında yer alan farklı glikan birimleri proteinlerin mikroçevresini değiştirerek görevlerini kontrol edebilirler. Böylece, hücrenin neredeyse tüm işlevlerinde doğrudan veya dolaylı olarak görev alırlar. Aynı aminoasit sıralarına sahip iki proteindeki glikozilasyon değişiklikleri proteinin işlevini doğrudan değiştirebildiği için, Reelin glikoproteininin glikan zincirlerinin de molekülün işlevi üzerinde etkili olması yüksek bir olasılıktır. Bu nedenle bu tez çalışmasında; SH-SY5Y nöroblastoma hücre hattından Reelin glikoproteinini ve önemli fragmanlarını izole etmek ve bu izolatların uç glikan profillerini lektin blotlama ile, bu glikanların yapı (monosakkarit) analizlerini ise CapLC-ESI-MS/MS ile belirlemek amaçlanmıştır. Bu amaçla, SH-SY5Y nöroblastoma hücre hattı kullanılmıştır. Hücreler uygun koşullar altında kültüre edikten sonra total ve sitoplazmik protein ekstraksiyonları yapılmıştır. Western Blotlama ile hangi bandın/bantların Reelin proteinine ait olduğu belirlenmiştir. Bu bantların taşıdığı uç glikan birimlerini saptamak için SNA, MAA, GNA, PNA ve DSA lektinleri kullanılarak lektin blotlama yapılmıştır. Hücre hattından immün çöktürme tekniği ile, Reelin glikoproteini izole edilmiştir. İzole edilen Reelin fragmanının monosakkarit analizi, CapLC-ESI-MS/MS sistemi ile gerçekleştirilmiştir. SH-SY5Y nöroblastoma hücre hattının total protein profili SDS-PAGE ile üç farklı lizis tampon (Ripa, NucBuster, IP-lysis) kullanılarak gösterilmiş, her üçünde de çok yakın sonuçlar elde edilmiştir. Reelin, 400, 310, 250 ve 85 kDa ağırlıklarında olmak üzere dört fragman şeklinde elde edilmiştir. Reelin glikoprotein fragmanlarında uç glikan olarak, α2,6 ve α2,3 bağlı sialik asitler, β-Galaktoz, α-Mannoz, β-GlcNAc saptanmıştır. Bant alan yoğunluğu bakımından en yüksek değer 400 kDa Reelin fragmanındaki α2,3 bağlı sialik asit bandında, 601 birim olarak bulunmuştur. Dört Reelin fragmanındaki toplam bant alan değerleri fazladan aza doğru sırasıyla α2,3 bağlı sialik asit (1224 birim), β-Galaktoz (1165 birim), α2,6 bağlı sialik asit (764 birim), β-GlcNAc (672 birim) ve α-Mannoz (205 birim) şeklindedir. Reelin glikoproteininin saflaştırılması transfeksiyon yapılmamış hücrelerden immün çöktürme tekniği ile gerçekleştirilmiş ve 250 kDa'luk Reelin fragmanı saf olarak izole edilmiştir. Bu izolatın monosakkarit analizi sonucu, miktarları fazladan aza doğru sırasıyla; N-asetilgalaktozamin, N-asetilglukozamin, galaktoz, glukoz ve mannoz olarak belirlenmiştir. Sonuç olarak, pek çok hastalık, glikokonjugatlardaki glikozilasyon değişmeleriyle ve/veya glikanların tanınmasıyla ilgili olarak ortaya çıkar. Reelin'in bir glikoprotein olduğunun bilinmesine karşın, glikan profiline ilişkin literatür bilgisi çok sınırlıdır. LC-MS/MS gibi yüksek analitik tekniklerle Reelin glikan analizleri, ilk kez gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, Reelin üretimi için transfeksiyon sistemi kullanılmadan doğal formda saflaştırma yapılması, olası glikan değişimlerini engellemesi açısından önemlidir ve literatürde rastlanmamıştır. Belirlediğimiz Reelin fragmanlarından 85 kDa'luk fragman da ilk kez ifade edilmiştir. Yüksek miktarda aminli glikan birimlerinin (GlcNAc ve GalNAc) belirlenmesi, Reelin üzerinde N-glikanların yanı sıra O-glikanların da önemli bir yerinin olabileceğini göstermektedir. Bu sonuçların ve devamında yapılacak çalışmaların, nöropsikiyatrik hastalıkların mekanizmasının daha detaylı anlaşılmasına ve glikobiyoloji bakış açısıyla bu hastalıkların teşhis ve tedavisi için yapılan araştırmalara katkı sağlaması beklenmektedir., Reelin is a highly conserved extracellular glycoprotein that have an importance in neural development. There is many research related with neural disease originate from dysfunction of Reelin protein and mutation of RELN gene. However, the information about the glycans in the structure of reelin is very limited as well as no information about the possible roles of glycans in the disease. Different units of glycan in the structure of glycoproteins can control their function by altering the microenvironment of proteins. Thus, they act to function directly or indirectly in almost all functions of the cell. It is highly probable that the glycan chains of the Reelin glycoprotein also have an effect on its function since the glycosylation changes in the two proteins with the same amino acid sequences can directly alter the protein's function. In this thesis, it is aim to isolate of the Reelin glycoprotein and its important fragments from SH-SY5Y neuroblastoma cell line and to characterize of glycans profiles of these isolates by lectin blotting and structure (monosaccharide) analysis of these by CapLC-ESI-MS/MS. For this aim, SH-SY5Y neuroblastoma cell line was used. Total and cytoplasmic protein extractions were carried out after cells were grown in appropriate conditions. Band / bands belong to Reelin were determined using Western blotting. Lectin blotting was carried out using SNA, MAA, GNA, PNA and DSA lectins to determine the terminal units of glycan on the Reelin bands. Reelin glycoprotein was isolated from the cell line using an immunoprecipitation technique. Monosaccharide analysis of the isolated Reelin fragment was performed using the CapLC-ESI-MS/MS system. The total protein profile of the SH-SY5Y neuroblastoma cell line was demonstrated by SDS-PAGE using three different lysis buffers (Ripa, NucBuster, IP-lysis) and very similar results were obtained in all three cases. Reelin was obtained in the form of four fragments with weight of 400, 310, 250 and 85 kDa. α2,3 and α2,6 bound sialic acids, β-Galactose, α-Mannose, β-GlcNAc were determined in the fragments of Reelin glycoprotein as terminal unit of glycan. The highest value in terms of band area density was found to be 601 units in the α2,3 linked sialic acid band of the 400 kDa fragment of Reelin. Total value of band areas in the four fragments of Reelin were α2,3 linked sialic acid (1224 unit), β-Galactose (1165 unit), α2,6 bound sialic acids (764 unit), β-GlcNAc (672 unit), α-Mannose (205 unit) respectively. Purification of the Reelin glycoprotein was performed by immunoprecipitation from not transfected cells and Reelin fragment with weight of 250 kDa was isolated in pure form. In the result of the monosaccharide analysis of this isolate, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, galactose, glucose and mannose were determined from high amount to low respectively. As a result, there are many diseases associated with alteration of glycosylation and/or recognition dysfunctions of glycans. Although Reelin is a glycoprotein, literature on glycan profile of Reelin is very limited. Glycan analysis of Reelin with high analytical techniques, LC-MS/MS, was performed for the first time. In addition, purification of the natural form without the use of transfection system to produce reelin is important for preventing possible glycan changes and not been found in the literature. The 85 kDa from the determined Reelin fragment was also shown for the first time. Determination of high amounts of aminoglycans (GlcNAc and GalNAc) demonstrate that N-glycans as well as O-glycans may be an important on Reelin. It is expected that these results and future studies will contribute to detailed understanding of the mechanism of neuropsychiatric diseases and to the research done for diagnosis and treatment of the diseases from the viewpoint of glycobiology.

Ökaryotik bir ribonükleoprotein olan telomeraz, "hTERT" katalitik alt birimi, "hTR" kalıp RNA'sı ve "p23/hsp90", "SnoRNA", "TEP1", "hnRNAPS C1/2", "La", "L22" ve "hStau" şeklinde bağlı proteinlerden oluşan bir holoenzim komplekstir. Her hücre bölünmesinde, kromozomların uçları (telomerler) kısalmaktadır. Bu kısalma ile birlikte hücresel senesens ve hücre bölünmesinin durdurulması tetiklemektedir. Telomeraz, telomerlere yeni nükleotidlerin eklenmesini katalizleyen (insanda: TTAGGG) bir ters transkriptazdır ve tüm malignant tümörlerin yaklaşık %90'ında belirlenmiştir. İnsan tümör hücrelerinin, evrensel olarak hücresel senesens ve DNA hasar-sinyal yol izlerini baypas ettiği düşünüldüğünde; telomeraz, ilgili moleküler mekanizmalar açısından son derece kritik bir noktada durmaktadır. Bir post-translasyonel modifikasyon olan protein glikozilasyonu, hücre içi ve hücreler arası tanıma, tutunma, sinyal iletimi ve farklılaşma gibi bir çok moleküler ilişkide önemli rollere sahiptir. Özellikle biyolojik tanıma olaylarının büyük bir kısmında bağlanmanın kalite kontrolü ve protein katlanmasında son derece önemlidir. Glikobiyolojinin perspektifinden baktığımızda, çok alt birimli bir ribonükleoprotein olan telomerazın; alt birimlerinin telomeraz kompleksini oluşturmasına ve enzimin katalitik işlevine dair ilgili moleküler mekanizmaların gerekli tanıma ve tutunma reaksiyonlarında glikanların rol oynaması olası görülmektedir. Bu tez çalışmasında, öncelikle hTERT ve farklı türlere ait telomeraz katalitik alt birimi (TERT) amino asit dizilerinde olası glikozilasyon pozisyonlarının biyoinformatik yöntemlerle belirlenmesi; nöroblastoma (SH- SY5Y) ve hepatoselüler karsinoma (Hep G2) hücre hattı örneklerinde, western ve lektin blotlama yöntemleriyle, olası glikanların deneysel olarak incelenmesi ve karşılaştırılması amaçlanmıştır. Yapılan biyoinformatik çalışma sonucunda: TERT proteini amino asit dizisi bakımından farklı türlerde karşılaştırıldığında, bu dizilerin türler arasında yüksek oranda korunduğu ve protein sekonder modellerinde katlanma motifleri açısından farklılıklar olduğu görülmüştür. Homo sapiens hTERT amino asit dizisinde olasılıkla bir N-bağlı ve birden çok O-bağlı glikozilasyon pozisyonu tespit edilmiştir. Ek olarak, Canis familiaris, Bos taurus, Rattus norvegicus ve Mus musculus TERT amino asit dizilerinde de olası O-bağlı glikozilasyon pozisyonları tespit edilmiş olup Rattus norvegicus ve Mus musculus TERT aminoasit dizilerinde olası iki N-bağlı glikozilasyon pozisyonu olduğu görülmüştür. Biyoinformatik verileri destekler şekilde, SH-SY5Y ve Hep G2 hücreleri nukleus lokalizasyonunda, hTERT'e bağlı N-asetilglukozamin (GlcNAc) ve sialik asit (Sia) belirlenmiştir. Her iki hücre hattında da en yoğun şekilde hTERT'e bağlı GlcNAc bulunmuştur. Hep G2 hücrelerinde ek olarak hTERT'e bağlı mannoz tespit edilmiştir. Her iki hücre tipine ait hTERT'de uç şeker olarak belirlenmiş olan α2,6 bağlı Sia'ların, O- ve/veya N-bağlı glikozilasyonla ilişkili olabileceği; hTERT ve etkileştiği bir protein olan TEP-1'in bağlanmasıyla ilgili moleküler reaksiyonlarda, tanıma ve tutunmada rollerinin olabileceği tartışılmıştır., Telomerase, an eukaryotic ribonucleoprotein, is a holoenzyme complex consisting of proteins linked together such as "HTERT" catalytic subunit, "hTR" template RNA and "p23 / hsp90", "SnoRNA", "TEP1", "hNRNAPS C1 / 2 "," La "," L22 "and" hStau. At each cell division, the ends of the chromosomes (telomeres) are shortened. With this shortening, the stopping of cell senescence and cell division is triggered. Telomerase is a reverse transcriptase that catalyzes the insertion of new nucleotides into telomeres (human: TTAGGG nucleotides) and has been identified in about 90% of all malignant tumors. When human tumor cells are thought to bypass the global pathways of cellular senescence and DNA damage signaling. So, telomerase is at a critical point in terms of the relevant molecular mechanisms. Protein glycosylation, a post-translational modification, has a number of important molecular roles, such as intracellular and intercellular recognition, adhesion, signal transduction and differentiation. Protein glycosylation is particularly important in the large proportion of biological recognition events, such as quality control of the binding and protein folding. From the perspective of glycobiology, telomerase, a multi-subunited ribonucleoprotein; it is possible that glycans play a role in the telomerase's subunits' form the telomerase complex and the necessary recognition and attachment reactions of the relevant molecular mechanisms of the catalytic function of the enzyme. In this thesis study, it is primarily aimed to determine possible glycosylation positions in the amino acid sequences of hTERT and telomerase catalytic subunit (TERT) that belongs to different species, by bioinformatic methods; and to experimentally compare and analyze possible glycans from Neuroblastoma (SH- SY5Y) and Hepatocellular carcinoma (Hep G2) cell line samples by western and lectin blotting methods. As a result of the bioinformatics study, it was found that when comparing the TERT protein in different species with respect to the amino acid sequence, these sequences are highly conserved between species and differ in terms of folding motifs in the protein secondary models. In the amino acid sequence of the Homo sapiens hTERT, an N-linked and multiple O-linked glycosylation positions were identified. In addition, possible O-linked glycosylation positions have been identified in the TERT amino acid sequences of Canis familiaris, Bos taurus, Rattus norvegicus and Mus musculus and two possible N-linked glycosylation positions were found in the TERT amino acid sequences of Rattus norvegicus and Mus musculus. In support of bioinformatics data, N-acetylglucosamine (GlcNAc) and sialic acid (Sia) bound to hTERT were identified in the nucleus localization of SH-SY5Y and Hep G2 cells. GlcNAc which is bound to hTERT has been found most intensively in both cell lines. Additionally hTERT-associated mannose was detected in Hep G2 cells. The α2,6-linked Sia, identified as end-sugar in hTERT of both cell types, might be associated with O- and/or N-linked glycosylation; and it is discussed that these α2,6-linked Sias might have attachment and recognition effects on molecular reactions of hTERT, and an interacting protein TEP-1's binding

Transkripsiyon; prokaryotik ve ökaryotik tüm canlılarda gerçekleşen, canlılığın evrensel ve kilit bir mekanizmasıdır. Ökaryotik canlıların tamamında trankripsiyonun gerçekleşmesinde, RNA Polimeraz II enzimi ve onunla etkileşen genel tranksripsiyon faktörleri rol oynamaktadır. Bu proteinlerden TFIIB, transkripsiyonun başlaması aşamasında üç yapı ile etkileşime girer. Bunlar; TATA'ya bağlanan protein'in tek ucu; TATA kutusunu izleyen GC zengin DNA dizisi ve RNA polimeraz II'nin C-terminal domaini kuyruğudur. RNA Polimeraz II'nin bir glikoprotein olduğu ve transkripsiyonun başlama aşaması sırasında C-terminal domaininde O-GlcNAc şekerini taşıdığı bilinmektedir. Fakat, RNA polimeraz II ile etkileşime giren transkripsiyon faktörü TFIIB'nin bir glikoprotein olup olmadığı ve bu etkileşimlerinde glikanların rolü ile ilgili bilinenler oldukça sınırlıdır. Bu nedenle çalışmanın amacı; nukleus proteinlerinden TFIIB transkripsiyon faktörünün olası glikozilasyon (N- ve O-bağlı glikozilasyonlar) noktalarını, çeşitli omurgasız ve omurgalı türlerinde biyoinformatik yöntemlerle belirlemek ve türler arasında korunmuş/farklılaşmış amino asit dizileri ile bunların olası glikozilasyon profilini ortaya koyarak elde edilecek bilgilerden hareketle, model organizma denizkestanesi Paracentrotus lividus'ta TFIIB'nin olası glikozilasyon profillerini (N- ve/veya O-) western blot/lektin blot yöntemleri ve TEM ile deneysel olarak ortaya koymaktır. Bu amaçla biyoinformatik çalışmalarda kullanılmak üzere; denizkestanesi Strongylocentrotus purpuratus, balık Oryzias latipes, kurbağa Xenopus laevis, sıçan Rattus norvegicus, fare Mus musculus, sığır Bos taurus, orangutan Pongo pygmaeus abelii ve insan Homo sapiens'e ait TFIIB amino asit dizilerinden yararlanılmıştır. Biyoinformatik veritabanları ve sunucuları kullanılarak her türün TFIIB proteininin sekonder ve üç boyutlu yapı tahminleri oluşturulmuş, potansiyel glikozilasyon pozisyonları belirlenerek doğruluk analizleri yapılmış ve ilgili pozisyonlar proteinin yapısı üzerinde görüntülendirilmiştir. Deneysel çalışmalarda ise denizkestanesi P.lividus'un ergin bireylerinden alınan yumurta hücreleri kullanılmış, elde edilen nuklear ekstrakt kullanılarak western/ lektin blotlama ve TEM ile immün/lektin işaretleme yapılmıştır. Biyoinformatik çalışmalar sonucunda, denizkestanesi ve kurbağa türlerine ait TFIIB proteininin N-bağlı glikozilasyon noktalarına sahip olduğu belirlenmiş, ayrıca çalışılan türlerin TFIIB proteininde musin tip O-bağlı glikozilasyon, O-α-GlcNAclasyon, O-β-GlcNAclasyon ve ying-yang pozisyonları da belirlenmiştir. Buna ek olarak, sekonder ve üç boyutlu yapı tahminlerinde, omurgasızlardan omurgalılara gidildikçe proteinin yapısal bir değişim gösterdiği bulunmuştur. Lektin blotlama sonucunda TFIIB proteininde, N-asetilglukozamin, Galaktoz, Mannoz ve α2-3 bağlı Sialik asit uç glikan birimleri olarak belirlenmiştir. TEM'de sialik asitlere yönelik yapılan lektin işaretlemede ise, α2-3 ve α2-6 bağlı sialik asitlerin TFIIB proteininde bulunduğu belirlenmiştir. Elde edilen bulgularla, TFIIB transkripsiyon faktörünün bir glikoprotein olduğu ilk kez belirlenmiştir. Ayrıca nukleositoplazmik proteinlerin O-GlcNAc modifikasyonunun yanında, O- ve/veya N- bağlı glikozilasyon modifikasyonlarını da gösterdiği/gösterebileceği belirlenmiştir. Bu bulgu ile nukleositoplazmik proteinlerin glikozilasyonuna yeni bir bakış açısı kazandırılmış ve glikobiyoloji alanına yeni bir araştırma sorusu sorulmuştur. Böylece, moleküler biyolojinin klasik bakış açısına farklı bir yaklaşım ile alternatif sunulmuştur. Bütün bunlara ek olarak bu çalışmada, TEM'de kullanılmak üzere, kesit alınmaksızın doğrudan grid üzerine uygulama yapılarak oluşturulan, son derece pratik ve yeni bir yöntem tarafımızca geliştirilmiş ve ilk kez bu tez çalışmasında kullanılmıştır., Transcription is the universal and key mechanism of life that occurs in all prokaryotes and eukaryotes. RNA polymerase II and transcription factors that interact with it are involved in transcription of all eukaryotic organism. Transcription factor TFIIB interacts with three structures at the initiation stage of transcription: the single end of TATA binding protein, TATA box followed by GC-rich DNA sequence, and C-terminal domain tail of RNA polymerase II. It has been known that RNA polymerase II is a glycoprotein and it contains O-GlcNAc sugar in the C-terminal domain at the initiation stage of transcription. However, it is not clear whether the transcription factor TFIIB interacting with RNA polymerase II is a glycoprotein or not. Also, data concerning the role of glycans in this interaction is quite limited. Thus, the first aim of the study is to determine the potential glycosylation positions (N- and O-linked glycosylation) of transcription factor TFIIB of nucleus proteins in various invertebrate and vertebrate species and to reveal conserved/differentiated amino acid sequences as well as their potential glycosylation profile amongst the species via bioinformatics. Taking into account the data obtained from bioinformatics, the second aim of the study is to determine experimentally of the potential glycosylation profiles (N- and/or O-) of TFIIB in the model organism sea urchin Paracentrotus lividus by using western/lectin blotting methods and TEM. For this purpose, TFIIB amino acid sequences of sea urchin Strongylocentrotus purpuratus, fish Oryzias latipes, frog Xenopus laevis, rat Rattusnorvegicus, mouse Mus musculus, bovine Bos taurus, orangutan Pongo pygmaeus abelii, and human Homo sapiens were used in bioinformatic studies. The construction of the secondary and three dimensional structure predictions of TFIIB protein, determination of the potential glycosylation positions and their accuracy analyzes, and the visualization of the relevant positions on the protein structure were performed using bioinformatic databases and servers. In experimental studies, egg cells from mature individuals of sea urchin P. lividus were used and western/lectin blotting and immune/lectin labelling by TEM were performed using the nuclear extract obtained. In addition to the determination of mucin type O-linked glycosylation, O-α-GlcNAcylation, O-β-GlcNAcylation, and ying-yang positions in the TFIIB protein of all studied species, N-linked glycosylation positions were also found in the TFIIB protein of sea urchin and frog as a result of bioinformatic studies. Furthermore, in the secondary and three dimensional structure predictions, changing in the protein structure from invertebrates to vertebrates was found. N-acetylglucosamine, Galactose, Mannose, and α2-3 linked Sialic acid were determined as a terminal glycan unit of the TFIIB protein in lectin blotting. The presence of α2-3 and α2-6 linked sialic acids in the TFIIB protein were found by using lectin labelling against sialic acids in TEM. With the findings obtained, it has been demonstrated for the first time that transcription factor TFIIB is a glycoprotein. It has also been determined that nucleocytoplasmic proteins may exhibit O- and/or N-linked glycosylation modifications as well as O-GlcNAc modification. With this finding, a new approach has been adopted to the glycosylation of nucleocytoplasmic proteins and prompted a new research question in the field of glycobiology. Thus, an alternative approach is presented for the classical viewpoint of molecular biology. Furthermore, a very practical and new method has been developed by us applying directly on the grid without sectioning in order to be used in TEM and used for the first time in this thesis.

IgA Nefropatisi poligenik bir hastalıktır. Son zamanlarda artan kanıtlar, anormal glikozilasyon sonucu IgA1'de oluşan α2,6 sialik asit ve galaktoz bozukluğunun IgAN'nin patogenezinde rol oynadığını göstermektedir. Bu çalışmada IgA1 molekülünün glikozilasyonuna katılan üç önemli genin ST6GALNAC2, C1GALT1 ve NEU1 polimorfizmlerinin IgAN ile ilişkisi araştırılmıştır. Histolojik olarak kanıtlanmış 50 IgAN hastası, 25 sağlıklı (kontrol grubu) birey araştırmaya katılmıştır. ST6GALNAC2, C1GALT1 ve NEU1 genlerinin aminoasit kodlayan bölgelerinde, bu bölgelere yakın intron bölgelerinde ve promotör bölgelerinde nukleotit dizilimi yolu ile SNP taranması yapıldı. ST6GALNAC2 geninde IVS2+65insA, IVS2+12G>A, IVS3+39 T>C, Ala73Asp, Leu83Leu, IVS7-19T>C polimorfizimleri, C1GALT1 geninde ise c.-1625G>A, c.-1042G>C, c.-694C>T, c.-562C>T, 5'UTR-321 A>G, c.-517A>T, 5'UTR-1391ins21bp, 3'UTR+211G>A polimorfizimleri saptandı. Sonuçlar ST6GALNAC geninin intron bölgesinde saptanan IVS2+65insA polimorfizminin kontrol bireylere kıyaslamada IgAN hastalarında daha sık rastlandığını göstermiştir (p = 0.001 A sadece IgAN hastalarında bulunmuştur. ST6GALNAC2. IVS7-19T>C (P=0,006; OR=0,2 0,09< IG95%, IgA Nephropathy is a polygenic disorder. Increasing evidence has implicated that aberrant glycosylation of IgA1 molecules, including a2,6 sialic acid and galactose defects, are involved in the pathogenesis of IgAN. In the present study, we designed an association study to investigate polymorphisms of three important genes, ST6GALNAC2, C1GALT1 and NEU1 which are involved in the glycosylation of the IgA1 molecule, in the susceptibility to IgA Nephropathy. A total of 50 patients with histologically proven IgAN and 25 healthy controls were enrolled. Screening of SNPs in the coding, and promoter regions of the ST6GALNAC2, C1GALT1 and NEU1 genes was performed by sequencing. IVS2+65insA, IVS2+12G>A, IVS3+39 T>C, Ala73Asp, Leu83Leu, IVS7-19T>C in the ST6GALNAC2 gene and c.-1625G>A, c.-1042G>C, c.-694C>T, c.-562C>T, 5'UTR-321 A>G, c.-517A>T, 5'UTR-1391ins21bp, 3'UTR+211G>A in the C1GALT1 gene were detected. Our results demonstrated that the frequency of IVS2+65insA polymorphism in the intron region of ST6GALNAC2 was significantly higher in IgAN patients than that in controls (P=0.003A was found only in patients with IgAN. ST6GALNAC2. IVS7-19T>C (P=0,006; OR=0,2 0,09< IG95%

Sperm ve yumurta interaksiyonunda yüzey karbonhidrat içerikleri büyük önem taşımaktadır. Denizkestanesi yumurtasını saran jel tabakada karbohidratça zengin glikoproteinler bulunmaktadır. Henüz çalışmamış olmakla birlikte bunların, omurgalı tanıma molekülleri ile homolog olduğu düşünülmektedir. Bu tabakada yer alan bazı glikoproteinler karakterize edilmiş olmasına karşın, glikan profilleri belirlenmemiştir. Bu nedenle bu tez çalışmasında; memeliler gibi alesital tip yumurtaya sahip olması nedeniyle model organizma olarak seçilen denizkestanesi Paracentrotus lividus'un yumurta jel kılıfında, fertilizasyonda önemi bilinen çeşitli glikoproteinlerin belirlenerek, glikan profillerinin glikomik yaklaşımla aydınlatılması amaçlanmıştır. Bunun için, asidik yöntemle izole edilen yumurta jel kılıflarına diyaliz ve liyofilizasyon yapılmış ve protein miktarı Bradford yöntemiyle ölçülmüştür. Jel kılıfın proteinleri SDS-PAGE ile, bunların hangilerinin glikozilli oldukları Periyodik asit-Schiff (PAS) boyama ile, glikozilli bu proteinlerden glikoprotein olanlarını belirlemek için ise, glikoproteinlerde uç şeker olan sialik aside spesifik LFA ile lektin blotlama yapılmıştır. Glikoproteinlerin glikan zincirlerini oluşturan monosakkaritlerin analizi için yumurta jel kılıfına asit hidrolizi yapılmıştır. Türevlendirme için sialik asit dışındaki monosakkaritlerde PMP reaktifi, sialik asitte DMB flouresan reaktifi kullanılmıştır. Örnekler CapLC-ESI-MS/MS sisteminde analiz edilmiştir. Glikanların glikomik yaklaşımla belirlenmesi için; N-glikanlar protein zincirinden PNGase F ile koparılmış, permetilasyon ile türevlendirilmiş, MALDI-TOF-MS ile N2 lazer eşliğinde analizleri yapılmıştır. Aynı örnekler, CapLC-ESI-MS/MS sisteminde parçalanma iyonları ile karakterize edilmiştir. O-glikan analizi için yumurta jel kılıfına amonyak çözeltisi doğrudan ilave edilmiştir. Ardından PMP ile türevlendirilmiş ve LC-MS/MS sisteminde analiz edilmiştir. Jel kılıf protein/glikoprotein profilinin karakterizasyonu sonucunda; SDS-PAGE ile ~250, 55, 50 ve 15 kDa civarında dört protein bandı ayırt edilmiştir. PAS boyama ile 250, 35 ve 10 kDa civarındaki proteinlerin glikozilli oldukları, bunlardan da sadece 250 kDa civarındaki büyük proteinin glikoprotein olduğu anlaşılmıştır. 35 ve 10 kDa civarındakiler olasılıkla proteoglikandır. Jel kılıf glikoproteinlerinde monosakkarit analizi sonucunda; sırasıyla en fazla fukoz olmak üzere mannoz, arabinoz+ksiloz, galaktoz, glukoz, N-asetilgalaktozamin ve N-asetilglukozamin bulunmuştur. Riboz, genetik materyalden kaynaklanmaktadır. Sialik asit tiplerinden en fazla Neu5Gc bulunmuştur. Ardından sırasıyla Neu5Ac, Neu9Ac5Gc, Neu5,9Ac2, Neu8Ac5Gc, Neu7Ac5Gc, Neu5,7Ac2, Neu5,8Ac2 gelmektedir. Eser düzeyde de sülfat grubu taşıyan Neu5GcS ve Neu5AcS belirlenmiştir. Jel kılıf glikoproteinlerinde glikomik yaklaşımla yüksek mannoz N-glikan ve O-heksoz tipinde O-glikanlar bulunmuştur. Ayrıca çekirdek 1-8 yapıya benzer O-glikanlar da LC-MSn sisteminde belirlenmiştir. MALDI-TOF sisteminde de çekirdek 1-8 yapısı bulunabilmiştir. Sonuç olarak; bu çalışmada, yeni ve modern glikomik tekniklerden olan MALDI-TOF/MS, LC-ESI-MS/MS, lektin blotting sistemleri yanında bilgisayar programları da kullanılarak P.lividus yumurta jel kılıfı glikan profili ilk defa ortaya çıkarılmıştır. Çalışmada model organizma olarak kullanılan P.lividus'un evrim sürecinde diğer türlere göre değişmeksizin günümüze kadar yaşamını sürdürmesi, bu türün özel yapısını ortaya koymaktadır. Bu sayede sadece fertilizasyon değil, onun da ötesinde türleşmenin de moleküler açıklamalarına özellikle glikobiyolojik açıdan cevapların bulunabilmesi ilgi çekicidir. Model organizmada belirlenen detaylar anlaşıldıktan sonra diğer canlılarda da homolog moleküllere bakış açısı etkilenebilir. Bu bağlantıların iyi bilinmesi insanlarda infertilitenin araştırılmasına ve çözülmesine de katkı sağlayabilir, The surface carbohydrate content is crucial in the sperm and egg interactions. There are carbohydrate-rich glycoproteins in the jelly coat which surrounding sea urchin eggs. Although there are no studies yet they are considered to be homologous to the vertebrate recognition molecules. Although some glycoproteins involved in this layer have been characterized, glycan profiles are not determined. Therefore, in this thesis;, it is aimed to identificate various glycoproteins known importance in fertilization and to clarify the glycan profile by glycomics approach in the egg jelly coat of the sea urchin Paracentrotus lividus which is selected as a model organisms due to having alecithal type egg like mammals. Hence, isolated egg jelly coat by acidic method was lyophilized and dialysed and protein content was measured by the Bradford method. Jelly coat proteins determined by SDS-PAGE, glycosylation of proteins identified by periodic acid-Schiff (PAS) staining, glycoproteins were defined by lectin blotting using LFA which is specific for the terminal sugar in the glycoprotein called sialic acid. Analysis of monosaccharides that is forming the glycan chains of glycoproteins is performed using acid hydrolysis to the egg jelly coat. PMP was used for the derivatization of the monosaccharides except sialic acids, DMB flourescent reagent used for the sialic acids. Samples were analysed using CapLC-ESI-MS/MS system. To determine glycans with glycomics approach; N-glycans were released by PNGase F from protein chain, derivatized with permethylation and analysis were performed by MALDI-TOF-MS in the presence of N2 with laser. The same samples were characterized using CapLC-ESI-MS/MS system with fragment ions. Ammonia solution was directly added on to the egg jelly coat for O-glycan analysis. Then derivatized with PMP and analysed by LC-MS/MS system. After the characterisation of protein/glycoprotein of egg jelly; by SDS-PAGE four protein band were observed near 250, 55, 50 ve 15 kDa. It is understood using PAS staining that near 250, 35 ve 10 kDa proteins are glycosylated, those of only near 250 kDa protein is a large glycoprotein. Probably near 35 and 10 kDa bands are proteoglycans. As a result of the monosaccharide analysis of jelly coat glycoproteins; fucose was found at high level and the mannose, arabinose+xylose, galactose, glucose, N-acetylgalactosamine ve N-acetylglucosamine found respectively. Ribose is derived from genetic material. Neu5Gc was found in highest level among sialic acid types. Then Neu5Ac, Neu9Ac5Gc, Neu5,9Ac2, Neu8Ac5Gc, Neu7Ac5Gc, Neu5,7Ac2, Neu5,8Ac2 was found respectively. Neu5GcS and Neu5AcS which substituted with sulphate were determined in trace level. High mannose N-glycan and O-hexose type O-Glycans were determined in the egg jelly coat glycoproteins using glycomics approach. Furthermore, core 1-8 like O-glycans were identified using LC-MSn system. Core 1-8 O-glycans determined in MALDI-TOF-MS, too. In conclusion; in this thesis, glycan profile of the egg jelly of P. lividus revealed for the first time using MALDI-TOF/MS, LC-ESI-MS/MS, lectin blotting and also software which are new and modern glycomics techniques. P.lividus is used as a model organism in this study which survives until today and has been unchanged during the evolution process compared to the other species, reveals the special nature of this species. Therefore, not only fertilization, but also it is interesting to get answers of the molecular explanation of speciation especially from glycobiological view. After the details identified in the model organism is understood, the perspective to the homologous molecules could be affected by other species. It may also contribute to the investigation and deciphering of infertility in humans by knowing these relations well.

Toxoplasma gondii, hemen hemen her sıcakkanlı hayvanı, kuş türlerini ve insanları enfekte edebilen bir zorunlu hücre içi parazitidir. Toksoplazmozis, immun sistemi sağlam kişilerde asemptomatik ilerlerken, immun sistemi baskılanmış ya da immun yetmezliği olan kişilerde ölüme neden olabilmektedir. Bu sebeplerden dolayı T. gondii'ye karşı geliştirilecek aşı enfeksiyondan korunmak için büyük önem taşımaktadır. Bu tez çalışmasında T. gondii'ye karşı multivalan rekombinant protein aşısı geliştirilmesi amaçlanmıştır.Bu amaçla protein mikroarray taramasıyla belirlenen T. gondii'ye ait 49 aşı adayı antijenik protein; biyoinformatik yöntemler, küçük çaplı ekspresyon ve saflaştırma özelliklerine göre analiz edilmiştir. Analiz sonucunda aralarından altı protein aşı adayı olarak seçilmiş ve ilk kez 6-Valantlı adjuvante rekombinant protein aşı formülasyonu geliştirilmiştir [6-Valant (+) Montanide]. Fareler üç hafta arayla iki kez aşılanmış ve daha sonra uyarılan humoral immun yanıt Western blot ve Rec-ELISA ile, hücresel immun yanıt ise flow sitometri ve sitokin ELISA ile belirlenmiştir. Aşılanan fareler T. gondii Ankara suşu takizoiti ile intraperitoneal yoldan letal dozda enfekte edilerek oluşturulan korunma belirlenmiştir.Sonuçlara göre, aşılama sonrası 6-Valant (+) Montanide aşısı kontrollere göre kuvvetli total IgG yanıtı uyarmıştır (P